CN105560157A - 虫草属真菌提取物的新用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及虫草属真菌提取物的新用途。本发明首先公开了虫草属真菌提取物作为外用护肤作用有效成分的用途。基于上述用途，本发明还进一步公开了一种化妆品组合物，含有护肤有效量的虫草属真菌提取物作为护肤有效成分。本发明揭示了虫草属真菌提取物具有使皮肤增白、增亮、以及修复等护肤作用，且在某些方面的功效超过现有已知的成分和制剂，十分适宜用作化妆品原料。

Description

虫草属真菌提取物的新用途

技术领域

本发明涉及虫草属真菌，特别是涉及虫草属真菌提取物的新用途。

背景技术

肌肤的美白、增亮、修复、祛皱、保湿、和抗衰老始终是一个巨大的市场。消费者对于高效、无毒产品有着持续性的期待。经过科学和实践认证过的新型肌肤的美白、增亮、修复、祛皱、保湿、和抗衰老产品很容易受到市场的追捧。

然而，一些皮肤美白成品中往往会添加一些具有毒性的美白化学成份，例如,含汞化合物、对苯二酚也称氢醌(Hydroquinone)、维甲酸(Tretinoin)、水杨酸(Salicyclicacid)、曲酸(Kojiacid)等；这些成份正受到各国监管部门的严格监控，要么完全禁止，或者是含量限制。

在现有的使用天然抽提物进行肌肤美白的专利中，都没有通过科学的体外细胞试验和人体临床试验来证明它们的功效。例如中华人民共和国专利201510062060.0公开了使用甘草、橄榄叶、绿茶和虎杖提取物作为活性成分的面膜具有美白、提亮和保湿功效。但其证明功效的方法是54人的主观感官评价。另外，中华人民共和国专利99124005.7所公开的美白配方中所含美白成份现在已属于禁止或限制使用之类例如曲酸、熊果苷。中华人民共和国专利201280061188.X则报道水溶性聚(环氧乙烷)树脂和一种或多种聚合物成膜剂提亮皮肤。

美国专利US20060018861阐述了一般认为具有皮肤增亮的成份，包括抗坏血酸化合物，壬二酸，丁基羟基茴香醚，没食子酸及其衍生物，甘草酸，对苯二酚(氢醌)，曲酸，熊果苷，桑树提取物，以及它们的混合物。皮肤增白和增亮成份的化学结构包括：羟基内酯、羧酸和二羧酸、苯基羧酸、苯酚。

美国专利US20060018861公开了一种皮肤护理组合含有一种类黄酮化合物和维生素B3并含有2％油性成份的水包油作为载体，这种组合具有亮肤和延缓衰老的功效。美国专利US8362305则公开了一种酪氨酸酶抑制剂-2,4-二羟基苯衍生物，这是一种皮肤袪色药用化合物。

美国专利USPatent5401504发现使用姜黄可以促进伤口皮肤的愈合。美国专利US5652274公开了可以促进伤口皮肤愈合的组合物，包括一种含有丙酮酸、一种抗氧化剂、饱和和不饱和脂肪酸的混合物；或者另一种含有丙酮酸、乳酸、饱和和不饱和脂肪酸的混合物。美国专利US8410055和US8455443公开热休克蛋白900alpha(hsp900)特别是其中间区域带电荷的氨基酸排列或者与其相类似的5-120氨基酸的短肽链可以通过强化上皮细胞的重建以及真皮细胞的再生来帮助伤口愈合。

所以，在现有已公开的专利中，和已发表的论文中都没有关于虫草属真菌细胞抽提物和成份结构在皮肤增白、增亮、修复、祛皱、保湿、和抗衰老方面的功效以及应用方面的论述。

发明内容

鉴于以上所述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种虫草属真菌提取物的新用途。

本发明第一方面提供了虫草属真菌提取物作为外用护肤作用有效成分的用途。

所述护肤作用选自以下：增白、增亮、修复、祛皱、保湿、和抗衰。

所述虫草属真菌选自：冬虫夏草(Cordycepssinensis或Ophiocordycepssinensis)、中华被毛孢(Hirsutellasinensis)、蝙蝠蛾拟青霉(PaecilomyceshepialidChenetDai,sp.Nov)、蝙蝠蛾被毛孢(HirsutellahepialiChenetShen)、蛹虫草或北虫草(Cordycepsmilitaris)、虫草藻(Cordycepsgracilis)、大团囊虫草(Cordycepsophioglossoides)、Cordycepsmemorabillis、Cordycepssphecocephala、亚香棒虫草(Cordycepshawkesii)、珊瑚虫草(Cordycepsmartialis)、蝉花(Cordycepssobolifera)、虫草实蝇(Cordycepscapitata)中的一种或多种。

所述虫草属真菌提取物是指：虫草属真菌的菌丝体与孢子的提取物。

优选的，所述虫草属真菌提取物为以虫草属真菌的菌丝体与孢子为原料经醇提制得。

较佳的，所述虫草属真菌提取物含有弱酸性粘多糖，还原性有机羧酸以及多酚化合物。

同样较佳的，所述虫草属真菌提取物具备抗氧化剂活性。

优选的，虫草属真菌提取物以干物质计，还原性有机羧酸含量不低于27克/100克，多酚化合物含量不低于1370mgGAE/100克,亲水性抗氧化剂活性不低于40,000molTrolox当量/100克，弱酸性粘多糖不低于48克/100克。

所述虫草属真菌的菌丝体与孢子可为虫草属真菌经人工培养获得。

进一步优选的，为防止人工培养过程中发生发酵污染，所述人工培养的虫草属真菌为虫草属真菌纯种。

更进一步的，为了使得虫草属真菌发酵周期缩短，更好地适应大工业生产要求，所述人工培养用的虫草属真菌为经驯化的虫草属真菌纯种。

可通过将有效量的虫草属真菌提取物施用于肌肤上以起到增白、增亮、修复、祛皱、保湿、和抗衰等目的。

本发明第二方面，提供了一种化妆品组合物，含有护肤有效量的虫草属真菌提取物作为护肤有效成分。

所述作为护肤有效成分可以是作为增白有效成分、增亮有效成分、修复有效成分、祛皱有效成分、保湿有效成分、和抗衰有效成分中的至少一项。

进一步的，为使得化妆品组合物有更好的观感与味道，所述虫草属真菌提取物经脱色和/或脱味处理。

进一步的，为降低肌肤所对述化妆品组合物的敏感性，所述虫草属真菌提取物进行了脱蛋白质处理。

所述化妆品组合物中还可以含有至少一种化妆美容可接受的辅料。

所述化妆品组合物中，可以虫草属真菌提取物作为其唯一增白、增亮、修复、祛皱、保湿或抗衰有效成分，或者也可以将虫草属真菌提取物作为增白、增亮、修复、祛皱、保湿或抗衰有效成分之一与其他同样具有增白、增亮、修复、祛皱、保湿或抗衰功效的有效成分同时含有。

本发明经研究惊讶地发现，虫草属真菌提取物具有使皮肤增白、增亮、以及修复的作用。在给定的实验条件下，其在这三方面的功效超过现有已知的成分和制剂。成份分析表明虫草真菌抽提物含有皮肤增白、增亮、保湿、祛皱、肌肤紧致、抗衰老、平滑等方面有一定功效的有效成分。自愿试用者对含虫草真菌制剂的化妆品进行了感官评价，结果显示在“紧脸/皮肤紧致”、“皮肤更光滑/更细嫩”方面比较有效；而在“皮肤年轻/复原”方面非常有效，在肌肤增白和增亮方面的功效优于市场上知名品牌产品。

附图说明

图1：CS-X100或HH-X100菌体细胞的气相色谱-质谱仪(GC-MS)标准图谱。

图2皮肤增白和增亮的人体临床实验前臂涂抹部位示意图

图3：样品CAM6，7，8的皮肤白亮参数比较。

图4：样品CAM31，32，33的皮肤白亮参数比较

图5：虫草真菌细胞多糖水解物的HPLC图谱。

图6：六种标准单糖在HPLC上的图谱。六种单糖标准包括：葡萄糖胺、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-葡萄糖醛酸、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺。

图7：虫草真菌细胞提取物的皮肤细胞修复能力。

具体实施方式

本发明经研究惊讶地发现，虫草属真菌种系的菌种经过液体和固体发酵主要是液体深层发酵所培养产生的真菌细胞或它们的代谢产物经过活性成份的分析鉴定、体外细胞实验，人体临床实验证明其具有使皮肤增白、增亮、以及修复的作用。在给定的实验条件下，其在这三方面的功效超过现有已知的成分和制剂。

此外，成份分析表明虫草真菌抽提物含有大量的还原性有机羧酸。气相色谱-质谱法的鉴定表明这些有机羧酸包括多种二羧酸、以及α,β-羟基酸。有机羧二酸是公认的皮肤增白/增亮成份；而α,β-羟基酸除了增白/增亮效果，还对皮肤保湿、祛皱、肌肤紧致和平滑等方面有一定的功效。

成份分析还表明虫草真菌抽提物含有大量的多糖。高效液相色谱法的鉴定发现这种多糖不是葡聚糖，而是某种弱酸性粘多糖/糖胺聚糖。粘多糖/糖胺聚糖例如玻尿酸不仅是细胞生长因子，在护肤方面它具有肌肤补水的作用。

成份分析又表明虫草真菌抽提物含有大量的多酚化合物，具有超高活性的抗氧化能力，从而使它具有优良的肌肤抗衰老功能。

自愿试用者对含虫草真菌制剂的商业护肤精华液进行了感官评价，结果显示在“紧脸/皮肤紧致”方面比较有效；在“皮肤更光滑/更细嫩”方面比较有效；而在“皮肤年轻/复原”方面非常有效。

特别是发明是有关某种护肤成品例如精华液、面霜或面膜中含有发明所阐述的虫草属真菌提取物或成份作为唯一的活性成份。这种护肤成品在肌肤增白和增亮方面的功效优于市场上知名品牌产品。

虫草属真菌提取物作为外用护肤作用有效成分

虫草属真菌提取物是指：虫草属真菌的菌丝体与孢子的提取物。

一般上，任何一种虫草属真菌均可以考虑接受。组群中可供选择的虫草菌种类包括：冬虫夏草(Cordycepssinensis或Ophiocordycepssinensis)、中华被毛孢(Hirsutellasinensis)、蝙蝠蛾拟青霉(PaecilomyceshepialidChenetDai,sp.Nov)、蝙蝠蛾被毛孢(HirsutellahepialiChenetShen)、蛹虫草或北虫草(Cordycepsmilitaris)、虫草藻(Cordycepsgracilis)、大团囊虫草(Cordycepsophioglossoides)、Cordycepsmemorabillis、Cordycepssphecocephala、亚香棒虫草(Cordycepshawkesii)、珊瑚虫草(Cordycepsmartialis)、蝉花(Cordycepssobolifera)、虫草实蝇(Cordycepscapitata)。在本发明实施例中，虫草真菌均以冬虫夏草为例。

优选的，所述虫草属真菌提取物为以虫草属真菌的菌丝体与孢子为原料经醇提制得。

进一步的，醇提所用的提取溶剂为乙醇水溶液。

醇提所用乙醇水溶液的体积百分比浓度可为常规，如体积百分比30％以上，优选50％以上。

所用醇提工艺可为常规醇提工艺，即采用提取溶剂浸透待提取物后进行固液分离，有效成分溶出于提取溶剂中，进一步去除提取溶剂即可获得提取物。

醇提所用的待提取物可以是虫草属真菌的菌丝体与孢子的混合物。为了缩短提取时间，亦可将虫草属真菌的菌丝体与孢子破碎后作为待提取物。

本发明使用气相色谱-质谱法(GC-MS)发现虫草真菌细胞提取物含有多种有机羧二酸及衍生物，特别是丁二酸、庚二酸、癸二酸，或类似物。有机羧二酸是公认的皮肤增白/增亮成份。

此外，本发明使用气相色谱-质谱法(GC-MS)还发现虫草真菌细胞提取物含有多种α,β-羟基酸，特别是α-羟基丙酸、α-羟基乙酸、β-羟基丙酸、β-羟基异丁酸、α-β-二羟基丙酸，或类似物。除了增白/增亮效果，α,β-羟基酸还用于皮肤保湿、去除死皮细胞、除皱、改善痤疮疤痕的外观、改善光老化皮肤的外观、肌肤紧致和平滑。

较佳的，所述还原性有机羧酸包括α-羟基丙酸(α-hydroxypropanoicacid)或其衍生物或类似物、α-羟基乙酸(α-hydroxyaceticacid)或其衍生物或类似物、3-羟基丙酸/β-羟基丙酸(3-Hydroxypropionicacid)或其衍生物或类似物、β-羟基异丁酸(β-hydroxyisobutyricacid)或其衍生物或类似物、丁二酸(Butanedioicacid)或其衍生物或类似物、α-β-二羟基丙酸(2,3-Dihydroxypropanoicacid)或其衍生物或类似物、庚二酸(Heptanedioicacid)或其衍生物或类似物、癸二酸(Sebacicacid)或其衍生物或类似物。

发明使用气相色谱-质谱法(GC-MS)还发现虫草真菌细胞提取物含有数种多酚化合物的结构，特别是环己烯羟基、氧基苯丙酸、异黄酮-脱氧α-吡喃甘露糖基-β-吡喃葡萄糖基，或类似物。多酚化合物是一类抗氧化剂，被认为具有许多保健功能。优选方案中，虫草真菌细胞提取物中总多酚化合物的含量(表5)高达1370mgGAE/100克；与此相比，被认为含有大量多酚化合物的松树皮(PineBark)的含量在394至1331mgGAE/100克之间，而大枣含多酚化合物661mgGAE/100克，红葡萄仅为170mgGAE/100克。

较佳的，所述多酚类化合物包括：环己烯羟基(Cyclohexene-ol)或其衍生物或类似物、氧基苯丙酸(2-Phenyl-2-oxypropanoicacid)或其衍生物或类似物、异黄酮-脱氧α-吡喃甘露糖基-β-吡喃葡萄糖基或其衍生物或类似物。

发明进一步提供了抗氧化活性(也称氧自由基吸收能力)测定数据，结果显示，优选方案中，虫草真菌细胞提取物的抗氧化活性在4万molTrolox当量/100克以上(表5)。根据美国农业部官方数据，枸杞(Wolfberry)的抗氧化活性仅有3290molTrolox当量/100克；而具有高抗氧化能力的野生蓝莓仅可达到9621molTrolox当量/100克，都大大低于本发明的虫草真菌细胞提取物。虫草真菌细胞提取物的超高抗氧化活性使它具有优良的肌肤抗衰老功能。

发明使用用高效液相色谱法(HPLC)发现虫草真菌细胞提取物中的多糖不是一般的葡聚糖，而是某种弱酸性粘多糖/糖胺聚糖或类似物。所述弱酸性粘多糖的pH在5.5-5.8之间。HPLC测试结果显示(虫草真菌细胞提取物中的弱酸性粘多糖由D-半乳糖、D-葡萄糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺等单糖所组成。许多粘多糖/糖胺聚糖是细胞生长因子，在护肤方面它具有肌肤补水的作用。

此外，发明提供了由权威认证的第三方实验室实施的体外细胞测试结果，证明虫草真菌细胞提取物具有高度的皮肤细胞修复活性。24小时后制剂的修复活性即超过玻尿酸/透明质酸，在40小时时，细胞修复活性高于玻尿酸25％。

优选方案中，本发明提供了商业化虫草真菌细胞护肤原料制剂简称虫草护肤原料推荐的活性成份指标(表5)，并阐明虫草护肤原料需要含有4类成份，即(1)还原性有机羧酸、(2)多酚化合物、(3)亲水性抗氧化剂活性(或亲水性氧自由基吸收能力)、(4)弱酸性粘多糖，其达到指标设定的含量水平可进一步确保护肤功效。

所述虫草属真菌的菌丝体与孢子可为虫草属真菌经人工培养获得。

为了获得菌丝体与孢子的混合物，人工培养应当包括固体发酵阶段与液体发酵阶段。

发酵是指单一虫草真菌菌种通过多级固体培养和/或多级液体培养产生真菌细胞包括菌丝体和孢子，以及胞外代谢产物的过程。

进一步优选的，为防止人工培养过程中发生发酵污染，所述人工培养的虫草属真菌为虫草属真菌纯种。所述虫草属真菌纯种不含共生细菌或其他生物，因此不会引发不明发酵污染。所述的其他生物主要指酵母菌。

虫草属真菌纯种可经纯种分离获得。具体的，可以是将从野生分离的虫草菌种在加有抑制细菌生长的抗生素的液体培养基中培养数周后，再在加有抑制细菌生长的抗生素的固体培养基上培养数周获得的单菌落中挑选获得。基于虫草属真菌与酵母形态差别较大，因此凭借形态即可将虫草属真菌与酵母区分。获得的纯种可进一步传代培养。

更进一步的，为了使得虫草属真菌发酵周期缩短，更好地适应大工业生产要求，所述人工培养用的虫草属真菌为经驯化的虫草属真菌纯种。

所述的驯化方法可选自以下：

方法一：

将虫草属真菌纯种在固体培养基上接种培养，选择最早长出的单菌落进一步传代培养，如此反复多次以驯化虫草属真菌纯种。

方法二：

将虫草属真菌纯种接种液体培养基培养至对数期，经紫外照射后接种固体培养基，选择最早长出的单菌落进一步传代培养，反复多次选择最早长出的单菌落传代培养驯化虫草属真菌纯种。

方法二中，可在两次传代培养之间，将挑选的单菌落接种液体培养基培养至对数期，再经紫外照射后进一步接种固定培养基，挑选最早长出的单菌落进行下一次传代培养。

较佳的，所述经驯化的虫草属真菌纯种相比驯化前，发酵周期缩短至少24小时。更佳的，所述经驯化的虫草属真菌纯种液体发酵罐发酵时间少于3天即可至稳定期。

本发明所用虫草真菌菌种可以来自自然界分离到虫草原菌种。原种在实验室里经过一个为期数年在驯化后，可使得菌种得到优化，尤其是培养特性获得优化。优化后的菌种特点是三高，即生長速率高、细胞得率高、生物活性成份含量高。虫草原菌种基本上需要7-14天完成生物发酵周期。与此相对应，优化后的菌种只需2天即可完成生物发酵周期。同时细胞得率和生物活性成份相对于原种大幅度提高，可以达到现有培养条件下的更高值。

所述虫草属真菌经人工培养包括以下步骤：

1.固体培养基在合适虫草属真菌生长的条件下培养；

2.将固体培养基培养产物接种液体培养并在合适虫草属真菌生长的条件下进行一级种子培养；

3.一级种子接种液体发酵罐并在合适虫草属真菌生长的条件下发酵培养。

优选的，所述步骤3中液体发酵罐发酵培养经多级放大发酵培养。

具体的，可将步骤2获得的一级种子接种液体发酵罐进行二级种子培养，将获得的二级种子进一步接种较第一次液体发酵用发酵罐大的发酵罐进行液体发酵培养，以此类推，多次逐级放大发酵培养。

如实施例列举的，所述多级放大发酵培养经两级液体发酵罐发酵培养。

固体培养或液体培养所用培养基可为现有的适合于虫草属真菌繁殖的培养基。本领域技术人员可以凭借本领域的技术知识进行适当选择，并无特殊要求。一般而言，所述固体培养基或液体培养基应含有微生物生长代谢的碳源、氮源、维生素和无机盐。

如本发明实施例列举的，所述固体培养所用培养基可以是马铃薯葡萄糖琼脂培养基或琼脂培养基，所述液体培养或液体发酵所用的培养基可以是含葡萄糖、麦芽糖、酵母提取物/蛋白胨以及矿物质的液体培养基。

可通过将有效量的虫草属真菌提取物施用于肌肤上以起到增白、增亮、修复、祛皱、保湿、和抗衰等目的。

化妆品组合物

本发明的化妆品组合物，含有护肤有效量的虫草属真菌提取物作为护肤有效成分。

所述作为护肤有效成分可以是作为增白有效成分、增亮有效成分、修复有效成分、祛皱有效成分、保湿有效成分、和抗衰有效成分中的至少一项。

进一步的，为使得化妆品组合物有更好的观感与味道，所述虫草属真菌提取物经脱色和/或脱味处理。

脱色和/或脱味处理可采用常规，如活性炭吸附处理。

进一步的，为降低肌肤所对述化妆品组合物的敏感性，所述虫草属真菌提取物进行了脱蛋白质处理。

所述脱蛋白处理优选的采用酸水解。所述酸水解所用酸液优选为稀硫酸水溶液。优选的酸水解方法为：采用稀硫酸水溶液在pH为0.5-1.5，80-85℃的条件下水解蛋白质；加入碳酸钙去除硫酸根并加碱中和获得水解液。

作为化妆品的原料，所述虫草属真菌提取物可以是浓缩或非浓缩状态，其形态可以液体、固体、凝胶、乳状液、冻干粉、饼状、浆液等。

护肤有效量，指无毒的但足以提供所希望的护肤作用的虫草属真菌提取物的量。应当施用的护肤有效量取决于许多因素，包括年龄、被施用者的状态、施用途径、频率等诸多因素。控制有效成分施用量可由本领域技术人员根据经验判断并针对个体情况调整。虫草属真菌提取物在用于实现所希望的护肤效果的有效浓度下用于本发明的化妆品组合物中，优选形式是相对于组合物的总重量的0.001-50％，更优选的在0.1-20％，最优选的在0.2-10％。

所述化妆品组合物中还可以含有至少一种化妆美容可接受的辅料。

所述的辅料可以选自：水；油脂，这种油脂可以是从动物、植物或石油里面提取的，也可以是人工合成的；保湿剂，如甘油、丙二醇、丁二醇或山梨醇；乳化剂；消泡剂；硅树脂；顺滑剂；增稠剂，如羧基酸聚合物、交联聚丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、多糖、树胶等；表面活性剂，如非离子表面活性剂、离子表面活性剂；pH调节剂；基质；盐；螯合掩蔽剂；分散剂；防腐剂；遮光剂；着色剂；赋形剂，如硬脂酸、棕榈酸、十八烷醇、十六烷醇、苯甲醇、硬脂酸和1～21位乙撑氧基的十六烷醇聚乙二醇醚及其混合物等；缓释剂；抗结块剂；抗氧化剂；缓冲剂；填充剂；螯合剂；成膜剂；乳浊剂

本发明的化妆品组合物的剂型无特别限定，可以是液态化妆品、油状化妆品、乳化体化妆品、悬浮体化妆品、膏状化妆品、凝胶状化妆品、粉状化妆品、块状化妆品、锭状化妆品、笔状化妆品、蜡状化妆品、气雾状化妆品、薄膜状化妆品、胶囊状化妆品、纸状化妆品等。可按各剂型化妆品的常规制备方法配合各剂型常用辅料制备。

所述化妆品组合物中，可以虫草属真菌提取物作为其唯一增白、增亮、修复、祛皱、保湿或抗衰有效成分，或者也可以将虫草属真菌提取物作为增白、增亮、修复、祛皱、保湿或抗衰有效成分之一与其他同样具有增白、增亮、修复、祛皱、保湿或抗衰功效的有效成分同时含有。

本发明所述的化妆品组合物还可以含有其它典型有效成分，如润肤剂；抗痤疮剂，如有间苯二酚、硫磺、水杨酸、过氧化苯甲酰、红霉素、锌等；除皱剂/抗萎缩剂，如硫代D-或L-氨基酸及其衍生物和盐如N-乙酰衍生物、硫醇如乙硫醇、羟基酸、植酸、硫辛酸、溶血磷脂酸、皮肤脱落剂(如苯酚等)、VB₃类和维生素A酸类(能改善皮肤角质组织的外观，特别是能调节角质组织的环境)；收敛剂，如丁香精油、薄荷醇、樟脑、桉油、丁香酚、乳酸薄荷酯、金缕梅萃取液；皮肤漂白和发光剂，如对苯二酚、曲酸、Vc、Vc磷酸镁、Vc葡糖胺、Vc甘糖；皮肤舒缓剂或修复剂，如泛醇即VB5和泛醇衍生物如乙基泛醇、芦荟浓缩物、泛酸和泛酸衍生物、尿囊素、甜没药醇、甘草酸二钾；抗氧化剂/自由基清除剂，如抗坏血酸(维生素C)及其盐，脂肪酸中的抗坏血酸酯，抗坏血酸衍生物(如抗坏血酸磷酸酯镁盐，抗坏血酸磷酸酯钠，抗坏血酸山梨酸酯)，生育酚(维生素E)，tocopherolsorbate，生育酚醋酸酯，其他生育酚酯，丁羟基安息香酯及其他盐，6－羟基－2，5，7，8－四甲基克罗曼铬镍合金基－2－羧基酸(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylicacid)，五倍子酸及其烷基酯，特别是丙基五倍子酸酯，尿酸及其盐和烷基酯，山梨酸及其盐，硫辛酸，胺(如硫辛酸，胺(N,N－二乙羟基胺，胺基胍)，硫氢基化合物(如谷胱甘肽)，含有两个羟基的反丁烯二酸及其盐，lycinepidolate，argininepilolate，去甲二氢愈创木酸，生物类黄酮，姜黄色素，赖氨酸，蛋氨酸，脯氨酸，超氧化岐化酶，水飞蓟素，茶提取物，葡萄皮/种子提取物，黑色素和迷迭香提取物等；抗炎剂，如类固醇类抗炎剂、非类固醇类抗炎剂、天然抗炎剂如芦荟等；抗脂肪剂；皮肤增亮剂，如清酒曲酸，熊果苷，维生素C及其衍生物(如抗坏血酸磷酸酯镁盐，抗坏血酸磷酸酯钠盐或抗坏血酸葡萄糖苷)和提取物(如桑树提取物，胎盘提取物)；皮肤润滑及皮肤修复活性物质，如泛酰酸衍生物(包括泛酰醇，泛醇，乙烷基泛酰醇)，真芦荟，尿囊素，红没药醇和甘草酸二钾等；抗菌剂和抗真菌活性物；遮光活性物质，无机遮光物如二氧化钛、氧化锌、氧化铁，有机遮光剂如2－乙烷己基－p－甲氧基肉桂酸，丁基甲氧基联苯甲酰－甲烷，2-羟基-4-甲氧基二苯甲酮，2－苯基苯并咪唑－5－磺酸，辛基二甲基－p－氨基安息香酸，奥克立宁等。

可以采用将本发明的化妆品组合物与施用对象皮肤之间接触的任何手段来施用本发明的化妆品组合物。

优选的使用方法是通过可涂敷产品如皮肤凝胶、精华、面膜或面霜施用本发明的化妆品组合物。稍差的方法是通过冲洗或可擦去产品如清洁剂，泡沫清洁剂，冷冻面霜清洁剂等施用本发明的化妆品组合物。

将本发明安全有效量的化合物用于角质层组织。使用量、使用的频率和使用的时间根据皮肤状况及想要达到的调节效果由施用者来自主调节。

优选的是长期将本发明的外用制剂用于皮肤，长期使用的含义是指，在使用者的生存期内的一段期间内连续使用，优选地是在一周内连续使用，更优选地是至少一个月，进一步优选地是至少大约三个月，再进一步优选地是大约六个月，更进一步优选地是至少一年内持续使用。当较长期间内(如5，10或20年)使用获得有益效果时，更优选的是持续使用贯穿使用者一生。典型地在上述期间内地使用频率是每天一次，其使用频率也可以在每周一次至每天三次或更多之间变化。

本发明的化妆品组合物的使用数量范围以改善皮肤外观或感到有益为准。例如每次使用的使用量每平方厘米0.1毫克－10毫克，显著有效的使用量是每平方厘米大约1毫克－2毫克。

使用本发明的化妆品组合物时，优选地是将化合物在皮肤上保留至少15分钟，更优选的是至少30分钟，进一步优选地是至少1小时，更进一步优选地是至少几个小时－12小时。身体、面部、头发和/指甲的任何外露部分均可以使用本发明的外用制剂如脸部、嘴唇、眼下部位、眼睑、头皮、脖子、眉毛、躯干、胳膊、脚、手指甲、脚趾甲、头发、睫毛、眉毛等，可以使用手指或其他器具(如垫、棉球、涂笔、喷雾器具及类似物)使用本化合物。

另一个方法就是通过无纺布将本发明外用制剂使用在面部等部位。本方法尤其适用于需要加强处理的问题区域(如面部区域，额线，眼下部分，及类似区域)。本发明化妆品组合物可以包含在无纺布中，也可以在使用无纺布之前使用。无纺布也可以含有附加活性物质例如能够引起发热反应物质。优选地是，无纺布在皮肤上保留至少5分钟，更优选地是保留至少10分钟，进一步优选地是保留15分钟，再进一步优选地是保留至少20分钟。

实施例提供了以涂抹前后的皮肤颜色参数L*、ITA°为基础的，由权威认证的第三方实验室实施的人体实验结果，即处理后的L*值越高表明皮肤越白，而ITA°越高表明皮肤越亮。人体实验结果表明虫草真菌细胞的提取物的皮肤颜色指数均高于以维生素C和常用化妆品辅料构成的安慰剂，也就是说虫草真菌细胞的提取物具有真实的净皮肤白亮效果(表1)。

实施例还提供了以涂抹前后的皮肤颜色参数L*、ITA°为基础的，由权威认证的第三方实验室实施的人体实验结果，表明虫草真菌细胞提取物的白亮效果优于细胞外成份，并且是浓度和使用时间依赖型，即浓度越高，及使用时间越长，白亮效果越好(表2)。

实施例还将虫草真菌胞内提取物的L*、ITA°与已知的皮肤白亮化合物，例如壬二酸、余甘子、氢醌、十八碳烯二酸、熊果苷的颜色参数进行比较，证明虫草真菌细胞提取物对皮肤白亮效果比那些化合物更好(表3)。如果将苯酚化合物和衍生物的毒性考虑在内，虫草真菌胞提取物是较安全和更有效的皮肤白亮制剂。

实施例还提供了虫草真菌细胞提取物作为唯一活性成份的护肤精华与市面上知名品牌的护肤精华的比较测试。这种测试是以涂抹前后的皮肤颜色参数L*、ITA°为基础的，由权威认证的第三方实验室实施的人体实验。结果表明含有4％虫草真菌细胞提取物的护肤精华在皮肤白亮的功效上可以大幅度超越市面上最优质的美白护肤精华(表4)；并且添加2-3％的虫草真菌细胞提取物即可使护肤产品的美白效果达到最佳。

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。

实施例1虫草真菌单一菌种的纯化和驯化

从菌虫复合体例如野生冬虫夏草上分离得到的真菌会有时候是共生型，即含有許多共生的細菌或其它生物，但再琼脂培养基上会表现出是单一菌种。用固体发酵没有问题，但使用液体深层发酵，經常出现偶發性不明发酵污染。所以，所有分离得到的真菌菌种需要进行纯种分离。以冬虫夏草(Cordycepssinensis)、或称中华被毛孢(Hirsutellasinensis)、或称蝙蝠蛾被毛孢(HirsutellahepialiChenetShen)为例。

纯种分离步骤：

1)从野生分离之虫草菌种(共生型生物种类)

2)在蛋白胨葡萄糖液体培养基加入氯霉素和庆大霉素；接种后在25℃下和摇瓶机上培养3-4周

3)接种孟加拉国红氯霉素琼脂培养基；在25℃下培养3周，在此出现的单菌落为纯种真菌

4)挑出和编号单菌落；接种在YM琼脂斜面25℃下培养3周

5)挑出的纯种虫草真菌菌种，编号AA

由于虫草菌分类系统：真子囊菌亚纲(Euascomycetes)，肉座菌目(Hypocreales),麦角科(Claviceptaceae),虫草属(Cordyceps(Fr.)Link)，属于丝状真菌，所以在形态上很容易与酵母区分。

打破共生体系得到虫草真菌纯种后，可进一步筛选快速生长和有效成份含量更高的虫草菌菌种。

一般未经驯化的虫草真菌的生物发酵周期为2-3周，这个速度不利于大工业生产的要求。设定的指标定为：琼脂固体培养基为7天、摇瓶培养为5天、液体深层发酵罐培养低于72小时，这样商业化生产的周期为每周两批，利于大生产。

菌种驯化：

可采用两种方法对菌种驯化：自然诱导法和紫外线诱变法。

自然诱导法：

1)AA编号虫草菌种接种土豆汁琼脂培养基在25℃下培养，每天观察发现最早出现的单菌落，然后传代

2)不断重复这样的筛选过程；得到653株单菌落，编号改为CSX或HHX系列。

紫外线诱变法：

1)AA编号虫草菌种接种蛋白胨葡萄糖液体培养达到细胞浓度10⁸/毫升；然后在280nm的紫外线下照射30分钟；

2)接种土豆汁琼脂培养基在25℃下培养，每天观察发现最早出现的单菌落，然后传代；

3)不断重复步骤2；得到245株单菌落，编号改为CSX或HHX系列。

上述两种方法均筛选获得了符合上述条件的菌种。

虫草菌有效成份筛选方法：

菌株培养条件：采用实施例2的方法培养菌株

5种活性成分分析：还原性有机酸、多酚、多糖、3’-脱氧腺苷(虫草素)、腺苷

上述活性成分可采用现有技术分析。

筛选出5种活性成分含量高的菌株作为优选菌株，取名为CS-X100或HHX-100，后续试验采用的菌株为从自然诱导法驯化获得的菌株中筛选获得。图1为CS-X100或HH-X100菌体细胞的参考标准图谱。

CS-X100或HH-X100虫草菌株再经过一段时间的稳定性培养还可达到更优的商业化生产状态：琼脂固体培养基为5天；摇瓶培养为3天；液体深层发酵罐培养48小时。

实施例2液体深层培养生产虫草真菌菌体细胞

发酵方法：

步骤一：为了生产虫草真菌菌体细胞，将分离的CSX系列或HHX系列菌株(本实施例选用CS-X100或HHX-100)首先在固体培养基上培养。25℃下在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)斜面或平板琼脂培养基(见表a)上培养3天。

步骤二：1升液体培养基(表b)装入5升锥形瓶，在121℃消毒20分钟后，接种3-6个冬虫夏草菌种斜板，然后在下列情况下生长：pH值5.5(接种前调节)、25℃、摇瓶旋转速度150rpm、培养时间36小时。

步骤三：培养二级种子使用搅拌生物反应器75升(或更大)，发酵培养基(表c)装液量50升或以上，在121℃下消毒30分钟，接种2升一级种子细胞(4％的接种量)，生长条件如下：pH值5.5(接种前调节)；25℃；通气量：1:0.2-1:0.9体积/体积/立方米(1500-2700升/小时每50公升液量)；搅拌速度：200rpm；48小时。

步骤三：培养虫草真菌菌体细胞，使用800升(或更大)搅拌式反应器，装600升(或75％)发酵培养基液量(见表c)接种50升或更多的二级种子(8％接种量)。发酵罐和培养基接种前需在121℃下消毒30分钟。生长条件如下：pH值5.5；25-29℃；搅拌速度：200rpm；通气量：1:0.5-1:1.1体积/体积/立方米(18-36立方米/小时每600公升液量)；培养期：48小时。

步骤四：当菌体细胞成长已达到其指数生长后期，或已达到成倍繁殖的生产目的，打开生物反应器的底部阀门收获全发酵物，然后经过滤器过滤去除发酵残液，获得虫草菌体细胞，每600升发酵培养基获得含15％干物质的100公斤湿菌体。此处获得的虫草菌体细胞是菌丝体和孢子的混合物。

表a马铃薯葡萄糖琼脂培养基

组成部分	含量
		马铃薯提取物	4.0克
葡萄糖	20.0克
		琼脂	15.0克
pH	5.6
		蒸馏水	到1升

表b摇瓶培养基

组成部分	含量克/升
		葡萄糖	40.0
麦芽糖粉	40.0
		KH2PO4	1.5
MgSO4.7H20	0.3
		酵母提取物/蛋白胨	20.0
水	到1升

表c液体培养基

实施例3原色原味型虫草真菌细胞护肤原料制剂的制备

将含15％干物质的50公斤活细胞虫草真菌湿菌体放置于带搅拌抽提器内，加入50升99％的食用酒精或工业酒精(含乙醇95％，改性甲醇5％)，在室温下，以搅拌速率150rpm，均匀搅拌4小时。抽提混合液先经布袋粗滤，粗滤液再经三层过滤，例如孔径34微米ADVANTEC滤纸在顶部、滤布居中、和4微米ADVANTEC滤纸在底部，获得67.5升澄清50％酒精抽提液。抽提混合液也可以直接用沉降式离心机，例如高速管式离心机，一步将滤液与滤渣分离。

将50％酒精抽提澄清液装入真空浓缩器，在80℃下真空蒸发浓缩，首先完全除去酒精，然后进一步将抽提液浓缩得到3.8升含干物质50％的浆状液体，命名为CordyS^TM-A浓缩液。酒精经过回收装置回收重复使用。因为CordyS^TM-A含有较高的脂溶性物质，其制剂形态为浓缩液体。

经检测，CordyS^TM-A的得率(CordyS^TM-A总固形物/虫草真菌干细胞)在25％以上。

实施例4脱色脱味型虫草真菌细胞护肤原料制剂的制备

40公斤含15％干物质的活细胞虫草真菌湿菌体加40升99％酒精抽提后得到54升含酒精过滤液，挥发去除酒精后浓缩得到含干物质15％液体9升，然后加8％活性炭，置于搅拌器中在80℃下搅拌45分钟脱色，过滤后得到4.5升脱色液(含干物质7％)；脱色液进一步用冷冻干燥器干燥得到350克粉剂。获得的脱色液或冷冻干粉命名为CordyS^TM-AD。由于虫草真菌细胞提取液含有大量的还原性成份，任何在25℃以上进行浓缩或干燥处理均会让制剂再次大幅度增色。CordyS^TM-AD的制剂形态为稀释液体或冷冻干粉。CordyS^TM-AD得率(CordyS^TM-AD总固形物/虫草真菌干细胞)为6％。

实施例5低蛋白质脱色脱味型虫草真菌细胞护肤原料制剂的制备

植物或微生物的抽提物不可避免地含有蛋白质，而蛋白质是潜在的皮肤过敏源。众多化妆品企业会对原料的蛋白质含量做出限定。本发明试验了各类去除和降低蛋白质的方法以满足客户的需求。已试验的脱蛋白质方法包括：物理法即膜分离和树脂吸附、蛋白酶水解、酸水解。

物理法无法使用是因为它对其他活性成份会造成较大损失以及高昂的加工成本。对4种商业酸性、中性和碱性蛋白酶在最佳温度下进行4至8小时的水解实验表明，这些蛋白酶对降低虫草真菌细胞提取物中蛋白质含量几乎没有效果。最后发现pH1硫酸水溶液在80-85℃下水解4小时的效果最佳，在此条件下虫草真菌细胞提取物的蛋白质可以降低接近10倍。

小心缓慢地将786.75克浓硫酸加入15升水，配制成5.245％稀硫酸溶液。将30公斤含15％干物质的活细胞虫草真菌湿菌体放置于夹层加热搅拌锅内，边搅拌边小心地加入15升5.245％稀硫酸溶液，搅拌均匀后测定pH为1.0。开启蒸汽夹层加热至80-85℃，保持温度搅拌水解4小时。放冷后分五次加入碳酸钙1050克用于形成不可溶的硫酸钙，搅拌均匀后，再分五次加入氢氧化钠1200克，将水解液的pH值中和至5.5-5.8，或所需要的pH值。

然后，水解液经布袋粗滤除去粗渣获得37.2升含固形物7.5％的粗滤液。此时，大量的硫酸根通过硫酸钙被去除。在37.2升的粗滤液中加入1860克活性炭(5％)，80℃下在搅拌锅内脱色反应45分钟，然后经过孔径1微米的滤纸过滤，或者沉降式离心机分离得到26升含固形物6％的脱色澄清液，命名为CordyS^TM-HD稀释液体。CordyS^TM-HD稀释液体进一步用冷冻干燥得到1.7公斤冷冻干粉。CordyS^TM-HD得率(CordyS^TM-HD总固形物/虫草真菌干细胞)为34.6％以上。

实施例6以虫草护肤原料作为唯一活性成份的护肤精华的制备

将CordyS^TM-HD稀释液体(5％固形物)800毫升中加入丙烯酰钠/丙烯酰胺、丙二醇、甘油、乙二胺四乙酸二钠、2-苯氧基乙醇(防腐剂)、乙基己基(防腐剂)、香精，然后用去离子水定容至1000毫升。将所有的原料搅拌至均匀，然后灭菌装瓶获得护肤精华。

实施例7皮肤增白和增亮的人体临床实验

标准化临床实验由权威认证的第三方实验室-法国SPINCONTROL的泰国子公司SPINCONTROLASIACo.Ltd.实施。

一共进行了三次标准化临床实验。第一次临床实验主要测试不同虫草真菌细胞提取组份的皮肤增白/增亮效果；第二次临床实验对最佳组份的不同浓度和脱色处理进行比较；第三次临床实验是商业化产品之间的比较，即测试“以虫草真菌细胞提取物为唯一活性成份的的护肤精华液”与市场上知名美白护肤精华液之间的皮肤增白/增亮效果。

1.实验设计原则：

双盲试验

比较研究

以实验对象自身部位为基准线(空白对照)

2.实验方法和原理：

2.1实验对象：亚洲人、健康、女性、年龄介于18至65岁之间、所有皮肤类型、在两只前臂上没有纹身和皮肤病、能够全程参与实验、非化妆品敏感人士、非孕妇和哺乳期妇女、过去1个月中在前臂上未使用美白/增亮/祛斑产品、过去24小时在测试部位未使用化妆品/护肤品、过去2个月中未使用过任何皮肤的药物治疗、等等。

2.2样品前臂涂抹部位示意图(参见图2)：

2.3样品涂抹处理方式：在内前臂随机确定五不同测试区域：左臂3个点，右臂2点，并使用透明覆盖纸(见示意图)。实验对象被要求在实验期间避免太阳紫外线照射。如果不能避免偶尔的曝光，他们被要求使用不低于SPF15的防晒霜。实验对象被要求在实验期间在前臂不使用任何其他类型的化妆品/护肤品，特别是美白/增亮/祛斑的产品。在实验室测定T0和T+4周/28天的样品重量，以确保适量地使用了试验样品。

2.4测试时间表：测试4周或28天期间内样品的效果

T0(开始时间)：

在设定环境下进行20分钟的适应调节。

用比色计测定内前臂测试部位的皮肤颜色指标。

测试样品称重。

分配测试样品和实验对象声明表格。监督T0到T+4周/28天期间实验对象是否按样品涂抹处理(治疗)的方法，每天涂抹一次。

T+4周/28天(终结时间)：

检查内前臂皮肤质量和要求。

询问实验对象。

收集实验对象声明表格。

测试样品称重。

在设定环境下进行20分钟的适应调节。

用比色计测定内前臂测试部位的皮肤颜色指标。

2.5实验原理：实验所采用的色度仪法的原理在于模拟人眼的颜色感知。色度仪法使用三色灵敏度测量光，以对应于人眼睛的敏感度。三色刺激值XYZ的概念来源于这样的理论，即红，绿和蓝3种颜色组份构成了眼睛所感知的颜色，以及所有的颜色被认为是这3个颜色的混合。国际委员会(CIE)在1931年的定义用于计算三色值，即一个标准观察者拥有X(λ)、y(λ)和z(λ)的混合功能。

颜色可分为其色调，亮度和饱和度。因此，任何颜色可以特征为一个几何坐标空间，它可以帮助确定亮度、主导色、饱和度。由于存在不同颜色的多个空间，数学链可以使坐标从一个到另一个进行转换。在颜色空间指标L^*、a^*、b^*中，L^*表示亮度，其衡量度从0为黑色，到100为白色。色调和饱和度是由色度a^*和b^*的组合来表示。

2.6仪器和测量：比色计(日本美能达)用于颜色测定。在测定前，需要在设定环境下(20-24℃，相对湿度在40-60％之间)进行20分钟的适应调节。

2.7皮肤颜色参数：下列参数来评估测试样品对皮肤颜色产生的效果。

L*(白度)：表示从全黑(L*＝0)到绝对白(L*＝100)的相对白度。

a*(红-绿色轴)。

b*(黄-蓝色轴)。

计算5次连续测量的平均值。然后从以上三个坐标，计算T0和T+4周/28天之间的以下参数：L*，a*，b*，ITA°。

ITA°＝Arctg[(L*-50)/b*].(180/π)，个人类型学的角度(IndividualTypologicalAngle)。

Arctg＝三角反正切函数。

颜色参数的解读：L*表示(皮肤)白；ITA°表示(皮肤)亮。所以，T0和T+4周/28天之间的L*越大说明皮肤增白的程度越高，ITA°越大说明皮肤增亮的程度越高。

3.人体临床实验1:初步试验-真菌细胞组份与安慰剂对于皮肤白亮效果的比较

样品：

CAM1：虫草真菌细胞内提取物4％+二氧化硅+水凝胶+防腐剂。

CAM2：虫草真菌细胞外分泌物8％+二氧化硅+水凝胶+防腐剂。

CAM3：小檗抽提物0.08％+二氧化硅+水凝胶(安慰剂，即空白对照组)+防腐剂。

CAM4：活性碳脱色虫草真菌细胞外分泌物4％+二氧化硅+水凝胶+防腐剂。

CAM5：虫草真菌细胞外分泌物4％+二氧化硅+水凝胶+防腐剂。

实验对象：亚洲女性22人，其中19人完成实验。平均年龄33.4岁，最小19岁、最大50岁。

实验时间：4周。

实验结果：

(1)虫草真菌细胞内提取物样品CAM1的皮肤白(4.1％)和亮(30.5％)效果均优于各种虫草真菌细胞外分泌物样品CAM2(3.2％和21.9％)、CAM4(3.5％和23.3％)、CAM5(3.6％和21.6％)。

(2)所有虫草真菌样品的皮肤白亮参数值均高于安慰剂(空白对照)CAM3的2.8％和18.3％，即与安慰剂对比虫草真菌样品具有皮肤增白亮的净效果，从而排除了天然维生素C(小檗抽提物)以及护肤品常用的组织赋型防腐原料产生的皮肤白亮效果。

(3)统计学上，用活性碳脱色对白亮活性没有影响。

表1：样品CAM1,CAM2,CAM3,CAM4和CAM5作用皮肤后相对于基线的颜色参数平均值和平均误差值汇总(以百分比表示)。

p值逊于0.05表示“有显著差异”；

ns意味着“差异不显著”。

4.人体临床实验2:虫草真菌细胞内提取物的皮肤白亮效果

样品：

CAM6：虫草真菌细胞内提取物4％。

CAM7：虫草真菌细胞内提取物2％。

CAM8：活性碳脱色虫草真菌细胞内提取物。

辅助原料：二氧化硅，聚丙烯酸聚合物，甘油，以及防腐剂：对羟基苯甲酸甲酯、山梨酸钾、苯甲酸钠。

实验对象：亚洲女性26人，全部完成实验。平均年龄35.9岁，最小18岁、最大62岁。

实验时间：4周。

表2：样品CAM6,CAM7,CAM8作用皮肤后经过未处理部位基线校正的颜色参数平均终值汇总(以百分比表示)。

p值逊于0.05表示“有显著差异”；

ns意味着“差异不显著”。

表3：虫草真菌细胞提取物CAM6与其他皮肤白亮成份的L*和ITA°值之间的比较。

实验结果：

(1)虫草真菌胞内提取物4％浓度(CAM6)对皮肤白亮效果比2％(CAM7)大幅度提高(参见表2和图1)。实验的结果表明虫草真菌胞内提取物的白亮效果是浓度依赖型，即浓度越高白亮效果。这符合美白产品的一般规律，即效果取决于活性成份的浓度和使用时间。

(2)活性碳脱色的样品CAM8在相同浓度下，皮肤白亮效果有20％的下降，但不算太大。

(3)表3主要对比了虫草真菌细胞提取物CAM6与其他皮肤白亮成份的L*和ITA°值。这些成份所使用的人体实验方法与本发明相同，但实验时间比较长。这些成份的L*和ITA°值采自于相关公司公开发表的报告。

(4)表3显示，虫草真菌胞内提取物4％浓度的ITA°亮值在4周内大幅度高于所有其他的已知皮肤美白化合物，包括壬二酸、余甘子、氢醌、十八碳烯二酸、熊果苷。尽管CAM6的L*白值略低于1％十八碳烯二酸，和2％熊果苷，但主要是因为CAM6的实验时间仅为4周，而1％十八碳烯二酸和2％熊果苷的实验时间是10周。

(5)结论：虫草真菌胞内提取物对皮肤的白亮效果比已知皮肤美白化合物更有效。如果将苯酚化合物的毒性考虑在内，虫草真菌胞内提取物是较安全和更有效的皮肤白亮制剂。

5.人体临床实验3:商业化产品的皮肤白亮效果比较

这个实验的目的主要测试以虫草真菌细胞提取物为唯一活性成份的商业化美白精华液与市面上公认的美白精华液品牌的效果比较，以及大概多少虫草真菌提取物浓度可以超过市面上同类产品的美白效果。

样品：

CAM31：护肤精华配方含0.2％虫草真菌制剂。

CAM32：护肤精华配方含4.0％虫草真菌制剂。

CAM33：X品牌护肤精华。

实验对象：亚洲女性27人，全部完成实验。平均年龄37.4岁，最小19岁、最大57岁。

实验时间：28天

实验结果：

1)2种含有不同浓度虫草真菌细胞提取物作为唯一活性成份的护肤精华与市面上知名品牌的护肤精华进行了比较测试，结果表明添加4％提取物在皮肤白亮的功效上可以大幅度超越市面上最优质的美白护肤精华。

2)从数据上分析，添加2-3％的虫草真菌细胞提取物即可使护肤产品的美白效果达到最佳。

表4：商业护肤精华产品CAM31,CAM32,CAM33作用皮肤28天后经过未处理部位基线校正的颜色参数平均差值％(T28-T0)。

p值逊于0.05表示“有显著差异”；

ns意味着“差异不显著”。

实施例8用高效液相色谱法(HPLC)鉴定虫草真菌细胞提取物中酸性粘多糖的单糖组成:

1.测定方法：

将水溶性虫草真菌细胞提取物与99％酒精按1：5混和、搅拌、静止沉淀。离心或过滤获取沉淀物-粗多糖。粗多糖用水溶解后再用酒精沉淀一次得到多糖样品。

4克多糖样品，加40ml77％浓硫酸液，在0℃下水解14小时；再加40ml25％硫酸液,在53℃下水解2小时；加水定溶至100ml。加氢氧化钡中和至pH7，过滤去除硫酸钡沉淀。上清液冷冻干燥成多糖水解物用于HPLC测试。

色谱柱为专门测糖柱。多糖水解物用去离子水或中性缓冲液溶解后上柱，流动相为去离子水或中性缓冲液。

2.结果：

测试结果如图5、图6，结果表明，虫草真菌细胞提取物中的弱酸性粘多糖由D-半乳糖、D-葡萄糖、N-乙酰-D-半乳糖胺、N-乙酰基-D-葡糖胺等单糖所组成。

实施例9虫草真菌细胞提取物的皮肤细胞修复实验:

1.实验方法：

实验由权威认证的第三方实验室-新加坡PSBPteLtd实施。

检测试剂盒:CytoSelect^TM24孔创伤愈合实验。CellBiolabs,Inc产品。

原理:测量体外细胞向“伤口间隙”迁移的程度。细胞“伤口间隙”合拢的百分比％越高表示创伤愈合的效果越好。

细胞系：CHO-K1成纤维细胞系。

样品(浓度0.1％):

虫草真菌细胞提取物CAM6。

正对照化合物:玻尿酸(透明质酸)。

负对照:缓冲液。

2.结果(参见图7)：

实验证明虫草真菌细胞提取物CAM6具有高度的皮肤细胞修复活性。在24小时CAM6的修复活性即超过玻尿酸/透明质酸，在40小时，CAM6的细胞修复活性高于玻尿酸25％。

实施例10用气相色谱-质谱鉴定虫草真菌细胞内提取物的活性成份:

1.目的：

气相色谱-质谱主要用于鉴定两类小分子活性成份，即:有机羧酸及衍生物和多酚类化合物。

2.方法：

衍生化处理：样品在气相色谱质谱仪测试前需要用三甲基硅化合物进行衍生化，从而使非挥发性化合物如某些醇，酚，或羧酸具有挥发性。

将0.1克样品溶解在1毫升吡啶中，加热该混合物至60℃，保持15分钟。然后将1毫升N-,O-双(三甲基硅基)三氟乙酰胺加入混合物进行衍生化步骤。混合物溶液在注射上载到气相色谱质谱仪以前需用用0.2微米的过滤器过滤。

气相色谱-质谱仪操作：

岛津气相色谱质谱仪QP2010和VF-1MS色谱柱用于测试。气相色谱的操作条件为：注射器和检测器温度分别设定在280℃和250℃。样品注入到色谱柱后按程序在120℃保持2分钟，随后以12℃/分钟的速度将温度升至285℃，再以20℃/分钟的速度达到最终温度300℃。

成份的化学结构或类似结构通过质谱图谱的化合物图书馆中获得。

3.结果：

有机羧酸及衍生物：气相色谱质谱法鉴定出9种有机羧酸、衍生物、或类似物。

虫草真菌11种化合物化学结构：

1.α-羟基丙酸(α-hydroxypropanoicacid)及衍生物或类似物：

2.α-羟基乙酸(α-hydroxyaceticacid)及衍生物或类似物：

3.3-羟基丙酸/β-羟基丙酸(3-Hydroxypropionicacid)及衍生物或类似物：

4.β-羟基异丁酸(β-hydroxyisobutyricacid)及衍生物或类似物：

5.丁二酸(Butanedioicacid)及衍生物或类似物：

6.α-β-二羟基丙酸(2,3-Dihydroxypropanoicacid)及衍生物或类似物：

7.庚二酸(Heptanedioicacid)及衍生物或类似物：

8.癸二酸(Sebacicacid)及衍生物或类似物：

多酚类化合物：

多酚类化合物广泛的存在于植物，真菌、或植物类食物中。许多抗氧化剂都是多酚化合物。多酚化合物结构可以是苯酸、黄酮类化合物、多酚类酰胺、环己烯/环醇单体或复合体。气相色谱质谱法鉴定出3种多酚化合物、衍生物、或类似物。

(1)环己烯羟基(Cyclohexene-ol)及衍生物或类似物：

(2)氧基苯丙酸(2-Phenyl-2-oxypropanoicacid)及衍生物或类似物：

(3)异黄酮-脱氧α-吡喃甘露糖基-β-吡喃葡萄糖基

实施例11虫草真菌细胞护肤原料制剂的成份质量指标

为更好的确保虫草护肤制剂具备本专利中的护肤功效，虫草真菌细胞护肤原料制剂简称虫草护肤原料，需要含有4类成份，即(1)还原性有机羧酸、(2)多酚化合物、(3)亲水性抗氧化剂活性/亲水性氧自由基吸收能力、(4)弱酸性粘多糖。

测试方法：

还原性有机羧酸：

还原性有机羧酸主要表示虫草护肤原料含有的各类有机羧酸，它是皮肤美白/光亮的成份指标。

新鲜高碘酸钠水溶液＝90毫升A液+110毫升B溶液

A液：浓硫酸溶液稀释20倍。

B液：高碘酸钠(Na₂H₃IO₆)溶液：1克钠高碘酸钠溶解在1000ml去离子水中。

碘化钾溶液＝15％的碘化钾(KI)水溶液。

样品溶液：将1克虫草护肤原料溶解在100ml去离子水中。

1ml样品+50ml高碘酸钠溶液，然后在60℃下加热15分钟，再加入碘化钾溶液作用5分钟后，用0.01摩尔/升硫代硫酸钠滴定。耗用每毫升0.02摩尔/升的硫代硫酸钠等于0.3643mg还原性有机羧酸。

多酚化合物：

标准福林乔卡梯奥试剂法，也叫没食子酸等价方法(GAE)，即样品与磷钼酸和磷钨酸盐反应后，在750nm用分光比色仪测定吸光度，并通过没食子酸标准曲线获得样品中酚类/多酚类化合物混合物总量。

DPPH法测定亲水性抗氧化剂活性/氧自由基吸收能力：

DPPH法测定抗氧化剂对稳定的自由基2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)的清除作用。DPPH自由基在517纳米处具有强吸收光谱，但是当DPPH与抗氧化化合物发生反应后转化成肼导致吸光度降低。DPPH法是目前最常用的测定抗氧化剂活性的方法。

虫草护肤原料溶解在水中。阳性对照Trolox即6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸溶解在甲醇中配制成下列浓度：10,000μM,1000μM,100μM,and10μM；这种化合物用作标准抗氧化能力-表达为Trolox当量。

200l的0.5mMDPPH甲醇溶液与20l测试样品，和20l溶剂(空白样品)混合，然后在黑暗处和室温下培养30分钟。30分钟后，将样品在比色计540nm处读数。Trolox样品用于建立标准曲线，使测试样品的结果可以Trolox的当量表示。

抗氧化活性或氧自由基吸收能力的标准单位：molTrolox当量/100g样品。

弱酸性粘多糖：

虫草真菌细胞提取的多糖是弱酸型，pH在5.5-5.8之间。多糖类型经HPLC鉴定属于糖胺聚糖类型。虫草护肤原料的补水功能来自于这类弱酸性粘多糖。在成份测试中，以总还原糖定量虫草护肤原料的总弱酸性粘多糖。

样品处理:取样品5.0g样品与40ml无水乙醇混合，3000转/分离心，弃去上清液，残渣用80％乙醇洗涤，离心(重复此过程2次)，用水溶解残渣，定容为100ml。此液即为样品处理液。

标准曲线:取0.2mg/ml葡萄糖标准溶液0.0,0.10,0.20,0.30,0.40,0.50ml，用水定容为1.0ml，加入0.5ml苯酚溶液，10ml浓硫酸，混匀，放置至室温，波长＝485nm测定吸收光度，绘制标准曲线。

样品测定:取样品处理液0.5ml于具塞比色杯中，以下同标准曲线操作。测定吸光度。

计算:X(mg/g)＝C×200×20/10/0.5/Mx1000

式中：X：为样品粗多糖含量(mg/g),C：为从标准曲线上查出的含量(μg),M：为取样量(g)本发明实施例3、4、5制备的制剂原料均可满足表5的指标。

表5：原色原味虫草护肤原料活性成份指标(按干物质计)

实施例12自愿试用者感官评价试验:

1.方法：

挑选12位年龄介于25-63岁的亚洲女性试用者对含4％虫草真菌制剂的商业护肤精华液进行评价。向每个试用者提供1个月用量的虫草商业护肤精华液，和调查问卷。试用者需要每日在脸部至少使用一次，持续4周，每周添写1次调查问卷。

调查问卷设计了3个评价项目，即1.紧脸/皮肤紧致(祛皱和提拉效果)，2.皮肤年轻/复原(抗衰老效果)，皮肤更光滑/更细嫩(补水和保湿效果)。调查问卷设计了9分制打分加评语的感官评价方法：

9分:效果极度明显；8分:效果非常明显；7分:效果中度明显；6分:效果略微明显；5分:未感觉有效果；

4分:略微没有效果；3分:中度没有效果；2分:非常没有效果；1分:极度没有效果。

表6：自愿试用者感官评价综合表

以上所述，仅为本发明的较佳实施例，并非对本发明任何形式上和实质上的限制，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还将可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。凡熟悉本专业的技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，当可利用以上所揭示的技术内容而做出的些许更动、修饰与演变的等同变化，均为本发明的等效实施例；同时，凡依据本发明的实质技术对上述实施例所作的任何等同变化的更动、修饰与演变，均仍属于本发明的技术方案的范围内。

Claims (17)

1.虫草属真菌提取物作为外用护肤作用有效成分的用途。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述护肤作用选自以下任一项或多项：增白、增亮、修复、祛皱、保湿、和抗衰。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述虫草属真菌选自：冬虫夏草Cordycepssinensis或Ophiocordycepssinensis、中华被毛孢Hirsutellasinensis、蝙蝠蛾拟青霉PaecilomyceshepialidChenetDai,sp.Nov、蝙蝠蛾被毛孢HirsutellahepialiChenetShen、蛹虫草或北虫草Cordycepsmilitaris、虫草藻Cordycepsgracilis、大团囊虫草Cordycepsophioglossoides、Cordycepsmemorabillis、Cordycepssphecocephala、亚香棒虫草Cordycepshawkesii、珊瑚虫草Cordycepsmartialis、蝉花Cordycepssobolifera、虫草实蝇Cordycepscapitata中的一种或多种。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述虫草属真菌提取物以虫草属真菌的菌丝体与孢子为原料经醇提制得。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述虫草属真菌提取物含有弱酸性粘多糖，还原性有机羧酸，以及多酚化合物，且所述虫草属真菌提取物具备抗氧化剂活性。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述虫草属真菌提取物以干燥物计，还原性有机羧酸含量不低于27克/100克，多酚化合物含量不低于1370mgGAE/100克,抗氧化剂活性不低于40,000molTrolox当量/100克，弱酸性粘多糖不低于48克/100克。

7.一种化妆品组合物，含有护肤有效量的虫草属真菌提取物作为护肤有效成分。

8.如权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述作为护肤有效成分为作为增白有效成分、增亮有效成分、修复有效成分、祛皱有效成分、保湿有效成分、和抗衰有效成分中的至少一项。

9.如权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述虫草属真菌提取物经脱色、脱味、脱蛋白质之中的一项或多项处理。

10.如权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述虫草属真菌选自：冬虫夏草Cordycepssinensis或Ophiocordycepssinensis、中华被毛孢Hirsutellasinensis、蝙蝠蛾拟青霉PaecilomyceshepialidChenetDai,sp.Nov、蝙蝠蛾被毛孢HirsutellahepialiChenetShen、蛹虫草或北虫草Cordycepsmilitaris、虫草藻Cordycepsgracilis、大团囊虫草Cordycepsophioglossoides、Cordycepsmemorabillis、Cordycepssphecocephala、亚香棒虫草Cordycepshawkesii、珊瑚虫草Cordycepsmartialis、蝉花Cordycepssobolifera、虫草实蝇Cordycepscapitata中的一种或多种。

11.如权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述虫草属真菌提取物以虫草属真菌的菌丝体与孢子为原料经醇提制得。

12.如权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述虫草属真菌的菌丝体与孢子经固体发酵阶段与液体发酵阶段人工培养获得。

13.如权利要求12所述的化妆品组合物，其特征在于，所述人工培养的虫草属真菌为虫草属真菌纯种且经驯化。

14.如权利要求13所述的化妆品组合物，其特征在于，其特征在于，所述驯化方法选自以下：

方法一：

将虫草属真菌纯种在固体培养基上接种培养，选择最早长出的单菌落进一步传代培养，如此反复多次驯化虫草属真菌纯种；

方法二：

将虫草属真菌纯种接种液体培养基培养至对数期，经紫外照射后接种固体培养基，选择最早长出的单菌落进一步传代培养，反复多次选择最早长出的单菌落传代培养以驯化虫草属真菌纯种。

15.如权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述化妆品组合物以虫草属真菌提取物为唯一护肤有效成分或为护肤有效成分之一。

16.如权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述虫草属真菌提取物含有弱酸性粘多糖，还原性有机羧酸，以及多酚化合物，且所述虫草属真菌提取物具备抗氧化剂活性。

17.如权利要求7所述的化妆品组合物，其特征在于，所述虫草属真菌提取物以干燥物计，还原性有机羧酸含量不低于27克/100克，多酚化合物含量不低于1370mgGAE/100克,亲水性抗氧化剂活性不低于40,000molTrolox当量/100克，弱酸性粘多糖不低于48克/100克。