CN112391295A - 野生蛹虫草菌种的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种野生蛹虫草菌种的制备方法，是选取野生蛹虫草菌核与子实体交界处内部组织，通过配制特定配方的培养基分离纯化，采用二次覆盖母种进行提纯复壮，获得野生蛹虫草纯化液体母种，进而将获得的野生蛹虫草纯化液体母种接种于柞蚕解除滞育蛹中培养，选用培养12天（DPPH抗氧化活性高）的全硬僵蛹超低温保藏。不仅操作简单，而且分离成功率高且保藏期可达30个月，解决了现有技术因分离成功率低且保藏期短所存在的种种问题。

Description

野生蛹虫草菌种的制备方法

技术领域

本发明属于野生食药用菌菌种制备方法，尤其是一种可有效提高分离成功率、延长保藏期的野生蛹虫草菌种的制备方法。

背景技术

蛹虫草（Cordyceps militaris）在分类地位上与冬虫夏草为同属不同种，为子囊菌门、麦角菌目、麦角菌科、虫草属，是虫草属的模式种。蛹虫草富含虫草素，虫草酸及超氧化物歧化酶等多种活性成分，具有抑制人体内有害细菌生长、抗癌、抗氧化、提高免疫力及降血糖等功效，为此已作为冬虫夏草替代品，应用于保健药品和食品。目前，市售的蛹虫草主要靠采集野生蛹虫草通过人工分离培养等制备成野生蛹虫草菌种，再经人工培育而成。由于野生蛹虫草仅产于特定季节，产量少且采集困难，加之过度采摘和牲畜践踏等导致资源逐年减少，故在野生蛹虫草菌种制备过程中提高菌种分离成功率及延长保藏期（保持菌种原有生物特性和生命力的保藏时间）至关重要。然而，现有野生蛹虫草菌种均是以子实体中上部为分离材料，此部位虽然活性强但污染率高，使蛹虫草菌菌丝相对于杂菌菌丝失去生长优势，无法有效提纯，分离成功率低。另外，现有菌种斜面保藏法的保藏期只能达到数月，即使采用甘油菌丝冷冻（-80℃）保藏法，保藏期限也不超过18个月，转种频繁，不仅费时费力，而且菌种污染几率高且容易变异。

发明内容

本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种可有效提高分离成功率、延长保藏期的野生蛹虫草菌种的制备方法。

本发明的技术解决方案是：一种野生蛹虫草菌种的制备方法，依次按照如下步骤进行：

a. 对野生蛹虫草进行消毒处理：选择外形完整、子实体健壮及无病虫害的野生蛹虫草，去除杂质并用水清洗干净后在无菌条件下进行表面消毒；

b. 母种分离培养：在野生蛹虫草菌核与子实体交界处内部取粒径2~4mm的块状组织，接入已灭菌的试管斜面培养基中进行培养，培养温度为20～25℃，培养时间为15～18d，所述培养基组分为：马铃薯煎汁液370～400mL，鲜蚕蛹煎汁液130～150mL，蛹虫草菌生长土浸泡液450～500m L，葡萄糖15～20g/L，硫酸镁0.5～1g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，琼脂18～20g/L，pH值4.5～7.5，所述马铃薯煎汁液是将马铃薯与水按质量比1：2.0～2.5混合后煮20～30min后的滤液，所述鲜蚕蛹煎汁液是将鲜蚕蛹与水按质量比1：1.5～2.0混合后煮20～30min后的滤液，所述蛹虫草菌生长土浸泡液是将野生蛹虫草菌生长地土壤与水按质量比1：2.0～2.5混合充分搅拌后的澄清过滤液；

c. 母种提纯复壮：将b步骤所述培养基在121℃高压下灭菌20～30min，冷却至30～45℃加入5.5万单位/L的链霉素，混合均匀后倒入b步骤的试管至覆盖母种厚度1～3mm，培养基凝固后放置在18～20℃条件下培养10～15d后，挑取先端菌丝转管培养，即在15～25℃条件下培养18～20d，所述培养基同b步骤；

d. 液体母种培养：将b步骤所述培养基去除琼脂配制成液体培养基，在121℃高压下灭菌20～30min，冷却后无菌条件下接种经过c步骤培养的菌种，在转速130～150r/min，温度22～25℃的条件下培育5～7d，得液体母种备用；

e. 柞蚕蛹选择：选择健康饱满的柞蚕解除滞育蛹，用75%乙醇进行体表面消毒，备用，所述柞蚕解除滞育蛹为将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下储存30～60d；

f. 接种培养：收集液体母种的孢子菌液并按照0.2～0.4mL/个接种于柞蚕解除滞育蛹中，单个放入无菌培养容器中于20～22℃下培养12天；

g. 将僵蛹真空包装后置于-80℃下冰箱中冷藏。

本发明选取野生蛹虫草菌核与子实体交界处内部组织，通过配制特定配方的培养基分离纯化，采用二次覆盖母种进行提纯复壮，获得野生蛹虫草纯化液体母种，进而将获得的野生蛹虫草纯化液体母种接种于柞蚕解除滞育蛹中培养，选用DPPH抗氧化活性高的全硬僵蛹超低温保藏。不仅操作简单，而且分离成功率高且保藏期可达30个月，解决了现有技术因分离成功率低且保藏期短所存在的种种问题。

具体实施方式

本发明的野生蛹虫草菌种的制备方法，依次按照如下步骤进行：

a. 对从辽宁省庄河市冰峪沟山上采集的野生蛹虫草进行消毒处理：选择外形完整、子实体健壮及无病虫害的野生蛹虫草，去除杂质并用水清洗干净后在无菌条件下进行表面消毒；具体是用无菌水冲洗3次，6％次氯酸钠溶液消毒8min，再无菌水冲洗3次，75％酒精浸泡1分钟，再无菌水冲洗3次；

b. 母种分离培养：在超净工作台上使用镊子在野生蛹虫草菌核（亦称虫体或蛹体）与子实体交界处内部取出粒径3mm的块状组织，接入已灭菌的试管斜面培养基中进行培养，培养温度为25℃，培养时间为15d，所述培养基组分为：马铃薯煎汁液400mL，鲜蚕蛹煎汁液150mL，蛹虫草菌生长土浸泡液500m L，葡萄糖20g/L，硫酸镁1g/L，磷酸二氢钾3g/L，琼脂20g/L，pH值5，马铃薯煎汁液是将马铃薯切片与水按质量比1：2.0混合后煮25min后的滤液，所述鲜蚕蛹煎汁液是将鲜蚕蛹与水按质量比1：2.0混合后煮25min后的滤液，所述蛹虫草菌生长土浸泡液是将野生蛹虫草菌生长地土壤与水按质量比1：2.0混合充分搅拌后的澄清过滤液；

c. 母种提纯复壮：将b步骤所述培养基在121℃高压下灭菌20～30min，冷却至30～45℃加入5.5万单位/L的链霉素，混合均匀后倒入b步骤的试管至覆盖母种厚度1～3mm，培养基凝固后放置在18～20℃条件下培养10～15d后，挑取先端菌丝转管培养，即在15～25℃条件下培养18～20d实现复壮，所述培养基同b步骤；

d. 液体母种培养：将b步骤所述培养基配方去除原料琼脂配制成液体培养基，在121℃高压下灭菌25min，冷却后无菌条件下接种经过c步骤培养的菌种，在转速140r/min，温度23℃的条件下培育6d，得液体母种备用；

e. 柞蚕蛹选择：选择健康饱满的柞蚕解除滞育蛹，用75%乙醇进行体表面消毒，备用，所述柞蚕解除滞育蛹为将处于滞育期的柞蚕蛹2℃条件下储存50d；

f. 接种培养：将制备好的液体母种离心或过滤收集孢子菌液并按照0.3 0.4mL/个接种于柞蚕解除滞育蛹中，单个放入无菌培养容器中于22℃下培养12天；

g. 取经过f步骤12天培养的全硬僵蛹，真空包装后置于-80℃下冰箱中冷藏。

实验1：野生蛹虫草不同部位组织分离

在超净工作台上使用镊子分别在实施例1的野生蛹虫草子菌核内部、菌核与子实体交界处内部（简称交界处内部）、子实体基部、子实体中部和子实体上部取出一块粒径3mm的块状组织，按照实施例1的方法进行菌种制备，结果如表1。

表1 野生蛹虫草不同部位组织分离纯化菌种试验比较

注：＋＋＋表示菌丝长势最好，＋＋表示菌丝长势较好，＋表示菌丝长势较差。

结果表明：来源不同部位组织分离纯化野生蛹虫草菌在培养基上的长势与成功率存在明显差异。子实体组织尤其基部及中上部组织细胞分化比较活跃，分离的组织菌丝长势好，但污染率高（分别为25%、22%及26%），成功率低（分别为75%、78%及74%），菌核内部分离的组织菌丝长势稍差，但污染率相对降低（13%），成功率有所提高（87%），而菌核与子实体交界处内部组织（本发明实施例）菌丝长势较好，但污染率最低（8%），成功率最高（92%），因此，野生蛹虫草菌核与子实体交界处内部组织适合野生蛹虫草菌种分离。

实验2：DPPH抗氧化活性测定

用电子天平准确分别称取按照实施例1方法但f步骤为培养10d、11d、12d、13d、14d及15d的僵蛹样品，用氯仿、甲醇和水的混合液( 体积比 1：2.5：1) 浸提，料液比 15：1( mg /m L) ，于 100Hz 超声波中提取 30 min，静置 4 h，5000 r / min 离心，吸取上清液作为初试样品，4 ℃ 冰箱保存。分别吸取初试样品溶液各100μL 和0. 2 mg/mL DPPH 试液 100μL 加入96孔酶标板中，3个重复。样品加入后振荡 30 s，于室温下遮光反应 20 min 后于517 nm 波长下测定其吸光值( Ds) 。同时测定不加 DPPH 的样品空白吸光值( Dc) 和加DPPH 但不加样品( 以等体积 100 μL 提取液代替样品) 的吸光值( Dmax) 。DPPH 自由清除率=［1－( Ds－Dc) /Dmax］×100%，结果如表2所示。

表2僵蛹期不同天数的DPPH自由基清除率（% ）

结果表明，培养12d的僵蛹自由基清除率最高，说明此时菌丝体的抗氧化能力最强，选择培养12d的僵蛹冷藏抵御低温伤害能力强，适于用于菌种冷藏。

实验3本发明实施例与现有技术保藏期对比

采用本发明实施例保藏法与现有技术保藏方法对同一野生蛹虫草菌种进行保藏，并对保藏不同时期的野生蛹虫草菌种按照常规方法培养，结果如表3所示。

表3不同保藏方法对野生蛹虫草菌丝生长的影响

注：＋＋＋表示菌丝长势最好，＋＋表示菌丝长势较好，＋表示菌丝长势较差，0表示菌丝体不生长。

结果表明：在4℃条件下，菌种斜面保藏法半年以上就已经失去大部分水分而干掉，菌种保藏期只有6个月；甘油菌丝保藏法菌种保藏期不足18个月；本发明实施例的菌种保藏期至少可达30个月。

Claims (1)

1.一种野生蛹虫草菌种的制备方法，其特征在于依次按照如下步骤进行：

a. 对野生蛹虫草进行消毒处理：选择外形完整、子实体健壮及无病虫害的野生蛹虫草，去除杂质并用水清洗干净后在无菌条件下进行表面消毒；

b. 母种分离培养：在野生蛹虫草菌核与子实体交界处内部取粒径2~4mm的块状组织，接入已灭菌的试管斜面培养基中进行培养，培养温度为20～25℃，培养时间为15～18d，所述培养基组分为：马铃薯煎汁液370～400mL，鲜蚕蛹煎汁液130～150mL，蛹虫草菌生长土浸泡液450～500m L，葡萄糖15～20g/L，硫酸镁0.5～1g/L，磷酸二氢钾1～3g/L，琼脂18～20g/L，pH值4.5～7.5，所述马铃薯煎汁液是将马铃薯与水按质量比1：2.0～2.5混合后煮20～30min后的滤液，所述鲜蚕蛹煎汁液是将鲜蚕蛹与水按质量比1：1.5～2.0混合后煮20～30min后的滤液，所述蛹虫草菌生长土浸泡液是将野生蛹虫草菌生长地土壤与水按质量比1：2.0～2.5混合充分搅拌后的澄清过滤液；

c. 母种提纯复壮：将b步骤所述培养基在121℃高压下灭菌20～30min，冷却至30～45℃加入5.5万单位/L的链霉素，混合均匀后倒入b步骤的试管至覆盖母种厚度1～3mm，培养基凝固后放置在18～20℃条件下培养10～15d后，挑取先端菌丝转管培养，即在15～25℃条件下培养18～20d，所述培养基同b步骤；

d. 液体母种培养：将b步骤所述培养基去除琼脂配制成液体培养基，在121℃高压下灭菌20～30min，冷却后无菌条件下接种经过c步骤培养的菌种，在转速130～150r/min，温度22～25℃的条件下培育5～7d，得液体母种备用；

e. 柞蚕蛹选择：选择健康饱满的柞蚕解除滞育蛹，用75%乙醇进行体表面消毒，备用，所述柞蚕解除滞育蛹为将处于滞育期的柞蚕蛹在0～4℃条件下储存30～60d；

f. 接种培养：收集液体母种的孢子菌液并按照0.2～0.4mL/个接种于柞蚕解除滞育蛹中，单个放入无菌培养容器中于20～22℃下培养12天；

g. 将僵蛹真空包装后置于-80℃下冰箱中冷藏。