CN101627701A - 一种蛹虫草菌种选育方法 - Google Patents

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本发明公开了一种蛹虫草菌种选育方法。本发明中,将蛹虫草孢子悬浮液与缺乏营养的基本培养基混合均匀,待其凝固后,再倒上一层基本培养基,第二层培养基也凝固了,在其上再倒上一层营养丰富的培养基,然后倒置培养,在培养过程中挑选性状优良的蛹虫草单孢菌落。本发明从培养开始,就通过培养基的层层筛选,将大量性状差、活力低的蛹虫草孢子淘汰掉,剩下性状优良、活力高的蛹虫草纯种,大大减少了筛选的工作量,便于后续实验中挑选性状优良的菌落,有效提高了筛选效率。

Description

一种蛹虫草菌种选育方法
技术领域
本发明涉及一种蛹虫草菌种选育方法。
背景技术
现有的蛹虫草菌种选育时,获取孢子后,一般通过平板划线和涂布的方法,以将孢子稀释到合适的程度,待菌落形成后,作进一步的挑选。这种选育方法虽然操作简单,但是由于技术本身的限制,难以获得单孢生长形成的菌落,获得的菌落需要进行进一步的分离和挑选。这一方法需要进行大量的重复性劳动,分离效率低,选育耗时长,难以满足生产的需要。
也有部分采用梯度稀释法将孢子到一定程度,然后在培养基中涂布培养以获得单孢生长形成的菌落。这一方法能够获得纯种菌种,但是因为单孢的数量巨大,生长形成的菌落同样也是很多的,仍需要进行大量的筛选工作,挑选部分发到性状优良的菌落进行后续的培养,总的工作量也没有减少多少,效率依然不高。
发明内容
为了解决上述问题,本发明提供一种简单高效获取具有优良性状纯种蛹虫草单孢的方法。
本发明采取的技术方案是:
一种蛹虫草菌种选育方法,包括以下步骤:
1)从蛹虫草菌苔表面刮取孢子,加入到装有无菌水的容器中,充分振荡摇匀,稀释至所需倍数,制得蛹虫草孢子悬浮液;
2)配制缺乏营养的基本培养基,高温灭菌后,保温使其处于液态;
3)配制营养丰富的加富培养基,高温灭菌后,保温使其处于液态,备用;
4)在培养皿中倒入基本培养基,在培养基还处于液态时,吸取蛹虫草孢子悬浮液加入培养皿中,摇动培养皿使孢子悬浮液和基本培养基混合均匀;待培养皿中基本培养基凝固后,再倒入一层基本培养基,第二次倒入的培养基凝固后,在培养皿中倒入一层加富培养基。
5)培养皿中的加富培养基凝固后,将培养皿置于20~25℃恒温培养箱中倒置培养。
6)观察培养过程中各菌落的生长情况,选取生成快,扩张快,菌丝浓密的菌落进行后续试验。
本发明的有益效果是:基本培养基上营养有限,性状优良、活力高的蛹虫草孢子能够较快的萌发,利用其中有限的营养进行菌丝生长;性状差、活性低的孢子萌发后,由于缺乏营养,难以继续生长。
性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快,能够较早的进入下一个基本培养基层,抢先利用其中有限有营养,进而抑制其他蛹虫草孢子产生的菌丝的生长。
性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快,能够较早的进入加富培养基层,优先利用加富培养基的丰富营养,快速生长形成菌落;性状较次、活力较低的蛹虫草孢子,其菌丝生长到加富培养基所用的时间更长,此时培养基中的营养已大量被其他性状更为优良的蛹虫草菌丝利用,难以形成可观的菌落。
这样培养时,通过培养基的层层筛选,大量性状差、活力低的蛹虫草孢子被淘汰掉,剩下的为性状优良、活力高的蛹虫草纯种,大大减少了筛选的工作量,便于后续实验中挑选性状优良的菌落,有效提高了筛选效率。
具体实施方式
下面结合实例,进一步说明本发明。
一种蛹虫草菌种选育方法,包含以下步骤:
1)从蛹虫草菌苔表面刮取孢子,加入到装含有无菌水和蛹虫草孢子分散剂吐温-80的三角瓶中,三角瓶中加入玻璃珠,使用回旋振荡器充分振荡摇匀,然后稀释至所需倍数,制得蛹虫草孢子悬浮液;
2)配制缺乏营养的基本培养基:PDA基本培养基,其配方为:
水:600-800ml    马铃薯:80-100g  葡萄糖:15-18g  琼脂:15-18g高温灭菌后,45高温灭菌后,45℃保温使其处于液态,临用前每1升培养基中加入无菌的12-16ml浓度为2%去氧胆酸钠溶液和1.8-2ml浓度为10000-15000u/ml的链霉素溶液,混合均匀,制得PDA基本选择培养基;
3)配制营养丰富的加富培养基:加富PDA培养基,其配方为:
水:600-800ml  马铃薯:80-100g  葡萄糖:15-18g  琼脂:15-18g  磷酸氢二钾:1.5-1.8g硫酸镁:0.7-0.9g  蛋白胨:2-2.5g
蚕蛹粉:2-2.5g,高温灭菌后,保温使其处于液态,备用;
4)在培养皿中倒入PDA基本选择培养基,当培养基还处于液态时,吸取蛹虫草孢子悬浮液加入培养皿中,摇动培养皿使孢子悬浮液和PDA基本选择培养基混合均匀;待培养皿中PDA基本选择培养基凝固后,再倒入一层PDA基本选择培养基,第二次倒入的培养基凝固后,在培养皿中倒入一层加富PDA培养基;三层培养基的厚度基本相同,均为1~2mm;
5)培养皿中的加富PDA培养基凝固后,将培养皿置于20~25℃恒温培养箱中倒置培养;
6)观察培养过程中各菌落的生长情况,选取生成快,扩张快,菌丝浓密的菌落进行后续试验。
使用分散剂之后,孢子分散更均匀,且不易沉降,保证了孢子悬浮液的均匀性,有利于实验的进行;加入玻璃珠,更容易将刮取的孢子打散,使用回旋振荡器振荡,振荡均匀迅速,有效提高实验效率。除了吐温-80,也可以使用其他对孢子无毒害作用的分散剂,如维生素E、吐温-60等。
培养基优选的保温温度为45~60℃,既便于操作,也不会因为过热对孢子造成不良影响。
PDA基本培养基也可以使用其他培养基代替,只要能保证蛹虫草孢子萌发后有基本的生长营养即可,本领域的技术人员可以很容易根据实际情况选择不同的配方。
加富PDA培养基也可以使用其他培养基代替,只要营养丰富、适宜蛹虫草菌丝生长即可,本领域的技术人员可以很容易根据实际情况选择不同的配方。
除了去氧胆酸钠、链霉素,微生物抑制剂也可以是一般的活性抗生素,如四环素、氯霉素、青霉素,但不能使用对蛹虫草孢子抑制作用太强化学杀菌剂,如人工合成的酰基化抗生素。
基本培养基上营养有限,性状优良、活力高的蛹虫草孢子能够较快的萌发,利用其中有限的营养进行菌丝生长;性状差、活性低的孢子萌发后,由于缺乏营养,难以继续生长;培养基中加入了微生物抑制剂,能够抑制培养基中细菌的霉菌的生长,避免杂菌感染,影响试验结果;同时微生物抑制剂对蛹虫草孢子的萌发也有一定的抑制作用,这样活力低、性状差的孢子就难以萌发。
性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快,能够较早的进入下一个基本培养基层,抢先利用其中有限有营养,进而抑制其他蛹虫草孢子产生的菌丝的生长。
性状越优良、活力越高的蛹虫草孢子产生的菌丝生长越快,能够较早的进入加富培养基层,优先利用加富培养基的丰富营养,快速生长形成菌落;性状较次、活力较低的蛹虫草孢子,其菌丝生长到加富培养基所用的时间更长,此时培养基中的营养已大量被其他性状更为优良的蛹虫草菌丝利用,难以形成可观的菌落。
这样培养时,通过培养基的层层筛选,大量性状差、活力低的蛹虫草孢子被淘汰掉,剩下的为性状优良、活力高的蛹虫草纯种,大大减少了筛选的工作量,便于后续实验中挑选性状优良的菌落,有效提高了筛选效率。

Claims (9)

1.一种蛹虫草菌种选育方法,其特征在于包含以下步骤:
1)从蛹虫草菌苔表面刮取孢子,加入到装有无菌水的容器中,充分振荡摇匀,稀释至所需倍数,制得蛹虫草孢子悬浮液;
2)配制缺乏营养的基本培养基,高温灭菌后,保温使其处于液态;
3)配制营养丰富的加富培养基,高温灭菌后,保温使其处于液态,备用;
4)在培养皿中倒入基本培养基,当培养基还处于液态时,吸取蛹虫草孢子悬浮液加入培养皿中,摇动培养皿使孢子悬浮液和基本培养基混合均匀;待培养皿中基本培养基凝固后,再倒入一层基本培养基,第二次倒入的基本培养基凝固后,在培养皿中倒入一层加富培养基。
5)培养皿中的加富培养基凝固后,将培养皿置于20~25℃恒温培养箱中倒置培养。
6)观察培养过程中各菌落的生长情况,选取生成快,扩张快,菌丝浓密的菌落进行后续试验。
2.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种选育方法,其特征在于:所述缺乏营养的基本培养基包括PDA基本培养基,PDA基本培养基的配方为:
水:600-800ml  马铃薯:80-100g  葡萄糖:15-18g  琼脂:15-18g。
3.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种选育方法,其特征在于:所述营养丰富的加富培养基包括加富PDA培养基,加富PDA培养基的配方为:
水:60-0800ml  马铃薯:80-100g  葡萄糖:15-18g  琼脂:15-18g
磷酸氢二钾:1.5-1.8g  硫酸镁:0.7-0.9g  蛋白胨:2-2.5g  蚕蛹粉:2-2.5g。
4.
根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种选育方法,其特征在于:步骤1)中加入蛹虫草孢子分散剂。
5.根据权利要求4所述的一种蛹虫草菌种选育方法,其特征在于:所述分散剂包括吐温-80、维生素E,吐温-60。
6.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种选育方法,其特征在于:步骤1)中容器中加入玻璃珠,使用回旋振荡器振荡均匀。
7.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种选育方法,其特征在于:步骤2)中保温处于液态的基本培养基,临用前加入一种或多种无菌的微生物抑制剂,混合均匀,制得基本选择培养基。
8.根据权利要求7所述的一种蛹虫草菌种选育方法,其特征在于:选用的微生物抑制剂包括去氧胆酸钠、链霉素、四环素、氯霉素、青霉素。
9.根据权利要求1所述的一种蛹虫草菌种选育方法,其特征在于:所述培养基的保温温度为45~60℃。
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