JPH02242668A - 時宜を得た惹起による植物の代謝産物生産の最大増強 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、細胞培養物からの代謝産物の生産方法に関す
る。

〔従来の技術およびその課題］ 植物は、医薬、フルーツ香味および香気、化粧品並びに
農薬において使われる化学物質のますます重要な入手源
になってきている。これらの化学物質の多くはフェノー
ル系化合物やアルカロイド類などの二次代謝産物である
。それらの化合物の有益な効果が示されるにつれ、それ
らの化合物への関心が高まってきている。例えば、フラ
ボン類は、生体高分子（酵素）および細胞膜への結合、
重金属イオンの錯生成、並びに酵素系、例えば酸化還元
酵素系における電子伝達、並びにラジカルの掃去にあず
かることが証明されている。フラボン類は更に、顕著な
抗アレルギー活性を有する。

それらの代謝産物の抗出血・活性、血行促進活性、消炎
活性および心血管活性も証明されている。

該化学物質のほとんどは植物Ｍｉ織から直接抽出される
。しかしながら、植物の細胞培養においてそれら代謝産
物を生産せしめることへの関心が増えてきている。従来
の植物物質の農業生産を上回る細胞培養の利点が多々あ
る。植物生産物の生産を環境要因、例えば気候、植物害
虫および季節と無関係にすることが可能であり、そして
地上のどの場所でもそれらを生産できるだろう。また、
未精製の生産物の品質は、圃場で生育したものでは決し
て見られない均一性において生産できる。更に、新たに
発見されたいずれの有益な植物でも、長い農業上の繁殖
および栽培の必要なくして、すぐに培養に入ることが可
能である。しかしながら、産業におけるこの技術の利用
を支配する基準は経済性である。検討中の生産物を圃場
生産品と同じかまたはより低いコストで細胞培養技術に
より工業生産できさえすれば、バイオテクノロジー的な
細胞培養方法の実現が前進するだろう。

−次代謝産物の生産については、植物細胞は細閑または
真菌細胞のような真の微生物にはとうてい匹敵できない
。植物細胞の増殖および代謝速度は、それら微生物に比
べて遅すぎるからである。

植物の細胞培養の産業利用の機会は、高等植物によって
しか合成されない特定の価値ある低分子量または高分子
量生成物にもっばら存在するだろう。

大部分は、それらのいわゆる二次化合物の化学合成の可
能性は実現されていない。

有用な二次代謝産物の生産のための植物細胞培養の産業
利用を実現するために、生合成速度を高めることが不可
欠である。この目的に向かって、改善された生合成能力
を有する細胞系を同定するために選択技法が使用されて
いる。それらの高生産性株は、細胞培養系による代謝産
物の工業生産に利用できるには安定でなければならない
。更に、細胞培養物の増殖および生産物形成に影響を与
える要因、例えば天然または合成の植物ホルモンまたは
エフェクターも考慮に入れなければならない。

代謝産物生産を増加させる試みは、培養条件を改善する
ことにより試みられている。二次代謝産物を増加させる
ためのそのような方法の１つは、最初に細胞の増殖に適
した液体培地中で植物細胞を培養し、次いで二次代謝産
物の生産に適した改変された液体培地中で培養する段階
を要求する。

この方法は、時間を消耗し且つ面倒である。本発明は、
細胞培養物からの代謝産物生産を最大にする方法に向け
られる。

［関連文献］ 米国特許第４，７１７．６６４号は、未分化細胞の懸濁
培養を使って高等植物の二次代謝産物を生産する方法を
開示している。該培養は液体培地中で少なくとも２段階
において行われている。Ｅｄｗａｒｄら、Ｐｒｏｃ、Ｎ
ａｔ、Ａｃａｄ、ｏｆ　Ｓｃｉ、　　ＵＳＡ（１９８５
）　８２　：　６７３１−６７３５の「惹起剤処理され
た豆細胞におけるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ
ｍＲＮへの迅速な一時的誘導」という論文は、惹起剤（
ｅ　ｌ　ｉｃ　ｉ　Ｌｏｒ）で処理されたアズキ（Ｐｈ
ａｓｅｏｌｕｓ　ａｎ　ｕｌａｒｉｓ）の細胞が、フェ
ニルプロパノイド由来のフィトアレキシンの蓄積を導く
防御応答の初期の出来事としてフェニルアラニンアンモ
ニアリアーゼｍＲＮＡの合成の迅速な刺激を示すことを
開示している。Ｅｂｅｌら、Ａｒｃｈｉｖｅｓ　ｏｒ　
ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ　　ａｎｄ　ｂｉｏ　ｈ　５ｉ
ｃｓ（１９８４）％３２　：　２４０−２４８の「ダイ
ズ細胞におけるフィトアレキシン合成：フェニルアラニ
ンアンモニアリアーゼおよびカルコンシンセターゼのｍ
ＲＮＡの惹起剤による誘導並びにフィトアレキシン蓄積
との相関性」という論文は、ｇ濁培養されたダイズ細胞
において真菌惹起剤が一般のフェニルプロパノイド代謝
の酵素であるフェニルアラニンアンモニアリアーゼ、並
びにフラボノイド系路の酵素であるアセチルＣｏＡカル
ボキシラーゼおよびカルコンシンセターゼの活性の大き
な且つ迅速な増加を誘導することを開示している。

〔課題を解決するための手段］ 細胞培養物から生産される二次代謝産物のレベルを最大
にする方法が提供される。該方法は、代謝産物の生産を
刺激する惹起剤（ｅｌｉｃｉｔｏｒ）を最適な時に適用
できるように培養細胞の生理的状態を監視することを含
む。細胞外生成物についての酵素アッセイを使って、惹
起剤の添加に最適な時ル１を知ることができる。惹起後
のこの増加された二次代謝産物の生産は、細胞生存力安
定剤および／〔具体的説明］ 本発明によれば、細胞培養物からの二次代謝産物の生産
を最大にする方法が提供される。代謝産物の生産を刺激
する惹起剤を使って、植物細胞の懸濁培養の増殖期の中
の最適な時にそれらの生産を最大にすることにより、特
定の生成物の経済的に有益なレベルがもたらされる。惹
起剤の添加の時機を注意深く調節することにより、二次
代謝産物の生産が増加し、そしてそれ故に、細胞による
代謝産物収量の増加が、普通の増殖条件に比較して有意
に短縮された時間内に達成され得る。例えば、本明細書
の実施例の部は、最適な時に惹起剤を培地に添加するこ
とにより、４８時間内の二次代謝産物の生産が約６７．
４■／！から少な（とも１３７．３■／ｌに少なくとも
倍増され得ることを証明している（第２表）。更に、惹
起時に細胞生存力安定剤および／または栄養素を添加す
ることにより、増加された代謝産物生産を安定化させ、
代謝産物の生産体系をより効果的に且つ経済的にするこ
とが可能である。惹起剤の添加は、一般的なフェニルプ
ロパノイド代謝のおよびフラボノイド経路の酵素の活性
の大きく且つ迅速な増大を引き出す。

この代謝の突然の増加は、植物細胞における阻害または
有害な影響を与え得る。惹起時における細胞生存力安定
剤および／または栄養素の添加は、惹起後の生成物の形
成に伴う細胞住存力を維持しそして延長する役割を果た
す。

本発明の細胞培養物は植物の細胞培養物である。

培養において増殖または繁殖することのできるいかなる
植物種からの細胞を使用してもよい。特定の植物培養物
は、着目の代謝産物に基づいて選択されるだろう。従っ
て、着目の代謝産物を生産しそして惹起に応答するいず
れのものでも、使用に適する細胞培養物に含まれる。使
用することのできる植物の種は、制限されないが、特に
、クルミ科（ムＣ剋血並耗）、ムラサキＭ（Ｂｏμ１１
赳亜）、イチヤクソウ科（ｂ皿ｕ並肥）　、イソマツ科
（■堕勤紅閃印並）、ミソハキ科（財遣ａｒａ（殺肥）
、ナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａｅ）　、およびキンポウ
ゲ科使用する培地は、細胞の生育および増殖に適当であ
るいずれのものでもよく、リンスマイヤー−スクーグ（
Ｌｉｎｓｍａｉｅｒ−Ｓｋｏｏｇ）培地、ムラシゲ−ス
クーグ（Ｍｕｒａｓｈｉｇａｅ−３ｋｏｏｇ）培地、ガ
ンボルグ（Ｇａｍｂｏｒｇ）　らのＢ　−Ｓ　培地等を
含む。培地の広範な選択が利用可能でありそして培地の
様々な改良が可能であることがわかる。ホルモン、ビタ
ミンもしくは別の置換基の変更またはそれらの濃度の変
更が考えられ得る変化の例である。

大部分は、植物細胞はカルス、廖府、または未分化細胞
であろう。未分化細胞を得る方法は幾つかある。一般に
、根、葉、茎などの植物の部分または他の部分からの組
織試料を滅菌し、そして固形培地に添加し、そこで組織
の一部分が未分化細胞の塊またはカルスに増殖する。そ
れらの未分化細胞は！Ｑ濁培養のための接種材料を提供
する。本発明は、細胞培養作業、使用する細胞のタイプ
、細胞が誘導される組織および細胞を増殖させるのに使
用する培地において考えられうる様々な変化のいずれか
を伴っても使うことが可能である。

選択される植物細胞は、植物細胞について周知である発
酵技術のいずれかにより増殖され得る。

様々な反応系は、エアーリフト反応器、振盪フラスコ、
タービン撹拌機、カブラン水車を備えたドラフト管等を
含む。大きさのために、植物細胞は剪断ストレスに対し
て感受性であり、そして高粘性の発酵では特別な注意が
必要である。惹起の開始前の系の無菌性に対しても更に
注意を払わなければならない。

植物細胞を大スケールで−様な特定無菌培地中で増殖さ
せることができる。従って、植物細胞の大部分は比較的
均質な状態で迅速に得ることができる。培養中の植物細
胞は、完全な植物全体の細胞について観察される発育の
パターンのいずれかを必ずしも示すとは限らない。どち
らかと言えば、培養中の植物細胞は独特な発育相にある
。例えばアスパラギン酸キナーゼの様々なアイソザイム
が、異なる生育相の間にニンジンの細胞により生産され
ており　〔Ｄａｖｉｅｓら、Ｐｌａｎｔ　Ｐｈ　５ｉｏ
１．　　（１９７Ｂ）　６１アブストラクト、５２６）
そして異なる集塊の太きさの細胞についてペルオキシダ
ーゼアイソザイムの発現の変化が報告されている〔Ｖｅ
ｒｎａら、ＣａｎＪ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、　（１９７０）
　４８　：　　４４４　４４９　）　、本発明は、二次
代謝産物生産の惹起が培養サイクルの最適な時に起こる
ように、代謝活性の変化を識別する。

惹起剤の添加に最適な時期を決定するために、培養物の
生理的状態が監視される。生理的状態とは、細胞培養物
の発育相、即ち定常期、指数増殖期などを意味する。培
養物への惹起剤の添加に最適な時期は、はぼ指数増殖期
の終わりである。即ち、細胞が最適な酵素ポテンシャル
を有すると同時に惹起剤に応答するための細胞生存力を
有する時期が最適な時期である。惹起剤の添加に最適な
時期を決定する方法は、バイオマスを測定し、炭水化物
利用を測定し、そして細胞外生成物についてアッセイす
ることを含んで成る。バイオマスの生産量または細胞乾
燥重量が細胞増殖の優れた指標である。約１日間のバイ
オマスが一定であることは、一般に細胞が指数増殖期の
ほぼ終わりに到達しそして定常期に入っていることを示
す。従って、約１２時間〜約２日間、普通１日間の期間
培養物のバイオマスが一定である時の終点として指数増
殖期のほぼ終りが定義される。こうして、培養物の発育
相を決定するためにバイオマスの直接測定を使用するこ
とができる。

衰退している増殖速度は衰退している炭水化物利用速度
にも反映される。従って、炭水化物利用のレベルをモニ
ターすることを使って、惹起剤の添加に最適な時期を決
定することもできる。

しかしながら、細胞増殖に対応する細胞外生産物につい
てのアッセイ、例えば細胞外ペルオキシダーゼ活性につ
いてのアッセイは、培養物の生理的発育相を決定するた
めの別の手段を提供することが確定されている。細胞外
ペルオキシダーゼ活性についてアッセイすることは、バ
イオマス、即ち培養物の増殖を測定するための特に効果
的な、高感度の且つ経済的な手段を提供する。ナンキン
マメ　（Ａｒａｃｈｉｓ　ｈ　　ｏｌ狙）　、タバコ　
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔｏｂａｃｃｕｍ）およびタイプ
（旦ム山至ユｕ）において証明されたように、細胞培養
物における増殖と密接に近似する。従って、細胞乾燥重
量と細胞外ペルオキシダーゼ活性との間の相関性は、ペ
ルオキシダーゼ活性を直接測定することによりバイオマ
ス生産量を測定する別の新規な手段を提供する。

本発明の方法は、細胞培養物からの代謝産物のレベルを
最大することを要求する。最大にするとは、正常な増殖
条件のものに比較して短縮された時間内でのより高濃度
の代謝産物の生産を意味する。即ち、最適時に惹起剤を
細胞培養物に添加することにより、最適量の二次代謝産
物が生産されるまでの時間が縮小される。惹起を使って
、約０．１２ｇ／ｆ〜約０．１５ｇ／ｆの範囲のフェノ
ール収量が獲得できる。時宜を得た惹起、惹起の時点で
の細胞生存力安定剤の添加および／または栄養素の添加
の組合せにより、更に大きな代謝産物生産の増強が獲得
できる。

惹起は、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（Ｉ”Ａ
Ｌ）　、カルコンシンセターゼ、カルコンイソメラーゼ
のｍＲＮＡのレベルの増加をもたらす誘導過程であり、
生化学的出来事のカスケードにおける惹起剤接触に対す
る最初の応答である。この誘導過程は、一般のフェニル
プロパノイド代謝、フラボノイド生合成、ブチロカルパ
ン生合成、防御応答等の酵素活性の増加を包含する。惹
起剤により触発される誘導過程の中に含まれるのは、低
分子量二次代謝産物、即ち、約１００〜約１　、０００
ダルトン（ｄ）の芳香族化合物の合成である。惹起に起
因する代謝産物の最大収量は、通常、惹起剤への暴露の
約ＩＯ時間後〜約５日後に認められる。本発明の目的上
代謝産物の最大収量に要する時間は各細胞培養物ごとに
異なるだろうが、時間経過実験により容易に決定できる
。ダイズ細胞培養物における最大ＰＡＬ活性は、酵母炭
水化物調製物による惹起の７〜８時間後に認められ、最
大グリセオリン合成はその２〜３時間後、即ち惹起の１
０〜１２時間後に認められた。同時に、与えられた細胞
系について、異なる生産物は異なる時間に最高レベルの
蓄積を示し得る。即ち、ゴガッササゲ（Ｐｈａｓｅ−ｏ
ｌｕｓ　ｖｕｌ　ａｒｔｓ）におけるキエビトンとファ
セオリン、またはタバコ（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ）のカル
ス培養物におけるフィツベリンとフィツベロール。

惹起剤または惹起剤調製物は、生物および非生物の惹起
剤の両者を包含する。生物惹起剤は、植物−微生物相互
作用に関与する生物起源の化合物を意味する。生物惹起
剤は、一般に、細胞の防御機構として一次代謝産物を生
産するように植物を誘導する微生物細胞壁の低分子量成
分または細胞外酵素であり、そして真菌または細菌起源
のオリゴ糖、多糖、糖タンパク質および低分子量化合物
を含む、ホモジネート、濾液および抽出物を包含する。

病原性真菌、即ちフィトフソラ（助犯」仇ユ卦旦姐）、
ボトリチス（ｈ江■ｎ）、パーティシリウム（Ｖｅｒｔ
ｉｃｉｌｌｉｕｍ）等、および非病原性真菌、即ちアス
ペルギルス（ハ月ｎ山」岨）、ミクロムコール（Ｍｉｃ
ｒｏｍｕｃｏｒ）　、ロドトルラ（Ｒｈｏｄｏｔｏｒｕ
ｌａ）等が使用され得る。細菌性惹起剤はりゾビウム（
Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ）　、エルウィニア（Ｅｒｔｖｉｎ
ｉａ）　、ストレフトマイセス（Ｓｔｒｅ　ｔｏｗ　ｃ
ｅｓ）等を包含する。

第１表は、幾つかの惹起剤の例、並びにそれらの調製方
法、それらが作用する細胞培養物および生産される生産
物を示す。培養物は、惹起剤への暴露後に代謝産物の生
産の有意な増加を示す（第２表）。

非生物性惹起剤は、ストレス剤、例えばＵＶ光線、アル
カリ性度、浸透圧、重金属イオン等を包含する。非常に
様々な惹起剤が知られており、本発明の方法に使用され
得る。生産物の蓄積に最適な惹起剤の使用は、幾つかの
基準の考慮を必要とし、細胞培養ごとに最適化され得る
。それらの基準には、惹起剤特異性、惹起剤濃度、惹起
剤接触の持続期間、細胞系、惹起剤の時間推移、培養物
の発育段階、増殖調節および栄養素組成が含まれる。

いずれかの細胞培養物および特定の代謝産物にとって最
も効果的な惹起剤を決定するために、様々な惹起剤１１
製物をスクリーニングし得る。もちろん、特定の培養物
について惹起剤が知られているならば、それを使用して
もよい。１種より多くの生物性惹起剤の惹起剤調製物へ
の組合せも、生物性と非生物性惹起剤との組合せも、使
用することが可能である。

惹起剤のｉＪＩ製のためのプロトコールは既知であり、
例えばＥｉｌｅｒｔら、Ｊ、Ｐｌａｎ工」丸が土ｏ１．
　　（１９８５）１１９　：　６５−７６中に記載され
ており、この開示は引用により本明細書中に組み込まれ
る。真菌性惹起剤の調製のための１つのそのような方法
は、１　ｃｆｆｌの菌糸の切除、ホルモン不含のＢ５−
培地１００ＩＩｄｌの接種、室温での数日間の培養、お
よび培養物全体のホモジナイズに続く高圧滅菌による滅
菌を含む。惹起剤調製物は、所望であれば、分画および
精製により更に精製され得る。

二次代謝産物の生産の増大に効果的である惹起剤調製物
の量は、広範囲に異なるが、各細胞材料について決定す
ることができる。ダイズ細胞培養物における最大のグリ
セオリン合成は、酵母炭水化物調製物２０ｍｇ／ｇ細胞
乾燥重量を使って得られた。

二次代謝産物の蓄積のための惹起剤接触時間の量は、惹
起剤調製物、培養しようとする細胞系、および得ようと
する生産物に依存する。大抵は、フィトアレキシンや他
の植物防御機構の成分といった生産物を考える時には、
比較的短い暴露のみを必要とする。惹起剤接触後、蓄積
された代謝産物を放出するように細胞を触発させ、続い
て培地を交換することによるか、または細胞単離と代謝
産物のその後の抽出により、代謝産物が単離され得る。

従って一般に、惹起剤の接触は約２４時間〜約６０時間
の範囲、好ましくは約４８時間であろう。

最大の生産物蓄積を誘導するのに必要な暴露の持続時間
が比較的短いことは、実際、有益な惹起の特色である。

惹起剤は、単独で、または二次代謝産物生産を増加させ
る他の手段と組合せて使用することができる。これらの
他の手段には、生産培地の使用、二次代謝産物の形成に
正の効果を有する要因、例えばホルモンまたは他の化学
的要因の変化、並びに細胞培養物の増殖および生存力に
影響を与える要因の変化が含まれるが、これらに限定さ
れない。

惹起時における細胞生存力安定剤および／または栄養素
の添加は、それらが細胞生存力を拡張しそして惹起剤ス
トレス後に最適な二次代謝産物生産を維持するので、特
に有益であることが証明された（表および実施例の部を
参照のこと）。これらの成分は一般に代謝産物生産の効
率を改善するが、惹起から来る突然の生産物形成が植物
細胞にとって有害である場面において特に重要である。

細胞生存力安定剤は、ポリアミド、オスモライト等を含
む。ポリアミドを惹起剤と一緒に添加すると、惹起後の
ＰＡＬ活性の一時的増加が安定化され、そして惹起後の
形成される二次代謝産物の量の増加が見られる（第３表
および第４表）。ポリアミドは、約２ｍＭ〜約１０ｎ＋
Ｍ、好ましくは約５ｍＭの最終濃度に添加される。ポリ
アミンは、カダベリン、プトレシン、スペルミジン、ス
ペルミン等を意味する。テトラアミンの使用は、それら
がジーまたはトリアミンよりも効果的であるのでおそら
く好ましいだろう。ポリアミンは、植物ホルモンの適用
後に植物中に増加し、そしておそらくｃＡＭＰと同様に
第二メツセンジャーとして働くであろう。従って、培養
物への植物ホルモンの添加は、ポリアミンを増大させる
ことにより代謝の生産物形成および発育に影響を与え得
る。一般に、ポリアミンは膜の物理的および化学的性質
を調節し、それによって透過性を変える。

有機オスモライトは、浸透圧調節物質として働きそして
おそらく主としてタンパク質安定剤として機能する細胞
質成分である。有機オスモライトは、プロリン、エルゴ
ステロール、グリセロール等を包含する。惹起に伴う有
機オスモライトの添加は、二次代謝産物の対応する増加
をもたらす（第５表および第６表）。オスモライトは、
約０．５％（ｗ／ｖ）〜約２％（１へ）、好ましくは約
１％（ｉｙ／ｖ）の最終濃度で添加された時に効果的で
あることが証明された。

本発明の目的上、栄養素には多量栄養素、微量栄養素、
ビタミン、アミノ酸、ホルモン、成長調節物質、炭水化
物源等が含まれる。惹起時におけるこれらの成分のいず
れかの添加または変更が、二次代謝産物の収量の改善を
もたらす。しかしながら、特に有益な結果は、惹起剤と
一緒のカルシラム（第７表）並びにショ糖および硝酸カ
リウムの添加により達成された。カルシウムについては
、１ｍＭ〜約５ｍＭの範囲、好ましくは約２ｍＭの最終
濃度が好ましい。ショ糖およびｆｉｌ’ｌ酸カリウムに
ついては、それぞれ、約０．５％（ｗ／ｖ）〜約２％（
Ｗ／ν）の範囲、好ましくは１％（ｗ／ｖ）、および約
０゜０５（ｗ／ｖ）〜約０．３％（ｗ／ｖ）、好ましく
は０．１％（ｗ／Ｖ）の最終濃度が最適な結果を与える
。

栄養素および／または安定剤の添加は、惹起時に独立的
に使用すると代謝産物生産を改善した。

しかしながら、惹起時に１種より多くの成分を添加する
ことによりさらに多くの収量が蓄積され得る（第２表〜
第８表を参照のこと）。論じたように、細胞生存力安定
剤、ショ糖、硝酸カリウムおよび惹起剤を添加した時に
最適収量が認められた。

従って、細胞周期の最適時における惹起剤のみの添加が
二次代謝産物の生産を増大するけれども、惹起時におけ
る細胞生存力安定剤および／または栄養素の使用により
有意な増加も獲得できる。

液体の生産培地中での第二段階の培養を使った二段階培
養方法の使用（Ｚｅｎｋら、Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ
Ｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｉｔｓ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏ
ｌｏ　１ｃａｌ　Ａ　　１ｉｃａｔｔｏｎ（１９７７）
、Ｂａｒｚら（編）、ｐｐ、２７−４３および米国特許
第４，７１７．６６４号〕は、幾つかの細胞培養におい
て高レベルの二次代謝産物をもたらすことを証明してい
る。本発明は、生産培地中での第二段階の培養の必要を
回避する。特別な培養条件の負担または生産培地への細
胞の移動を伴わない代謝産物の実質的な蓄積のために惹
起過程が用意される。

しかしながら、所望であれば、惹起剤を生産培地工程と
組合せて使用し、最大の生産物蓄積に必要な培養時間を
短縮することもできる。

本明細書中では、代謝産物は惹起生産物として定義され
る。これらは、広範囲の偏在する植物構成要素、例えば
フェノール類化合物、フラボノイド、フラボン、フラボ
ノン、フィトアレキシン、ブチロカルパン、アルカロイ
ド類等を包含する。

これらの代謝産物は、プロテイナーゼ阻害剤、植物ウィ
ルス阻害剤、酵素、色素、抗腫瘍性物質、血漿抑制化合
物、抗生物質、殺精薬、抗炎症性物質等として適用され
る。代謝産物または細胞懸濁培養により生産させること
を試みる点から着目される化合物は、高等植物から誘導
される共通のおよび本質的な薬用化合物、例えばステロ
イド類、コデイン、アトロビン、レセルピン、ジコキシ
ン、モルヒネ、コルヒチン等を含む。もちろん、上記に
挙げた化合物の他に、本発明の方法により生産され得る
別の医薬用化合物が多数ある。これには、抗腫傷薬の入
手源としてのメイテヌス（ム旦並旦）、ブルセア（Ｂｒ
ｕｃｅａ）　、タクス（↑ａｘｕｓ）　、バンカリス（
Ｂａｃｃｈａｒｉｓ）等の細胞からの植物組織および細
胞の培養発酵の発展が含まれる。

医薬の他に、本発明は化粧品、農薬および植物源からの
天然の香気または香味成分において使用される化学物質
の生産に用途を見出す。望ましい芳香化合物は、はとん
どが、■または複数の不斉中心を有しそして非常に珍重
される嗅覚および味覚特性を有するテルペノイドである
。これらの化合物の化学合成は、しばしば不可能である
かまたは少なくとも経済的でない。

使用に適当である細胞培養物は、着目の代謝産物を生産
しそして惹起剤に応答するどんなものでも包含する。種
々様々な培養物の例は第９表中に列挙したものであるが
、それに限定されない。

植物細胞培養の工業化を実現可能にするためには、与え
られた生産物が発酵により単位時間あたりに生産される
収量が経済的でなければならない。

この点で重要なパラメーターは、細胞収量、生産物収量
および増殖率である。植物細胞の二次代謝産物は普通、
培地中に排出されずに液胞中に保持および貯蔵される。

液胞は、与えられた生産物が細胞内に蓄積する最大収量
についての自然の■界を与える。しかしながら、培地中
への多量のグルタチオンの排出がタバコ細胞について報
告されているように例外がある。同様に、キョウチクト
ウおよびケシの細胞の各培地においても生産物が検出さ
れた。そういった出来事は、培地中への生産物の排出ま
たは細胞の破損による漏出のためであり得るが、惹起後
の細胞の超微細構造の分析は、細胞が完全に無傷である
ことを示した。この発見は、細胞破損よりもむしろ培地
中への生産物の排出を指摘している０本来培地中に代謝
産物を排出しない細胞培養物は、それらの二次代謝産物
を放出するように化学的に誘導することができる。代謝
産物の放出を触発させるための化学的手段は、ソルビタ
ル−ト、タウロコレート、ジメチルスルホキシド等を含
む。必要ならば、それらの化合物の１つまたは組合せを
培地に添加し、二次代謝産物の放出を触発させることが
できる、従って、所望の代謝産物の単離のための一手段
は、惹起後に培養細胞を触発せしめ、貯蔵された二次代
謝産物を放出させることを含む。培地への放出後、培養
細胞を破壊することなく代謝産物を回収することができ
る。従って、本発明の好ましい態様は、細胞増殖と惹起
の循環工程を含む。惹起に続いて、必要であれば、二次
代謝産物を放出するように細胞を化学的に触発せしめ、
培地を収集し、そして培地から代謝産物を抽出する一方
で、植物細胞の再生を可能にし、次いで再惹起および再
抽出を行う。この循環は、代謝産物形成の低下が認めら
れるまで続けられる。

二次代謝産物の単離のための他の手段は、自然濾過、遠
心等による培地からの植物細胞の単離を含む、植物細胞
膜の溶解が生産物の濃縮スラリーを与え、これから所望
の化合物を単離することができる。

さらに別の態様は、細胞培養物の固定化後に惹起剤での
処理および生産物の回収のための培地の除去／交換を含
む。アルギン酸カルシウムは惹起側活性を証明されてい
るので、アルギン酸カルシウム中への細胞の閉じ込めに
続いて生産物の抽出のための培地交換を使用してもよい
。

次の実施例は例示のためであり限定のためではない。

例に および！立 ダイス細胞（ｊＴ江匣　ｗａｘ）の懸濁培養物は、ダイ
スの胚軸から作製されたカルスからＬＭ　Ｒされた。０
．５　ｐｐｍの２．４−Ｄと０．１　ｐｐｍのキネチン
が補足されたＧａｍｂｏｒｇｓ　Ｂ−５培地中で２６°
Ｃおよび１２５ｒｐｍにて暗中でダイス細胞を増殖させ
た。２０％（ｖ／ｖ）の接種材料を使って７日間ごとに
細胞を継代培養した。細胞は１５−２５細胞数の凝集塊
に成長しそして時にはより大きな集合体に成長した。全
実験は１００＃ｌｅの培地を含む２５０ｄのアーレンマ
イヤーフラスコ中でインキュベートした。どのサンプリ
ングも三重反復において行われた。

例２ 胤許乾盈側１１貫 活発に増殖している培養物１０威を増殖期間中毎日取り
出した。この試料を予め重さを量ったワットマン１濾紙
上で吸引濾過した。次いで濾紙を７０゛Ｃにて２４−３
６時間乾燥した後、再度重さを量り細胞乾燥重量を決定
した。細胞乾燥重量はｇ／ｌ培地に補正された。濾液は
保存されそしてペルオキシダーゼ活性の測定に使用され
た。

例３ 重　と　　　　との 成長周期の様々な段階からの約７０の試料を、試料をオ
ーブンに移す前に重量分析したそれらの生鮮重量とそれ
らの乾燥重量の両方を測定した。湿潤重量に対する乾燥
重量の相関性は、生鮮重量の平均４．８％が細胞乾燥重
量から成り立っていることを示した（評価の６０％が４
．６％−４，９％の範囲内にある）。

例４ ペルオキシダーゼＳ ペルオキシダーゼ活性を測定し、そして細胞乾燥重量に
関係づけた。４−アミノアンチピリンをベルオキシダー
ゼアンセイにおける水素供与体として使った。過酸化水
素の分解および該ビリンの酸化に起因する５１０ｎｎ＋
における吸光度の増加を測定することにより、反応速度
を測定した。

王皿：　１．４　ｍｌｌのフェノール／アンチピリン溶
液と１．５　ｍｉのＯ，００１７Ｍ過酸化水素とを混合
した。次いでこの溶液を３−４分間インキュベートし、
温度平衡を達成させそしてバックグラウンド反応速度を
確立した。次に０．１−の細胞外性濾液（酵素）を添加
し、そして５１０ｎｍにおける吸光度の増加を４−５分
間追跡した。活性はＡｓ＋ｏ／分として表示された。

例５ ヱＬと二ビ遣１ ５−の９５％エタノール中の０．５ｇ（生鮮重量）の細
胞（上記の相関性により決定すると２４■の乾燥重量に
相当する）を３−５分間超音波処理により粉砕した。そ
の後、内容物をベックマンＪ２ＩＣ型遠心機中で１２．
　ＯＯＯｒｐｍにて３０分間遠心した。エタノール画分
（上清）をフェノールアッセイのために保存した。

１」５欠（：　ｌＩｎ１のエタノール抽出物と１−の７
５％エタノールを５−の蒸留水中に混合した。次いで０
．５　ｍｌの５０％フォリンーシオカルト試薬を添加し
た。５分後、１ｄの５％ＮａｚＣＯ，，を添加し、そし
て反応混合物を６０分間放置しておいた。次にそれの吸
光度を７２５ｎｍにて測定した。対照は９５％エタノー
ルのみを含んだ。９５％エタノール中の様々な濃度の没
食子酸を使って標準曲線を作成した。

例６ １創Ｊ１１且 １−の無細胞培地を、Ｍｏｒｒｉｓ　（１９４Ｂ）　５
ｃｉｅｎｃｅ（１９４Ｂ）１０７　：　２５４のアント
ロン法により炭水化物についてアッセイした。５４０ｎ
ｍでのアントロン色素の吸光度の変化を測定することに
より、標準の炭水化物としてシｇ糖を使った標準曲線か
ら、炭水化物の消耗を評価した。培養上清中の全炭水化
物の量は、培地１２あたりの炭水化物のダラムで表わさ
れた。

例７ フエニルアーニンアンモニア１アーゼ　　（ＰＡＬ）１
ｇの細胞を５ｄのｐｉｔ８．８のホウ酸塩−ＩＩＣ！！
、抽出緩衝液（２５ｄホウ酸塩−１１ｃｊ２＋２ｍＭ亜
硫酸水素ナトリウム）中に？Ａ濁させた。この懸濁液を
乳鉢と乳棒で穏やかに練り、生じた混合物を超音波で処
理した（１分間；約Ｏ′Ｃにて４−５回繰返す）。

超音波破壊の間にはプローブを３０秒間水冷した。

超音波処理後、ホモジネートを１０．　ＯＯＯｒｐｍで
２０分間遠心し、次いでその上清を酵素抽出液として使
用した。

ヱヱ皇工：全量２．８ｄ中の１０Ｍホウ酸塩緩衝液（ｐ
ｉｔ　８．８　）中の１５ｐＭ　　Ｌ−フェニルアラニ
ンを、０．２−の酵素抽出液と混合し、そして３０゛ｃ
にてインキュベートした。対照は２．８　ｍｌの１００
−ホウ酸塩−１１ＣＩ！　　（ｐＨ８，８）と０．２　
ｍｌの酵素抽出液を含有し、Ｌ−フェニルアラニンを含
まなかった。最初の３０分間のインキュベーションの間
に、反応混合物の安定化の間の吸光度（２９０ｎｍ）が
ゆっくり減少した。安定化後、２９０ｎｍでの吸光度の
増加を６０分間追跡した。いずれのアッセイも三重反復
において行い、そして対応する対照値を差し引くことに
より補正した。ＰＡＬアッセイをミリユニット（ｍｕ）
として記録した。ここで１ｍｕは細胞の生重量１ｇあた
り１分あたり０．００１の吸光度の変化に匹敵する。

例８ ■引阻社悦山亘 フザリウム・ソラニ（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　５ｏｌａｎ
ｉ）　ｖａｒ。

ｐｉｓｉ、　：　ジャガイモのデキシトロース培地中で
増殖させた対数増殖後期の細胞１Ｎを遠心し、そしてそ
れらの生重量を測定した後、５０ｄのフラスコ中の２５
−の１００ｍＭ酢酸カリウム（ｐＨ５，５）中に混合お
よび再懸濁することにより細胞を破壊した。

次にこの懸濁液を高圧滅閉した。０．０５％（ｈ／ｖ）
当量の無菌の惹起剤を細胞懸濁培養物に添加した。

植物の細胞培養においてより高い生産物濃度を得るため
に、別々の増殖培地と生成物形成培地を使用することが
できる。本発明者らは、微生物惹起剤を使うことにより
、この必要を回避しそして更に最適量のフェノール類が
生産されるまでの時間を縮小させた（第２表）。この実
験では、指数増殖期の終わり（７日目）に添加された真
菌フザリウム・ソラニ・パル・パイシ（Ｆｕｓａｒｉｕ
ｍ　５ｏｌａｎｉｖａｒ、　ｐｉｓｉ、）の細胞抽出物
が８日目に最適量のフェノール類をもたらした。Ｌ−フ
ェニルアラニンアンモニアリアーゼ活性は、惹起剤の添
加の６時間後に一時的に増加した。

例９ ■　およびフェノール　ま童 指数増殖期の間の増殖パラメーターは次の方程式を使っ
て決定された。

Ｘ＝Ｘｏ　　　ｅ　　μ　ｍ１ｘ（Ｌ−Ｌｏ）上式中、
Ｘは乾燥重量である。バッチ培養における増殖は、１日
間の遅滞朋の後の１〜６日が指数増殖であった。高い接
種レベル（２０％、Ｖ／ν）のために遅滞期が短かかっ
た。指数増殖期での相対増殖速度（μヨａｘ　）は０．
２１日１であり、これは３．３日の倍加時間に相当する
。定常期に入る前に、細胞は６−９日間増殖速度衰退期
に入った。この増殖速度の衰退は炭水化物利用速度の衰
退にも反映した。炭水化物利用の速度は、接種時から７
日目までは迅速でありそしてほぼ直線であった。７日月
以後、炭水化物利用速度は２．３ｇ１１日から１．０ｇ
／ρ日にシフトした。

増殖期および定常期の間、エタノール可１容性フェノー
ル類はほぼ等量で生産された。衰退期と１２日口辺後に
はほとんどフェノール類の生産がなかった。更にその３
日後でも、フェノール類の濃度は１２２日目観察された
レベルから１５％しか増加しなかった。

例１０ 細胞増殖の指標として細胞外ペルオキシダーゼ活性の量
も調べた。ペルオキシダーゼ活性は増殖と関係があるこ
とが知られている。ペルオキシダーゼ活性のレベルの低
下（ｌｅｖｅｌｉｎｇ　ｏｆｆ）は、増殖速度論におけ
る変化、炭水化物利用速度の変化、およびフェノール類
蓄積速度の変化と同時に起こった。最も興味深い知見は
、細胞増殖の７日目の終わりに惹起剤を添加した時惹起
の結果として最適フェノール形成が触発されたというこ
とである。

７日目よりも早い惹起剤の添加は細胞質量が低いために
適当でなく、または７日目を超えると、酵素が惹起剤に
応答しなければならず、そしてペルオキシダーゼ活性に
より例示されるように、フェノール類の生産が活性を減
少させてしまうので適当でなかった。また、衰退の開始
と共に、細胞が定常期に入ると細胞分裂は減少した。

Ｌ〜フェニルアラニンアンモニア−リアーゼ（ＰＡＬ）
活性を増殖期間に渡って追跡した。ＰＡＬ活性は定常期
の開始時に増加し、これは可溶性フェノール類生産の開
始と同時に起こった。ＰＡＬはフェニルプロパノイド経
路のかぎ酵素であり、それらの化合物の多くは細胞分裂
が始まる時に形成される。

例１１ カルシウム：惹起剤と一緒に添加すると、カルシウムは
ＰＡＬ活性を増加させ、そして同時に全フェノール重量
を増加させたく第３表〜第７表）。

ＰＡＬの一時的増加は、惹起剤のみにより観察されたも
のと同様であったが全体の活性はより高かった。カルシ
ウム濃度の変化は惹起剤で媒介されるフィトアレキシン
のＭ！ｉに影響を与え、そしてキレート剤により全ての
カルシウムを除去することにより、惹起剤で媒介される
酵素誘導およびフィトアレキシン生産が削除された。

ポリアミド：スペルミジンおよびスペルミンポリアミド
は、カルシウムおよび惹起剤と一緒に添加すると、惹起
後のＰＡＬ活性の一時的増加を安定させた。それらは更
に、カルシウムと惹起剤のみを使ったものに比べて生成
されるフェノール類の量を増加させた（第３表および第
４表）。生成されるフェノール類の量はポリアミドによ
り影響され得るらしい。スペルミジンは成熟した非分裂
性細胞の寿命を延長するだけでなく、フ５、ノール類の
収量を増加させそして様々な種類のフェノール類を提供
することが観察されているＣ　Ｍｕｈｉｔｃｈら（１９
８５）拐互ｌノ膓１移ユ（１９８５）邦；２５〕。

肩」ｉオニ（至じ士仁」−：有機オスモライ１へは細胞
質の構成要素であり、浸透圧調節剤として働きそしてお
そらく主にタンパク質安定剤として働いている。この実
験で使用する有機オスモライトのプロリンは、惹起剤お
よびカルシウムの添加後のＰＡＬ活性の一時的増加を安
定させなかった。しかしながら、プロリンは、惹起剤お
よびカルシウムのみを添加したものに比べて、生産され
るフェノール類の増加をもたらした（第５表および第６
表）。

有機オスモライトであるグリセロールは、惹起剤の添加
後のＰＡＬ活性の一時的増加を安定させた。

グリセロールの添加は対応するフェノール類の増加もも
たらした（第６表）。

フェノール牲叫生庄ｄａ肘捌乙〔比扛夫ぴ１席１！帽劾
■：ダイズ（但１江吐　里）細胞懸濁液中のフェノール
類の生産は、惹起剤を、細胞生存力安定剤であるショ糖
および硝酸カリウムと共に添加した時が最も高かった（
第８表）。

［発明の効果］ 本発明の方法は細胞培養を通した二次代謝産物の生産に
幾つかの利点を付与する。二次代謝産物の生産のための
現行の方法は、細胞をまず増殖培地中で培養し、次いで
生成物形成培地中で培養する必要がある。本発明は、増
殖培地と生成物形成培地の必要を回避する。１種類の培
地のみを使用することは、代謝産物の生産の労力および
費用を減らすだけでなく、最適な量の代謝産物が生産さ
れるまでの間の時間を縮小する。

二次代謝産物の形成を増大させるための惹起剤の使用は
、組織培養による特定の化合物の生産のための強力な手
段を提供する。惹起だけにより改善された代謝産物の収
量が得られる。細胞生存力安定剤および／または栄養素
を惹起時に添加することにより、更に最大限にすること
が実現可能である。

今まで本発明を理解の明確化のために説明および実施例
により幾分詳細に記載してきたが、特許請求の範囲内で
幾つかの変更および改良を行い得ることは明白であろう
。

】」シ表 微生物惹起剤（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　５ｏｌａｎｉ　ｖ
ａｒ、ｐｉｓｉ）の添加後に可溶性フェノール類（■／
ｄ）により測定された惹起剤応答 面バＬ表 微生物惹起剤（Ｆｕｓａｒｌｕｍ　　５ｏｌａｎｉ　ｖ
ａｒ、ｐｉｓｉ）の添加後に可溶性フェノールＭ　（ｍ
ｇ　／　ｍｌ　）により測定された惹起剤応答 惹起剤 対照（無添加） ６１．７　　１２３．１　　１３７．３”６３．４　　
　６２．１　　　６７．４ａ　　Ｆｉｓｈｅｒのり、Ｓ
、Ｄ、を使ったその他全ての処理から９５％の信転水準
で有効。

全ての数値は３回の読取りの平均である。

惹起剤＋Ｃａ”＋スペルミジン 惹起剤十Ｃａ″ 惹起剤＋スペルミジン 惹起剤 対照＋Ｃａ”＋スペルミジン 対照＋Ｃａ″ 対照十スペルミジン 対照 ６３．７ ６１．８ ６３．９ ６４．６ ５９．２ ６７．３ ５８．６ ６３．７ １２７．８ １１８．７ １１６．３ １２３．６ ６３．４ ６４．６ ６１．４ ６１．６ １５８．６” １４３．６ １４１．３ １３３．７ ６２．７ ６５．３ ６３．６ ６２．３ ａ　　Ｆｉｓｈｅｒのり、Ｓ、Ｄ、を使ったその他全て
の処理から９５％の信幀水準で有効。

全ての数値は３回の読取りの平均である。

」しＬ表 微生物惹起剤（Ｐｕｓａｒｉｕｍ　　５ｏｌａｎｉ　ｖ
ａｒ、ｐｉｓｉ）の添加後に可溶性フェノール類（■／
−）により測定された惹起剤応答 ｌα１に 微生物惹起剤（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　５ｏｌａｎｉ　ｖ
ａｒ、ｐｉｓｉ）の添加後に可溶性フェノール類（■／
Ｍｌ）により測定された惹起剤応答 惹起剤＋Ｃａ″ 惹起剤＋スペルミン 惹起剤 対照＋Ｃａ″＋スペルミン 対照十Ｃａ″ 対照＋スペルミン ６９．６゜ ６３．７ ６８．７ ６３．６ ６４．８ ６１．２ １２４．２ １１８．７ １２０．３ ７０．４ ６７．３ ６２．８ １４３．３ １４０．８ １３１．４ ６９．８ ６８．１ ７０．３ 惹起剤＋Ｃａ″ 惹起剤＋プロリン 惹起剤 対照＋Ｃａ″＋プロリン 対照＋Ｃａ” 対照＋プロリン ６３．８゜ ６１．３ ６３．７ ６９．８ ６３．９ ６９．８ １１９．７ １！８．８ １２１．７ ６３．８ ６５．６ ６９．３ １４１．６ １４７．３ １３８．８ ６４．３ ６７．８ ６８．４ ａ　　Ｆｉｓｈｅｒのり、Ｓ、Ｉ］、を使ったその他全
ての処理がら９５％の信転水準で有効。

全ての数値は３回の読取りの平均である。

ａ　　Ｆｉｓｈｅｒのり、Ｓ、Ｄ、を使ったその他全て
の処理から９５％の信転水準で有効。

全ての数値は３回の読取りの平均である。

ｍ 微生物惹起剤（Ｆｕｓａｒｉｕｌｌｓｏｌａｎｉ　ｖａ
ｒ、ｐｉｓｉ）の添加後に可溶性フェノールＭ（■／ｄ
）により測定された惹起剤応答 囲」−表 微生物惹起剤（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　５ｏｌａｎｉ　ｖ
ａｒ、ｐｉｓｉ）の添加後に可溶性フェノール類（ｍｇ
／ｄ）により測定された惹起剤応答 惹起剤＋Ｃａ″＋グリセロール 惹起剤＋Ｃａ” 惹起剤＋グリセロール 惹起剤 対照＋Ｃａ″＋グリセロール 対照＋Ｃａ’″ 対照＋グリセロール 対照 ５３．４ ５４．３゜ ５９．８ ５７．４ ６１．８ ５９．６ ５７．６ ６３．４ １２３．７ １１９．３ １２９．６ １２３．８ ６３．８ ６１．７ ５９．３ ６１．８ １（ｉｏ、４” １４３．３ １５３．３ １４１．７ ６７．４ ６２．２ ５８．４ ６７．６ ａ　　Ｆｉｓｈｅｒのり、Ｓ、Ｄ、を使ったその信金て
の処理から９５％の信鎖水準で有効。

全ての数値は３回の読取りの平均である。

惹起剤 Ｃａ″ 惹起剤＋Ｃａ″″ 対照（無添加） ６３．４ ６１．３゜ ５９．７ ５８．７ １１７．４ ６３．４ １２３．７ ６１．３ １３９．８ ６４．６ １４９．８’ ６２．７ ａ　　Ｆｉｓｈｅｒのり、Ｓ、Ｄ、を使ったその信金て
の処理から９５％の信軌水準で有効。

全ての数値は３回の読取りの平均である。

ＩＬＥＬ表 微生物惹起剤（Ｆｕｓａｒｉｕｍ　　５ｏｌａｎｉ　ｖ
ａｒ、ｐｉｓｉ）の添加後に可溶性フェノール類（■／
戚）により測定された惹起剤応答 対照 ショ糖上にＮＯ。

惹起剤＋（シヨ糖十ＫＮＣｈ） 惹起剤＋Ｃａ″＋（シａ　ｔＦｆ　＋　ＫＮ（ｈ　）５
７．８ ６８．４ ６３．４ ５９．３ ６４．７ ６３．４ １５４．７ １５９．８ 惹起剤＋Ｃａ”＋（シー１糖十ＫＮｏ、）　　６５．４
　１５９．７＋プロリン 惹起剤＋Ｃａ″＋（シａ　ｔＦ’　十ＫＮＯｔ）　　５
９．６　１７４．６”＋グリセロール ａ　　Ｆｉｓｈｅｒのり、Ｓ、Ｄ、を使ったその信金て
の処理がら９５％の信軌水準で有効。

全ての数値は３回の読取りの平均である。

ジンセンゴシド アントラキノン類 ローズマリー酸 シンコニン アントラキノン類 ジオスゲニン ビスコクラウリン カフェイン アジャマリシン パニクリドＢ セルペンチン プロトピン ビスナジン グルタチオン ユビキノン−１Ｏ アルカロイド類 第」Ｌ表 Ｐａｎａｘ　　　ｉｎｓｅｎ Ｍｏｒｉｎｄａ　　ｃｉｔｒｉｆｏｌｉａＣｏｌｅｕｓ
　　ｂｔｕｍｅｉ Ｌｉｔｈｏｓ　　ｅｒｍｕｉ　　ｅｒ　　ｔｈｒｏｒｈ
ｉｚｏｎＣａｓｓｉａ　　ｔｏｒａ Ｄｉｏｓｃｏｒｅａ　　ｄｅｌｔｏｉｄｅｓΣす■ｈａ
ｎｉａ　ｃｅ　ｈａｒａｎｔｈａＣｏｆｆｅａ　　ａｒ
ａｂｉｃａ Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　　ｒｏｓｅｕｓＡｎｄｒｏ
　　ｒａ　　ｈｉｓ　　ａｎｉｃｕｌａｔｅＣａｔｈａ
ｒａｎｔｈｕｓ　　ｒｏｓｅｕｓＭａｃｌｅａ　　ａ　
　ｍ１ｃｒｏｃａｒ　　ａＡｍｍｉ　　ｖｉｓｎａ　　
ａ Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　　ｔａｂａｃｕｍＮｉｃｏｔｉａ
ｎａ　　ｔａｂａｃｕｍＣａｔｈａｒａｎｔｈｕｓ　　
ｒｏｓｅｕｓアルカロイド類 カテコール類 カテコール類 カテコール類 アルテミシアン ベタシアニン Ｓｏｌａｎｕｍ　　ｌａｃｉｎｔａｔｕｍ！１ｅｘ　　
　ｕ　　ｅｓｃｅｎｓ Ａｒｔｅｍｉｓｉａ　　ｃａ　　１ｌｌａｒｉｓＳａｌ
ｖｉａ　　ｍ１ｌｔｉｏｒｒｈｉｚａ八ｒｔｅｍｉｓｉ
ａ　　ａｎｎｕａ Ｂｅｔａ　　ｖｕｌ　　ａｒｉｓ ベルベリン バニリン Ｃｏ　　Ｕｓ　　’ａ　　ｏｎｉｃａ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、植物細胞培養物からの二次代謝産物の生産を増大さ
   せる方法であって、 生産培地中の植物細胞を指数増殖期のほぼ終りまで増殖
   させ； 前記培地に、二次代謝産物の生産を増大させる量におい
   て惹起剤調製物を添加し；そして 少なくとも一種の二次代謝産物を単離する；ことを含ん
   で成る方法。 ２、前記指数増殖期のほぼ終りが、細胞外生産物をモニ
   タリングすることにより決定される、請求項１に記載の
   方法。 ３、前記モニタリングが、細胞外ペルオキシダーゼ活性
   についてアッセイすることを含んで成る、請求項２に記
   載の方法。 ４、植物細胞培養物からの二次代謝産物生産を増大させ
   る方法であって、 生産培地中の植物細胞を指数増殖期の少なくともほぼ終
   りまで増殖させ； 前記培地に、二次代謝産物の生産を増大および安定させ
   る量において惹起剤調製物並びに少なくとも一種の細胞
   生存力安定剤および栄養素を添加し；そして 少なくとも一種の二次代謝産物を単離する；ことを含ん
   で成る方法。 ５、前記生存力安定剤がポリアミンおよびオスモライト
   を含んで成る、請求項４に記載の方法。 ６、前記オスモライトがプロリン、エルゴステロールお
   よびグリセロールから選択される、請求項５に記載の方
   法。 ７、前記栄養素がショ糖、カルシウムおよび硝酸カリウ
   ムから選択される、請求項５に記載の方法。 ８、前記添加段階が、惹起剤調製物、カルシウム、ショ
   糖、硝酸カリウム、並びにスペルミン、スペルミジン、
   プロリンおよびグリセロールのうちの少なくとも１つの
   添加を含んで成る、請求項４に記載の方法。 ９、前記二次代謝産物がフラボノイド、フラボン、フラ
   ボノン、フィトアレキシン、ブテロカルビンおよびアル
   カロイドから選択される、請求項１または４に記載の方
   法。 １０、前記植物培養物が、ムラサキ科（Ｂｏｒａｇｉｎ
   ａ−ｃｅａｅ）、イチヤクソウ科（Ｐｙｒｏｌａｃｅａ
   ｅ）、クルミ科（Ｊｕｇｌａｎｄａｃｅａｅ）、イソマ
   ツ科（Ｐｌｕｍｂａｇｉｎａｃｅａｅ）、ミソハギ科（
   Ｌｙｔｈｒａｃｅａｅ）、キンポウゲ科（Ｒａｎｕｎ−
   ｃｕｌａｃｅａｅ）およびナス科（Ｓｏｌａｎａｃｅａ
   ｅ）から選択される、請求項１または４に記載の方法。