CN108795840A - 一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括以下步骤：A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的木贼，消毒后接种于木贼愈伤组织诱导培养基，诱导出木贼愈伤组织；B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液；C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，装入高产阿魏酸木贼干细胞培养液中悬浮培养，得木贼干细胞固体粉末；D、将步骤C获得的木贼干细胞固体粉进行破壁处理；E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2‑3）混合，过滤，冷冻结晶，分离出柱型结晶，得高含量阿魏酸木贼提取物。本发明具有所得阿魏酸木贼提取物得率高，阿魏酸木贼提取物中阿魏酸含量高的优点。

Description

一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及植物干细胞培养技术领域，具体涉及一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法。
背景技术
阿魏酸在医药，食品，化妆品等领域有着日益广泛的用途。作为药品具有抗炎，止痛，抗血栓形成，抗紫外线辐射，抗自由基以及调节人体免疫功能的作用，调节内分泌、改善微循环和抗疲劳作用。在临床上用于冠心病，脑血管病，脉管炎，白细胞和血小板减少等疾病的治疗。在化妆品中则主要作为抗氧化剂使用，具有吸收紫外线和防止氧化的作用。阿魏酸是科学界公认的美容因子，能改善皮肤质量，使其细腻、光泽、富有弹性。它能防止因日晒而形成的色斑及雀斑，还能抑制自由基的过量产生，改善肤质，调节内分泌，使肌肤细腻光泽，富有弹性。作用机理：通过抑制色素细胞的酪氨酸脢(Tyrosinase)与铜离子反应，来减少黑色素的形成与沉淀。
早期，阿魏酸主要是从当归中提取，需要使用大量的有机提取溶剂，而且产物的纯化困难，更重要的是提取效率较低，产量难以满足需求。目前，阿魏酸主要是采取化学合成的方法制备以香兰素和丙二酸为原料通过Knoevenagel反应合成。该路线存在一些缺点：(1)该反应所用的催化剂为吡啶，苯胺等，溶剂和带水剂为甲苯。吡啶具有强烈的恶臭，毒性较大：苯胺具有强烈的致癌作用；甲苯也是易挥发的中强毒性的有机溶剂，不符合绿色化学的要求。(2)反应需要时间，较长，长达几十个小时。(3)反应原料丙二酸昂贵，生产成本较高。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法。该方法获得的木贼干细胞固体粉末中阿魏酸木贼提取物含量较高，阿魏酸木贼提取物得率高，阿魏酸木贼提取物中阿魏酸的含量高的优点。
解决上述技术问题的具体技术方案如下：
一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗1-3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数60-80％的乙醇消毒30-35s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒5-10min，再用无菌水冲洗5-8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成2-5mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的木贼愈伤组织；
B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取45-70％MS培养基、10-25％卡拉胶、2.5-5.5％2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-4.2％蔗糖、0.05-0.2％3-吲哚丁酸、0.05-0.35％N6-异戊烯基腺嘌呤、0.04-0.1％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100-120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000-1500lx，每天光照8小时，培养10-12天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末；
D、按质量比1:(1-3)将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:(2-3)混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量阿魏酸木贼提取物。
优选的，所述步骤A中木贼愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖20-25g/L、琼脂3-6g/L、噻苯隆1.0-3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5-3.5mg/L、a-萘乙酸0.1-0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.01-0.07mg/L，pH值5.8。
优选的，所述步骤A中诱导培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养20-30天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。
优选的，所述步骤A中继代培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养55-65天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。
本发明所得高含量阿魏酸木贼提取物在化妆品中应用，具有祛黑眼圈祛皱保湿功效。
本发明提供一种眼霜，包括如下重量百分比的组分：上述阿魏酸木贼提取物0.1-5％、霍霍巴(SIMMONDSIA CHINENSIS)脂0.1-2％、环五聚二甲基硅氧烷5-15％、环己硅氧烷1-5％、聚二甲基硅氧烷1-5％、聚二甲基硅氧烷醇1-3％、SEPIPLUS 2650.3-0.8％、聚二甲基硅氧烷PEG-10/15交联聚合物0.1-2％、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1-0.5％、水解透明质酸钠0.01-0.1％、精氨酸0.1-0.5％、焦糖色0.001-0.01％、多元醇5-15％、水余量。
在其中一些实施例中，所述多元醇为甘油、山梨醇、1,3-丁二醇中的一种或一种以上的混合。
在其中一些实施例中，所述眼霜还可以包括防腐剂，所述防腐剂的添加量为0.1-1％，所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠中的一种。
本发明所述的SEPIPLUS 265是赛比克公司的一款乳化增稠剂。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种高含量阿魏酸木贼干细胞培养技术，可进行大规模培养获取大量的原材料，采用反相HPLC法测定，阿魏酸木贼提取物的含量可达木贼干细胞干重的9.5-11.5％，阿魏酸木贼提取物得率可达7.5-9.5％，阿魏酸木贼提取物中阿魏酸的含量大于94％。本发明制备的高含量阿魏酸木贼提取物可用于制备食品、保健品、化妆品以及药品。
本发明通过采用特定的高产阿魏酸木贼干细胞培养液，用植物干细胞培养的方法获取富含阿魏酸的木贼干细胞，培养周期短，可进行大规范生产，所得木贼干细胞固体粉末中阿魏酸的含量高；阿魏酸木贼提取物的含量可达木贼干细胞干重的9.5-11.5％，阿魏酸木贼提取物得率可达7.5-9.5％，阿魏酸木贼提取物中阿魏酸的含量大于94％。
本发明所得高含量阿魏酸木贼提取物应用在化妆品中，具有祛黑眼圈祛皱保湿功效。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数或条件，可参照常规技术进行。
本发明所述MS培养基采用生产商Sigma-Aldrich，型号M5519。
实施例1
一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗1遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数60％的乙醇消毒30s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒5min，再用无菌水冲洗8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成2mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60％，先暗培养两周，再光培养30天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60％，先暗培养两周，再光培养60天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到增殖后的木贼愈伤组织；所述木贼愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖25g/L、琼脂3g/L、噻苯隆3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤3.5mg/L、a-萘乙酸0.1mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.01mg/L，pH值5.8；
B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取45％MS培养基、10％卡拉胶、5.5％2,4-二氯苯氧乙酸、1.5％蔗糖、0.2％3-吲哚丁酸、0.35％N6-异戊烯基腺嘌呤、0.04％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500lx，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇的重量为60g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末的净重量为17g，采用反相HPLC测定固体粉末中阿魏酸的含量为9.5％；
D、按质量比1:3将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的阿魏酸纯度为94.5％,从木贼细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量阿魏酸木贼提取物的收率为80％。
实施例2
一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数80％的乙醇消毒35s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒10min，再用无菌水冲洗5次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成5mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度70％，先暗培养两周，再光培养20天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度70％，先暗培养两周，再光培养40天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到增殖后的木贼愈伤组织；所述木贼愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖20g/L、琼脂6g/L、噻苯隆1.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L、a-萘乙酸0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.07mg/L，pH值5.8；
B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取70％MS培养基、25％卡拉胶、2.5％2,4-二氯苯氧乙酸、4.2％蔗糖、0.05％3-吲哚丁酸、0.05％N6-异戊烯基腺嘌呤、0.1％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000lx，每天光照8小时，培养10天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇的重量为75g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末的净重量为12g，采用反相HPLC测定固体粉末中阿魏酸的含量为10.5％；
D、按质量比1:1将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:3混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的阿魏酸纯度为95.5％,从木贼细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量阿魏酸木贼提取物的收率为82％。
实施例3
一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗2遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数70％的乙醇消毒32s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒8min，再用无菌水冲洗7次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成3mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度65％，先暗培养两周，再光培养25天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度65％，先暗培养两周，再光培养50天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到增殖后的木贼愈伤组织；所述木贼愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖23g/L、琼脂4g/L、噻苯隆2g/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L、a-萘乙酸0.3mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.04mg/L，pH值5.8；
B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取50％MS培养基、20％卡拉胶、3％2,4-二氯苯氧乙酸、3％蔗糖、0.1％3-吲哚丁酸、0.2％N6-异戊烯基腺嘌呤、0.06％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至80℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在110rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1300lx，每天光照8小时，培养11天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇的重量为70g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末的净重量为10g，采用反相HPLC测定固体粉末中阿魏酸的含量为11.5％；
D、按质量比1:2将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:3混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的阿魏酸纯度为96.5％,从木贼细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量阿魏酸木贼提取物的收率为85％。
实施例4
一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗2遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数75％的乙醇消毒34s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒7min，再用无菌水冲洗6次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成4mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60％，先暗培养两周，再光培养28天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度65％，先暗培养两周，再光培养55天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到增殖后的木贼愈伤组织；所述木贼愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖22g/L、琼脂5g/L、噻苯隆1.5g/L、6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L、a-萘乙酸0.2mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.05mg/L，pH值5.8；
B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取60％MS培养基、15％卡拉胶、4％2,4-二氯苯氧乙酸、3.5％蔗糖、0.15％3-吲哚丁酸、0.25％N6-异戊烯基腺嘌呤、0.08％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1200lx，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇的重量为65g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末的净重量为9g，采用反相HPLC测定固体粉末中阿魏酸的含量为10.4％；
D、按质量比1:1将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的阿魏酸纯度为95.2％,从木贼细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量阿魏酸木贼提取物的收率为83％。
实施例5
一种眼霜，包括如下重量百分比的组分：实施例1制备得的阿魏酸木贼提取物5％、霍霍巴(SIMMONDSIA CHINENSIS)脂0.1％、环五聚二甲基硅氧烷15％、环己硅氧烷5％、聚二甲基硅氧烷1％、聚二甲基硅氧烷醇3％、SEPIPLUS 2650.3％、聚二甲基硅氧烷PEG-10/15交联聚合物2％、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1％、水解透明质酸钠0.1％、精氨酸0.1％、焦糖色0.01％、甘油5％、水余量。
实施例6
一种眼霜，包括如下重量百分比的组分：实施例2制备得的阿魏酸木贼提取物0.1％、霍霍巴(SIMMONDSIA CHINENSIS)脂2％、环五聚二甲基硅氧烷5％、环己硅氧烷1％、聚二甲基硅氧烷5％、聚二甲基硅氧烷醇1％、SEPIPLUS 2650.8％、聚二甲基硅氧烷PEG-10/15交联聚合物0.1％、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.5％、水解透明质酸钠0.01％、精氨酸0.5％、焦糖色0.001％、山梨醇15％、山梨酸钾0.1％、水余量。
实施例7
一种眼霜，包括如下重量百分比的组分：实施例3制备得的阿魏酸木贼提取物3％、霍霍巴(SIMMONDSIA CHINENSIS)脂1％、环五聚二甲基硅氧烷10％、环己硅氧烷3％、聚二甲基硅氧烷3％、聚二甲基硅氧烷醇2％、SEPIPLUS 2650.6％、聚二甲基硅氧烷PEG-10/15交联聚合物1％、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.3％、水解透明质酸钠0.05％、精氨酸0.3％、焦糖色0.005％、1,3-丁二醇10％、苯甲酸钠0.6％、水余量。
实施例8
一种眼霜，包括如下重量百分比的组分：实施例4制备得的阿魏酸木贼提取物2％、霍霍巴(SIMMONDSIA CHINENSIS)脂0.5％、环五聚二甲基硅氧烷12％、环己硅氧烷2％、聚二甲基硅氧烷4％、聚二甲基硅氧烷醇2％、SEPIPLUS 2650.5％、聚二甲基硅氧烷PEG-10/15交联聚合物0.8％、丙烯酸(酯)类/C10-30烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.2％、水解透明质酸钠0.05％、精氨酸0.4％、焦糖色0.008％、甘油5％、山梨醇7％、山梨酸钾1％、水余量。
试验例1本发明眼霜的祛黑眼圈效果
为测试产品的实际使用效果,对实施例5-8和对比例(市售具有祛黑眼圈功效的眼霜)分别进行了人群试用调查,派发样品给250名眼周围皮肤血液淤滞及浮肿现象的黑眼圈患者试用,年龄15-44岁,男性100名，女性150名，受试者随机均分为5组,眼霜用量根黑眼圈大小调整，彻底清洁面部肌肤后,以无名指将本产品轻轻涂抹于眉骨及眼部下方,用手指在黑眼圈上按摩直至完全吸收,眼霜每日早、晚两次涂抹。使用前拍下照片以作对比，试用30天,同时填写调查问卷,最后统计结果。
分级判定的标准：
治愈：黑眼圈消失,浮肿消失。
显效：黑眼圈变浅,浮肿变小。
无效：无改变或自觉症状加重。
人群试用调查结果表1
试用结果 治愈/例 显效/例 无效/例 显效率/％
实施例5 39 9 2 96
实施例6 43 6 1 98
实施例7 46 4 0 100
实施例8 41 9 0 100
对比例 10 20 20 60
人群试用结果表明,眼霜对祛除黑眼圈有显著疗效。
由上述表1数据可知,受试者使用本发明的眼霜30天,显效改善症状可达100％。祛黑眼圈效果优于市售产品。说明本发明制备的阿魏酸木贼提取物的祛黑眼圈性能优越。
经问卷得知,本发明眼霜经使用后,温和，没有刺激性,安全,无毒副作用，并且对痊愈患者的原黑眼圈部位进行检查,皮肤变得柔嫩细腻,紧致。询问患者得知,80％的患者眼部浮肿消失,眼睛不易疲劳，变得更有神采。
试验例1本发明眼霜的祛皱效果
为了评估本发明眼霜的功效，将实施例5-8和对比例(市售具有祛皱功效的眼霜)制得的产品在志愿者身上进行测试，参与试验志愿者250人，其中男性100人，女性150人，年龄在30岁到50岁之间，随机分为5组，每组50人，使用制得的眼霜，选择志愿者左右眼缘部位作为实验部位；涂抹上述抗皱霜样品，每天早晚涂抹两次，每次1克。实验期间，志愿者在实验部位不能涂抹任何其它化妆品；志愿者在测试部位连续使用眼霜2个月和3个月后，以涂抹前的照片为对照，评价眼霜祛皱的效果。同时询问志愿者使用样品后自我感觉及有无过敏现象等，并记录下来，使用结果见表2。
记录前后对比疗效标准：
显效：皮肤光滑富有弹性，皱纹明显淡化，小细纹消失。
有效：皮肤较为光滑，弹性有所改善，小细纹明显淡化，但皱纹依然存在。
无效：小细纹、皱纹依然存在，甚至有加深的趋势。
观察使用结果可以看出，本发明实施例5-8所提供的眼霜有明显的消除皱纹、平滑肌肤的效果，长期使用效果更佳，能让皮肤光滑紧致、富有光泽，且没有发现产品对试用者产生刺激过敏现象。
从上表2可以看出，涂抹实施例5-8制备高含量阿魏酸木贼提取物的眼霜在使用后2个月、3个月后祛皱效果均高于市售产品,说明本发明制备的阿魏酸木贼提取物的祛皱性能优越。
试验例3对实施例5-8制得的眼霜进行保湿功效测试
本测试使用德国CK公司的Corneometer测试，恒温恒湿房间条件为25℃，50％相对湿度，志愿者120人，平均分为6个小组，每组20人，分别涂抹空白样品、0.5％透明质酸钠(山东福瑞达公司,平均分子量为130万)及实施例5-8制备高含量阿魏酸木贼提取物的眼霜。
1)受试者需要使用指定的洁面乳清洗双手前臂内侧，清洁后在受试者双手前臂内侧做好测量区域标记。正式测试前应该在恒温恒湿房间内静坐20min，前臂暴露。
2)使用Corneometer对受试者左右手臂内侧指定区域进行测量和记录。
3)先测量各测试区域的初始值，求平均值，然后将试样均匀涂布于测试区域内。
4)用Corneometer分别在样品使用后2小时、4小时、6小时、8小时进行测量受试区域和空白对照区域的皮肤水合状态值，求平均值。测试由同一个测量人员完成。
皮肤水分含量随时间延长变化情况，实验结果见表3(表中数字为实测的皮肤水合状态值)
表3
标注：样品A为未添加任何提取物的相同基质的空白样品；样品B为添加0.5％透明质酸钠样品的相同基质的样品；样品C为实施例5制备的样品；样品D为实施例6制备的样品；样品E为实施例7制备的样品；样品F为实施例8制备的样品；
从上表可以看出，涂抹实施例5-8制备高含量阿魏酸木贼提取物的样品C在使用后2小时、4小时、6小时、8小时后皮肤水分含量均高于添加0.5％透明质酸钠样品的相同基质的样品B,说明本发明制备的阿魏酸木贼提取物的保湿性能优于透明质酸钠。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (9)

1.一种高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、挑选新鲜木贼，先流水冲洗1-3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数60-80%的乙醇消毒30-35s，然后用0.1%HgCl2 溶液消毒5-10min，再用无菌水冲洗5-8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将木贼切成2-5mm小段，接种于木贼愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养木贼愈伤组织；将得到的初级培养木贼愈伤组织再转接至木贼愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的木贼愈伤组织；
B、制备高产阿魏酸木贼干细胞培养液：按质量比称取45-70% MS培养基、10-25%卡拉胶、2.5-5.5% 2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-4.2%蔗糖、0.05-0.2% 3-吲哚丁酸、0.05-0.35% N6-异戊烯基腺嘌呤、0.04-0.1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的木贼愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例,装入含250mL高产阿魏酸木贼干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100-120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000-1500lx，每天光照8小时，培养10-12天得到乳白色团簇即木贼干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得木贼干细胞固体粉末；
D、 按质量比1:（1-3）将步骤C获得的木贼干细胞固体粉末与丙二醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、 将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2-3）混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量阿魏酸木贼提取物。
2.根据权利要求1所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中木贼愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖20-25g/L、琼脂3-6g/L、噻苯隆1.0-3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5-3.5mg/L、a-萘乙酸0.1-0.5mg/L、2,4-二氯苯氧乙酸0.01-0.07mg/L，pH值5.8。
3.根据权利要求1所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中诱导培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养20-30天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。
4.根据权利要求1所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中继代培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养40-60天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。
5.根据权利要求1-4任一项所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于：所得高含量阿魏酸木贼提取物可以添加至化妆品，使得化妆品具有美白和保湿功效。
6.根据权利要求5所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述化妆品为眼霜。
7.根据权利要求6所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述眼霜包括如下重量百分比的组分：权利要求1-4任一项制得的阿魏酸木贼提取物0.1-5%、霍霍巴（SIMMONDSIA CHINENSIS）脂0.1-2%、环五聚二甲基硅氧烷5-15%、环己硅氧烷1-5%、聚二甲基硅氧烷1-5%、聚二甲基硅氧烷醇1-3%、SEPIPLUS 265 0.3-0.8%、聚二甲基硅氧烷 PEG-10/15 交联聚合物0.1-2%、丙烯酸（酯）类/C10-30 烷醇丙烯酸酯交联聚合物0.1-0.5%、水解透明质酸钠0.01-0.1%、精氨酸0.1-0.5%、焦糖色0.001-0.01%、多元醇5-15%、水余量。
8.根据权利要求7所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述眼霜中，所述多元醇为甘油、山梨醇、1,3-丁二醇中的一种或一种以上的混合。
9.根据权利要求7所述的高含量阿魏酸木贼提取物的制备方法，其特征在于，所述眼霜还包括防腐剂，所述防腐剂的添加量为0.1-1%，所述防腐剂为山梨酸钾、苯甲酸钠中的一种。
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