KR101842700B1 - 에델바이스 식물 세포 배양 추출물 및 천연 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 에델바이스(Leontopodium alpinum) 식물세포 또는 부정근 배양 추출물; 및 금은화(Lonicera Japonica Flower) 추출물, 또는 쑥국화(Tanacetum Vulgare) 추출물;을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물을 제공한다.

Description

에델바이스 식물 세포 배양 추출물 및 천연 복합 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물{A COSMETIC COMPOSITION COMPRISING LEONTOPODIUM ALPINUM CELL CULTURE EXTRACT AND NATURAL COMPLEX EXTRACT}

본 발명은 천연 추출물을 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 인체의 일차 방어막으로서 체내의 기관들을 온도 및 습도 변화, 자외선, 공해물질 등 외부환경의 자극으로부터 보호해 주며, 체온조절 등의 생체 항상성 유지에 중요한 역할을 한다.

산업이 발달함에 따라 환경 오염이 심각해지고, 피부의 노화 방지, 미백 등에 관한 관심이 고조되고 있다. 특히, 사람의 피부는 끊임없이 변화를 겪게 되는데, 가장 대표적인 변화가 노화에 의한 피부 기능 저하 및 시각적 아름다움의 감소이다. 피부 노화의 결과 나타나는 최종적인 피부 외관에서의 현상은 주름의 형성, 피부 탄력 저하, 노인성 반점 형성 등이 있으며, 주름의 형성이 가장 대표적인 현상으로 손꼽힌다.

피부의 주요 구성물질인 지질, 단백질, 다당류 및 핵산 등은 산화되어 피부 세포 및 조직이 파괴될 수 있으며, 결국 피부가 노화될 수 있다. 특히 단백질의 산화에 의해 피부의 결합조직인 콜라겐, 히알루론산, 엘라스틴, 프로테오글라이칸, 피브로넥틴 등이 절단되고 과다 염증반응이 나타날 수 있으며, 더욱 심화되는 경우 DNA 변이에 의한 돌연변이, 면역기능의 저하, 암의 유발이 촉진될 수 있다.

따라서, 신체의 대사 과정 중 발생하는 활성산소종이나 자외선 조사, 염증반응에 의해 매개 되는 활성산소종을 소거하여 세포막을 보호하고, 활발한 신진대사를 통해 손상 받은 세포를 재생시켜 피부 건강을 회복시키는 것이 바람직하다.

한편, 멜라닌은 색소 세포 내에 존재하는 타이로시네이즈의 작용에 의해 타이로신으로부터 도파(dopa), 도파퀴논(dopaquinone)으로 변환되어 도파크롬(dopachrome) 등을 거쳐 생성된다. 멜라닌은 자외선 등 피부 유해 요소로부터 신체를 보호하고 체내 호르몬 분비를 조절하는 역할을 한다.

그러나, 멜라닌은 과잉 생산되어 기미, 주근깨의 형성 및 피부노화를 촉진시킬 수 있으며, 피부암의 유발에 관여할 수 있으므로, 멜라닌의 과잉생산을 억제하기 위한 연구개발이 활발하게 이루어지고 있다.

종래에 아스코르빈산(일본특개평 4-9320), 하이드로퀴논(일본특개평 6-192062), 코직산(일본특개소 56-7710), 알부틴(일본특개평 4-93150) 및 식물 추출물 등이 타이로시네이즈 저해 활성을 나타내어 미백 화장료로 이용되었다. 하지만, 상기 성분들은 화장품 제형 중에서 안정성이 미흡하여, 분해되어 착색되거나, 이취를 유발할 수 있으며, 생체 내에서 안전성 또는 효능이 불명확하여 그 사용이 제한되고 있다.

화장품 업계는 여러 화학물질 등에 의한 피부 자극을 줄이기 위해 천연물을 사용한 다수의 제품을 개발하고 있다. 천연 재료는 피부에 부작용이 적을 뿐 아니라, 최근 천연 재료를 이용한 화장품에 대한 소비자들의 호응이 높아짐에 따라 화장품 원료로서 개발가치가 점차 증가하고 있다.

그러나, 통상의 방법으로 수득된 천연 유래의 추출물을 함유하는 화장료 제품은 피부 미백 효과 등 기능성이 충분히 구현되지 아니하며, 피부 개선 활성이 지속적으로 유지되지 않는 문제가 있었다.

따라서, 우수한 기능성과 함께 생체 안정성 및 피부 개선 효과가 우수한 천연물 유래 화장료 제품의 개발 필요성이 꾸준히 대두되고 있는 상황이다. 이에 따라, 본 발명자들은 EWG 1 등급에 해당하는 천연 성분만을 담아 민감한 피부도 안심하고 사용할 수 있는 친환경적 피부 외용제 제품을 개발하고자 하였다.

본 발명은 전술한 종래 기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 본 발명의 목적은 피부 미백 및 항산화 활성 등 기능성뿐만 아니라 생체 안전성이 우수한 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 에델바이스(Leontopodium alpinum) 식물세포 또는 부정근 배양 추출물; 및 금은화(Lonicera Japonica Flower) 추출물, 또는 쑥국화(Tanacetum Vulgare) 추출물;을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 상기 에델바이스 식물세포 또는 부정근 배양 추출물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 5.0 중량% 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 상기 금은화 추출물 10 내지 30 중량부, 및 상기 쑥국화 추출물 10 내지 30 중량부를 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 에델바이스 식물세포 또는 부정근 배양 추출물은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp .) 균주를 접종하여 수득된 발효 추출물일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 석유에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출될 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 고구마 추출물, 아사이베리 추출물, 인디언구스베리 추출물, 및 아스파라거스 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부 미백, 피부 보습, 항산화, 항염, 또는 피부 주름 개선용일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 중금속 또는 미세먼지 제거용일 수 있다.

일 실시예에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화될 수 있다.

본 발명의 일 측면에 따른 화장료 조성물은 천연 원료의 유효성분들이 상호 작용하여 사용자의 피부 건강에 유익할 뿐만 아니라 피부 개선 효과가 극대화될 수 있다.

특히, 본 발명의 화장료 조성물에 적용된 천연 원료는 EWG 1 등급에 해당하는 원료로서 인체에 대한 유해성이 없고 민감한 피부에도 안심하고 적용될 수 있다.

본 발명의 효과는 상기한 효과로 한정되는 것은 아니며, 본 발명의 상세한 설명 또는 청구범위에 기재된 발명의 구성으로부터 추론 가능한 모든 효과를 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 명세서에서 사용되는 용어는 본 발명에서의 기능을 고려하면서 가능한 현재 널리 사용되는 일반적인 용어들을 선택하였으나, 이는 당 분야에 종사하는 기술자의 의도 또는 판례, 새로운 기술의 출현 등에 따라 달라질 수 있다. 또한, 특정한 경우는 출원인이 임의로 선정한 용어도 있으며, 이 경우 해당되는 발명의 설명 부분에서 상세히 그 의미를 기재할 것이다. 따라서 본 발명에서 사용되는 용어는 단순한 용어의 명칭이 아닌, 그 용어가 가지는 의미와 본 발명의 전반에 걸친 내용을 토대로 정의되어야 한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

수치 범위는 상기 범위에 정의된 수치를 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최대의 수치 제한은 낮은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 낮은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 최소의 수치 제한은 더 높은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼 모든 더 높은 수치 제한을 포함한다. 본 명세서에 걸쳐 주어진 모든 수치 제한은 더 좁은 수치 제한이 명확히 쓰여져 있는 것처럼, 더 넓은 수치 범위 내의 더 좋은 모든 수치 범위를 포함할 것이다.

이하, 본 발명의 실시예를 상세히 기술하나, 하기 실시예에 의해 본 발명이 한정되지 아니함은 자명하다.

본 발명의 일 측면에 따르면, 에델바이스(Leontopodium alpinum) 식물세포 또는 부정근 배양 추출물; 및 금은화(Lonicera Japonica Flower) 추출물, 또는 쑥국화(Tanacetum Vulgare) 추출물;을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물이 제공된다.

상기 화장료 조성물은 천연 유래의 추출물을 유효성분으로 포함하여 피부 개선 효과 및 생체 안전성이 우수할 뿐만 아니라 피부 자극이 최소화될 수 있다. 특히, 상기 에델바이스 식물세포 배양 추출물 및 천연 복합 추출물은 피부에 동시에 작용하므로 상승 효과로 인해 피부 미백 및 피부 보습 등 기능성이 현저히 증대될 수 있다.

특히, 상기 화장료 조성물은 EWG 1 등급 성분만을 함유하므로 기능성과 안전성을 모두 충족하고 있으며, 유해성이 없어 민감한 피부에도 적용이 용이하다.

EWG 등급은 미국의 비영리 환경 시민단체 EWG(Environmental Working Group)에서 발표하는 화장품 성분 유해 등급으로서 EWG는 화장품 성분의 유해성에 대해 면밀한 조사를 진행해 성분 유해도를 1등급에서 10등급까지 구분하고 있으며, 1등급 및 2등급을 안전 등급으로 분류하고 있다.

상기 “유효 성분으로 포함하는”은 피부 개선 효과를 나타낼 수 있는, 예컨대, 주름개선효능과 관련된 콜라겐 합성, 탄력 개선 또는 피부 미백, 피부 자극 완화, 항산화 효과 등을 나타낼 수 있는 정도의 유효량을 함유하는 것을 의미할 수 있다.

상기 “에델바이스(Leontopodium alpinum)”는 쌍떡잎식물 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀로 주로 건조한 곳에서 서식하는 고산식물로서, 항염증성(anti-inflammatory property) 및 항산화성(anti-oxidant property)이 일부 공지된 바 있으며, 비타민 E 또는 레티놀(retinol)과 같은, 종래에 이용되는 화합물 보다 항산화력이 우수한 것으로 알려져 있다.

상기 에델바이스 식물 세포 배양물은 에델바이스 식물체의 일부, 예컨대, 줄기, 또는 잎의 전체 또는 일부를 잘라 유도 배지에서 배양을 통해 수득될 수 있다.

상기 배양 유도는 식물조직배양에 관한 것으로, 살아있는 식물 조직을 기내(in vitro)에서 무균적으로 배양하여 배양 목적에 따라서 식물 세포, 기관 및 식물체를 증식시킬 수 있다. 상기 식물조직배양은 식물이 지니는 기본적인 특성을 이용하는 것으로 식물이 지니는 독특한 특징인 식물의 체세포로부터 식물체를 재생시킬 수 있는 분화전능성(totipotency)을 기반으로 한다.

즉, 식물의 단세포(원형질체 포함), 잎 및 뿌리 절편을 특정 영양물질 및 생장 조절제가 첨가된 배지에 배양하면 세포 및 조직으로부터 식물체가 재생될 수 있다. 상기 분화전능성은 식물이 지니는 특성인 고착 생활과 장기간 생존을 위하여 열악한 환경 및 초식동물의 피해로부터 생존하기 위해 요구된다. 모식물체로부터 분리된 식물조직세포는 적정배양환경에서 배양하면 완전한 식물체로 재생될 수 있는 잠재력 즉, 전형성능을 가지고 있는 식물은 발생학 등의 학술적인 중요성뿐만 아니라 화장품 원료 등의 실용화를 위해서도 활용가치가 크다.

상기 "식물 세포 배양물"은 식물체에서 잘라낸 조직을 옥신을 함유한 배지에서 배양하거나, 어떤 종류의 식물에 상처를 내거나, 상구를 옥신으로 처리하거나 할 때에 생기는 특수한 조직 또는 세포덩어리를 의미한다. 캘러스는 정상적인 기관형성이나 조직분화를 일으키는 능력을 잃은 무정형의 조직 또는 세포덩어리로 대부분 유세포로 구성되며, 넓은 의미로는 아그로박테리움(agrobacterium) 등의 감염에 의해서 생기는 식물종양조직도 포함할 수 있다.

상기 식물 세포 배양물은 에델바이스의 줄기, 잎 등의 어느 부위로부터 유도된 것이든 무방하나, 일 구체예로, 에델바이스의 줄기와 잎의 조직 일부, 또는 에델바이스 종자의 발아된 유묘로부터 자엽을 절취하여 유도시킨 식물세포일 수 있고, 에델바이스의 일부 조직을 분리하여 옥신 및 사이토키닌의 함량을 조절한 배지에서 형성된 식물세포 일 수 있다. 부정근 배양의 경우는 식물 세포 배양 과정과 동일하게 진행되나, 다만, 부정근이 유도될 수 있도록 식물 호르몬의 조합을 달리할 수 있다.

상기 “금은화(Lonicera Japonica Flower)”는 인동과(Caprifoliaceae)에 속하는 인동 덩굴(Lonicera japonica Thunb.)의 꽃으로, 민간에서는 이뇨, 건위, 관절염, 화농성 피부염, 기관지염에 사용되고 있다. 상기 금은화는 탄닌(tannin), 이노시톨(inositol), 스테롤(sterol), 클롤제닉산(chlorogenic acid), 이소클로제닉산(isochlogenic acid) 등을 포함하며, 플라보노이드(flavonoid) 성분으로서는 루테올린(luteolin), 에피게닌(apigenin), 루테올린-7-람노글루코시드(luteolin-7-O-rhamnoglucoside), 쿼세틴(quercetin) 등이 포함한다. 특히 상기 금은화의 플라보노이드(flavonoid)에 의한 항염증작용 및 항돌연변이 작용이 보고된 바 있다.

상기 “쑥국화(Tanacetum Vulgare)”는 초롱꽃목 국화과의 여러해살이풀로서 근경이 길게 벋고 줄기는 곧추서며 총생하고 상부에 가지가 갈라지며 높이 60 내지 70㎝이고 잎과 더불어 거미줄 같은 털이 있다. 상기 쑥국화는 민간에서는 '야생 마가목'이라 부르기도 하며 약용식물로서 소화가 안될 때 사용되기도 한다. 상기 쑥국화의 꽃에는 유기산, 비타민C, 수렴성분 등이 함유되어 있어 피부 개선의 용도로서 활용 가능하다.

상기 “추출물”은 용매와 추출 원료를 특정 조건 하에서 접촉시킴으로써 추출 원료에 함유된 유효성분이 전이된 용매를 지칭하는 것으로, 천연물로부터 원료에 함유된 성분을 분리해낸 물질이라면, 추출 방법이나 성분의 종류와 무관하게 모두 포함할 수 있다. 예컨대, 물이나 유기용매를 이용하여 천연물로부터 용매에 용해되는 성분을 추출한 것, 천연물의 특정 성분, 예컨대 오일과 같은 특정 성분만을 추출하여 얻어진 것 등을 모두 포함할 수 있다. 상기 추출물은 상기 나노클로롭시스 오세아니카를 건조 후 분말화하거나, 열수추출법, 에탄올 추출법 등 종래 알려진 다양한 추출법에 의해 수득할 수 있다.

상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 석유에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출될 수 있고, 구체적으로 60 내지 90% 농도(v/v)의 에탄올에 의해 추출될 수 있다.

상기 원료에 포함된 유효성분은 용매의 극성에 따라 추출 비율이 상이해질 수 있으며, 상기 에탄올은 천연 원료의 생리 활성 물질 추출에 있어서 선택성이 뛰어나므로 상기 에탄올 추출에 의해 최적의 피부 개선 효과가 구현될 수 있다

물과 에탄올은 극성이 상이하고 각 극성에 따라 추출되는 유효성분이 달라질 수 있으므로 최적의 피부 개선 효과가 구현될 수 있도록 상기 에탄올의 농도를 적절히 제어할 수 있다. 이 때, 상기 에탄올의 농도가 60% 미만이면 피부 개선 효과를 나타내는 유효성분이 충분하게 추출되지 않을 수 있고, 90% 초과이면 적정한 수율이 구현되지 않을 수 있다.

상기 추출물은 추출 원료를 물로 수세한 후 건조 및 분쇄하여, 원료 중량의 8 내지 12배에 달하는 부피의 용매로 약 1 내지 24시간 동안 환류 순환 추출, 가압 추출, 초음파 추출 등 통상적인 방법으로 추출 및 여과하여 제조할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 감압 증류 또는 동결 건조 등과 같은 추가적인 공정에 의해 분말 상태로 수득할 수 있다.

상기 추출물은 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함할 수 있다. 예컨대, 상기 추출물은 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피(크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 분획물을 포함할 수 있다.

상기 조성물은 상기 에델바이스 식물세포 또는 부정근 배양 추출물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 5.0 중량% 포함할 수 있다.. 상기 에델바이스 식물세포 또는 부정근 배양 추출물의 함량이 0.5 중량% 미만인 경우 피부 개선 효과가 적절히 구현되지 않을 수 있고, 5.0중량% 초과인 경우 제품화에 요구되는 기타 성분의 비중이 감소하여 제품 본연의 상품성이 저하되거나, 비용 효율이 저하될 수 있다.

상기 조성물은 상기 금은화 추출물 10 내지 30 중량부, 및 상기 쑥국화 추출물 10 내지 30 중량부를 포함할 수 있다. 상기 추출물의 혼합 비율의 편차가 큰 경우 각 추출물의 유효성분에서 유래한 피부 개선 효과가 적절하게 구현되지 않을 수 있으므로, 작업 환경 및 최종 산물의 품질을 고려하여 혼합비율을 적절하게 제어할 수 있다. 상기 추출물은 상기 중량 범위에서 유효성분에서 유래한 최적의 피부 개선 효과가 구현될 수 있다.

상기 에델바이스 식물세포 또는 부정근 배양 추출물은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp .) 균주를 접종하여 수득된 발효 추출물일 수 있다.

상기 “발효”는 미생물이 자신이 가지고 있는 효소를 이용해 유기물을 분해시키는 과정을 의미한다. 상기 미생물에 의해 발효과정을 거친 원료는 발효 전보다 최소 2배에서 최대 수 십배의 효과가 증대되는 것으로 알려져 있다. 발효를 거친 대사물질은 피부에 좋은 각종 아미노산, 유기산, 항산화물질을 함유하여 피부대사를 촉진시켜 피부결을 탄력있고 매끄럽게 가꿔준다. 또한, 발효과정을 거치면서 입자가 작아지고 중금속 등의 독성이 분해되어 흡수율이 좋을 뿐 아니라 피부트러블이나 알레르기 부작용을 완화해준다고 보고되고 있다.

상기 “발효 추출물”은 상기 추출물을 자연적으로, 또는 장치, 구체적으로 회전감압농축기 및 동결건조기를 사용하여 건조시킨 후, 상기 배양물 또는 추출물을 용매, 바람직하게는 정제수에 일정 농도로 희석한 후 발효용 미생물, 즉, 락토바실러스 속(Lactobacillus sp .) 균주를 접종하고 발효시켜 제조할 수 있다.

상기 락토바실러스 속 균주는 락토바실러스 펜토서스(Lactobacillus pentosus), 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum), 락토바실러스 카제이(Lactobacillus casei) 또는 락토바실러스 아시도필루스(Lactobacillus acidophilus)일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 조성물은 고구마 추출물, 아사이베리 추출물, 인디언구스베리 추출물, 및 아스파라거스 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.

상기 “고구마(Ipomoea batatas)”는 통화식물목 메꽃과의 여러해살이풀로서 과거에는 대부분 식용으로 소비하였으나, 최근에는 식용이 40% 안팎에 그쳐 예전처럼 주식을 보조하는 식품이 아니라 주로 부식 또는 간식으로 이용된다. 상기 고구마는 지방생성 및 축적 저해효과와 간섬유증 예방 및 치료효과를 나타내는 것으로 알려진 바 있다.

상기 “아사이베리(Euterpe Oleracea)”는 브라질의 열대 우림지역에서 주로 서식하는 식물의 열매로서 여러 세기동안 원주민들이 질병 해독제, 천연 최음제 및 에너지와 활력을 증가시키는 강장제로 사용되었다. 최근 아사이베리의 풍부한 항산화 효능 및 면역력 증진 특성이 주목을 받고 있다.

상기 “인디언구스베리(Phyllanthus emblica)”는 인도의 전통 의학서 아유베다에 수재되어 있는 건강과실로서 비타민 C와 폴리페놀을 다량 함유한다. 상기 인디언구스베리는 필란터스 엠블리카(Phyllanthus emblica), 아마륵, 암라(amla), 아말리카(amalika)라고도 불리며 오렌지에 비하여 비타민 C를 20배 이상 더 함유하는 것으로 알려져 있다. 상기 인디언구스베리는 노화방지, 보습성분 보호, 콜라겐 보호, 염증 및 알러지 증상 완화뿐만 아니라, 열에 강해 화학성분의 분해를 막아주어, 비타민 C 의 단점을 상쇄할 수 있다.

상기 “아스파라거스(Asparagus officinalis)”는 백합목의 외떡잎식물로서 멸대 혹은 열대라고도 알려져 있다. 상기 아스파라거스는 아스파라긴(asparagin)과 아스파라긴산(asparaginic acid)이라는 알칼로이드계 성분을 다량 포함할 뿐만 아니라, 이외에 칼슘, 인, 칼륨 등의 미네랄과 비타민 A·B1·B2·C 등을 함유한다. 상기 아스파라거스의 주성분인 아스파라긴은 콩팥의 기능을 돕고 요산 배설을 촉진시키며 신장이나 전 근육계의 옥살산 결정을 파괴시켜 요산축적에 의한 신경통이나 류머티즘에 효과적이라고 알려져 있다.

상기 조성물은 피부 미백, 피부 보습, 항산화, 항염, 피부 탄력 개선, 또는 피부 주름 개선용일 수 있다.

상기 "피부 미백"은 피부색에 영향을 미치는 멜라닌, 산화-환원 헤모글로빈, 카로틴, 멜라노이드 등 다양한 생체 분자의 생성을 억제함으로써 잡티, 주근깨, 기미 등의 피부 색소 침착 현상을 완화시키고, 피부 누런기, 붉은기를 완화시켜 피부 밝기 및 균일도를 향상시키는 효과를 의미한다.

상기 "피부 보습"은 피부의 수분 손실(수분 증발) 등을 적절히 조절하여 피부조직의 항상성을 유지하는 모든 행위를 의미한다. 상기 피부 보습 효과는 각질 개선효과, 피부자극 감소효과 등 다양한 측면의 추가적인 피부 개선 효과를 수반할 수 있다.

상기 “항염”은 염증을 억제하는 작용을 의미하며, 염증반응의 조절은 매우 복잡한 것으로 알려져 있는데, 이는 생체 내 복구체계의 증강 및 손상을 감소시킨다. 그러나 반복되는 조직의 손상이나 재생에 의해 염증반응이 지속되면, 염증관련 세포에서 ROS와 RNS가 과다 생성되고 영구적인 유전자의 변형이 야기될 수 있다. 즉, ROS와 RNS는 생체 내 여러 가지 세포의 작용을 조절하는 염증 반응과 깊이 관련되어 있다.

상기 "주름 개선"은 피부에 주름이 생성되는 것을 억제 또는 저해하거나, 이미 생성된 주름을 완화되는 현상을 의미한다.

상기 "피부 탄력 개선"은 엘라스틴으로 구성된 탄력섬유가 콜라겐과 함께 존재하며, 상기 엘라스틴과 콜라겐이 충분히 존재하는 상태에서 피부 탄력이 유지 또는 향상되는 현상을 의미한다.

상기 조성물은 중금속 또는 미세먼지 제거용일 수 있다. 상기 조성물은 중금속 또는 미세먼지 제거를 위한 성분으로 양이온계면활성제 1.0 내지 3.0 중량%, 피막형성제 0.3 내지 0.7 중량%를 더 포함할 수 있다.

상기 양이온계면활성제는 CTAC(Cetrimonium Chloride), STAC(Steartrimonium Chloride), 또는 BTAC(Behentrimonium Chloride)일 수 있고, 상기 피막형성제는 폴리비닐알코올, 폴리쿼터늄, 구아하이드록시프로필트리모늄클로라이드, 또는 잔탄검일 수 있으나 미세먼지의 흡착을 방지하거나, 피부 보호 기능이 구현될 수 있으면 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 조성물은 유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상의 방법에 의해 제형화될 수 있다. 피부 외용제의 제형화에 있어서 Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있고, 화장료 조성물의 제형화에 있어서 International cosmetic ingredient dictionary, 6th ed(The cosmetic, Toiletry and Fragrance Association, Inc., Washington, 1995)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.

구체적으로, 상기 화장료 조성물은 일반적인 유화 제형 및 가용화 제형으로 제조할 수 있다. 예컨대, 유연 화장수 또는 영양 화장수 등의 화장수; 훼이셜 로션, 바디로션 등의 유액; 영양 크림, 수분 크림, 아이 크림 등의 크림; 에센스; 화장연고; 스프레이; 젤; 팩; 선 스크린; 메이크업 베이스; 액체 타입, 고체 타입 또는 스프레이 타입 등의 파운데이션; 파우더; 클렌징 크림, 클렌징 로션, 클렌징 오일 등의 메이크업 제거제; 또는 클렌징 폼, 비누, 바디워시 등의 세정제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 또한 상기 피부 외용제는, 연고, 패취, 겔, 크림 또는 분무제로 제형화될 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 화장료 조성물은 각각의 제형에 있어서 상기 필수성분 외에 제형의 종류 또는 사용 목적 등에 따라 본 발명에 따른 목적을 저해하지 않는 범위 내에서 다른 성분들이 적절히 배합될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 통상적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있으며, 예컨대 유분, 물, 계면활성제, 보습제, 저급 알코올, 증점제, 킬레이트제, 색소, 방부제, 향료 등을 적절히 배합할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 허용 가능한 담체는 제형에 따라 달리할 수 있다. 예컨대, 연고, 페이스트, 크림 또는 젤로 제형화될 때 담체 성분으로서 동물성 유, 식물성 유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크, 산화아연 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있다

상기 화장료 조성물은 파우더 또는 스프레이로 제형화될 때, 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록사이드, 칼슘 실케이트, 폴리아미드 파우더 또는 이들의 혼합물이 사용될 수 있고, 스프레이의 경우 클로로플루오로히드로카본, 프로판, 부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진제를 더 포함할 수 있다.

상기 화장료 조성물은 용액 또는 유탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 용매, 용해화제, 또는 유탁화제가 사용될 수 있고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-브틸글리콜 오일이 사용될 수 있고, 특히, 목화씨 오일, 땅콩 오일, 옥수수 배종 오일, 올리브 오일, 피마자 오일 및 참깨 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 현탁액으로 제형화될 때, 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리 옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물이 비누로 제형화될 때, 담체 성분으로서 지방산의 알칼리 금속 염, 지방산 헤미에스테르 염, 지방산 단백질 히드롤리제이트, 이세티오네이트, 라놀린 유도체, 지방족 알코올, 식물성 유, 글리세롤, 당 등이 사용될 수 있다.

상기 화장료 조성물은 최종 제품의 품질이나 기능에 따라 업계에서 통상적으로 사용되는 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉 쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 추가적으로 함유할 수 있다.

다만, 상기 보조제 및 그 혼합 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 영향을 미치지 않도록 적절히 선택할 수 있다.

이하 실시예를 통해, 본 발명을 더욱 상술하나 하기 실시예에 의해 본 발명이 제한되지 아니함은 자명하다.

제조예 1 : 에델바이스로부터의 식물세포 유도

인터넷에서 구득한 에델바이스 씨앗을 70%(v/v) 에탄올에 30초 동안 침지한 후 멸균수로 세척하고 소독액(30% 락스+Tween20)으로 20분 소독하였다. 멸균수로 3회 수세하여, 발아시킨 후, 에델바이스 식물체의 잎을 칼로 상처를 내어 1mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D, 3% Sucrose 및 agar 8g/L 가 포함된 기본 MS배지(Murashige and Skoog 1962, Duchefa 사, Cat No. M0221)에서 25℃, 습도 70% 의 생장상 조건으로 암배양하며 초기 식물세포를 유도하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다. 계대배양은 2주 간격으로 수행하였다.

제조예 2 : 에델바이스 식물체 부정근 유도

에델바이스 식물세포로부터 부정근을 유도하기 위하여 MS 기본배지에 Sucrose 30g/L, Gelite 2.0g/L 을 첨가하였고, 생장조절물질 IBA(indole-3-butyric acid) 0.5 mg/L 을 첨가하여 25±2℃ 의 배양실에서 4주간 배양하였다. 유도된 부정근의 정단부를 약 1 cm 절단하여 0.5 mg/L의 IBA(indole-3-butyric acid), Sucrose 50g/L을 첨가한 액체배지(1/2 MS 배지)에 접종하고, 25℃의 배양실에서 4주간 배양하였다. 수확한 부정근은 스테인레스 채로 걸러 배지를 분리해내고 수분을 제거한 후 60℃로 2일간 건조하여 실험에 사용하였다. 각각의 배지는 1N 수산화나트륨(NaOH)을 이용하여 pH 5.8 로 조정하였다.

제조예 3 : 에델바이스 식물세포 및 부정근의 대량생산

에델바이스 식물체로부터 무균적으로 유도되어 배양된 에델바이스 식물세포 및 에델바이스 부정근을 대량생산하기 위하여, 에델바이스 식물세포를 MS배지에 1mg/L 6-Benzylaminopurine, 0.3mg/L 2,4-D가 함유된 배지에서 배양하였다.

에델바이스 부정근은 IBA(indole-3-butyric acid) 0.5mg/L, Sucrose 50g/L가 함유된 1/2 MS 배지에서 25℃, 습도 70% 조건으로 5주간 배양하였다.

제조예 4 : 에델바이스 식물세포 배양 추출물의 제조

제조예 3에서 배양하여 수득한 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양물을 수확하여 수분을 제거한 후 60℃로 2일 동안 건조기에서 건조하였다. 건조된 에델바이스 식물세포 및 부정근 배양물 분말 100g을 1L의 정제수와 혼합한 후 90 내지 120℃ 에서 48시간동안 열수 추출하였다.

250메쉬 및 0.5㎛ 필터로 추출물을 여과한 후 30℃에서 감압 농축하고, 동결 건조하여 고형분을 수득하였다.

제조예 5 : 식물 추출물의 제조

금은화, 쑥국화, 고구마, 아사이베리, 인디언구스베리, 아스파라거스를 각각 수세한 후 상온에서 완전히 건조시키고 분쇄하여 분쇄물을 각각 100g씩 수득하였다.

각 분쇄물 100g에 대해 각각 10배 부피의 에탄올 수용액(70% 질량농도)를 용매로 하여 70℃의 온도에서 12시간 동안 침적 추출하였다.

추출물을 250메쉬 및 0.5㎛ 필터로 여과한 후 잔여 원료에 대해 동일한 방법으로 3회 반복 추출하였다. 상기 추출물을 30℃에서 감압 농축하고, 동결 건조하여 고형분을 수득하였다.

제조예 6 : 발효 추출물의 제조

제조예 4에서 수득한 추출물을 정제수를 이용하여 5중량%로 희석한 후 발효 균주인 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum)을 접종하여 12시간 동안 발효하였다.

발효 공정이 중료된 후 500메쉬 및 0.2㎛ 필터로 여과하여 발효 추출물을 수득하였다.

실시예 및 비교예

수득한 추출물 및 발효 추출물의 피부 개선 효과를 검증하고자 하기 표 1과 같이 시료를 혼합하여 실시예 및 비교예를 설정하였다.

하기 표 1과 같이 각 원료를 소정의 비율로 혼합하여 피부 개선 효과를 측정하였으며, 실시예 4 및 8은 제조예 6의 발효 추출물을 혼합하였다.

[함량(중량부)]

구분	실시예								비교예
	1	2	3	4	5	6	7	8	1	2	3	4
에델바이스 식물세포 추출물	40	40	40	-	30	20	20	-	80	-	-	-
에델바이스 식물세포 발효 추출물	-	-	-	40	-	-	-	20	-	80	-	-
금은화 추출물	40	-	20	20	20	20	20	20	-	-	40	-
쑥국화 추출물	-	40	20	20	20	20	20	20	-	-	40	-
고구마 추출물	-	-	-	-	10	10	5	5	-	-	-	20
아사이베리 추출물	-	-	-	-	-	10	5	5	-	-	-	20
인디언 구스베리 추출물	-	-	-	-	-	-	5	5	-	-	-	20
아스파라거스 추출물	-	-	-	-	-	-	5	5	-	-	-	20

실험예 1 : 피부 안전성 시험

실시예 및 비교예의 시료에 대한 피부 안전성을 검증하기 위해, 섬유아세포(HDF), 멜라닌형성세포(B16F10), 각질세포(HaCaT)에 대한 MTT assay 실험을 수행하였다.

실시예 및 비교예의 시료를 정제수에 농도별(50 mg/L)로 각각 현탁한 후, 세포 생존율을 측정하였다.

세포 독성은 MTT{3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2-5-diphenyltetrazolium bromide} 시약을 이용하여 세포 생존율을 측정하는 모스만(Mosmann)의 방법을 변형하여 수행하였다.

섬유아세포(HDF), 멜라닌형성세포(B16F10), 및 각질세포(HaCaT)를 각각 96-웰 플레이트에 1×10⁴ cells/well의 농도로 분주하여 37℃, 5 % CO₂ 에서 48 시간 동안 배양하였다.

배양 배지를 제거하고 시료를 농도별로 처리한 배지에 48 시간 동안 배양한 후 배지를 제거하고 PBS(Phosphate buffered saline)로 반복 세척하였다.

MTT를 5 mg/mL로 PBS에 녹여 50 L 첨가하고 37℃, 5 %의 CO₂ 에서 24 시간 동안 배양하였다. DMSO(Dimethyl sulfoxide)를 한 웰(well) 당 100L 넣고, 10 분 동안 교반한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 각 시료의 모든 농도에서 세포 독성은 확인되지 않았다. 상기 결과는 상기 시료가 인체에 무해할 뿐만 아니라 인체 안전성이 우수함을 시사한다.

실험예 2 : 멜라닌 생성량 평가

멜라민 함량 분석(melanin contents assay)를 통해 실시예 및 비교예의 시료에 의한 멜라닌형성(melanogenesis) 저해능을 평가하였다(Eisinger M et al, 1982; Siegrist W and Eberle AN, 1986). 실시예 및 비교예의 시료를 정제수에 50 mg/L 농도로 각각 현탁한 후 멜라닌 생성량을 평가하였다.

60 mm culture dish에 B16F10 세포를 1.5x10⁵ cells/well의 농도로 접종한 후 24시간 동안 배양하였다. 멜라닌 형성을 촉진하는 호르몬인 α-MSH(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)와 실시예 및 비교예의 시료를 50 mg/L 농도로 배지에 투입하였다(Virador VM et al, 1999).

48시간 경과 후, 세포를 수확하여 PBS로 1회 세척한 후, 1N NaOH lysis buffer 120 μL를 넣고 95℃에서 10분간 가열하여 세포를 용해하였다. microplate reader를 이용하여 450 nm 파장에서 흡광도를 측정하였으며, 대조군으로 100μg/mL 농도의 알부틴(arbutin)을 사용하였다.

하기 수학식에 따라 멜라닌 생성 억제율을 산출하였으며, 평과 결과는 하기 표 2와 같다.

[수학식]

멜라닌 생성 억제율(%) = 100 x (1 - (각 시험물질의 흡광도 / 대조군의 흡광도))

구분	멜라닌 생성 억제율(%)
실시예 1	25.6
실시예 2	26.1
실시예 3	28.5
실시예 4	30.0
실시예 5	31.4
실시예 6	33.1
실시예 7	35.7
실시예 8	41.4
비교예 1	15.9
비교예 2	16.8
비교예 3	13.6
비교예 4	15.0
양성대조군	31.1

실시예 1 내지 8의 시료는 멜라닌의 생성을 효과적으로 억제하였으며, 미백 효과가 널리 알려진 알부틴과 비교하여 멜라닌 생성을 동등하거나 더욱 높은 수준으로 저해하였다.

특히, 고구마 추출물, 아사이베리 추출물, 인디언구스베리 추출물, 및 아스파라거스 추출물 중 하나 이상의 추출물이 함께 작용하였을 때 멜라닌 생성 억제 효과는 더욱 개선되었으며(실시예 5 내지 7), 추출물의 발효에 의해 미백 효과는 현저히 증가하였다(실시예 4 및 8).

실험예 3 : 티로시나아제 저해 활성 시험

시험관 내에서 티로시나아제 효소 억제 활성을 측정하여 실시예 및 비교예의 미백 효과를 비교하였다.

실시예 및 비교예의 시료를 정제수에 50 mg/L 농도로 각각 현탁한 후, 0.1M 인산염완충액(pH 6.5) 220 μL, 시료액 20 μL, 티로시나아제(1500 U/ml 내지 2000 U/ml) 20 μL 를 순차적으로 투입하였다. 1.5 mM 티로시나아제 용액 40 μL 를 넣고 37℃에서 약 15분 동안 반응시켰다.

ELISA reader를 이용하여 490 nm에서 흡광도를 측정하였으며, 공시료액으로 시료액 대신 0.1M 인산염완충액(pH 6.5)을 사용하였다.

대조군으로 50μM 농도의 코직산(Kojic acid)을 사용하였으며, 하기 수학식에 따라 티로시나아제 저해 활성을 산출하였다. 평과 결과는 하기 표 3과 같다.

[수학식]

티로시나아제 저해 활성(%) = 100 x (1 - (각 시험물질의 흡광도 / 음성대조군의 흡광도))

구분	티로시나아제 저해 활성(%)
실시예 1	24.3
실시예 2	25.4
실시예 3	29.8
실시예 4	31.2
실시예 5	34.6
실시예 6	36.8
실시예 7	38.0
실시예 8	41.3
비교예 1	12.0
비교예 2	14.4
비교예 3	13.5
비교예 4	11.3
양성대조군	28.5

실시예 1 내지 8의 시료는 티로시나아제의 활성을 효과적으로 억제하였으며, 양성 대조군(코직산)과 비교하여 티로시나아제 저해 활성이 더욱 높거나 동등한 수준으로 평가되었다.

특히, 고구마 추출물, 아사이베리 추출물, 인디언구스베리 추출물, 및 아스파라거스 추출물 중 하나 이상의 추출물이 함께 작용하였을 때 티로시나아제 효소 억제 활성이 더욱 개선되었으며(실시예 5 내지 7), 상기 추출물은 발효에 의해 티로시나아제 억제 활성이 증진되었다(실시예 4 및 8).

실험예 4 : 콜라겐 생합성 유도 시험

섬유아세포의 생장에 따라 콜라겐의 합성이 촉진되는지 확인하였다.

1.0×10⁴세포/mL농도로 인간진피섬유아세포를 96 웰 플레이트에 100μL씩 분주하고, 37℃, 5% C0₂, 가습 조건하에서 3일간 배양하였다.

Medium 106S(쿠라시키보세키 가부시키가이샤 제조)에 LSGS(Low Serum Growth Supplement, 쿠라시키보세키 가부시키가이샤 제조)를 10 중량%로 함유한 배지를 웰 당 100μL씩 사용하였다.

상기 배지를 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, Sigma社 제조)으로 교환하고, 상기 실시예 및 비교예의 시료를 50 mg/L 농도로 처리한 후 배양하였다. 상기 시료를 처리하지 않고 정제수를 첨가한 것을 대조군으로 사용하였고, 아스코르빈산(50 μg/mL)을 양성 대조군으로 사용하였다.

상기 세포를 7일간 배양한 후 배양액을 채취하고, 효소 결합 면역 측정법(Procollagen type I c-peptide EIA Kit; 타카라바이오 가부시키가이샤 제조)을 통해 배양액 중 분비된 타입 I 콜라겐 농도를 정량하였다.

대조군의 타입 I 콜라겐 양을 기준(100%)으로 하여 각 시험 샘플 배양액 중의 콜라겐 양을 산출하였으며, 측정 결과는 하기 표 4와 같다.

[% of control]

구분	콜라겐 생산량(%)
실시예 1	121.0
실시예 2	119.8
실시예 3	112.2
실시예 4	123.6
실시예 5	124.9
실시예 6	126.6
실시예 7	129.4
실시예 8	145.3
비교예 1	111.1
비교예 2	106.9
비교예 3	106.4
비교예 4	107.9
양성대조군	127.3

실험예 5 : 피부 보습 효과 시험

실시예 및 비교예의 시료를 정제수에 현탁하여 50 mg/L 농도로 희석하고 피부 보습 효과를 평가하였다.

인간각질형성세포주(Keratinocytes)에서 피부보습에 관여하는 HAS2 유전자 및 AQP3 유전자의 발현정도를 mRNA 수준에서 측정하였다.

인간 각질세포(HaCaT)를 Dulbecco's Modified Eagle's Medium(DMEM), 10% Fatal bovine serum(FBS), 1% Antibiotic-Antimycotic과 함께 100 mm/60.1 cm culture dish에서 37℃, 5% CO₂의 조건으로 배양하였다.

각질세포를 1.0x10⁶세포/mL농도로 96 웰 플레이트에 분주하여, 24시간 동안 배양하였다. DMEM free 배지로 교환 후 소정의 농도로 희석한 실시예 및 비교예의 시료를 처리하고 24시간 동안 배양하였다.

세포를 회수하여 냉각된 인산완충용약(PBS)로 세척하고 트리졸 시약[TRIzol™reagent, 라이프 테크놀로지스, 인크(Life Technologies, Inc.)] 1mL를 첨가하고 총 RNA를 추출하였다.

유전자 발현 변화는 중합효소 연쇄 반응(PCR)에서 증폭되는 DNA 산물에 형광물질을 결합하고 형광물질을 지속적으로 검출하는 qRT-PCR(quantitative real time PCR)로 측정하였다.

HAS2 및 AQP3 유전자 발현의 변화를 정량하고자 SYBR green Ⅰ(Invitrogen)을 통해 PCR 산물이 발산하는 형광값을 측정하였다. PCR tube에 0.2μM 프라이머, 50 mM KCl, 20 mM Tris/HCl pH 8.4, 0.8 mM dNTP, 0.5U Extaq DNA polymerase, 3 mM MgCl₂, 1×SYBR green을 혼합하여 반응액을 제조하였다.

Linegene K(BioER, China)를 이용하여 94℃에서 3분 동안 예비적 변성(primary denaturation) 시킨 후 변성(denaturation), 어닐링(annealing), 중합(polymerization)을 94℃에서 30초, 58℃에서 30초, 72℃에서 30초로 총 40 cycle을 수행하였고, 매 cycle 이 종료된 후 형광강도를 측정하였다.

PCR 결과는 각 결과별 melting curve로 검증하였다. 각 유전자의 threshold cycle(Ct)값을 β-actin의 Ct값으로 표준화한 후, Ct값의 변화량을 비교하여 분석하였다.

Ct값은 PCR 산물에 의해 발생하는 형광의 양(증폭된 PCR 산물의 수)이 기본 값 이상의 일정한 기준 값에 도달했을 때의 cycle 수로서 Ct값을 통하여 유전자 발현량을 확인할 수 있다. 실험에 사용한 프라이머 서열은 하기 표 5와 같다.

Gene	정방향 프라이머	역방향 프라이머
HAS-2	5'-TTTCTTTATGTGACTCATCTGTCTCACCGG-3'	5'-ATTGTTGGCTACCAGTTTATCCAAAGGG-3'
AQP3	5′- ACCCTCATCCTGGTGATGTTTG-3′	5′- TCTGCTCCTTGTGCTTCACAT-3′

HAS2 및 AQP3 mRNA 발현량 측정 결과는 하기 표 6과 같으며, mRNA 발현량은 상기 추출물의 처리에 따라 농도 의존적으로 증가하였다. HAS2 및 AQP3 발현 촉진능이 높을수록 피부 보습 효과가 우수한 것으로 평가할 수 있다.

[% of control]

구분	HAS2 발현량	AQP3 발현량
실시예 1	120.8	116.2
실시예 2	119.5	116.7
실시예 3	123.8	119.4
실시예 4	127.0	123.0
실시예 5	129.8	124.6
실시예 6	131.2	127.4
실시예 7	134.7	131.7
실시예 8	138.2	137.0
비교예 1	105.6	103.2
비교예 2	109.7	106.2
비교예 3	109.1	105.0
비교예 4	109.8	106.6

상기 결과는 천연 복합 추출물의 유효성분이 상호 작용하여 아쿠아포린 단백질의 발현 및 히알루론산의 합성을 효과적으로 촉진시킬 수 있으며 이를 통해 피부 보습 효과가 개선될 수 있음을 시사한다.

특히, 고구마 추출물, 아사이베리 추출물, 인디언구스베리 추출물, 및 아스파라거스 추출물 중 하나 이상의 추출물이 함께 작용하였을 때 아쿠아포린 단백질의 발현 및 히알루론산의 합성 촉진 효과는 현저히 개선되었으며(실시예 5 내지 7), 추출물의 발효에 의해 피부 보습 효과는 더욱 개선되었다(실시예 4 및 8).

실험예 6 : 피부 주름 개선 효과 시험

피부 주름 개선 효과를 평가하기 위하여 하기와 같이 실험을 하였다.

30세 이상의 성인 여성 120명을 대상으로 10명씩 12개의 그룹으로 나누고, 피시험자는 4주 동안 매일 아침, 저녁 세안 후 크림 타입으로 제형화한 화장료를 안면에 고르게 도포하여 충분히 흡수시켰다.

주름개선 평가를 위하여 ANTERA 3D(Miravex, Ireland)를 적용하였으며, 기기측정은 시험물질 사용 전과 2주 사용 후, 4주 사용 후의 시점에서 이루어졌다.

동일한 시험담당자가 모든 피시험자의 왼쪽 눈꼬리부위를 측정하였고, 측정의 재현성을 위하여 시험 물질 사용 전에 측정한 이미지와 오버랩시켜 동일부위를 측정하였다. 촬영된 이미지는 ANTERA 3D 전용 소프트웨어인 ANTERA pro software를 이용하여 매칭시킨 후 일치된 측정부위를 분석에 사용하였다.

측정값은 측정변수인 Indentation index를 이용하여 피부의 주름을 나타내는 Wrinkles small값을 분석하였다. 하기 표 7에서 실시예 및 비교예의 시료를 제형화한 화장료 사용에 따른 피시험자의 4주 후의 Wrinkles small값의 변화량을 나타내었다. 즉, 주름 개선 효과가 우수할수록 Wrinkles small 값의 변화량은 크게 나타난다.

구분	Wrinkles small 평균값
실시예 1	1.31
실시예 2	1.31
실시예 3	1.37
실시예 4	1.39
실시예 5	1.41
실시예 6	1.45
실시예 7	1.46
실시예 8	1.52
비교예 1	0.73
비교예 2	0.83
비교예 3	0.69
비교예 4	0.77

표 7을 참조하면, 실시예 1 내지 8의 시료를 제형화한 화장료 조성물의 피부 주름 개선 효과가 우수한 것으로 확인되었다.

특히, 고구마 추출물, 아사이베리 추출물, 인디언구스베리 추출물, 및 아스파라거스 추출물 중 하나 이상의 추출물이 함께 작용하였을 때 피부 주름 개선 효과가 현저히 개선되었으며(실시예 5 내지 7), 추출물의 발효에 의해 피부 주름 개선 효과는 현저히 증대되었다(실시예 4 및 8).

실험예 7 : 항산화 활성 시험

자유라디칼인 DPPH(1, 1-diphenyl-2-picryl hydrazyl)를 이용한 자유라디칼 소거활성 측정방법을 이용하여 활성산소 분해 효과를 확인하였다.

시험관에 4mL 메탄올을 넣고 상기 40 μg/mL 농도의 추출물을 첨가하였다. 0.15mM DPPH 용액 1mL를 첨가하여 실온에서 30분간 반응시킨 후 520 nm에서 흡광도를 측정하였다.

기질과 DPPH가 없는 Initial(Ai)과 blank(Ab)를 측정하였으며, 양성대조군으로 α-tocopherol 및 BHT를 사용하였다. 결과는 하기 표 8에 나타내었다.

구분	DPPH 소거율%
α-tocopherol	77.5
BHT	72.5
실시예 1	61.5
실시예 2	62.2
실시예 3	65.7
실시예 4	69.1
실시예 5	70.6
실시예 6	71.9
실시예 7	74.2
실시예 8	78.5
비교예 1	43.8
비교예 2	48.7
비교예 3	38.0
비교예 4	42.4

상기 추출물은 당업계에 널리 알려진 α-tocopherol 및 BHT와 동등하거나 높은 수준의 자유라디칼 소거활성을 가진것으로 평가되었다.

즉, 실시예 1 내지 8의 시료에 의해 활성산소의 분해가 촉진될 수 있으며, 상기 결과는 항산화 활성에 의한 피부 노화 방지 및 피부 상태 개선 효과가 우수함을 시사한다.

실험예 8 : 항염 활성 시험

NF-kB reporter assay를 통해 NF-kB 전사 억제 효과를 측정하였다. LPS에 의해 유도되는 iNOS, COX-2, IFN-β 또는 TNF-α 등은 전사인자인 NF-kB 에 의해 발현된다. 상기 NF-kB는 세포질에서는 IkB와 복합체 상태로 불활성화되어 있다가 I-kB-αkinase에 의해 I-kB-α가 인산화되면 결합되어 있던 복합체가 분해되어 NF-kB로 활성화되어 핵 내로 이동(translocation)한다. NF-kB의 표적유전자의 발현을 유도하여 염증작용을 일으킨다.

다발성 경화증(multiple sclerosis)과 같은 염증질환에 작용하는 TRIF는 인터페론-β를 유발하는 수용체를 가지는 TIP-도메인으로 TLRs(toll-like-receptors)의 활성에 반응하는 수용체로서, 상기 TLRs는 침입 미생물의 특정 구성을 인식하여 항원에 대한 면역반응을 활성화한다.

상기 수용체는 잘 보존된 병원성 패턴을 인식해서 염증성 사이토카인의 방출을 자극하기 위해 신호를 활성화한다. IRF-3(인터페론자극유전인자3)은 인터페론α/β자극에 의해 유도되는 전사 활성화 인자로 대부분 인터페론 유도 유전자의 전사조절영역에 있는 인터페론자극반응순서(ISRE)에 결합하여 그 전사를 활성화한다.

제조자의 프로토콜(Jin et al., 2009)에 따라 12-웰 플레이트에 PEI 방법을 이용하여 β-갈락토시다제(β-galactosidase)와 같은 수용체 분자(MyD88 및 TRIF)의 존부에 따라 NF-kB-Luc 또는 TRIF 각각을 포함하는 플라스미드 1μg을 HEK293(1×10⁶ cells/ml)세포에 주입(transfection)하였다. 24시간 동안 배양한 후 LPS(100 ng/ml) 및 20 μg/Ml 농도의 추출물을 처리하고, 24시간 후에 루시퍼라제 분석법(Luciferase assays)을 이용하여 NF-kB 의 활성 및 IRF-3 활성을 측정하였다.

상기 루시퍼라제 분석법은 제조자의 프로토콜(Jung et al., 2009)에 보고된 루시퍼라제 분석 시스템(Promega Co., USA)을 이용하여 수행하였으며, 분석 결과는 하기 표 9와 같다.

구분	NF-kB 활성	IRF-3 활성
대조군(블랭크군)	1.00	1.00
실시예 1	1.50	1.42
실시예 2	1.51	1.45
실시예 3	1.56	1.50
실시예 4	1.59	1.53
실시예 5	1.62	1.57
실시예 6	1.64	1.59
실시예 7	1.67	1.62
실시예 8	1.71	1.66
비교예 1	1.29	1.21
비교예 2	1.33	1.25
비교예 3	1.24	1.16
비교예 4	1.23	1.18

[Fold, Luciferase activity]

표 9을 참조하면, 실시예의 시료에 의해 NF-kB의 활성 및 IRF-3의 활성이 현저히 감소하였다. 상기 결과는 상기 추출물이 NF-kB의 전사를 효과적으로 억제하므로 이를 통해 염증을 저해 또는 완화시킬 수 있으며 염증 질환의 예방 및 개선 효과가 있음을 시사한다.

실험예 9 : 다환방향족탄화수소 제거 효과 시험

미세먼지 중 다량 함유된 유해대기물질인 다환방향족탄화수소(polycyclic aromatic hydrocarbons: PAH)의 흡착 효과를 시험하였다. 털을 제거한 돼지 외피(1cm x 1cm) 시편을 준비한 후, PBS로 10분간 세척하였다.

세척 후 나프탈렌(Naphtalene), 아세나프틸렌(Acenaphthylene), 아세나프텐(Acenaphthene), 플루오렌(Fluorene), 벤조피렌(Benzopyrene)을 600ppm 함유하는 용액(pH 11)에 2시간 동안 담지한 후 상온에서 건조하였다.

실시예 및 비교예의 추출물을 50 mg/L 농도로 시편에 처리하고 3시간 동안 반응시켰으며, 대조군은 PBS를 도포하고 3시간 동안 반응시켰다.

PBS로 세척한 후 시편을 일정 중량으로 절단하고 호모게나이저로 분쇄하였다. 분쇄된 조직을 anhydrous sodium sulfate(Na₂SO₄)으로 건조시킨 후 속실렛 추출(Sohxlet extraction) 및 액액 추출(Liquid-liquid extraction) 방법을 통해 조직 내 다환방향족탄화수소를 추출하였고(Husain et al., 1997; Takatsuki et al., 1985), HPLC로 정량하였다. 평가 결과는 실험군 대비 대조군의 비율로 나타내었으며, 정량 결과는 하기 표 10과 같다.

[% of control]

구분	나프탈렌	아세나프틸렌	플루오렌	벤조피렌
실시예 1	7.1	5.5	6.2	6.6
실시예 2	7.3	5.7	5.9	6.8
실시예 3	7.8	6.3	7.0	7.4
실시예 4	8.2	6.7	7.4	7.9
실시예 5	8.6	7.0	7.8	8.3
실시예 6	8.8	7.2	8.0	8.5
실시예 7	9.0	7.4	8.2	8.7
실시예 8	9.2	7.6	8.4	8.9
비교예 1	3.1	3.0	3.7	4.1
비교예 2	3.4	3.6	3.4	4.4
비교예 3	4.1	2.7	3.1	3.2
비교예 4	3.5	2.5	2.5	2.5

표 10을 참조하면, 상기 다환방향족탄화수소는 실시예 1 내지 8의 추출물의 처리에 의해 현저히 감소되었으며, 상기 결과는 상기 추출물이 미세먼지 및 대기 중 다량 함유되어 피부에 트러블을 야기할 수 있는 유해물질을 효과적으로 제거할 수 있음을 시사한다.

실험예 10 : 미세먼지 제거 효과 시험

실시예 1 내지 8을 제형화한 화장료의 미세먼지 제거 효과를 시험하였다. PM2.5 내지 PM10 크기에 해당하는 미세먼지를 인공 피부에 도포한 후, 실시예 1 내지 8을 제형화한 클렌징 크림을 이용하여 세척하였다.

상기 클렌징 크림 세척 전후의 미세먼지 비율을 계산하였으며 대조군으로 실시예 1 내지 8의 추출물을 포함하지 않는 클렌징 크림을 사용하였다. 평가 결과는 하기 표 11와 같다.

구분	미세먼지 제거율(%)
실시예 1	87%
실시예 2	85%
실시예 3	91%
실시예 4	92%
실시예 5	94%
실시예 6	95%
실시예 7	96%
실시예 8	95%
비교예 1	74%
비교예 2	73%
비교예 3	71%
비교예 4	72%
대조군	70%

표 11을 참조하면, 미세먼지는 실시예 1 내지 8의 추출물을 제형화한 클렌징 크림에 의해 효과적으로 제거된 반면, 상기 추출물을 함유하지 않는 대조군의 미세먼지 제거 효과는 상대적으로 미흡하였다.

특히, 고구마 추출물, 아사이베리 추출물, 인디언구스베리 추출물, 및 아스파라거스 추출물 중 하나 이상의 추출물이 함께 작용하였을 때 미세먼지 제거 효과는 현저히 개선되었다(실시예 5 내지 7).

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 예를 들어, 단일형으로 설명되어 있는 각 구성 요소는 분산되어 실시될 수도 있으며, 마찬가지로 분산된 것으로 설명되어 있는 구성 요소들도 결합된 형태로 실시될 수 있다.

본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

1. 에델바이스(Leontopodium alpinum) 식물세포 또는 부정근 배양 추출물; 및
   금은화(Lonicera Japonica Flower) 추출물, 또는 쑥국화(Tanacetum Vulgare) 추출물;을 유효성분으로 포함하는 미세먼지 제거용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서,
   상기 에델바이스 식물세포 또는 부정근 배양 추출물을 조성물 총 중량 대비 0.5 내지 5.0 중량% 포함하는 미세먼지 제거용 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서,
   상기 금은화 추출물 10 내지 30 중량부, 또는 상기 쑥국화 추출물 10 내지 30 중량부를 포함하는 미세먼지 제거용 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서,
   상기 에델바이스 식물세포 또는 부정근 배양 추출물은 락토바실러스 속(Lactobacillus sp.) 균주를 접종하여 수득된 발효 추출물인 미세먼지 제거용 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서,
   상기 추출물은 물, 탄소수 1 내지 4개의 무수 또는 함수 저급 알코올, 아세톤, 석유에테르, 에틸아세테이트, 부틸아세테이트, 트리클로로메탄, 디클로로메탄, 클로로포름, 헥산 및 1,3-부틸렌글리콜로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 용매로 추출된 미세먼지 제거용 화장료 조성물.
6. 제1항에 있어서,
   고구마 추출물, 아사이베리 추출물, 인디언구스베리 추출물, 및 아스파라거스 추출물로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 미세먼지 제거용 화장료 조성물.
7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   피부 미백, 피부 보습, 항산화, 항염, 또는 피부 주름 개선 용도를 더 포함하는 미세먼지 제거용 화장료 조성물.
8. 삭제
9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
   유연화장수, 영양화장수, 수분크림, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 앰플, 젤, 아이크림, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 스프레이 및 파우더로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상으로 제형화된 미세먼지 제거용 화장료 조성물.