KR101520477B1

KR101520477B1 - 산겨릅나무 유래 식물세포 배양 추출물의 제조방법 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101520477B1
Application number: KR1020120145376A
Authority: KR
Inventors: 김창헌; 김진아; 김문숙; 송재영
Original assignee: 주식회사 삼양바이오팜
Priority date: 2012-12-13
Filing date: 2012-12-13
Publication date: 2015-05-14
Also published as: KR20140076865A; WO2014092488A2; WO2014092488A3

Abstract

본 발명은 산겨릅나무 (Acer tegmentosum Maxim)의 식물세포의 배양물을 제조하는 방법, 식물세포 배양물의 추출물을 제조하는 방법, 상기 추출물의 간질환 예방, 개선, 및 치료용 약학 조성물과, 간 독성 치료, 간 기능 보호 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

Description

산겨릅나무 유래 식물세포 배양 추출물의 제조방법 및 이의 용도{PLANT CELL CULTURE OF ACER TEGMENTOSUM AND USE THEREOF}

본 발명은 산겨릅나무 (Acer tegmentosum Maxim)의 식물세포의 배양 추출물을 제조하는 방법, 상기 식물세포의 배양물로부터 얻어진 추출물의 간질환 예방, 개선, 및 치료용 약학 조성물과 간기능 보호 및 개선용 식품 조성물에 관한 것이다.

산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim.)는 단풍나무과에 속하는 식물로서 한국 및 중국 동북부 고산지대의 계곡에서 자라는 낙엽소교목이다 (이창복: 대한식물도감, 향문사, 서울, 522, 1993). 산청목 및 벌나무라고도 불리며, 잎은 넓고 어린 줄기는 연한 녹색이며 줄기가 매우 연하여 잘 부러지며 껍질이 두껍고 재질은 희고 가볍다. 산겨릅나무는 독성이 없으므로 어떤 체질에도 부작용이 거의 없는 약재이며, 맛이 담백하여 청혈제 (淸血劑)와 이수제(利水劑)로도 쓰인다.

또한 산겨릅나무 추출물은 다양한 이차대사산물을 함유하고 있으며, 암세포 성장 억제 효과 (J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 49(4): 322-327, 2006), 항산화 및 지질 과산화 억제 효과 (Korean J. Medicinal Crop Sci. 15(4): 296-303, 2007), 위염 및 소화성 궤양 치료 효과 (한국특허등록 0927101호), 간 보호 효과 (Korean J. Oriental Physiology & Pathology 22(6):1525∼1531, 2008) 등이 있다고 보고된 바 있다.

상기한 바와 같이, 산겨릅나무 및 이의 추출물 등은 다양한 약리학적 효과가 알려져 있고, 의약품 또는 기능성 식품으로의 응용에 관한 연구가 진행되어 왔지만, 한정된 식물자원과 천연 식물체의 낮은 유효물질 함량으로 인해 산업적 활용이 어려운 실정이다.

산겨릅나무 및 이의 추출물을 얻는 방법은, 식물을 직접 재배하고 추출, 정제함으로써 이루어지고 있는데 이는 지리적, 기후적, 정책적 영향을 받으며 재배환경의 변화에도 크게 영향을 받는다는 단점이 있다. 특히 식물재배로 추출할 수 있는 생산량이 매우 적고, 대부분의 식물유래 유용물질들은 여러 단계의 생합성 경로를 거쳐 복잡한 구조로 생성되기 때문에 화학적인 합성 방법을 이용하기 어려워 식물세포배양 기술을 통한 유용 이차대사산물의 대량생산은 산업적 활용을 위한 유용한 대안으로 평가받고 있다. 그러나 현재까지 산겨릅나무의 세포배양과 이를 이용한 산업적 응용은 보고된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 산겨릅나무로부터 식물세포배양을 유도하고, 자연산 산겨릅나무에 비해 이차대사산물의 함량이 증가된 산겨릅나무 세포의 배양물을 대량으로 얻을 수 있는 산겨릅나무 유래 식물세포의 배양 추출물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 산겨릅나무 유래 식물세포를 배양하여 얻어진 배양물, 또는 이의 추출물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 산겨릅나무 유래 식물세포가 생산하는 이차대사산물을 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가 목적은 산겨릅나무 유래 식물세포, 바람직하게는 수탁번호 KCTC 12257BP을 갖는 식물 세포를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 상기 식물세포의 배양물로부터 얻어진 추출물을 포함하는 간질환 예방, 개선, 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 추가적인 목적은 상기 식물세포의 배양물로부터 얻어진 추출물을 포함하는 간 기능 보호 및 개선용 식품 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 또한 살리드로사이드를 포함하는 간질환 예방, 개선, 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.

상기와 같은 과제를 달성하고자, 본 발명의 일 구현예는 (a) 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim)의 조직을 캘러스 유도 배지에 접종하여 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 캘러스로부터 액체 배지에서 배양 가능한 식물세포를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 식물세포를 액체 배지에서 배양하여 배양액을 수득하고 이의 추출물을 제조는 단계를 포함하는, 산겨릅나무 식물세포의 배양 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

상기 식물세포의 배양 추출물은 용매추출법, 유기용매를 이용한 분배 추출법, 및 칼럼 크로마토그래피를 이용한 분획추출법으로 이루어진 군에서 선택된 1종이상의 추출법으로 얻어진 용매 추출물, 분배 추출물, 또는 분획 추출물일 수 있으며, 상기 추출물은 바람직하게는 이차대사산물, 예를 들면 살리드로사이드를 0.1 내지 99.9%의 양으로 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구현예는 (a) 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim)의 조직을 캘러스 유도 배지에 접종하여 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 캘러스로부터 액체 배지에서 배양 가능한 식물세포를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 식물세포를 액체 배지에서 배양하여 배양액을 수득하고 이의 추출물을 제조는 단계를 포함하는, 상기 식물세포의 배양물로부터 상기 식물세포가 생산한 이차대사산물을 회수하는 단계를 포함하는 이차대사산물을 생산하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 상기 용매 추출물, 분배 추출물, 또는 분획 추출물에는 이차대사산물이 높은 농도로 포함되어 있으며, 바람직하게는 상기 이차대사산물은 살리드로사이드이다.

본 발명은 다양한 약리 효능을 가지고 있는 살리드로사이드를 고함량으로 생산하는 산겨릅나무의 세포배양을 이용하여 고품질의 산겨릅나무 세포배양 추출물 및 이로부터 얻어지는 살리드로사이드를 산업적으로 생산할 수 있는 방법을 제공함으로써, 간기능 보호 및 간독성 치료 기능의 의약품 소재 또는 간기능 보호 및 개선 기능의 기능성 식품 소재로 활용이 가능하여 산업적 생산에 크게 기여할 수 있다.

이하에서는, 상기 산겨릅나무 식물세포의 배양 추출물을 제조하는 방법을 단계별로 구체적으로 설명하고자 한다.

A. 산겨릅나무의 조직으로부터 캘러스를 유도

본 발명의 일 구현예에서, 식물세포를 제조하기 위해서는 식물 조직으로부터 캘러스를 유도하며, 이 단계에서 선택되는 산겨릅나무의 조직은, 모든 살아있는 조직, 예를 들어 유묘, 잎, 줄기, 뿌리, 꽃, 종자, 미성숙 배아, 멸균된 종자로부터 발아된 어린 유묘 및 식물체 각 기관의 형성층 조직 등을 사용할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

캘러스 유도 및 캘러스 증식을 위한 방법은 당업계에 일반적으로 알려진 방법으로 수행할 수 있다. 구체적인 예로서, 캘러스는 산겨릅나무, 바람직하게는 산겨릅나무의 유묘, 잎, 줄기 등에서 유도되며, 상기의 식물 재료를 깨끗한 물과 소독제, 예를 들어 차아염소산염, 습윤제, 트윈 (Tween) 또는 트리톤 (Triton), 항생제, 및/또는 항진균제를 사용하여 철저히 세척함으로써 식물 조직의 표면을 살균할 수 있다. 일반적으로, 표면 살균된 식물 재료는 아래에서 보다 상세하게 설명되는 캘러스 유도 및 증식을 위한 고체 배지의 표면 상에 두고, 멸균 환경에서 약 1-12주 동안 비분화된 세포의 덩어리 (캘러스)가 식물재ㅔ에 유사하게 성장할 때까지 배양한다. 캘러스 배양이 확립된 후에는 탈분화된 세포 부위를 신선한 배지로 옮겨 배양을 지속한다.

본 발명의 바람직한 일 예에 있어서, 상기 캘러스 유도 및 증식 배지로서 표 1에 기재된 바와 같은 LS(Linsmeier-Skoog), MS(Murashige and Skoog's), B5(Gamborg) 및 SH(Schenk and Hildebrandt)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 LS 배지 또는 B5 배지를 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

상기의 캘러스 유도 및 증식 배지는 식물성장 조절물질, 고형화제, 항갈변제 및 항산화제 등의 1종 이상의 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 고형화제는 예를 들어 한천, 히드로겔, 젤라틴, 젤라이트 및 피타젤을 포함한다. 또한 상기의 배지는 배지의 갈변화 및 식물 재료 및 캘러스 세포의 괴사를 막는 성분들을 더욱 포함할 수 있으며, 예를 들면 XAD 수지류, polyvinylpolypyrrolidone (PVPP), 및 활성탄 등의 항갈변제이다. 배지에 첨가되는 이러한 성분들은 현탁 배양세포 유도과정에서 스트레스에 직면한 식물 세포가 분비하는 폐놀계 화합물을 흡착하여 식물 세포의 성장을 촉진하고 안정적인 현탁 배양세포 유도에 기여할 수 있다. 또한 상기 배지에 산화 방지를 목적으로 항산화제 성분을 첨가할 수 있다.

상기 캘러스 배양의 유도와 증식에 적절한 생육온도는 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 20 내지 30℃일 수 있으며, 바람직하게는 22 내지 27℃일 수 있다. 상기 캘러스 배양의 유도와 증식에 적절한 pH 범위는 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 바람직한 pH는 5 내지 7 일 수 있으며, 더 바람직하게는 5 내지 6 일 수 있다. 상기 캘러스 배양의 유도와 증식에 적절한 배양시간은 특별히 제한되지는 않으며, 예를 들면 1 내지 12주, 바람직하게는 7 내지 9주일 수 있다. 상기 캘러스를 유도하기 위해서는 인공적인 광원을 통해 시간과 빛의 세기를 조절하는 명조건과 빛을 제공하지 않는 암조건에서 배양할 수 있으며, 바람직하게는 암조건에서 배양할 수 있다.

B. 상기 캘러스로부터 식물세포 제조

캘러스가 충분하게 성장한 경우 이로부터 현탁 배양 세포주를 유도할 수 있다. 이는 상기 캘러스를 액체 배지로 옮겨 액체 현탁 배양을 실시하며, 상기 액체배지에서 2 내지 3주간 배양한 세포 배양액은 동일 조건의 배지에 접종하여 계속적으로 계대 배양할 수 있다.

상기와 같이 제조된 산겨릅나무의 캘러스로부터, 배양 및 현탁 배양을 포함하는 산겨릅나무의 세포배양은 성장이 좋고, 이차대사산물의 생산성이 높은 것을 기준으로 식물세포주를 선택하며, 상기 선택기준을 만족하는 한 산겨릅나무의 식물세포로 사용할 수 있으며 특별히 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 있어서, 산겨릅나무에서 유도된 캘러스에서 액체배지에서 배양가능한 식물세포를 제조하는 방법은, 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 알려진 적절한 캘러스 유래 식물세포 제조방법 모두 사용될 수 있으며 특별히 한정하지 않는다.

본 발명에 따른 산겨릅나무의 식물세포를, 2012년 8월 7일자로 한국생명공학연구소 유전자은행(Korean Collection for Type Cultures)에 SYGB-5로 기탁하였고, 기탁번호 KCTC 12257BP를 수여받았다.

따라서, 본 발명은 산겨릅나무 유래 식물세포, 바람직하게는 수탁번호 KCTC 12257BP을 갖는 식물 세포를 제공하는 것이다.

C. 식물세포 배양

본 발명에 따른 산겨릅나무 식물세포의 배양 추출물을 제조하는 방법은, 상기 캘러스로부터 액체 배지에서 배양 가능한 식물세포를 제조하고, 이를 적절한 식물세포의 세포배양용 배지에서 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명에 적용가능한 산겨릅나무 식물세포의 배양용 배지는 영양분 및 식물세포의 생육력을 유지하는데 필요한 인자, 예를 들어 탄소원, 질소원, 염, 비타민을 포함하는 식물세포 배양에 통상적으로 사용되는 모든 배지 성분를 사용할 수 있다.

산겨릅나무 식물세포의 배양용 배지의 구체적인 예로는, 셍크 힐더브란트 배지 (Schenk and Hildebrandt medium, 이하 SH 배지), 앤더슨 로도덴드론 배지(Anderson rhododendron medium), 씨에이치유 배지 (CHU(N6) medium), 씨엘씨 이포모에 배지(CLC/Ipomoea medium), 체-풀 비티스 배지(Chee & Pool (C2D) vitis medium), 데 그리프-야곱 배지(De greef & jacobs medium), 디케이더블유-정글란 배지(DKW/JUNGLANS medium), 에릭슨 배지(Eriksson(er) medium), 갬보그 배지(Gamborg B5 medium, 이하 B5 배지), 그리숍-도이 배지(Gresshof & doy (DBM2) medium), 헬러 배지(Hellers medium), 카오 미카이룩(kao michayluk medium), 운드슨 코키드 배지 (knudson corchid medium), 린더만 오키드 배지(Lindemann Orchid medium), 리트베이 배지(Litvay medium), 린스마이어-스쿡 배지(Linsmaier & Skoog medium, 이하 LS 배지), 맥카운 우디플랜트 배지(McCowns woody plant medium), 무라시케-스쿡 배지(Murashige & Skoog medium, 이하 MS 배지), 무라시케- 밀러 배지(murashige & Miller medium), 니취 배지 (nitsch medium), 엔엘엔 배지(NLN medium), 오키맥스 배지(orchimax medium), quoirin & Lepoivre medium, rugini olive medium, schenk & hildebrandt medium, 에스 배지(S-Medium), 베이신-웬트 배지(vacin and went medium), 화이트 배지(white medium) 또는 웨스트바코 배지(westvaco WV3 medium) 또는 이를 변형한 배지 등을 포함하며 이에 한정되는 것은 아니다.

또한 본 발명의 산겨릅나무 식물세포의 세포배양용 배지에는 필요에 따라 각종 첨가제를 가하거나, 상기 배지성분 중 일부 성분을 제외하고 사용할 수도 있다. 상기 첨가제의 일예는 또한 추가로 식물성장 조절제일 수 있다. 상기 식물성장 조절물질은 식물의 성장, 세포분열, 조직의 분화, 개화, 열매 형성 및 숙성 등을 조절하는 기능을 가지는 천연 및 합성의 모든 물질을 포함한다.

상기 식물성장 조절물질은 이에 한정되지 않지만, 예를 들면 나프탈렌 아세트산 (α-naphtalene acetic acid, 이하 NAA), 2,4-D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid), p-클로로페녹시아세트산 (p-Chlorophenoxyacetic acid), 인돌-3-아세트산 (indol-3-acetic acid), 3-인돌 부트릭산 (3-indolbutyric acid), b-나프톡시아세트산 (b-naphthoxyaxetic acid), 지아틴 (zeatin), 6-벤질아미노퓨린(6-benzylaminopurine, 이하 BA), 카이네틴(kinetin), 이소펜티닐아미노퓨린 (2iP), 지베렐산(GA₃; giberellic acid), 티디아주론(TDZ; thidiazuron) 일 수 있으며 이에 한정되지 않지만, 바람직하게는 나프탈렌아세트산, 2,4-D, BA 그리고 카이네틴일 수 있다. 상기 식물성장 조절물질은 함량은 배양 식물세포에 따라 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들면 배양 배지에 0.01mg/l 내지 10mg/로, 바람직하게는 0.1mg/l 내지 10mg/l로 함유될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 산겨릅나무의 세포배양은 현탁 배양이 바람직하다. 상기 현탁 배양은 캘러스 유래 식물세포가 액체 영양 배지 내에 분산되어 배양되는 것을 말하며, 현탁 배양은 다양한 응집 단계의 세포를 포함하고 있다. 일반적으로, 현탁 배양은 충분하게 성장한 캘러스 배양으로부터 유도할 수 있으며, 상기 캘러스 배양을 액체 영양 배지로 옮겨 배양하고, 상기 액체배지에서 1 내지 4주간 배양한 세포 배양액은 동일 조건의 배지에 접종하여 계속적으로 계대 배양할 수 있다.

상기의 현탁 배양에서 사용되는 배지는 캘러스 유도 및 증식에 사용된 배지에서 고형화제를 제거한 것으로서, 캘러스 유도 및 증식에 사용된 배지와 동일 조성의 배지가 사용될 수 있지만, 경우에 따라 캘러스 유도 및 증식 배지와는 다른 조성의 배지가 사용될 수 있다. 본 발명에서 현탁 배양을 유도하기 위하여, LS 배지, MS 배지, B5 배지 및 SH 배지를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 LS 배지 또는 B5 배지를 사용할 수 있다.

상기의 현탁 배양을 유도하기 위하여, 상기 액체배지에 캘러스를 10 내지 40g/l로, 바람직하게는 20 내지 30g/l로 첨가할 수도 있고, 배양온도를 20 내지 30℃에서, 바람직하게는 22 내지 26℃에서 암조건으로 배양할 수 있다.

본 발명에 있어서, 산겨릅나무 식물세포를 배양하는 방법은 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 알려진 적절한 식물세포의 배양 공정이 모두 사용될 수 있다. 상기 공정의 예로는 회분식 배양 공정 (batch culture process), 연속식 배양 공정 (continuous culture process), 유가식 배양 공정 (fed-batch culture process), 반연속식 회분 배양 공정 (semi-continuous batch culture process), 고정화 배양 공정 (immobilized culture process), 이원상 배양 공정(two-phase culture process) 등이 있다. 각 식물세포는 세포의 특성에 따라 적절한 배양 공정을 선택하여 사용할 수 있다.

본 발명의 바람직한 일구현예에 따라, 상기 식물세포의 액체 배지에서 배양하는 단계에 있어서, 식물세포가 생산하는 이차대사산물의 생산 유도제(elicitor) 및 이차대사산물의 전구체(precursor)로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 물질을 처리하여 이차대사산물의 생산을 증가시킬 수 있다. 구체적 일예로서, 상기 식물세포 배양배지에서 이차대사산물의 생산 유도제 및 이차대사산물의 전구체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 물질을 첨가하여 배양할 수 있으며, 상기 첨가물질은 일반적으로 배양 초기 또는 배양 중반에 처리할 수 있으며, 이차대사산물은 종류에 따라 그 합성에 관여하는 생화학적 경로 또한 다양하기 때문에 대량 생산의 대상이 되는 특정 이차대사산물의 생산성을 증가시키기 위하여는 적절한 유도제를 선별하고, 그 처리 조건을 최적화하여야 한다.

혹은, 상기의 산겨릅나무의 세포배양을 유도제 또는 전구체를 포함하는 영양배지에서 수행할 수 있다. 상기의 영양배지는 식물 세포 배양용으로 사용 가능한 배지라면 이에 제한되지 않으나, 특히 캘러스 배양과 현탁 배양에서 사용된 배지와 동일 조성의 배지를 계속 사용할 수도 있고, 각각 다른 조성의 배지를 사용하는 것도 가능하다. 이는 일반적으로 식물세포의 경우 성장과 이차대사산물 생산의 최적 조건이 서로 다른 경향이 있어, 현탁 배양에서 세포의 성장을 위한 성장 배지의 최적화 및 이차대사산물의 생산을 위한 생산 배지의 최적화 작업이 별도로 필요하기 때문이다. 그러나 이것이 절대적인 것은 아니며, 세포의 성장과 이차대사산물의 생산을 동일 조성의 배지에서 동시에 진행하는 것도 가능하다.

상기 유도제는 생물성 유도제와 비생물성 유도제로 구분할 수 있으며, 상기 유도제는 유도체 자체의 특성에 따라 적정 처리량의 범위가 다르며 식물세포의 종류에 따라 반응에도 차이가 많다. 따라서 사용하는 유도제의 종류 및 적용대상 식물 세포에 따라 적절한 범위를 선택하여 처리할 수 있다.

상기 생물성 유도제로서 곰팡이, 세균 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 세포의 파쇄물, 추출물, 분획 추출물, 또는 여과물일 수 있으며, 상기 상기 유도제는 곰팡이, 세균 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 세포로부터 얻어진, 다당체, 당단백질, 비활성화된 효소, 쿠드란, 잔탄, 키토산 및 글루칸으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 물질일 수 있다. 추가적으로, 생물성 유도제의 예는 진균류 추출물, 세균류 추출물, 효모 추출물, 키토산, 리케난, 글루코만난, 플레우란, 글루칸,카르복시메틸글루칸, 술포에틸글루칸, 히드록시메틸글루칸, 만난, 크실란, 만노비노스, 만노트리오스, 만노펜타오스, 만노테트라오스, 셀루리신, 멀티펙트 XL, 멀티펙트 CL, 레시나세, 펄프크심, SP 431, 펙티놀, 라피다제, 키티나제 등을 들 수 있다.

비생물성 유도제로는 화학적 자극제 및 식물 대사 조절제를 포함한다. 상기 비생물성 유도제중 화학적 자극제는 질산은, 염화카드늄 및 염화코발트로 이루어지는 군에서 선택되는 금속염류일 수 있다. 상기 비생물성 유도제중 식물 대사 조절제는 살리실산 (salicylic acid), 자스몬산 (jasmonic acid), 및 메틸자스모네이트 (methyl jasmonate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상일 수 있으나 이에 한정되는 의도는 아니다.

비생물성 유도제의 예는 아라키돈산, 엘라이드산, 시클릭 AMP, 디부티릴 시클릭AMP, 메틸 자스모네이트, 시스-자스몬, 미코나졸, 페룰산, 바나딜 설페이트, 우니코나졸, 파클로부트라졸, 스페르민, 스페르미딘, 푸트레신, 카다바린, 프로타민 설페이트, 펜프로페모르프, 프로클로라즈, 나프티핀, EDU, HTA, MPTA, 글루타치온, EGTA, AMP-1618, 트리톤 X-100, 벤조산, 살리실산, 프로필 갈레이트, 세사몰, 클로로콜린 클로라이드, 3,4-디클로로페녹시트리에틸아민 히드로로퀴논, 클로로에틸포스폰산, 디에틸디티오카르밤산, 노르디히드로구아이아레트산, 디티오트레이톨, 메타중아황산칼륨, 메타중아황산나트륨, 베타-아미노-DL-페닐알라닌, SKF-7997, MER 29, 안시미돌, 트리아디메폰, 포스폰 D, 티오우레아, 덱스트란 설페이트, 카라게난, 티라민, 아세트산나트륨, 아세트산칼륨, 아세트산암모늄, 메발론산, 파르네실 아세테이트, 제라닐제라니올 아세테이트, 트립타민, 멘톨, 알파 피넨, 트란스-신남산, 캄브렌 A, 베르티실렌, 베르티실롤, 캄포르, 퀘르세틴, 레불린산, 아비에트산, 보르네올, 질산은, 염화코발트, 염화카드뮴, 노르보르나디엔, 알라르, 4-아미노-5-헥신산, 페닐에탄올아민, 펜에틸아민, 글리포세이트, 디히드로시클로에우칼레놀, 메티오닌 설폭사이드, 베타-히드록시펜에틸아민, 5-메틸-DL-트립토판, 알파-플루오로페닐알라닌, 5-2-아미노에틸-L-시스테인 히드로클로라이드, DCPTA, DIPTA, ACC, 브라시노스테로이드, BHA, BHT, OTA, 키토산 글루타메이트, 지베렐린, 아브시스산, 1,3-디페닐 우레아, 디아졸리디닐 우레아, 플로로글루시놀, 및 알긴산나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예에서, 고농도 세포 배양 및 이차대사산물의 최종 용적생산성을 증가시키기 위해서, 고 삼투압 처리를 하는 것이 바람직하며, 상기 고 삼투압 처리를 위하여 배지 내 탄소원의 농도가 3 (w/v)% 내지 10 (w/v)%로 포함하는 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 3 (w/v)% 내지 6 (w/v)%로 포함할 수 있다. 상기 3% 보다 낮은 농도의 탄소원 처리는 삼투압의 효과가 저하되며, 탄소원이 10% 보다 농도가 높을 경우 과다한 삼투압의 효과로 인한 세포의 괴사를 초래할 수 있는 문제가 있으므로 상기 농도가 바람직하다. 상기 탄소원은 배양 세포가 이용 가능한 탄소원이라면 제한 없이 사용될 수 있으나 바람직하게는 자당, 유당, 과당 및 포도당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 사용될 수 있다.

이차대사산물의 최종용적생산성을 증가시키기 위하여 통상의 식물세포의 접종비에 비해 고농도 세포접종이 사용될 수 있으며, 바람직하게는 상기 배지에 접종되는 현탁 배양 세포주의 농도를 2 g/l 내지 10 g/l 범위로 접종하여 7일 이상 장기 배양할 수 있으며, 고농도 세포접종을 위하여, 보다 바람직하게는 상기 배지에 접종되는 현탁 배양 세포주의 농도를 5 g/l 내지 10 g/l 범위로 접종하여 14일 이상 장기 배양할 수 있다. 상기 접종되는 현탁 배양 세포주의 농도가 2 g/l 보다 적으면 전체 배양기간이 길어지고 세포 성장이 지연되어 이차대사산물의 생산성이 감소할 수 있는 문제가 있을 수 있고, 10 g/l 보다 큰 고농도 접종일 때는 과도한 세포성장으로 인하여 이차대사산물의 생산능력이 감소할 수 있는 문제가 있으므로 상기 농도가 바람직하다.

D. 식물세포 배양물로부터 배양추출물 수득

본 발명의 또 다른 구현예는 (a) 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim)의 조직을 캘러스 유도 배지에 접종하여 캘러스를 유도하는 단계; (b) 상기 캘러스로부터 액체 배지에서 배양 가능한 식물세포를 제조하는 단계; (c) 상기 식물세포를 액체 배지에서 배양하여 배양액을 수득하는 단계; 및 (e) 상기 식물세포 배양액을 추출용매를 사용하여 추출하여 얻어지는 추출물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명으로부터 얻어진 산겨릅나무의 세포배양은 본 발명의 기술분야에 종사하는 자들에게 널리 공지된 적절한 방법을 이용하여 추출 및 정제될 수 있다. 상기 산겨릅나무의 세포배양은 열수 및 알코올 또는 유기용매에 의한 추출법으로 산겨릅나무의 세포배양 추출물을 얻을 수 있다. 이때 사용되는 용매의 성질에 따라 살리드로사이드 및 살리드로사이드 유도체 및 다른 종류의 이차대사산물이 함께 추출될 수 있으며, 다양한 용도의 약학적 조성물 및 기능성 식품 소재로 사용될 수 있다.

상기의 산겨릅나무의 세포배양을 유도제 또는 전구체를 포함하는 영양배지에서 배양한 경우에는 살리드로사이드를 포함하는 다양한 이차대사산물을 보다 높은 농도로 함유하는 배양물을 얻을 수 있다.

상기 산겨릅나무의 건조 세포배양물에는 살리드로사이드를 0.01 중량% 내지 30 건조중량%, 예를 들면, 0.02 내지 20 건조중량% 또는 0.3 내지 15 건조중량%으로 포함할 수 있다.

상기 산겨릅나무의 세포배양 추출물은 용매추출법, 재결정법 및 크로마토그래피법 등 추출물을 제조, 분리 및 정제하는 통상의 방법을 모두 적용할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 산겨릅나무의 세포배양물을 용매추출법, 유기용매를 이용한 분배 추출법, 및 칼럼 크로마토그래피를 이용한 분획추출법으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 추출법으로 추출할 수 있다. 또한, 고농도의 산물을 얻고자, 상기 추출물을 감압농축 등의 방법으로 농축하거나, 추가 정제방법을 사용하여 고순도로 정제할 수 있다. 또한 상기 추출물은 감압 증류, 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조될 수 있다.

상기 추출물은, 식물세포 배양물을 물, 탄소수 1 내지 5의 저급알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 벤젠, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 추출용매로 추출하여 제조된 식물세포 배양물의 추출물일 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구현예에서, 용매추출물을 유기용매를 이용한 분배 추출법으로 분배추출물을 얻고, 이어서 칼럼 크로마토그래피법으로 처리하여 얻어진 분획 추출물을 얻을 수 있으며, 상기 분획 추출물에는 살리드로사이드가 0.1% 내지 99.9 중량%로 함유될 수 있다.

본 발명은 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim) 나무 유래 식물세포를 배양하여 얻어진 배양물 또는 이의 추출물에 관한 것이다. 상기 추출물은 용매 추출, 용매를 이용한 분획 추출, 및 추가로 칼럼 크로마토그래피를 이용한 분획추출물일 수 있다.

본 발명의 산겨릅나무 세포배양은 자연산 산겨릅나무에 비해 유효성분인 살리드로사이드 (salidroside)의 함량이 1,600배 증가되어 뛰어난 간 기능 보호 및 개선 효과를 나타내는 산겨릅나무 배양세포를 대량으로 얻을 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 산겨릅나무의 세포배양과 산겨릅나무의 세포배양 추출물 및 살리드로사이드는 간 독성 치료, 간 기능 보호 및 개선 효과를 가지는 치료제 또는 기능성 식품 소재로 활용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 구현예는 상기 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim)의 식물 세포 배양물의 추출물을 포함하는 간질환 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 99중량%로 포함할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 간질환은 간위, 간경화, 간염, 알콜성 지방간, 및 간암을 포함한다.

상기 약학 조성물은 추가로 약리학적으로 허용되는 부형제, 희석제, 및/또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 추가적인 구현예는 상기 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim)의 식물 세포 배양물의 추출물을 포함하는 간기능 보호 또는 개선용 식품 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 99중량%로 포함할 수 있으며, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.

식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 추가적인 구현예는 살리드로사이드를 포함하는 간질환 예방, 개선 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 유효성분은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 내지 99.9중량%로 포함할 수 있다. 상기 간질환은 간위, 간경화, 간염, 알콜성 지방간, 및 간암을 포함한다.

상기 약학 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명의 약학조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며 (예: 문헌 [Remington's Pharmaceutical Science, 최신판; Mack Publishing Company, Easton PA), 예를 들면 과립제, 세립제, 산제, 경질캡슐제, 연질캡슐제, 시럽제, 유제, 현탁제 또는 액제 등의 경구 투여용 약학 조성물로서 투여해도 되고, 정맥내 투여, 근육내 투여, 또는 피하 투여용 주사제, 점액제, 좌제, 경피흡수제, 경점막 흡수제, 점비제, 점이제, 점안제, 흡입제, 크림제, 연고제, 파프제 등의 비경구 투여용 의약조성물로서 투여하는 것도 가능하다. 분말형태의 약학조성물로서 조제된 제제를 사용시에 용해하여 주사제 또는 점액제로서 사용해도 된다. 특히, 본 발명의 약학조성물은 페이스트 연고, 크림, 밀크, 파프제, 분제, 침투 패드, 용액, 겔, 분무제, 로션 또는 현탁액 형태의 제형인 것이 바람직할 수 있다.

본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 성인 1일당 유효성분인 산겨릅나무 세포배양물의 추출물을 통상적인 투여량 10 내지 10000mg/kg로 투여할 수 있으며, 환자의 연령, 병태, 증상에 따라 적절히 증감(增減)하는 것이 바람직한 것으로 본 발명의 범위가 상기 범위에 한정되는 것은 아니다. 상기 1 일량은 1일에 1회, 또는 적당한 간격을 두고 하루에 2~3회에 나눠 투여해도 되고, 수일 간격으로 간헐투여해도 된다. 그러나, 본 발명의 약제학적 조성물의 상기 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니된다.

본 발명에 따라 산겨릅나무 (Acer tegmentosum Maxim)의 식물세포의 배양물을 제조하는 방법을 제공하여, 종래에 식물의 직접 재배로부터 얻어진 추출물 또는 이차대사산물을, 지리적, 기후적, 정책적 영향을 받지 않으면서도 대량으로 얻을 수 있고, 식물세포배양 기술을 통한 유용 이차대사산물의 대량생산이 가능하다는 장점이 있으며, 상기 추출물의 간질환 예방, 개선, 및 치료용 약학 조성물과, 간 독성 치료, 간 기능 보호 및 개선용 식품 조성물로 사용될 수 있다.

도 1은 실시예 1-1에서의 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim)로부터 유도된 캘러스 배양을 나타낸 것이다.
도 2는 실시예 1-2에서의 산겨릅나무의 현탁 세포배양을 4종의 액체 배양 배지에서 배양하면서 세포의 성장 변화를 나타낸 것이다.
도 3은 실시예 2에서의 산겨릅나무 세포배양과 살리드로사이드 표준품의 고속 액체크로마토그래피와 액체크로마토그래피-질량분석기 분석 결과를 나타낸 것으로서 (A)는 산겨릅나무 세포배양의 고속 액체크로마토그래피 분석 결과, (B)는 1 mg/ml 농도의 살리드로사이드 표준품의 고속 액체크로마토그래피 분석 결과이다.
도 4은 실시예 2에서의 산겨릅나무 세포배양과 살리드로사이드 표준품의 액체크로마토그래피-질량분석기 분석 결과를 나타낸 것으로서, (A) 산겨릅나무 세포배양의 액체크로마토그래피-질량분석기 분석 결과, (B) 1 mg/ml 농도의 살리드로사이드 표준품의 액체크로마토그래피-질량분석기 분석 결과이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 기재한다. 다만, 하기의 실시예는 본 발명의 바람직한 일 실시예일뿐, 본 발명이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 산겨릅나무 세포배양의 확립

실시예 1-1: 산겨릅나무 캘러스의 유도

국내 자생하는 산겨릅나무의 잎과 줄기를 채취하여 5 cm 정도 되게 자른 후 주방용 세제를 이용하여 표면을 깨끗하게 세척하고 수돗물로 충분히 헹궈 내었다. 준비된 시료는 95% 에탄올에 1 분 동안 침지 시킨 뒤, 1% 차아염소산나트륨 용액에서 30분간 계속 흔들어 주면서 살균한 후, 멸균된 증류수로 3 차례 씻어 주었다. 멸균이 끝난 재료는 외과수술용 칼을 이용하여 각각 1 cm x 1 cm 크기의 절편으로 만들어 sucrose 30g/L, agar 8g/L, NAA 2 mg/L, BA 0.02 mg/L, casein hydrolyzate 1 g/L, MES 1 g/L를 첨가하고 pH를 5.7로 조절한 하기 표 1의 4 종류의 배지(LS 배지, MS 배지, B5 배지, SH 배지)에 치상하여 24 ℃에서 암조건으로 8주간 배양하여 캘러스를 유도하였다.

산겨릅나무의 세포배양용 배지 조성표

성분(mg/L)	LS	MS	B5	SH
CaCl₂	332.02	332.02	113.23	151
KH₂PO₄	170	170	-	-
NaH₂PO₄	-	-	130.44	-
KNO₃	1900	1900	2500	2500
MgSO₄	180.54	180.54	121.56	195.05
NH₄NO₃	1650	1650	-	-
(NH₄)₂SO₄	-	-	134	-
(NH₄)H₂PO₄	-	-	-	300
CoCl₂.6H₂O	0.025	0.025	0.025	0.1
CuSO₄.5H₂O	0.025	0.025	0.025	0.2
FeNaEDTA	36.7	36.7	36.7	19.8
H₃BO₃	6.2	6.2	3	5
KI	0.83	0.83	0.75	1
MnSO₄.H₂O	16.9	16.9	10	10
Na₂MoO₄.2H₂O	0.25	0.25	0.25	0.1
ZnSO₄.7H₂O	8.6	8.6	2	1
myo-Inositol	100	100	100	1000
Nicotinic acid	-	1	1	5
Pyridoxine HCl	-	1	1	0.5
Thiamine HCl	0.4	10	10	5

유도된 캘러스는 4주 간격으로 새로운 배지로 계대 유지되었으며, 4종류의 배지에서 산겨릅나무 캘러스의 유도 및 증식 결과를 나타낸 것을 표 2 에 나타냈다.

표 2 에 나타나듯이, LS 배지와 B5 배지에서 캘러스의 유도율이 가장 높았으나 이후 연속된 계대 배양에서 가장 캘러스의 성장이 빠른 것은 B5 배지였다.

산겨릅나무의 캘러스 유도 및 증식을 위한 최적 배지 선정

배지	캘러스 유도	캘러스 증식
LS	+++	++
MS	++	+
B5	+++	+++
SH	+	+

실시예 1-2 : 산겨릅나무의 현탁 배양

실시예 1-1 의 조건으로 B5배지에서 4 주간 배양된 산겨릅나무의 캘러스 조직을 이용하여 액체 현탁 배양을 유도하였다. 4종류의 액체배지 50 ml을 함유한 250 ml 삼각플라스크에 생체중량 약 1~2 g의 캘러스를 취하여 외과수술용 칼을 이용하여 잘게 다진 후 접종하고 24 ℃, 암조건에서 110 rpm으로 진탕 배양하였다. 수시로 각 플라스크의 현탁 배양액을 취하여 당도계(Refractometer)를 이용하여 배지 내 잔류당을 측정하여 배지의 잔류 당이 1%(w/v) 내외로 떨어지면 새로운 배지로 계대를 계속하였다. 최초 2~3 계대 동안은 배지의 갈변과 세포의 산화를 방지하기 위하여 0.5 ~ 1%(w/v)의 PVPP, XAD 수지 혹은 0.5 %(w/v) 활성탄을 첨가하여 주었으며, 이후 계대 부터는 배지로부터 제거하였다.

상기의 과정을 거쳐 유도된 본 발명의 산겨릅나무의 세포배양 중 가장 성장이 빠르고, 이차대사산물의 생산성이 높은 세포를 선별하여 SYGB-5 (Acer tegmentosum Maxim. SYGB-5)라 명명하고, 2012년 8월 7일 대전광역시 유성구 어은동 52번지에 위치한 한국생명공학연구원 생물자원센터 (Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 기탁번호 KCTC 12257BP로 기탁하였다.

2 ~ 3개월 간 액체 배지에서 계대 유지된 세포 배양액 60 ml을 4 종의 새로운 액체 배지 180ml이 담겨 있는 500 ml 삼각 플라스크에 접종하여 150 rpm으로 현탁 배양 세포를 배양하면서 세포건조중량의 변화를 관찰하였다. 세포 건조중량은 임의로 채취된 식물 세포 배양액을 흡인여과기 (Buchner funnel)을 이용하여 와트만 4번 여과지로 여과하여 얻은 세포를 60℃의 건조오븐에서 24시간 동안 건조하여 측정한 중량이다.

4종류의 액체 현탁 배양 배지에서 배양된 산겨릅나무 현탁 배양 세포의 세포 건조중량 변화를 도 2에 도시하였다. 그 결과 산겨릅나무 현탁 배양 세포의 성장에 가장 바람직한 배지는 LS 배지였다. LS 배지에서 산겨릅나무의 현탁 배양 세포는 배양 10 일만에 세포 건조중량이 18.9 g/L로 초기 접종량보다 3.9 배 이상 증가하였다.

실시예 2 : 산겨릅나무 세포 배양의 살리드로사이드 생산

실시예 1-2와 같이 LS 액체 배양 배지에서 산겨릅나무 현탁 배양 세포를 배양하면서, 배양 후 14일에 배양 세포를 회수하여 다음과 같이 살리드로사이드를 추출하였다.

배양된 세포 배양액으로부터 임의로 5㎖의 시료를 취한 후 원심분리하여 배양액을 제거하고 세포를 40℃의 건조오븐에서 24시간 이상 충분히 건조한 후 막자사발을 이용하여 분쇄한 세포건조분말 250 mg에 메탄올 5㎖을 첨가하여 24 시간 동안 추출하였다. 추출 후 추출액을 원심분리한 후 메탄올 층을 회수하여 살리드로사이드의 분석에 사용하였다.

살리드로사이드의 분석은 고속 액체크로마토그래피를 이용하여 실시하였으며, 분석 조건은 Capcell Pak C18 (시세이도 사, 4.6 x 250 mm) 컬럼을 이용하여 이동상으로 0.05%의 트리플로르아세트산을 함유하는 물-메탄올 혼합액(19:1, v/v)을 사용하여 분당 1ml의 유속으로 흘려주면서 214nm의 파장에서 흡광도를 분석하였다. 또한 살리드로사이드 표준품과 산겨릅나무 세포배양의 추출물로부터 분리한 살리드로사이드에 대한 분자량의 비교를 액체크로마토그래피-질량분석기 분석을 통해 실시하였다. 도 3은 산겨릅나무 세포배양 추출물과 표준시료인 살리드로사이드의 고속 액체크로마토그래피 분석 차트를 도시한 것으로, A는 산겨릅나무 세포배양의 메탄올 추출물에 대한 고속 액체크로마토그래피 분석 차트이며, B는 1 mg/ml 농도의 살리드로사이드 표준 시료에 대한 고속 액체크로마토그래피 분석 차트이다. 또한 산겨릅나무 세포배양에서 생산된 살리드로사이드의 동정을 위하여 액체크로마토그래피-질량분석을 실시하였다. 분석에 사용된 기기는 미국 피니간 사의 LCQ-Deca 시스템을 사용하였으며, 분석 조건은 아래 표 3과 같다.

액체크로마토그래피-질량분석기 분석 조건

항목	수치
Ion source	ESI mode
Sheath gas flow rate	80 arb
Aux gas flow rate	20 arb
Spray voltage	5.00 kV
Capillary current	270 ℃
Capillary voltage	15 V
Tube lens offset	50 V

도 4는 산겨릅나무 세포배양 추출물과 표준시료인 살리드로사이드의 액체크로마토그래피-질량분석기 분석 차트를 도시한 것으로, (A)는 산겨릅나무 세포배양의 메탄올 추출물에 대한 고속 액체크로마토그래피 분석 차트이며, (B)는 1 mg/ml 농도의 살리드로사이드 표준 시료에 대한 고속 액체크로마토그래피 분석 차트이다.

고속 액체크로마토그래피와 액체크로마토그래피-질량분석기 분석을 통하여 산겨릅나무 세포배양에서의 살리드로사이드 생산을 확인하였다.

실시예 3 : 유도제와 전구체를 이용한 살리드로사이드의 생산

실시예 1-2와 같은 방법으로 2 주간 배양된 산겨릅나무 현탁배양액 50 ml를 2 mg/L의 NAA와 0.5 mg/L의 BA가 포함된 새로운 LS 액체 배지 200ml에 접종하고 아래 표 4와 같이 다양한 유도제와 전구체가 처리한 후 2 주간 배양하였다. 배양이 완료된 세포배양은 실시예 2와 같이 세포를 회수하여 살리드로사이드 함량을 분석하여 비교하였다.

살리드로사이드의 생산량은 아래와 같은 방법으로 정량하였다. 상기의 실시예 2와 같이 고속 액체크로마토그래피 분석을 통해 얻은 살리드로사이드 피크의 면적으로부터 0.05 내지 1 mg/L 살리드로사이드 표준 물질의 피크 면적으로부터 얻은 스탠다드 커브를 이용하여 살리드로사이드의 농도를 구한 후, 이로부터 %DW(Dry Weight) 함량을 계산한다. %DW 함량은 세포건조중량 1 g에 포함된 살리드로사이드의 % 비율을 의미한다. 계산된 %DW 함량에 세포배양액의 세포농도 (g/L, DW)를 곱하여 최종 용적생산성 (mg/L)을 계산한다.

상기 방법에 따라 코로소릭산의 생산량을 측정하여 그 결과를 표 4에 나타내었다. 표 4에 나타나듯이, 산겨릅나무 세포배양의 살리드로사이드 생산성은 유도제와 전구체의 처리에 따라 크게 증가하였으며, 특히 전구체인 티로솔의 처리가 매우 효과적임을 알 수 있다. 또한 메틸자스모네이트와 티로솔을 함께 처리할 경우 살리드로사이드의 생산은 더욱 증가하였다.

유도제와 전구체의 처리를 통한 살리드로사이드의 생산

처리물질	처리량	살리드로사이드 생산성
처리물질	처리량	%DW	mg/L
대조구	-	0.02	2.22
질산은	5 μM	0.02	3.19
질산은	10 μM	0.01	1.17
메틸자스모네이트	50 μM	0.03	3.47
메틸자스모네이트	100 μM	0.07	7.42
티로신	0.5 mM	0.02	3.19
	2 mM	0.04	5.43
	4 mM	0.05	7.06
티로솔	0.5 mM	0.32	38.47
	2 mM	1.24	160
	4 mM	2.31	304.58
	6 mM	4.42	449.03
티로솔 6 mM + 메틸자스모네이트100 μM		8.26	834.66
티로솔 8 mM + 메틸자스모네이트100 μM		8.39	923.17

실시예 4 : 산겨릅나무 식물세포의 배양 추출물 및 이로부터 분리된 살리드로사이드의 간기능 보호 효과

실시예 4-1: 산겨릅나무의 세포배양 추출물 및 살리드로사이드 정제

상기 실시예 1-2와 실시예 3과 같이 산겨릅나무의 세포배양을 2 주간 배양한 후, 배양이 완료된 세포를 회수하고 건조하여 산겨릅나무 세포배양 건조분말을 얻는다. 산겨릅나무 세포배양 건조분말 1 kg에 20 L의 70% 에탄올을 가하여 24 시간 동안 추출한 후, 여과하여 에탄올 층을 회수하였다. 회수된 추출액은 감압농축과 동결건조를 이용하여 산겨릅나무의 세포배양 추출물 250g을 제조하였다. 상기 방법으로 제조한 산겨릅나무의 세포배양 추출물의 살리드로사이드 함량은 HPLC 분석으로 정량한 결과 9.8% DCW 였다.

상기 산겨릅나무의 세포배양 추출물 200g을 1 L의 증류수에 현탁시키고, 부탄올 1 L를 가하여 3회 분배추출한 후 농축한 부탄올 분획물을 실리카겔 컬럼 크로마토그래피에서 클로로포름-메탄올 전개용매를 이용하여 9:1로 1 L 용출하다가 6:4 로 변경하여 다시 전개하여 살리드로사이드가 포함된 분획을 구하였다. 상기 분획은 감압농축을 통해 무색의 분말을 얻었으며, 이 분말은 실시예 2의 방법으로 살리드로사이드임을 동정하였다.

실시예 4-2: 실험동물의 처리

실험동물은 4 주령 수컷 흰쥐 (Sprague-Dawley)를 ㈜ 샘타코에서 구입하였으며 사육실의 일정한 조건(온도 21.4℃±0.05℃, 습도 61±1%, 명암은 12시간 주기) 하에서 사육하였다. 식이는 물과 사료(AIN-93G Purified Rodent Diet)를 충분히 섭취하게 하면서 1주일 동안 순치한 뒤 체중이 150±10 g인 흰쥐를 선별하여 각 실험군당 10마리씩 실험에 사용하였다.

일주일간의 순치 과정을 거친 흰쥐에 실험 시작 2일 전, 1일 전 및 2 시간 전에 각각 전 D-galactosamine 투여 2일 전, 1일 전 및 2시간 전에 상기 실시예 4-1에서 제조한 산겨릅나무의 세포배양 추출물 (300 mg/kg) 및 살리드로사이드 (30 mg/kg, 100 mg/kg)를 극소량의 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 용해 후 생리식염수와 1%의 olive oil로 희석하여 경구 투여하였다. 이후 D-galactosamine (700 mg/kg)을 복강 투여하여 간독성을 유발하였다.

간 독성을 유발한 후 24시간이 경과한 뒤, 실험동물을 약 12시간 절식시킨 후 ether로 마취시켜 경동맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 serum용 튜브에 받아 1,500 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 회수하여 분석 전까지 -80℃에서 저온 보관하였다.

실시예 4-3: 혈액성분 분석을 통한 간기능 보호 효과 평가

채취한 혈액을 이용하여 간질환 유발 시 혈중 내 활성에 변화를 나타내는 간기능의 지표 효소인 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase) 및 LDH (lactate dehydrogenase)의 활성을 조사하였다. AST 및 ALT의 활성 분석은 Reitman-Frankle법(1957)에 따라 조제된 kit (Asan, Korea)를 사용하여 기질액을 37℃에서 5분간 반응 시킨 후 혈장을 첨가하여 37 ℃에서 ALT는 30분, AST는 60분간 반응시켰다. 이 후 정색시액(2,4-dinitrophenylhydrazine, 19.8 mg/100 ml) 을 첨가하고 0.4N-NaOH 용액을 가하여 실온에서 방치하고 파장 505 nm에서 흡광도를 측정하였다. 활성도는 표준검량선에 따라 혈청 1 ml당 Karmen unit (IU/L)로 표시하였다. LDH (lactate dehydrogenase) 활성의 측정은 Wroblewskin와 LaDue의 방법(1955)에 따라 조제된 kit (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)를 사용하였다. 분석 방법으로는 기질액과 정색시액을 1:1 로 혼합하여 37℃에서 5분간 반응한 다음 시료와 혼합하였다. 이 후 37℃에서 10분간 방치하여 염산으로 반응을 종료시켜 파장 570 nm에서 흡광도를 측정하였으며 표준곡선에 따라 활성도를 분석하였다.

각 실험에서 얻어진 결과는 평균 ± 표준편차로 나타내었다. 통계 처리는 SPSS(version 12.0)로 분석한 후 t-검정을 실시하여 분산과 평균의 동일성 여부를 검정하였으며, 분석결과는 일원분산분석(one way ANOVA)에 의한 Duncan 검정을 실시하여 p값이 0.05 미만일 때 유의한 것으로 간주하였다. AST, ALT 및 LDH의 활성 분석 결과는 아래 표 5에 도시하였다.

간독성 유발 전 약물을 처리한 실험동물의 AST, ALT 및 LDH 활성 비교

약물 처리군	AST (IU/L)	ALT (IU/L)	LDH (IU/L)
대조군	60.1±3.2	35.6±2.0	1041.2±11.2
GalN	180.0±1.5⁺	101.0±3.5⁺	2317.03±13.1⁺⁺
산겨릅나무 세포배양 추출물 (300 mg/kg)	150.7±1.8^**	95.6±0.9	2017.2±19.1
살리드로사이드(30 mg/kg)	132.1±0.9^**	90.2±0.1^*	1880.3±23.3^*
살리드로사이드(100 mg/kg)	99.5±1.4^**	42.9±0.7^**	1320.0±19.6^**

+p < 0.05, ++p <0.01 indicate a significant difference between the control group and the GalN treated group.

*p < 0.05, **p < 0.01 indicate a significant difference between the GalN group and the medicine treated group.

대조군의 혈청 AST와 ALT 활성은 60.1±3.2 IU/L와 35.6±2.0 IU/L로 나타났으나 D-galactosamine으로 간독성을 유발한 GalN 실험군은 180.0±1.5 IU/L와 101.0±3.5 IU/L로 유의하게 증가하였다. 이러한 증가는 산겨릅나무의 세포배양 추출물 (300 mg/kg)을 처리한 실험군에서 150.7±1.8 IU/L와 95.6±0.9 IU/L, 살리드로사이드 30 mg/kg를 처리한 실험군에서는 132.1±0.9 IU/L와 90.2±0.1 IU/L로 감소하였는데, 특히 살리드로사이드 100 mg/kg를 처리한 실험군은 99.5±1.4 IU/L와 42.9±0.7 IU/L로 유의하게 감소하였다. 또한 LDH 수치는 대조군이 1041.2±11.2 IU/L인데 반해 GalN군이 2317.0±13.1 IU/L로 나타나 간독성 유발로 LDH 활성이 증가하였으나 산겨릅나무의 세포배양 추출물 300 mg/kg를 처리한 실험군에서 2017.2±19.1 IU/L, 살리드로사이드 30 mg/kg를 처리한 실험군에서 1880.3±23.3 IU/L로 감소하였고, 살리드로사이드 100 mg/kg를 처리한 실험군의 경우 1320.0±19.6 IU/L로 나타나 대조군의 LDH 수준과 유사하게 감소된 것으로 확인되었다.

실시예 5 : 산겨릅나무 식물세포의 배양 추출물 및 이로부터 분리된 살리드로사이드의 간독성 치료 효과

실시예 5-1: 실험동물의 처리

상기 실시예 4-2와 같이 준비한 실험동물에 만성 간독성을 유발하기 위하여 모든 실험군에 D-galactosamine (400 mg/kg)을 실험 시작 당일과 3일 경과 후 복강 투여하여 만성 간독성을 유발하였으나, 대조군은 D-galactosamine 대신 동량의 생리식염수를 투여하였다. 또한 약물 투여 실험군은 D-galactosamine 투여 24시간 후부터 상기 실시예 4-1과 같이 준비한 산겨릅나무의 세포배양물 (300 mg/kg) 및 살리드로사이드 (30 mg/kg, 100 mg/kg)를 극소량의 DMSO에 용해 후 생리식염수와 1%의 olive oil로 희석하여 5 일간 매일 일정시간에 경구 투여하였다.

실험 최종일에 실험동물을 약 12시간 절식시킨 후 ether로 마취시켜 경동맥에서 혈액을 채취하였다. 채취한 혈액은 serum용 튜브에 받아 1,500 rpm에서 15분간 원심분리 후 혈청을 회수하여 분석 전까지 -80℃에서 저온 보관하였다.

실시예 5-2: 혈액성분 분석을 통한 간독성 치료 효과 평가

채취한 혈액을 이용하여 상기 실시예 4-3에서와 같이 AST (aspartate aminotransferase), ALT (alanine aminotransferase) 및 LDH (lactate dehydrogenase)의 활성을 조사하여 아래 표 6에 나타냈다.

⁺ p < 0.05, ⁺⁺ p <0.01 indicate a significant difference between the control group and the GalN treated group.

^* p < 0.05, ^** p < 0.01 indicate a significant difference between the GalN group and the medicine treated group.

대조군의 혈청 AST와 ALT 활성은 62.5±4.2 IU/L와 34.9±1.1 IU/L로 나타났으나 D-galactosamine으로 간독성을 유발한 GalN 실험군은 201.0±3.3 IU/L와 99.8±2.0 IU/L로 유의하게 증가하였다. 이러한 증가는 산겨릅나무의 세포배양 추출물을 300mg/kg 처리한 실험군에서 162.4±3.2 IU/L와 90.2±1.5 IU/L, 살리드로사이드를 30 mg/kg 처리한 실험군에서 105.3±2.2 IU/L와 64.7±1.0 IU/L로 감소하였는데, 특히 살리드로사이드를 100 mg/kg 처리한 실험군은 101.6±1.0 IU/L와 50.3±1.4 IU/L로 유의하게 감소하였다.

또한 LDH 수치는 대조군이 1030.2±11.9 IU/L인데 반해 D-galactosamine으로 간독성을 유발한 실험군이 2510.0±16.7 IU/L로 나타나 간독성 유발로 활성이 증가하였으나 산겨릅나무의 세포배양 추출물 300 mg/kg를 처리한 실험군에서 2401.8±14.4 IU/L, 살리드로사이드 30 mg/kg를 처리한 실험군에서 1895.1±10.8 IU/L로 감소하였고, 특히 살리드로사이드를 100 mg/kg 처리한 실험군의 경우 1540.6±17.1 IU/L로 나타나 대조군의 LDH 수준과 유사하게 감소된 것으로 확인되었다.

한국생명공학연구원

KCTC12257BP

20120807

Claims

(a) 산겨릅나무(Acer tegmentosum Maxim)의 조직을 캘러스 유도 배지에 접종하여 캘러스를 유도하는 단계;
(b) 상기 캘러스로부터 액체 배지에서 배양 가능한 식물세포를 제조하는 단계; 및
(c) 상기 식물세포를 액체 배지에서 배양하여 배양액을 수득하고 이의 추출물을 얻는 단계를 포함하는, 산겨릅나무 식물세포의 배양 추출물을 제조하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (b) 단계의 액체 배지에, 이차대사산물의 생산 유도제 및 이차대사산물의 전구체로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 물질을 추가하여 이차대사산물의 생산을 증가시키는 것인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 유도제는 생물성 유도제로서 곰팡이, 세균 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 세포의 파쇄물, 추출물, 분획 추출물, 또는 여과물인 생산방법.
제 3 항에 있어서, 상기 유도제는 곰팡이, 세균 및 효모로 이루어진 군에서 선택된 세포로부터 얻어진, 다당체, 당단백질, 비활성화된 효소, 쿠드란, 잔탄, 키토산 및 글루칸으로 이루어지는 군에서 선택된 1종 이상의 물질인 방법.
제 2 항에 있어서, 상기 유도제는 금속염류 및 식물 대사 조절제로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상의 비생물성 유도제인 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 금속염류는 질산은, 염화카드늄 및 염화코발트로 이루어지는 군에서 선택되는 1종 이상인 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 식물 대사 조절제는 살리실산 (salicylic acid), 자스몬산 (jasmonic acid), 및 메틸자스모네이트 (methyl jasmonate)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (b)단계에서, 자당, 유당, 과당 및 포도당으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 삼투압 증가제를 추가로 첨가하는 것인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 식물 세포는 산겨릅나무의 식물 세포 SYGB-5 (KCTC 12257BP)인 것인 생산방법.
제 1 항에 있어서, 상기 (c)단계에서 얻어진 식물세포의 배양 추출물은 추출용매로 추출된 용매추출물, 유기용매를 이용한 분배 추출법으로 추출된 분배 추출물, 및 칼럼 크로마토그래피를 이용한 분획추출법으로 추출된 분획추출물로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인, 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 용매추출물은 물, 탄소수 1 내지 5의 저급알코올, 클로로포름, 디클로로메탄, 벤젠, 아세톤, 헥산, 에틸아세테이트 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택된 1 종 이상의 추출용매로 추출된 용매추출물인 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 분배추출물은 부탄올, 클로로포름, 디클로메탄, 벤젠, 헥산 및 에틸아세테이트로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 유기용매로 분배하여 얻어진 추출물인 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 용매추출물을 유기용매를 이용한 분배 추출법으로 분배추출물을 얻고, 이어서 칼럼 크로마토그래피법으로 처리하여 얻어진 분획 추출물인 방법.
수탁번호 KCTC 12257BP을 갖는 산겨릅나무 유래 식물 세포.
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