RU2360964C1 - КУЛЬТУРА КОРНЯ Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) - ПРОДУЦЕНТ ИЗОФЛАВОНОВ - Google Patents
КУЛЬТУРА КОРНЯ Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) - ПРОДУЦЕНТ ИЗОФЛАВОНОВ Download PDFInfo
- Publication number
- RU2360964C1 RU2360964C1 RU2008103978/13A RU2008103978A RU2360964C1 RU 2360964 C1 RU2360964 C1 RU 2360964C1 RU 2008103978/13 A RU2008103978/13 A RU 2008103978/13A RU 2008103978 A RU2008103978 A RU 2008103978A RU 2360964 C1 RU2360964 C1 RU 2360964C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- hed
- culture
- roots
- root
- isoflavons
- Prior art date
Links
Images
Landscapes
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Изобретение относится к области физиологии растений, биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности. Культура корня Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) обладает всеми признаками pRi Т-ДНК трансформированных корней, а именно интенсивным ростом на питательных средах простого состава, не содержащих фитогормоны, плагиотропным ветвлением корней, а также генетической и биохимической стабильностью, способностью к синтезу видоспецифичных изофлавонов. Химический анализ вторичных метаболитов подтверждает, что он сохраняет способность к синтезу изофлавонов - ононина, гликозида тексазина, малонилононина, формононетина, характерных для корней целого растения. 7 ил., 1 табл.
Description
Изобретение относится к области физиологии растений, биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано в фармацевтической промышленности.
Копеечник чайный (Hedysarum theinum Krasnob.) - многолетнее травянистое растение, называемое также красным корнем, относится к семейству бобовых (Fabaceae) и к роду Hedysarum (Черепанов С.К. Сосудистые растения России и сопредельных государств (в пределах бывшего СССР). - Санкт-Петербург: изд. «Мир и семья». 1995).
Корни копеечника чайного находят широкое применение в народной медицине Сибири и используются как болеутоляющее, кроветворное, противовоспалительное и диуретическое средство (Володарская С.Б., Винокурова Е.Ю., Шульц Э.Э. К химическому изучению копеечника чайного. Физиолого-биохимические аспекты изучения лекарственных растений. Материалы международного совещания, посвященного памяти В.Г.Минаевой. 15-18 апреля 1998 года. 1998. Новосибирск. С.18-19).
Ценные целебные свойства растения, ограниченность его произрастания, а также отсутствие четких морфологических признаков, позволяющих безошибочно выявлять копеечник чайный из природной популяции растений рода Hedysarum, являются предпосылками для разработки биотехнологических приемов культивирования клеток растения в условиях in vitro, причем наиболее перспективным может быть введение в культуру именно корней этого растения.
Известны методы культивирования тканей in vitro других видов копеечника - копеечника забытого и копеечника альпийского (Ляпкова Н.С., Хадеева Н.В., Шаин С.С., Майсурян А.Н. Разработка методов культивирования тканей копеечника in vitro. Биотехнология, 1999, №1, с.55-61). Авторам удалось получить каллусные ткани листового, стеблевого и корневого происхождения, а также изолированные корни этих растений.
Однако культивирование недифференцированно растущих клеток растений не всегда гарантирует сохранение биосинтеза видоспецифичных соединений в условиях in vitro. Кроме того, выращивание клеточных культур, а также культивирование изолированных корней на питательной среде, содержащей фитогормоны, существенно ограничивает вероятность дальнейшего использования получаемой растительной массы и тем самым снижает ценность метода.
Учитывая редкость этого растения и сложность его видовой идентификации в биоценозах, полученную культуру корня Hedysarum theinum Krasnob. можно рассматривать как потенциальный источник экологически чистого сырья и как возможный способ размножения и сохранения этого растения.
Задачей изобретения является получение культуры корня Hed.th., интенсивно растущей в условиях in vitro на безгормональных питательных средах, сохраняющей способность к синтезу изофлавонов, характерных для корней целого растения, и обладающей генетической и биохимической стабильностью, для контролируемого выращивания лекарственного сырья в любое время года.
Поставленная задача решается созданием новой культуры корня Hedysarum theinum Krasnob., депонированной в Коллекции генетически трансформированных корней растений при Институте физиологии растений РАН - под обозначением Hed.th. - продуцента изофлавонов: ононина, гликозида тексазина, малонилононина, формононетина.
Видовая принадлежность культуры корня Hed.th. - Hedysarum theinum Krasnob.; происхождение культуры корня Hed.th. - семядоли ювенильных растений, трансформация pRi Agrobacterium rhizogenes, штамм А 4; культурально-морфологическая характеристика культуры корня Hed.th. - плагиотропно растущие и интенсивно ветвящиеся корни; условия выращивания культуры корня Hed.th. - на среде Гамборга (без фитогормонов) при температуре +22-25°С в условиях качания (90 об/мин), погруженная культура; процедура пересева - отделение кончиков корней через 7 недель (эксплант ~250 мг на 70 мл питательной среды); консервация - на агаризованной питательной среде Гамборга при комнатной температуре; при контроле контаминации в культуре корня Hed.th. бактерии и грибы не обнаружены; контроль видовой идентичности культуры корня Hed.th. - синтез видоспецифичных изофлавонов: ононина, гликозида тексазина, малонилононина, формононетина.
Изобретение иллюстрируется следующим примером.
Пример
При получении культуры корня Hed.th. путем pRi Т-ДНК трансформации используют стерильные проростки этого растения, выращенные из стерильных семян, с первыми двумя настоящими листочками. Стерилизацию обезжиренных этиловым спиртом семян проводят концентрированной серной кислотой в течение 3 мин, после чего их тщательно отмывают стерильной дистиллированной водой. Простерилизованные семена помещают в чашки Петри на агаризованную питательную среду Стрита (Смирнов А.М. Рост и метаболизм изолированных корней в стерильной культуре. - М.: Наука, 1970. С.92). Выдерживают семена в течение 4-5 дней при 26°С в темноте для их прорастания, после чего неконтаминированные проростки переносят в биологические пробирки на питательную среду того же состава. Выращивание ювенильных растений проводят при температуре 26°С на свету (12-часовое освещение люминесцентными лампами). После появления пары настоящих листьев надземную часть проростков отделяют, разрезают на сегменты, которые после осторожного накалывания иглой инсулинового шприца помещают в жидкую питательную среду Мурасиге и Скуга (МС), содержащую суспензию 48-часовой почвенной бактерии. Для инокуляции эксплантов проростков используют дикий (не модифицированный) штамм Agrobacterium rhizogenes (A 4). После инкубации обработанные сегменты промывают стерильной средой и переносят на агаризованную питательную среду МС, не содержащую гормонов с добавлением антибиотика (клафоран - 500 мг/мл) для элиминирования бактерии. Через 3-4 недели на семядолях в зонах поранения появляются плагиотропно растущие корни, что является морфологическим признаком успешной генетической трансформации (фиг.1а). Эти трансформированные участки отделяют и пересаживают на агаризованную питательную среду Гамборга (В5), содержащую уменьшенную дозу антибиотика (250 мг/мл) (фиг.1б). После 3-5 пассажей (период между пассажами составляет 5-7 недель) корневых эксплантов на агаризованной среде и достижения полной аксеничности культуры корня Hed.th. часть экспланта переносят в жидкую питательную среду того же состава, не содержащую антибиотик (фиг.2а), и выращивают в условиях качания (90 об/мин) в темноте при температуре 26°С. Исключение антибиотика после элиминирования бактерии приводит к стимуляции роста корней.
К настоящему времени культура корня Hed.th. растет стабильно, образуя массу рыхло переплетенных корней (фиг.2а, б). Для поддержания непрерывного роста культуры корня в период 6-8-недельного интервала между пересадками в культуральные колбы регулярно добавляют свежую питательную среду, что позволяет выращивать лекарственное сырье в контролируемых условиях в любое время года. Культура корня Hed.th. обладает всеми признаками pRi Т-ДНК трансформированных корней, а именно интенсивным ростом на питательных средах простого состава, не содержащих фитогормоны, плагиотропным ветвлением корней, а также генетической и биохимической стабильностью. По своей анатомии, морфологии и биохимии такие корни сопоставимы с корнями ювенильных растений, так как они не имеют вторичного роста, способствующего утолщению корней. Химический анализ вторичных метаболитов культуры корня Hed.th. подтверждает, что полученная культура корня сохраняет способность к синтезу вторичных метаболитов, характерных для корней целого растения. Основными вторичными метаболитами культуры корня Hed.th. являются изофлавоны. Профиль высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) метанольного экстракта культуры корня Hed.th. имеет большое сходство с профилем соответствующего экстракта корней проростков копеечника по времени удерживания (Rt) детектируемых веществ (фиг.3) и по УФ-спектрам их поглощения (фиг.4). В результате многократно проведенного препаративного разделения метанольного экстракта культуры корня Hed.th. выделены и очищены 4 вещества, которые на основании данных 1Н- и 13С-ЯМР-спектрометрии идентифицированы как изофлавоны группы формононетина: ононин, гликозид тексазина, малонилононин, формононетин (таблица), причем первые два вещества входят в состав смеси, представленной компонентом 1 на ВЭЖХ (фиг.3б). Структуры выделенных и идентифицированных вторичных метаболитов культуры корня Hed.th. представлены на фиг.5.
Claims (1)
- Культура корня Hedysarum theinum Krasnob., депонированная в Коллекции генетически трансформированных корней растений при Институте физиологии растений РАН - под обозначением Hed.th. - продуцент изофлавонов: ононина, гликозида тексазина, малонилононина, формононетина.
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008103978/13A RU2360964C1 (ru) | 2008-02-07 | 2008-02-07 | КУЛЬТУРА КОРНЯ Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) - ПРОДУЦЕНТ ИЗОФЛАВОНОВ |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
RU2008103978/13A RU2360964C1 (ru) | 2008-02-07 | 2008-02-07 | КУЛЬТУРА КОРНЯ Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) - ПРОДУЦЕНТ ИЗОФЛАВОНОВ |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2360964C1 true RU2360964C1 (ru) | 2009-07-10 |
Family
ID=41045738
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2008103978/13A RU2360964C1 (ru) | 2008-02-07 | 2008-02-07 | КУЛЬТУРА КОРНЯ Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) - ПРОДУЦЕНТ ИЗОФЛАВОНОВ |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
RU (1) | RU2360964C1 (ru) |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2446670C1 (ru) * | 2010-11-13 | 2012-04-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Томский государственный университет" (ТГУ) | СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ EX SITU ВЫСОКОГОРНОГО РАСТЕНИЯ Hedysarum theinum krasnob. |
RU2547593C2 (ru) * | 2013-08-14 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | Способ размножения копеечника чайного (hedysarum theinum krasnob.) |
RU2605912C1 (ru) * | 2016-03-02 | 2016-12-27 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ, НИ ТГУ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КОРНЕЙ Silene linicola К1601 - ПРОДУЦЕНТА ЭКДИСТЕРОИДОВ |
RU2714403C1 (ru) * | 2019-03-22 | 2020-02-14 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) | Способ получения корневой культуры in vitro potentilla alba l. - продуцента флавоноидов |
EA035296B1 (ru) * | 2017-11-17 | 2020-05-26 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова" | Способ получения in vitro корней phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol. |
RU2787746C1 (ru) * | 2022-08-03 | 2023-01-12 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Способ получения каллусной культуры Hedysarum alpinum L. |
-
2008
- 2008-02-07 RU RU2008103978/13A patent/RU2360964C1/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
ЛЯПКОВА Н.С. и др. Разработка методов культивирования тканей копеечника in vitro. Биотехнология, 1999, №1, с.55-61. СМИРНОВ A.M. Рост и метаболизм изолированных корней в стерильной культуре. - М.: Наука, 1970. с.92. КРАСНОБОРОДОВ И.М., АЗОВЦЕВ Г.Р., ОРЛОВ В.П. Новый вид рода Hedysarum (Fabaceae) из Южной Сибири. Ботанический журнал, 1985, т.70, с.968-973. * |
Cited By (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2446670C1 (ru) * | 2010-11-13 | 2012-04-10 | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Томский государственный университет" (ТГУ) | СПОСОБ ВЫРАЩИВАНИЯ EX SITU ВЫСОКОГОРНОГО РАСТЕНИЯ Hedysarum theinum krasnob. |
RU2547593C2 (ru) * | 2013-08-14 | 2015-04-10 | Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Алтайский государственный университет" | Способ размножения копеечника чайного (hedysarum theinum krasnob.) |
RU2605912C1 (ru) * | 2016-03-02 | 2016-12-27 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Национальный исследовательский Томский государственный университет" (ТГУ, НИ ТГУ) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КОРНЕЙ Silene linicola К1601 - ПРОДУЦЕНТА ЭКДИСТЕРОИДОВ |
EA035296B1 (ru) * | 2017-11-17 | 2020-05-26 | Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Северо-Восточный федеральный университет имени М.К. Аммосова" | Способ получения in vitro корней phlojodicarpus sibiricus (steph.) к.-pol. |
RU2714403C1 (ru) * | 2019-03-22 | 2020-02-14 | федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Кемеровский государственный университет" (КемГУ) | Способ получения корневой культуры in vitro potentilla alba l. - продуцента флавоноидов |
RU2787746C1 (ru) * | 2022-08-03 | 2023-01-12 | Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Томский национальный исследовательский медицинский центр Российской академии наук" (Томский НИМЦ) | Способ получения каллусной культуры Hedysarum alpinum L. |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
Gupta et al. | Callusing in Stevia rebaudiana (natural sweetener) for steviol glycoside production | |
Shohael et al. | Application of bioreactor system for large-scale production of Eleutherococcus sessiliflorus somatic embryos in an air-lift bioreactor and production of eleutherosides | |
CN107094625B (zh) | 一种南方红豆杉组织培养种苗繁育方法 | |
US6713303B2 (en) | Method for the mass propagation of adventitious roots of ginseng, camphor ginseng and wild ginseng by tissue culture and the improvement of their saponin content | |
RU2360964C1 (ru) | КУЛЬТУРА КОРНЯ Hed.th. (Hedysarum theinum Krasnob.) - ПРОДУЦЕНТ ИЗОФЛАВОНОВ | |
Tasheva et al. | Role of biotechnology for protection of endangered medicinal plants | |
Adhikari et al. | Induction and proliferation of in vitro mass of callus of Withania somnifera (L.) Dunal | |
RU2605912C1 (ru) | СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КУЛЬТУРЫ ИЗОЛИРОВАННЫХ КОРНЕЙ Silene linicola К1601 - ПРОДУЦЕНТА ЭКДИСТЕРОИДОВ | |
Vdovitchenko et al. | Artificial seeds as a way to produce ecologically clean herbal remedies and to preserve endangered plant species | |
KR101467661B1 (ko) | 생리활성물질의 함량이 증가된 섬오갈피 부정근의 배양방법 | |
Shatnawi et al. | Antimicrobial activity and micropropagation of some rare and endangered plants of Jordan | |
EA020503B1 (ru) | Штамм культуры корня шлемника андрахновидного (scutellaria andrachnoides vved.) scut. andr. (hrc) - продуцент вогонозида и актеозида | |
Musbah et al. | Effects of feeding tyrosine or phenylalanine on the accumulation of polyphenols in Coleus Blumei in Vivo and in Vitro. | |
Nihayati et al. | Comparative assessment of The Effect of Moringa oleifera Leaf Extract (MLE) and Zeatin on invitro Regeneration Response of Pogostemon cablin Bud Explants | |
Fiasal et al. | Effect of some plant hormones on growth of Mentha piperita L. in vitro. | |
KR100398749B1 (ko) | 생물공학적인 기술에 의한 산삼 묘목의 대량생산방법 | |
KR100294656B1 (ko) | 배양기 내에서 직접배발생을 통한 가시오갈피 묘목의 미세 번식방법 | |
Shohael et al. | Effects of Murashige and Skoog medium strength on germination and secondary metabolites production of Eleutherococcus senticosus's somatic embryos in bioreactor. | |
JPS61205427A (ja) | 掌状葉大黄の茎頂培養法 | |
JP4686716B2 (ja) | 植物における二次代謝物の産生を増大せしめる方法 | |
KR20210035601A (ko) | 메틸자스모네이트 처리를 통한 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법 | |
KR20200042701A (ko) | 쿠메스트롤 함량이 증가된 콩과 식물 배양근의 생산 방법 | |
RU2714403C1 (ru) | Способ получения корневой культуры in vitro potentilla alba l. - продуцента флавоноидов | |
RU2787746C1 (ru) | Способ получения каллусной культуры Hedysarum alpinum L. | |
Kant et al. | Insect induced plant galls in tissue culture |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20100208 |