JP4769868B2 - 植物細胞懸濁培養によるコロソール酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は植物細胞を細胞生長用培地で懸濁培養した後、細胞生産用培地で高濃度細胞培養と誘導体の処理を通じて懸濁培養するコロソール酸製造方法に関するものである。

下記構造式（１）で表現されるコロソール酸はミソハギ科の植物であるバナバ及びバラ科植物である枇杷の葉、山査子の果肉などに存在する物質で、インシュリンと同様に葡萄糖を細胞内に迅速に吸収させる性質があることが報告され（非特許文献１：Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４１（１２）:２１２９-２１３１，１９９３）、臨床実験を行った結果、コロソール酸が副作用なく血糖を下げるだけでなく、血糖値の再上昇を抑制することが知られた（非特許文献２：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ８７:１１５ １１７， ２００３）。このような効能によってコロソール酸は血糖調節剤及び第２型糖尿病治療剤として利用することができ（特許文献１：ＵＳ特許６，４８５，７６０）、体重調節剤としても使用されている（特許文献２：ＵＳ特許６，７８４，２０６）。

現在コロソール酸はバナバ葉から熱水抽出及びアルコール抽出技術を利用して生産されているが、天然の葉に存在するコロソール酸の含量が非常に低いため、健康機能食品及び医薬品素材としてコロソール酸の需要増加にもかかわらず、天然の植物から直接的な生産による供給には制限がある。一方、一部では前駆体であるウルソール酸から半合成技術を利用してコロソール酸を生産する方法が報告されたこともあるが、前駆体を天然抽出し、化学合成を経なければならないという点が経済的に問題となり得る。

植物は有用物質の根源として植物が生産するアルカロイド、ステロイド、テルペノイド、フェノール性化合物のような二次代謝産物は医薬品、染料、色素、香料、食品添加剤などとして利用されている。現在これら有用物質の生産は植物を栽培して抽出、精製することによって行われているが、このような在来工程は地理的、気候的、政策的影響を受け、栽培環境の変化にも大きく影響を受けるという短所がある。特に、植物栽培で抽出できる生産量が非常に少なく、大部分の植物由来有用物質は多段階の生合成経路を経て複雑な構造に生成されるため、直接抽出や化学的合成法を利用することが難しくて植物細胞培養技術による有用二次代謝産物の大量生産が引き続き試みられてきた。

植物細胞培養技術が内在している幾多の長所にもかかわらず、この技術を利用した産業化が活性化できない原因は主に低い生産性と不安定性に起因すると言える。植物の組織から脱分化されたカルス（ｃａｌｌｕｓ）組織（傷跡にできる癒傷細胞団）を誘導することは比較的に容易であるが、このようなカルス組織自体を産業的に活用することは難しいため、液体培地上で培養が可能な懸濁培養細胞株を誘導しなければならない。しかし、この過程で二次代謝産物生産性が高く、この特性が安定的に維持される優秀細胞株を選別して確立することはかなり難しいことである。また、時間と努力が要求される選別過程を経て確立された懸濁培養細胞株も培地組成と培養条件の最適化と適切な誘導剤の選択及び適用、そして生産性を増加させる培養法の開発などが複合的に行われなければ量産システムを確立することはできない。

２００２年谷口などによって枇杷植物体からカルス組織を誘導し、これからコロソール酸の生産を調査した研究結果が報告されたが（非特許文献３：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５９:３１５ ３２３，２００２）、コロソール酸の生産性は天然の葉で存在する含量と類似な水準程度であり、未だに植物細胞培養技術の産業化のために必須の懸濁培養細胞株の誘導及び確立とコロソール酸の量産法に対する詳細な報告はないのが実情である。バナバの場合も同様に、懸濁培養細胞株の誘導及び確立とコロソール酸の量産法に対する詳細な報告はない。
：ＵＳ特許６，４８５，７６０ ：ＵＳ特許６，７８４，２０６ ：Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４１（１２）:２１２９-２１３１，１９９３ ：Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｅｔｈｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ８７:１１５ １１７， ２００３ ：Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ５９:３１５ ３２３，２００２

本発明はこのような問題点を解決するためのもので、本発明の目的は、今まで研究が不足であった枇杷（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ）またはバナバ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ）植物体から誘導された懸濁培養細胞を最適の条件で培養した後、コロソール酸の生産を増加させる各種培養条件及び技術を適用することによって植物の懸濁培養細胞を利用してコロソール酸を量産することができる方法を提供することにある。

本発明は前記目的を達成するために、コロソール酸生産植物組織からカルスを誘導する段階;前記カルスから液体培地で培養可能な懸濁培養細胞株を作る段階;前記懸濁培養細胞株を懸濁培養する段階;前記培養段階の培養液からコロソール酸を抽出する段階を含む植物細胞懸濁培養によるコロソール酸製造方法を提供する。

また、本発明は前記コロソール酸製造方法において懸濁培養細胞株を懸濁培養した後、誘導剤を含む培地で培養する段階をさらに含むコロソール酸製造方法を提供する。

また、本発明は前記植物懸濁培養によるコロソール酸の量産法において植物懸濁培養のコロソール酸生産性を増加させる培養法を提供する。

また、本発明は枇杷及びバナバからカルスを誘導する段階;前記カルスから液体培地で培養可能な懸濁培養細胞株を作る段階;及び、前記懸濁培養細胞株を懸濁培養する段階を含む枇杷またはバナバの植物細胞株を懸濁培養する方法を提供する。

以下、本発明をより詳細に説明する。
本発明ではコロソール酸を生産すると知られている植物の枇杷、バナバなどの植物体からカルスを誘導することによって懸濁培養細胞株を確立し、これを懸濁培養してコロソール酸を量産する方法を提供する。

前記懸濁培養細胞からコロソール酸を量産する方法は、 コロソール酸を産生すると知られた全ての植物種から誘導された懸濁培養細胞に適用できる。前記植物としてはバナバ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）、枇杷（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ）、モッコク（Ｔｅｒｎｓｔｒｏｅｍｉａ ｇｙｍｎａｎｔｈｅｒａ）、山査子（Ｃｒａｔａｅｇｕｓ ｐｉｎｎａｔｉｆｉｄａ）、喘息薬種（Ｔｉａｒｅｌｌａ ｐｏｌｙｐｈｙｌｌａ）などがあるが、本発明の範囲はこれに限定されない。また、これら植物体の全ての生きている組織から脱分化（共通化）した組織であるカルスと、これから誘導された懸濁培養細胞株を誘導することができる。

前記植物からカルスを誘導する方法は植物材料をアルコール及び滅菌剤を活用して表面殺菌した後、適切な植物生長調節剤が含まれた栄養培地上に置いて培養することによって行われる。

培養に使用される植物組織として幼苗、幹、根、葉、花、種子などを使用することができ、滅菌処理された種子から発芽した幼い幼苗なども使用することができる。材料の滅菌はアルコール浸漬及び塩素漂白処理のような公知の滅菌法が効果的である。

前記カルスを誘導する時に使用される栄養培地は栄養分及び植物細胞の生育力を維持するのに必要な因子、例えば炭素源、窒素源、塩及びビタミンなどを含有する植物細胞の培養に幅広く使用される培地、例えば、ムラシゲ−スクーグ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ ｍｅｄｉｕｍ、以下、ＭＳ培地）、ガンボーグ培地（Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ ｍｅｄｉｕｍ、以下、Ｂ５培地）、変形ガンボーグＢ５培地（ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｇａｍｂｏｒｇ Ｂ５ ｍｅｄｉｕｍ、以下、ｍＢ５培地）、リンスマイエル-スクーグ培地（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ＆ Ｓｋｏｏｇ ｍｅｄｉｕｍ、以下、ＬＳ培地）等を使用することができる。

この場合、必要に応じて前記培地には各種添加剤を添加したり、成分のうちの一部を除去して使用することができる。前記添加剤はα−ナフタレン酢酸（α−Ｎａｐｈｔａｌｅｎｅ ａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、以下、ＮＡＡ）、６−ベンジルアミノプリン（６−ｂｅｎｚｙｌａｍｉｎｏｐｕｒｉｎｅ、以下、ＢＡ）などの適切な植物生長調節剤を使用することができる。

枇杷のカルスを誘導する場合に好ましい培地は、ＮＡＡ１０μＭ及び６-ＢＡ１０μＭを添加したＬＳ培地であり、バナバカルスの誘導時にはＮＡＡ１０μＭ及びＢＡ１０μＭを添加したＭＳ培地あるいはＬＳ培地である。

前記カルスの誘導に好ましい生育温度は２０乃至３０℃であり、好ましくは２２乃至２７℃である。

前記カルスが十分に成長した場合は、これから懸濁培養細胞株を誘導することができる。これは前記カルスを液体培地に移して液体懸濁培養を実施し、前記液体培地で２乃至３週間培養した細胞培養液は同一条件の培地に接種して継続して継代培養する。

前記培養に使用される培地はカルス誘導時に使用された培地で固形化成分、例えば、寒天などが除去されたもので、カルス誘導及び培養と同一組成の培地を使用することができ、場合によっては他の組成の培地を使用することもできる。本発明の枇杷懸濁培養のためにはＬＳ培地が好ましく、バナバ細胞の懸濁培養のためにはＢ５培地が好ましい。また、これら培地は褐変化及び怪死を防止する成分をさらに含むことができる。前記成分としてはＸＡＤ樹脂類、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰＰ）、活性炭などがある。培地に添加されるこのような成分は懸濁培養細胞誘導過程でストレスに直面した植物細胞が分泌するフェノル系化合物を吸着して植物細胞の成長を促進し、安定した懸濁培養細胞株誘導に寄与することができる。また、前記培地に酸化防止を目的として抗酸化剤成分をさらに添加することもできる。本発明は枇杷からの懸濁培養細胞株としてエリオボトリヤ・ヤポニカ・リンドル（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｌｉｎｄｌ．）ＳＹＧ-２を誘導して２００５年６月２２日付で大韓民国大田広域市、儒城区魚隠洞５２番地に所在する韓国遺伝子銀行に受託番号ＫＣＴＣ１０８２２ＢＰで受託された。

また、バナバからの懸濁培養細胞株としてラゲルストロミア・スペシオサ（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ）ＳＹＧ-３を誘導して２００５年６月２２日付で大韓民国大田広域市広域市、儒城区魚隠洞５２番地に所在する韓国遺伝子銀行に受託番号ＫＣＴＣ１０８２３ＢＰで受託された。

本発明は前記カルスから液体培地で培養可能な懸濁培養細胞株を作る段階;前記懸濁培養細胞株を懸濁培養する段階を含む。

一般に植物細胞の場合、成長と二次代謝産物生産の最適条件が互いに異なる傾向がある。従って、本発明の場合も植物細胞懸濁培養で細胞の成長のための成長培地の最適化及び二次代謝産物の生産のための生産培地の最適化作業がそれぞれ要求される。

前記懸濁培養で使用される培地は一般に使用されるすべての培地を使用することができ、好ましくはリンスマイエル-スクーグ培地、ムラシゲースクーグ培地、ガンボーグ培地、変形ガンボーグ培地などを使用することができ、２０〜３０℃で３日以上培養することができる。

また、前記方法で懸濁培養をした後、炭素源の濃度が１％（ｗ/ｖ）またはそれ以下に減少する場合、コロソール酸の生産性を増加させるための誘導剤を含む新たな培地で培養する段階をさらに含むことができる。この場合にも前記培地は一般に使用されるすべての培地を使用することができ、好ましくはリンスマイエル-スクーグ培地、ムラシゲースクーグ培地、ガンボーグ培地、変形ガンボーグ培地などを使用し、さらに好ましくはガンボーグ培地及び変形ガンボーグ培地を使用することができる。前記２段階において培地はそれぞれ異なる組成の培地を使用することができ、同一組成の培地を継続して使用することも可能である。

培養時間は植物細胞種に応じて異なり、本発明では７日以上培養が可能である。
前記植物細胞懸濁培養において二次代謝産物の生産性を増加させるために誘導剤を処理することができる。誘導剤処理は一般に培養初期または培養中盤に処理することができ、二次代謝産物は種類に応じてその合成に関与する生化学的経路も多様であるので、量産の対象となる特定二次代謝産物の生産性を増加させるためには適切な誘導剤を選別し、その処理条件を最適化しなければならない。本発明で使用される誘導剤には生物的誘導剤または非生物的誘導剤を使用することができ、前記生物的誘導剤の例としてはカビ、細菌及び酵母の選択群からの細胞壁抽出物またはろ過物とこれらから由来した多糖体及び糖蛋白質、不活性化した酵素または精製された形態のカードラン、ザンサン、キトサン、グルカンなどを含む精製分画がある。また、前記非生物的誘導剤としては化学的刺激剤または生物起源化合物がある。このような誘導剤として用いることができる種類を下記表１に記載する。

一般に前記誘導剤は種類によって多様な濃度で使用が可能であり、１種以上の誘導剤と共に使用してその効果をさらに増加させることができる。

本発明においてコロソール酸の生産のための誘導剤は硝酸銀、酪酸ナトリウム及びジャスモン酸メチルからなる群より１種以上選択されるのが好ましい。前記硝酸銀は０．０１μＭ乃至５００μＭ添加することができ、好ましくは０．５μＭ乃至１００μＭ添加することができる。また、前記酪酸ナトリウムは０．０１乃至５００ｍＭ添加することができ、好ましくは１ｍＭ乃至２００ｍＭ添加することができる。前記ジャスモン酸メチルは０．１μＭ乃至５０ｍＭ添加することができ、好ましくは１μＭ乃至１０μＭの範囲で添加することができる。また、前記複数の誘導剤はそれぞれまたはこれらの混合物を１回以上処理して生産性を増加させることができる。

なお、植物細胞懸濁培養において高濃度細胞培養及び二次代謝産物の最終容積生産性を増加させるために培地内高濃度炭素源を添加することができる。高濃度炭素源は高浸透処理効果をもたらし、培養細胞が利用可能な炭素源を提供することができる。炭素源としては蔗糖、乳糖、果糖、葡萄糖などを使用することが可能である。前記高浸透圧処理のために培地内炭素源を１乃至２０％（ｗ/ｖ）添加することができ、３乃至６％（ｗ/ｖ）添加するのが好ましい。

二次代謝産物の最終容積生産性を増加させるために高濃度細胞接種を使用することができ、好ましくは前記培地に接種される細胞の濃度を１乃至２０ｇ/Ｌ範囲に接種して７日以上長期培養することが可能である。

本発明において、植物細胞を培養する方法としては本発明の技術分野に務める者に幅広く公知された適切な植物細胞の培養工程を全て使用することができる。前記工程の例としては、回分式培養工程、連続式培養工程、流加式培養工程、半連続式灰分培養工程、固定化培養工程、二元相培養工程などがある。各植物細胞は細胞の特性に応じて適切な培養工程を選択して使用することができる。

前記方法によって植物懸濁培養液から生産されるコロソール酸は公知の方法を使用して抽出及び精製することができる（ＵＳ特許６，４８５，７６０）。前記植物懸濁培養液は熱水及びアルコールあるいは有機溶媒による抽出法でコロソール酸を抽出することができる。この時、使用される溶媒の性質に応じてコロソール酸の他にコロソール酸誘導体及び他の種類の二次代謝産物を共に抽出することができ、このような物質は互いに異なる溶媒を使用した液−液抽出法、再結晶法あるいはカラム樹脂を用いたカラム精製法によって除去して純粋なコロソール酸を得ることができる。

本発明で生産されたコロソール酸はメタノール抽出及びカラム樹脂精製を経て高速液体クロマトグラム分析によって確認することができる。

本発明で提供する方法によると、Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ細胞を培養した場合、コロソール酸の生産性は天然のＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａの葉から生産される量より２５倍以上高い水準に生産することができ、Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａカルス培養で報告されたことよりも１８．３倍だけ高い水準の生産性を示す。また、Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ細胞を培養した場合、コロソール酸の生産性は天然の葉より５６倍以上増加した生産性を得ることができる。

本発明はＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ及びＬａｇｅｒｓｔｒｏｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａからカルスを誘導する段階;前記カルスから液体培地から培養可能な懸濁培養細胞株を作る段階;及び前記懸濁培養細胞株を懸濁培養する段階を含む枇杷またはバナバの植物細胞株を懸濁培養する方法によってコロソール酸量産に最も適したＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａまたはＬａｇｅｒｓｔｒｏｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａの植物細胞株を得て韓国遺伝子銀行（ＫＣＴＣ）に寄託した。

以下、本発明の好ましい実施例を記載する。ただし、下記の実施例は本発明の好ましい一実施例に過ぎず、本発明が下記の実施例によって限定されるわけではない。

実施例１:Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養の確立と最適細胞成長条件選定
実施例１-１:Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａカルスの誘導
露地及び温室で培養したＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａの葉と幹を採取して５ｃｍ程度に切断した後、台所用洗剤を利用して表面を清潔に洗浄し、水道水で十分に洗った。

準備された試料は９５％のエタノールに１分間浸漬させた後、１％の次亜塩素酸ナトリウム溶液で３０分間振り続けながら殺菌した後、滅菌された蒸溜水で３回洗った。

滅菌が終わった材料は外科手術用ナイフを利用してそれぞれ１ｃｍｘ１ｃｍ大きさの切片に作ってサッカロース３０ｇ/Ｌ、寒天 ８ｇ/Ｌ、１０μＭのＮＡＡ、１０μＭのＢＡ、カゼイン加水分解産物１ｇ/Ｌ、２-ＭＥＳ（Ｍｏｒｐｈｏｌｉｎｏ ｅｔｈａｎｅ ｓｕｌｆｏｎｉｃ ａｃｉｄ）１ｇ/Ｌを添加し、ｐＨを５．７に調節した下記表２の４種類の培地（リンスマイエル-スクーグ培地（以下、ＬＳ）、ムラシゲ−スクーグ培地（以下、ＭＳ）、ガンボーグ培地（以下、Ｂ５）、変形ガンボーグ培地（以下、ｍＢ５）に置いて２４℃で暗条件で８週間培養してカルスを誘導した。

誘導されたカルスは４週間隔で新たな培地に継代維持され、４種類の培地でＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａカルスの誘導及び増殖結果を示すことを表３に示した。

表３に示したように、ＭＳ培地とＢ５培地でカルスの誘導率が最も高かったが、その後、連続した継代培養でカルスの成長が最も速かったのはＬＳ培地であった。

実施例１-２:Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養
実施例１-１の方法でＬＳ培地で４週間培養したＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａのカルス組織を利用して液体懸濁培養を誘導した。

４種類の液体培地５０ｍｌを含む２５０ｍｌの三角フラスコに生体質量約２ｇのカルスを取って外科手術用ナイフを利用して細かく切断した後に接種し、２４℃の暗条件で１１０ｒｐｍで振盪培養した。

随時に各フラスコの懸濁培養液を取って糖度計を利用して培地内残留糖を測定して培地の残留糖が１％（ｗ/ｖ）内外に落ちると新たな培地に継代を続けた。

最初２〜３継代の間には培地の褐変と細胞の酸化を防止するために０．５〜１％（ｗ/ｖ）のＰＶＰＰ、ＸＡＤ樹脂あるいは０．５％（ｗ/ｖ）活性炭を添加し、その後の継代からは、培地から除去した。

前記過程を経て誘導された本発明のＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養細胞株の中で最も生長が良くて生産性の高いＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ植物細胞株を選別してＳＹＧ-２（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｌｉｎｄｌ．ＳＹＧ-２）と命名し、２００５年６月２２日大田広域市儒城区魚隠洞５２番地に位置した韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ１０８２２ＢＰで受託された。

２〜３ヶ月間液体培地で継代維持された細胞培養液６０ｍｌを４種の新たな液体培地１８０ｍｌが入っている５００ｍｌの三角フラスコに接種して１５０ｒｐｍで懸濁培養細胞株を培養し、２日間隔で培地内残留糖及び細胞乾燥質量の変化を観察した。

細胞乾燥質量は任意に採取された植物細胞培養液を吸引ろ過器を利用してワットマン４番ろ過紙でろ過して得られた細胞を６０℃の乾燥オーブンで２４時間乾燥して測定した質量である。

４種類の液体懸濁培養培地で培養したＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養細胞株の細胞乾燥質量変化及び培地内残留糖の変化を図１と図２に示した。

その結果、早い成長に最も好ましい培地はＬＳ培地であった。

ＬＳ培地でＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａの懸濁培養細胞は培養８日目に細胞乾燥質量が１２．２ｇ/Ｌで初期接種量より３倍以上増加した。

Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養細胞の細胞成長特徴を表４に示した。

実施例１-３:植物成長ホルモンの処理
実施例１-２で得たＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａを２４℃で培養し、植物成長調節剤のα-ナフタレン酢酸（以下、ＮＡＡ）及び６-ベンジルアミノプリン（以下、ＢＡ）の量を下記表５のように培養開始時に添加して培養した後、培養後７日目に細胞乾燥質量を測定して図３に示した。

図３に示したように、Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養細胞の成長に最も好ましい植物成長調節剤の濃度はＮＡＡ１０μＭ及びＢＡ１μＭの組み合わせであることが確認された。

実施例２:Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養
実施例２-１:Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａの懸濁培養
植物成長調節剤ＮＡＡ１０μＭ及びＢＡ１μＭが処理された液体培養培地で実施例１-２の方法に従ってＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａの懸濁培養細胞株を２４℃で７日間培養した。
実施例２-２:コロソール酸の分離及び分析
７日目の実施例２-１の懸濁物から細胞を集め、次のようにコロソール酸を抽出した。
実施例２-１で培養した細胞培養液から５ｍｌの試料を取った後、遠心分離して培養液を除去し、細胞を４０℃の乾燥オーブンで２４時間以上十分に乾燥した後、乳鉢を利用して粉砕した細胞乾燥粉末１０ｍｇにメタノール１ｍｌを添加して５時間以上振って１次抽出を実施した。１次抽出が終わった試料は遠心分離してメタノール層のみ回収し、残った細胞粉末層にメタノール１ｍｌを添加して１時間振りながら２次抽出を実施した後、遠心分離してメタノール層を回収した。
前記１次抽出物と２次抽出物を混合物２ｍｌにメタノール濃度が６０乃至７０％になるように蒸溜水１ｍｌを添加した後、ＯＤＳ-カラム精製過程を実施した。
まず、ＯＤＳカラムを７０％メタノール５ｍｌに安定化させた後、試料を注入して再び７０％メタノール５ｍｌを加えて洗浄した。
その後、１００％のメタノール５ｍｌを加えてカラムに残った物質を溶離し、減圧濃縮して分析用試料を製造した。
コロソール酸の分析は高速液体クロマトグラフィーを利用して実施し、分析条件はクロモリスＲＰ１８ｅ（Ｍｅｒｃｋ社、１００ｘ４．６ｍｍ）カラムを利用して移動相として０．０５％のトリフルオロアセト酸を含有する７５％のメタノールを使用して分当り１ｍｌの流速で流し、、２１０ｎｍの波長で吸光度を分析してその結果を図４に示した。
図４は標準時料であるコロソール酸とＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養細胞のコロソール酸分析チャートを示したもので、ａ）は０．１ｍｇ／ｍｌ濃度のコロソール酸標準試料で、ｂ）はＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養細胞のメタノール抽出物である。
実施例２-３:コロソール酸生産培地の選定
実施例２-１で得た細胞株を実施例１-２に従って４種の液体培養培地で細胞株を培養し、培養後７日目に培養細胞を回収して実施例２-１の方法に従ってコロソール酸を抽出し、コロソール酸の生産性を測定した。
コロソール酸の生産量は次のような方法で定量した。
前記高速液体クロマトグラフィー分析を通じて得られたコロソール酸ピークの面積から０．０５〜１ｍｇ／Ｌコロソール酸標準物質のピーク面積から得たスタンダードカーブを利用してコロソール酸の濃度を求めた後、これから％ＤＷ（乾燥質量）含量を計算する。
％ＤＷ含量は細胞乾燥質量１ｇに含まれたコロソール酸の％比率を意味する。
計算された％ＤＷ含量に細胞培養液の細胞濃度（ｇ/Ｌ、ＤＷ）をかけて最終容積生産性（ｍｇ／Ｌ）を計算する。
前記方法によってコロソール酸の生産量を測定して、その結果を図５に示した。
図５に示したように、懸濁培養におけるＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ細胞株の生産性は培地に著しく依存している。コロソール酸生産に好ましい培地はＢ５培地及びｍＢ５培地であり、ＬＳ培地及びＭＳ培地はコロソール酸の低調な生産示した。
これは実施例１-２における細胞成長の結果とは対照的なもので、細胞成長のためとコロソール酸生産のためでは、適切な培地の条件は互いに異なることが分かった。

実施例３:二段階培養
実施例１-２で得られた細胞株５０ｍｌは、ＮＡＡ１０μＭ及びＢＡ１μＭを追加したＬＳ培地で培養し７日後に収穫して、２倍濃度のｍＢ５培地５０ｍｌと２５０ｍｌフラスコで混合して培養した。実施例２-３の方法でコロソール酸の生産性を測定した。

表６に示したように、ＬＳ培地に２５％（ｖ/ｖ）接種比で接種されて７日間培養したＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養細胞のコロソール酸生産性は２．６９％ＤＷであり、ＬＳ培地で培養された後、再び変形Ｂ５培地で７日間培養したＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養細胞のコロソール酸含量は３．６１％ＤＷに３４．２％増加した。これは容積生産性で５０９．６１ｍｇ/Ｌに相当する値である。

実施例４:高細胞密度培養によるコロソール酸生産
実施例３の方法でＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ細胞を培養し、生産段階のｍＢ５培地に炭素源として添加される蔗糖の濃度及び接種されるＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ細胞の接種比を下記表７のように異ならせて培養し、細胞の乾燥質量及びコロソール酸の生産量を実施例２-３の方法で調査して表７に示した。
表７に示したように、高濃度細胞培養によりＥｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ懸濁培養細胞は最大２３．４７ｇ/Ｌの細胞乾燥質量まで成長が可能であり、この時、コロソール酸の最大容積生産性は２６０４．１３ｍｇ/Ｌであった。

実施例５:誘導剤添加時のコロソール酸生産
実施例４の高濃度培養を含む二段階培養において、生産段階のｍＢ５培地に６％の蔗糖を添加し、細胞の接種比を６ｇ/Ｌ細胞乾燥質量にして接種し、培養初期０日または３日目に硝酸銀、酪酸ナトリウム及びジャスモン酸メチルを下記表８のような比率で培養培地に添加して１４日間培養した後、細胞の乾燥質量及びコロソール酸の生産を調査してその結果を表８に示した。

表８に示したように、２〜６μＭの硝酸銀を細胞培養液に処理する場合、懸濁培養細胞のコロソール酸含量は大きく増加し、４μＭの硝酸銀を処理した場合には最大含量は４５％増加した。
また、酪酸ナトリウムを１ｍＭと４００μＭのジャスモン酸メチルをそれぞれ処理した場合、コロソール酸含量は約１００％増加し、特に酪酸ナトリウム１．０ｍＭとジャスモン酸メチル４００μＭを同時に処理した場合にはコロソール酸の含量はさらに増加して１２８％増加し、容積生産性は２１５１．３８ｍｇ／Ｌであった。

実施例６:Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａからのコロソール酸生産
実施例６-１:Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａカルスの誘導
露地及び温室で培養したＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａの葉と幹を採取して実施例１-１の方法ｎｉ従ってＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａカルスを誘導及び増殖して表９に示した。
表９に示したように、Ｂ５培地でＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａカルスの誘導率が最も高かったが、その後、連続した継代培養で最もカルスの成長が速かったのはＬＳ培地であった。

実施例６-２:Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａの細胞懸濁培養
実施例６-１のＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａカルス組織を利用したことと第２段階にＢ５培地を使用したことを除いては、実施例１-２の方法に従って液体懸濁培養を誘導した。
Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ懸濁培養細胞の細胞特性を下記表１０に記載した。

前記過程を経て誘導された本発明の枇杷懸濁培養細胞株の中で最も生長が良くて生産性の高いＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ懸濁培養細胞株を選別してＳＹＧ-３（Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ ＳＹＧ-３）と命名し、２００５年６月２２日大田広域市魚隠洞５２番地に位置した韓国生命工学研究院生物資源センター（ＫＣＴＣ）に受託番号ＫＣＴＣ１０８２３ＢＰで受託された。
実施例６-３:バナバ懸濁培養細胞のコロソール酸生産
実施例６-２の方法に従ってＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａを培養し、培養後１４日目に培養細胞を回収した。次いで、実施例２-３の方法に従ってコロソール酸生産を測定した。ｍＢ５培地で培養されたＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａによるコロソール酸生産性を表１１に記載する。実施例２-２の方法に従ってＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ懸濁培養細胞のメタノール抽出物のコロソール酸を分析して図６に示した（図６のａ:１ｍｇ/ｍｌ濃度のコロソール酸標準試料、ｂ:Ｌａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ懸濁培養細胞のメタノール抽出物）。

表１１に示したように、ｍＢ５でのＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ懸濁培養細胞のコロソール酸の含量は０．５６％ＤＷであった。これはＬａｇｅｒｓｔｒｏｅｍｉａ ｓｐｅｃｉｏｓａ葉に存在するコロソール酸の含量である０．０１％（非特許文献１：Ｃｈｅｍ Ｐｈａｒｍ． Ｂｕｌｌ． ４１（１２）:２１２９-２１３１、１９９３）と比較した時、５６倍高い含量であることが分かった。
本発明は植物細胞の懸濁培養によってコロソール酸を量産する方法で、天然の葉で存在するコロソール酸含量より２５倍乃至５６倍ほど高い水準にコロソール酸を生産することができ、植物細胞懸濁培養の産業化において重要な容積生産性を極大化するので、健康機能食品素材及び医薬品素材として活用が可能で産業的生産に大きく寄与する。
本発明が実際的な実施例に関係づけて述べられていても、本発明が開示された実施例に限定されず、広範な変形および等価な組合せも請求範囲の精神に含まれる。

図１は実施例１-２における枇杷（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の懸濁培養細胞を４種の液体培養培地で培養した場合の細胞乾燥質量の変化を示す図面である。 図２は実施例１-２における枇杷の懸濁培養細胞を４種の液体培養培地で培養した場合の培地内残留糖の変化を示す図面である。 図３は実施例１-３における枇杷懸濁培養細胞の培養培地に植物成長調節剤であるα-ナフタレン酢酸（以下、ＮＡＡ）と６-ベンジルアミノプリン（以下、ＢＡ）の濃度を表５のように異ならせて培養した場合の、培養後７日目になる日に細胞乾燥質量を測定した図面である。 図４は実施例２-２における高速液体クロマトグラフィー分析結果を示す図面である。｛（ａ）０．１ｍｇ/ｍｌ濃度のコロソール酸標準試料、（ｂ）枇杷懸濁培養細胞のメタノール抽出物｝ 図５は実施例２-３における培養細胞を回収してコロソール酸の生産を測定した図面である。 図６は実施例６-３における高速液体クロマトグラフィー分析を通じてバナバ懸濁培養細胞のメタノール抽出物のコロソール酸を分析した図面である。｛（ａ）１ｍｇ/ｍｌ濃度のコロソール酸標準試料、（ｂ）バナバ懸濁培養細胞のメタノール抽出物｝

Claims (11)

1. （ａ）エリオボトリヤ・ヤポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の組織からカルスを誘導する段階;
   （ｂ）前記カルスから液体培地で培養可能な懸濁培養細胞株を作る段階;
   （ｃ）前記懸濁培養細胞株を懸濁培養する段階;
   （ｃ−１）前記細胞株を、誘導剤を含む培地に移して培養する段階；および
   （ｄ）前記培養段階（ｃ−１）の培養液からコロソール酸を抽出する段階；
   を含み、前記誘導剤が、０．５μＭ〜１００μＭの量の硝酸銀、１ｍＭ〜２００ｍＭの量の酪酸ナトリウムおよび０．１μＭ〜５０ｍＭの量のジャスモン酸メチルからなる群より選択される非生物的誘導剤の群より選択されることを特徴とする植物細胞懸濁培養によるコロソール酸製造方法。
2. 前記懸濁培養細胞株がエリオボトリヤ・ヤポニカ・リンドル（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｌｉｎｄｌ．）ＳＹＧ-２（受託番号ＫＣＴＣ１０８２２ＢＰ）細胞株であることを特徴とする、請求項１に記載のコロソール酸製造方法。
3. 前記（ａ）段階で植物組織をリンスマイエル-スクーグ（Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ ＆ Ｓｋｏｏｇ）培地またはムラシゲ−スクーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ ＆ Ｓｋｏｏｇ）培地に置いて培養してカルスを誘導することを特徴とする、請求項１に記載のコロソール酸製造方法。
4. 前記培地がα-ナフタレン酢酸または６-ベンジルアミノプリンをさらに含むことを特徴とする、請求項１に記載のコロソール酸製造方法。
5. 前記（ｃ）でリンスマイエル-スクーグ培地またはガンボーグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）Ｂ５培地で懸濁培養細胞株を培養することを特徴とする、請求項１に記載のコロソール酸製造方法。
6. 前記段階（ｃ−１）における培地がガンボーグＢ５培地または変形ガンボーグＢ５培地であることを特徴とする、請求項１に記載のコロソール酸製造方法。
7. 前記培養時に誘導剤を１回以上処理することを特徴とする、請求項１に記載のコロソール酸製造方法。
8. 接種細胞の初期濃度が１乃至２０ｇ/ＬＤＷであることを特徴とする、請求項１に記載のコロソール酸製造方法。
9. 前記培地が炭素源を１乃至２０％（ｗ/ｖ）含むことを特徴とする、請求項１に記載のコロソール酸製造方法。
10. （ａ）エリオボトリヤ・ヤポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の組織からカルスを誘導する段階;
    （ｂ）前記カルスから液体培地で培養可能な懸濁培養細胞株を作る段階;
    （ｃ）前記懸濁培養細胞株を懸濁培養する段階；および
    （ｃ−１）前記細胞株を、誘導剤を含む培地に移して培養する段階
    を含み、前記誘導剤が、０．５μＭ〜１００μＭの量の硝酸銀、１ｍＭ〜２００ｍＭの量の酪酸ナトリウムおよび０．１μＭ〜５０ｍＭの量のジャスモン酸メチルからなる群より選択される非生物的誘導剤の群より選択されるものである、エリオボトリヤ・ヤポニカ（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ）の植物細胞株を懸濁培養する方法。
11. 前記（ｂ）段階の植物細胞株がエリオボトリヤ・ヤポニカ・リンドル（Ｅｒｉｏｂｏｔｒｙａ ｊａｐｏｎｉｃａ Ｌｉｎｄｌ．）ＳＹＧ-２（受託番号ＫＣＴＣ１０８２２ＢＰ）細胞株であることを特徴とする、請求項１０に記載の懸濁培養方法。

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