KR102685165B1

KR102685165B1 - 병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황의 복합 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 진정, 보습 및 주름개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102685165B1
Application number: KR1020230152010A
Authority: KR
Inventors: 이상일; 사영승; 이수연; 이동규; 전소희; 한상희
Original assignee: (주) 옵트바이오
Priority date: 2023-11-06
Filing date: 2023-11-06
Publication date: 2024-07-15

Abstract

본 발명은 병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황의 복합 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 추출물은 총 플라보노이드 함량이 높으면서도 피부에 안전하고, 라디컬 소거능이 우수하면서, 면역/염증관련 인자인 IL-1α, 보습관련 인자인 HAS2 및 AQP3, 주름개선 인자인 COL1A1, COL3A1, 엘라스틴 등의 발현을 증진시켜, 피부 진정, 보습 및 주름개선용 화장료 조성물로서 용이하게 이용될 수 있다.

Description

병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황의 복합 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 진정, 보습 및 주름개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition for skin calming, moisturizing and anti-wrinkle containing mixed natural extracts of Centella asiatica, Houttuynia cordata, Hamamelis virginiana, Scutellaria baicalensis and methyl sulfonyl methane as active ingredients}

본 발명은 병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황의 복합 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 진정, 보습 및 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 외부환경으로부터 인체를 보호하는 기능을 하는 기관으로서, 체내의 수분이나 영양소 등의 소실을 막으며 외부 유해물질의 체내 침입을 방지하는 역할을 한다. 인간의 피부는 크게 표피(epidermis) 및 진피(dermis), 피하지방층 (subcutaneous fat)으로 구분된다.

일반적으로 피부 진피의 대부분(피부 전체 건조 중량의 약 70 내지 80%)을 차지하는 콜라겐과 신축성이 큰 엘라스틴 단백질은 섬유아세포에서 생성되는 주요 단백질로서, 피부 진피층에서 피부의 기계적 견고성, 조직의 결합력 및 탄력성 등에 깊이 관여하는 것으로 알려져 있다. 이에 깨끗하며 밝고 탄력 있는 피부는 건강과 젊음을 상징하는 것이 되었다. 남녀노소 불문하고 깨끗한 피부를 갖기 위하여 다양한 화장품을 사용하거나 피부 시술을 받는 등 사람들의 관심이 점차 증가하고 있으며, 피부진정, 보습은 사람의 피부노화를 방지하기 위하여 필수적으로 요구되는 요소이다.

피부의 표피층은 죽은각질세포(Coneocyte)와 멜라닌 세포로 구성되며, 인체가 외부와 직접 접촉하는 각질 세포층은 물리, 화학적, 물질의 투과와 수분 손실에 대한 강한 저항이 필요하다. 각질층 또는 피부 장벽(Stratum corneum, Skin barrier)은 각질세포와 세포간 지질(Intercellular lipid)로 구성되어 있고, 외부로부터 피부를 보호하고 수분이 증발하는 것을 막는 피부 보호막으로서 피부건강에 핵심적인 기능을 담당한다. 특히, 피부의 수분 불투과성은 죽은각질세포(corneocyte)와 세포간 지질에 의해 획득되는데, 죽은 각질세포의 표면을 구성하는 각질세포 외피(Corneocyte envelope)는 세포간 지질의 안정성에 중요한 역할을 한다. 각질세포 외피는 인볼루크린(involucrin), 로리크린(loricrin), 필라그린(filaggrin) 등의 단백질 막으로 구성된다. 또한, 피부는 filaggrin에서 유래한 천연함습인자 외에도 히알루론산, 아쿠아포린 등의 다양한 함습인자에 의해 보습장벽 기능을 수행한다.

히알루론산(hyaluronic acid, HA)은 글루코사민글라이칸(glycosaminoglycan)의 하나이다. 히알루론산은 N-아세틸 글루코사민(N-acetyl glucosamine)과 글루쿠론산(Glucuronic acid)으로 이루어지는데, 세포외 기질에 존재하며 조직의 수분유지, 세포성장인자 및 영양성분의 저장 및 확산에 관여하며, 각질형성세포와 섬유아세포에 의해 합성되는 것으로 알려져 있다. 피부 내 히알루론산의 감소는 피부탄력감소 및 주름증가의 원인으로 알려져 있다. 히알루론산은 히알루론산 합성효소(hyaluronic acid synthase, HAS)를 통해 합성되며 합성 과정 중에는 세포외 기질에 축적된다. 히알루론산 합성효소는 히알루론산 합성효소1(HAS1), 히알루론산 합성효소2(HAS2) 및 히알루론산 합성효소3(HAS3)이 알려져 있으며, 이들 중 HAS2와 HAS3는 섬유아세포와 각질형성세포에서 히알루론산 합성에 중요한 역할을 한다고 알려져 있다.

자외선은 아쿠아포린의 발현을 감소시켜 피부 건조를 유발한다고 알려져 있다. 아쿠아포린은 물, 글리세롤과 작은 용해물질들이 세포막을 통해 이동할 수 있도록 해 주는 선택적 포어(selective pore)다. 아쿠아포린은 크게 13가지 정도의 서브 타입(subtypes)이 있으며, 이들 중 피부와 가장 관련된 타입은 아쿠아포린3(aquaporin 3, AQP3)이다. AQP3는 마우스와 인간의 각질세포에서 발현되며, 기저 층에서 과립층(granular layer)까지만 발현되고 각질층에서는 사라진다. AQP3가 없는 피부는 피부 탄력성이 떨어지고, 피부 장벽기능의 회복이 저하되는 문제가 있다. AQP3는 피부에 가장 많이 존재하고 있으며, 보습, 상처 회복, 피부 표피 항상성 유지에 작용을 하는 것으로 알려져 있다. 자외선은 AQP3의 발현을 감소시켜 피부 건조를 유발한다고 알려져 있다. AQP3는 작은 소수성 세포막 내재 단백질(Small hydrophobic integral membrane proteins)로 수분을 특이적으로 수송하는 역할을 담당한다. 인간 각질형성세포는 세포막에 AQP3를 발현하고 있고, AQP3 부족시 피부보습, 피부 보호막손상, 상처치유능 저하 등의 피부문제를 나타내고 있다는 보고가 있다.

또한, 피부는 여러 가지 유해 물질 등에 의하여 자극을 받게 된다. 장기간 자외선에 노출되거나 화장품 제품 형성 제조에 사용되는 일부 원료 등에 의해서도 피부는 손상을 받게 되며 일반적으로 피부에 염증, 뾰루지, 부종 등을 유발하는 주원인으로 알려져 있다. 피부 손상 및 노화의 주요 원인의 일종으로 염증반응이 알려져 있으며, 염증반응은 우리 몸에서의 항상성 유지를 위한 자극에 대한 생체의 방어 반응으로 LPS (lipopolysaccharide)와 같은 외부 자극원과 아라키돈산(arachidonic acid)과 같은 내부 자극원들을 매개로 한다. LPS는 그람 음성 박테리아의 세포 표면을 구성하는 물질로서 병원성 세균과 진핵생물간의 상호작용에 다양한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. LPS의 또 다른 역할은 숙주로부터 방출되는 독소 물질로부터 세균 자신을 보호하는 역할을 하며, 세포 방어 시스템을 활성화시킴으로 면역 조절 물질, 염증 유발 물질을 자극하게 된다. 따라서 LPS를 처리한 대식세포는 활성화되어 염증 반응 매개 인자(inflammation mediator)인 산화질소(nitric oxide, NO), 프로스타글라딘E2 (Eprostaglandin E2, PGE2)를 방출시키게 되며, 과량의 NO 및 PGE2 등의 염증 인자는 NOS (inducible nitric oxide synthase; iNOS) 및 사이클로옥시지네이스-2(cyclooxygenase-2; COX-2)를 통해 형성된다. 상기 NOS는 특성에 따라 type I, Ⅱ, Ⅲ의 3종류가 존재하며, type I (neuronal NOS; nNOS)과 type Ⅲ (edothelial NOS; eNOS)와 같이 정상적인 상태의 세포에 계속적으로 존재하는 constitutive NOS (cNOS)와 type Ⅱ NOS와 같이 LPS 및 내독소(endotoxin)와 같은 자극제들에 노출된 경우에만 발현되는 inducible NOS (iNOS)로 구분된다. 일반적인 NO는 생리적인 현 상인 혈압 조절과 신경 전달 매개체로 작용하며, 면역 반응에 중추적인 역할을 하고 있다. 하지만 iNOS에 의해 과발현된 NO는 염증 반응을 일으키고 면역 체계의 이상을 나타낸다. COX(cyclooxygenase)는 아라키돈산을 프로스타글란딘(prostaglandins; PGs)으로 전환시키는 효소로 COX-1과 COX-2가 존재한다. COX-1은 cNOS처럼 세포내 계속적으로 존재하여 여러 생리적인 기능을 담당하나, COX-2는 염증 반응이 유도되었을 시 생성되어 PGE2를 방출시키게 된다. 또한 염증 반응과 그에 따른 신호 전달에 중요한 역할을 하는 nuclear factor-κB (NF-κB)가 존재하며, 이는 inhibitory κB-α (IκB-α)와 복합체를 형성하여 염증 반응이 진행될 경우 IκB-α가 분해되고 NF-κB는 핵내로 유입되어 iNOS, COX-2 등의 염증 반응에 관련된 단백질의 발현을 증가시킨다. 항염 효능은 피부 진정과 여드름, 아토피에 관련하여 많이 사용되는 효능으로 피부 자극 완화를 목적으로 하는 화장품류에 많이 사용되고 있다. 그러나 화장품에 함유된 인공 화합물들로 인해 발생하는 부작용 사례가 다수 발생함으로써, 소비자들의 천연물을 원료로 식물성 폴리페놀, 플라보노이드 등 다양한 천연 성분을 함유하는 화장품에 대한 소비자들의 관심이 높아지고 있다.

플라보노이드는 식물에서 생성되는 이차대사산물의 일종으로 식물 생육에 있어 외부환경에 적응하기 위해 생성되는 천연 성분, 색소의 일종이다. 일반적으로 플라보노이드는 두 개의 페닐 고리와 헤테로 사이클릭 고리로 구성된 15개의 탄소 골격의 화학적 구조를 지니고 있다. 이런 특이적인 구조로 인해 항산화, 항염, 항노화 등 다양한 생리활성을 나타내며 최근 식품, 기능성 화장품의 소재로 각광받고 있으며 병풀, 어성초 등 다양한 식물에서 보고된 바 있다.

병풀(Centella asiatica, Indian pennywort)은 미나리과에 속하는 다년생 식물로 원산지는 아프리카 동부의 Madagascar 섬에서 시작되어 퍼지기 시작하여 인도, 스리랑카, 벵갈, 히말라야산까지 널리 분포하면서 중국이나 인도 등에서 상처 치 유 등의 약용으로 많이 사용하였다. 센텔라사포닌, 아시아티코사이드, 마데카소사이드, 세폴코사이드 등 다양한 생리활성 성분이 포함되어 있어 콜라겐 생성과 분비에 관여하여 상처 치료, 피부 재생, 탄력을 높이는데 효능이 있다. 예로부터 피부 상처나 만성 궤양 등의 치료에 이용되었으며 보습, 피부염의 억제, 항암, 항균 등의 효능이 있어 의약품뿐만 아니라 기능성 화장품 소재로 사용하기 위한 수요가 증가하고 있다.

어성초는 삼백초과(Saururaceae)에 속한 일년생 본초인 약모밀(Houttuynia cordata Thunb.)의 지상부를 일컬으며 우리나라의 제주도, 울릉도 및 중국 절강, 강소, 호북에 주로 분포한다. 주요성분으로는 아피질린, 베타 시토스테롤 등이 있으며 항산화, 항염, 항암, 항균 등의 효능이 보고되었다. 예로부터 폐농양, 폐렴, 백일해, 이질 등의 치료에 이용되었다.

위치하젤(Hamamelis Virginiana, Witch Hazel)은 버지니아 풍년화라고도 불리며 북미 원산으로 아열대에 서식하며 높이 5~10m 정도 자라는 낙엽수로 조록나무과 (Hamamelidaceae)에 속한다. 17세기 아메리카 원주민들이 통증, 상처 진정 등에 대한 약으로 사용하였으며 주요 성분으로 탄닌(tannin), 플라보노이드(flavonoid) 및 다양한 헥세놀(hexenol)을 포함한 천연 성분들이 함유되어 있고 항염, 항균, 항산화, 진정, 보습 등의 효능이 보고되었다.

황금 (Scutellaria Baicalensis)은 중국 원산의 귀화식물로 생약으로 뿌리를 말린 것이 황금색을 띄어 황금 또는 뿌리가 비어 속썩은풀이라고도 불린다. 항염, 항균, 항산화, 항암 등의 효능과 주요 성분으로 Baicalin, Baicalein 등의 성분이 보고되었다.

식이유황 (Methyl Sulfonyl Methane, MSM)은 뼈와 콜라겐과 같은 연골 결합조직의 필수 구성 성분으로 인체 내 콜라겐 성분이 풍부하게 하며 세포의 투과성을 높여 독소와 노폐물을 배출하고 항산화 효과, 통증 전달 신경 차단, 신경세포 손상 방지, 체세포 조직의 복구 치료 등의 효과가 있다.

본 발명자들은 이와 같은 천연물을 혼합하여 얻은 추출물 소재의 우수한 기능성을 이용하고자 연구하던 중, 병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황의 천연 성분들이 우수한 항산화, 피부 진정(IL-1α), 보습 (AQP3, HAS2) 및 피부 노화(COL1A1, COL3A1, Elastin) 개선이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하게 되었다.

대한민국 등록특허 제10-2280941호 (발명의 명칭 : 알로에베라잎즙 및 할미꽃, 병풀, 쇠비름 및 위치하젤 추출물을 함유하는 피부 보습 및 피부 진정용 화장료 조성물, 출원인 : 주식회사 이엔코스, 등록일 : 2019.03.27.) 대한민국 등록특허 제10-2006979호 (발명의 명칭 : 울금, 유향, 몰약 또는 황금에서 유래된 물질을 활성성분으로 포함하는 비누, 출원인 : 주식회사 헤르마, 등록일 : 2018.06.08) 대한민국 등록특허 제10-0795225호 (발명의 명칭 : 독일붓꽃, 병풀, 캐모마일, 달맞이꽃 및 어성초 추출물을 함유하는 여드름 피부 개선을 위한 피부 외용제 조성물, 출원인 : 주식회사 에스티씨나라, 등록일 : 2006.06.02.) 대한민국 공개특허 제10-2019-0023691호 (발명의 명칭 : 유산균발효 한방추출물을 함유하는 피부 항산화, 주름, 미백, 트러블 개선 화장료 조성물 및 그 제조방법, 출원인 : 김은주, 공개일 : 2019.03.08.) 대한민국 등록특허 제10-2066261호 (발명의 명칭 : 초정광천수와 황금추출물을 포함하는 피부 수분 향상용 화장료 조성물의 제조방법, 출원인 : (주)화니핀코리아, 등록일 : 2017.09.20.)

본 발명의 목적은 병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황의 복합 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 진정, 보습 및 주름개선용 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

본 발명은 병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황의 복합 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 진정용 화장료 조성물에 관한 것이다.

상기 추출물은 피부 각질세포 간의 지질 구조가 변형으로 인해, 피부장벽이 손상된 피부를 진정하는 효능이 있는 것을 특징으로 하고, 또한, ROS(Reactive oxygen species) 소거 활성이 우수하다.

상기 추출물은 피부장벽의 손상으로 증가된 IL-1α(Interleukin-1α)의 발현을 저해하는 것일 수 있다.

상기 추출물은 피부 보습 효능이 있는 것으로서, 히알루론산 합성효소 2(Hyaluronan synthase 2, HAS2) 및 아쿠아포린-3(Aquaporin 3, AQP3) 중 1종 이상 유전자의 발현을 증강시키는 것을 특징으로 한다.

덧붙여, 상기 추출물은 피부 주름개선 효능이 있는 것이며, 제1형콜라겐(Collagen type 1; COL1A1), 제3형콜라겐(Collagen type 3, COL3A1) 및 엘라스틴(ELASTIN)으로 이루어진 군 중 1종 이상 유전자의 발현을 증강시킨다.

상기 조성물은 병풀 100 중량부를 기준으로 어성초 75~150 중량부, 위치하젤 175 내지 300 중량부, 황금 125~250 중량부, 식이유황 75 내지 150 중량부를 포함하는 것을 특징으로 한다.

이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.

상기 추출물은 50~100ppm에서 ROS를 40~50% 소거하는 능력이 있으며, IL-1α의 유전자 발현을 35~45% 저해하는 효능이 있다. 또한, 상기 추출물은 50~100ppm에서 히알루론산 합성효소 2(의 발현을 2~3배(200~300%) 증강시키고, 아쿠아포린-3의 발현을 1.5~2.0배 증강시킨다. 이 외에도, 50~100ppm의 추출물 처리로 인해 제1형콜라겐이 1.5~2.0배, 제3형콜라겐이 1.4~1.9배, 엘라스틴이 1.5~2.0배 증강된다.

상기 추출물은 병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황의 각 원료의 혼합물을 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액을 용매로 하여 추출할 수 있으며, 상기 C1~C4 알코올은 메탄올, 에탄올, 프로판올, 이소프로판올, 부탄올 및 이소부탄올로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 추출물은 또한 물 또는 30~90%(v/v) 알코올 수용액 추출물, 바람직하게는 물 또는 50~80%(v/v) 알코올 수용액 추출물일 수 있다. 상기 추출물의 제조시 사용되는 물, C1~C4 알코올 또는 이들의 혼합용액은 원료 혼합물 사용 중량 기준 1~40배 부피(1kg 기준 1~40ℓ) 또는 1~40배 중량을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 5~40배 부피 또는 5~40배 중량을 사용할 수 있다. 상기 추출물의 추출조건은 20~100℃에서 1분~48시간일 수 있다. 상기 과정은 1~4번까지 반복할 수 있다.

상기 추출물의 추출용 기기로는 통상의 추출기기, 초음파분쇄추출기 또는 분획기를 이용할 수 있다. 이렇게 제조된 추출물은 열풍건조, 감압건조 또는 동결건조하여 용매를 제거할 수 있다.

상기 추출물은 상법에 따라, 유기용매(알코올, 에테르, 아세톤 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 컬럼크로마토그래피에 의한 방법 등, 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지의 방법을 단독 또는 적합하게 조합한 방법을 이용하여 분획 또는 정제하여 사용할 수 있다.

상기 크로마토그래피는 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 컬럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 이온교환수지 크로마토그래피(ion exchange resin chromatography), 중압 액체 크로마토그래피(medium pressure liquid chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography), 실리카겔 진공 액체 크로마토그래피(silica gel vacuum liquid chromatography) 및 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 중에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 추출물은 화장료 조성물 총 중량에 대하여 0.1~20 중량%, 바람직하게는 0.5~10 중량%, 더욱 바람직하게는 5~9 중량%를 함유하는 것을 특징으로 한다. 상기 추출물의 함량이 0.5 중량% 미만이면 효과적인 성능 발휘 한계의 문제가 있고, 20 중량%를 초과하면 제형화 및 제형 안정화에 문제가 있다.

상기 화장료 조성물의 제형으로는 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 에센스, 로션, 에멀젼, 팩, 핸드크림, 풋크림, 립밤, 립스틱, 아이섀도우, 아이라이너, 아이브로우 펜슬, 블러셔, 하이라이터, 일반화장수, 스킨, 크림, 세럼, 미용비누, 유연화장수, 약용화장수, 전신세정제, 클렌징폼, 클렌징로션, 겔, 클렌징 오일, 클렌징 크림, 샴푸, 린스, 헤어트리트먼트, 헤어로션, 클렌징 티슈 및 클렌징 워터에서 선택되는 것을 제공할 수 있다.

보다 더 자세하게는, 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판-부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물의 제형이 계면-활성제 함유 클렌징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 아세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다. 본 발명의 화장료 조성물은 형광물질, 살진균제, 굴수성 유발물질, 보습제, 방향제, 방향제 담체, 단백질, 용해화제, 당 유도체, 일광차단제, 비타민, 식물 추출물 등을 포함하는 부형제를 추가로 함유할 수 있다. 상기 성분들은 제형 또는 사용목적에 따라 그 첨가량을 화장료 조성물 고유의 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 선택할 수 있다. 상기 성분들의 첨가량은 예를 들어 조성물 총 중량에 대하여 0.1~10 중량%, 바람직하게는 0.1~6 중량%일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

도 1은 본 발명의 실시예 1, 비교예 1 및 2 추출물의 ROS 활성을 나타내는 결과 그래프다.
도 2는 본 발명의 실시예 1, 비교예 1 및 2 추출물이 갖는 IL-1α 유전자 발현 감소 효능을 확인한 결과 그래프다.
도 3은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 추출물이 갖는 HAS2 유전자 발현 증가 효능을 확인한 결과 그래프다.
도 4는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 추출물이 갖는 AQP3 유전자 발현 증가 효능을 확인한 결과 그래프다.
도 5는 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 추출물이 갖는 COL1A1 유전자 발현 증가 효능을 확인한 결과 그래프다.
도 6은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 추출물이 갖는 COL3A1 유전자 발현 증가 효능을 확인한 결과 그래프다.
도 7은 본 발명의 실시예 1 및 비교예 1 추출물이 갖는 ELASTIN 유전자 발현 증가 효능을 확인한 결과 그래프다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해지도록, 당업자에게 본 발명의 사상을 충분히 전달하기 위해 제공하는 것이다.

실시예 1 내지 4, 비교예 1 내지 12 : 복합 추출물의 제조

건조된 시료를 세절하여 표 1의 시료 함량으로 병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황(Methyl Sulfonyl Methane, MSM)을 혼합하여 원물(총합) 대비 20배 중량의 증류수를 첨가하여 70℃에서 환류 추출 및 여과하여 추출물을 수득하였다. 추출물을 거름종이와 여과패드로 여과 후 이틀 이상 상온 냉침 후 멤브레인 필터 (Membrane filter)를 사용하여 최종 여과하여 액상 상태의 복합 추출물을 얻었다. 각 추출물은 그대로 사용하거나 감압농축 또는 동결건조하여 분말로 제조한 후, 추출물 내 고형분의 함량을 확인하여 그 수율을 확인하였다.

	병풀 (g)	어성초 (g)	위치하젤 (g)	황금 (g)	식이유황 (g)	총합 (g)	추출물 내 고형분 수율(g)
실시예 1	100	100	200	200	100	700	18.2
실시예 2	100	75	300	150	75	700	19.5
실시예 3	100	75	200	250	75	700	18.2
실시예 4	100	150	175	125	150	700	17.0

비교예 1	200 (100)	100 (50)	100 (50)	200 (50)	100 (50)	700	18.7
비교예 2	100	100	100	200	200	700	18.6

비교예 3	175 (100)	175 (100)	175 (100)	88 (50)	87 (50)	700	19.0
비교예 4	78 (100)	78 (100)	78 (100)	233 (300)	233 (300)	700	18.4
비교예 5	78 (100)	78 (100)	155 (200)	156 (200)	233 (300)	700	18.2
비교예 6	233 (100)	78 (33)	78 (33)	233 (100)	78 (33)	700	17.9
비교예 7	78 (100)	233 (300)	233 (300)	233 (100)	233 (100)	700	18.4
비교예 8	64 (100)	63 (100)	191 (300)	191 (300)	191 (300)	700	18.1

비교예 9	400	0	300	0	0	700	18.2
비교예 10	0	300	0	300	100	700	17.4
비교예 11	100	150	150	150	150	700	18.5
비교예 12	100	200	100	200	100	700	19.1
※ 일부 원료 함량 값 아래의 괄호수치는 병풀 100 중량부 기준으로 할 때의 수치로 환산한 값임

이렇게 확인된 추출물은 각 실험에 추출물을 정량하여 사용하되, 추출물로 제조한 액상 성분을 그대로 사용하거나 또는 건조되거나 농축된 것을 다시 용액화하여 실험에 적용하였다.

실험예 1 : 총 플라보노이드 함량 평가

상기 제조된 복합 추출물의 총 플라보노이드 함량을 분석하기 위해 Moreno법에 따라 비색 정량하였다. 즉, 5종 천연물의 복합 발효 추출물을 여과하여 얻은 액상 100 μL를 미리 80(v/v)% 에탄올 수용액으로 10배 희석한 후 희석 시료 500 μL와 10(w/v)% aluminum nitrate 0.1 mL, 1M potassium acetate 0.1 mL, 80(v/v)% 에탄올 수용액 4.3 mL를 가하여 상온에서 40분 방치한 후 Microplate Reader(ALLSHENG China)를 이용하여 415 nm에서 흡광도를 측정하였다. 대조구는 검액 대신 증류수를 넣어 동일하게 처리하였다. 이때 표준물질로는 Quercetin을 50∼500 ㎍/ml의 농도로 조제하여 검량곡선을 작성하고 시료의 흡광도 값에 해당하는 표준물질의 농도 값으로 환산하여 표 2에 나타내었다.

	총 플라보노이드 함량 (ppm)
실시예 1	454
실시예 2	455
실시예 3	464
실시예 4	451

비교예 1	411
비교예 2	421
비교예 3	413
비교예 4	428
비교예 5	410
비교예 6	419
비교예 7	435
비교예 8	441
비교예 9	345
비교예 10	353
비교예 11	390
비교예 12	392

상기 표 1을 참고하면 실시예 1 내지 4의 추출물이 약 450~500ppm의 총 플라보노이드를 함유하여, 대부분의 비교예 1 내지 12의 추출물에 비해 총 플라보노이드를 다량 함유한 것으로 확인된다.

실험예 2 : 복합 추출물의 세포 독성 시험

본 발명에서 제조한 복합 추출물이 각 세포에 대해 세포 생존율에 어떠한 영향을 미치는지 관찰하기 위해 세포 생존율 시험을 실시하였다.

이를 위해, 각질형성세포인 HaCaT (human keratinocyte cell) 세포와 섬유아세포인 CCD1064sk (human Fibroblast cell) 세포를 이용하여 MTT 어세이를 수행하였는데, HaCaT 세포는 소태아혈청(FBS)이 함유된 DMEM 배지에 HaCaT 세포를 24 well plate에 1.5x10⁵로 분주한 후 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하였고, 섬유아세포인 CCD1064sk는 소태아혈청(FBS)이 함유된 IMDM 배지에 CCD1064sk를 24 well plate에 1x10⁵cells/well로 분주한 후 37℃, 5% CO₂조건에서 배양하여 세포를 준비하였다.

이 후 각 Plate에서 배지를 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline)로 1회 세척하고, 무혈청(serum free) 배지 상태에서 실시예 1 내지 4와 비교예 1 내지 12의 복합 추출물을 각각 최종농도가 100 ppm과 200 ppm이 되도록 세포에 처리한 상태로 24시간 동안 배양하였다. 다음으로, 세포 생존율 평가를 위해, 배양액을 제거한 뒤, 각 well 당 0.1 mg/mL의 MTT 용액을 500 μL씩 분주하고, 4시간 동안 암반응하였다. 암반응 후에는 반응액을 제거하고 DMSO 500 μL를 분주하여 생성된 Formazan을 용해시켜 Microplate reader를 이용하여 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.

각 추출물을 처리하지 않은 well(정상군; 무처리군)의 세포 생존율을 100%로 하여 그 결과를 표 3에 표시하였다.

시험군	세포생존률 (%)
	각 추출물 100 ppm		각 추출물 200 ppm
	HaCaT	CCD-1064SK	HaCaT	CCD-1064SK
대조군	100.00	100.00	100.00	100.00
실시예 1	103.45	103.45	100.23	101.23
실시예 2	101.63	102.43	102.45	101.20
실시예 3	102.54	101.50	101.63	102.50
실시예 4	99.02	99.02	102.32	101.68

비교예 1	102.12	101.25	101.20	102.39
비교예 2	101.93	100.27	98.41	99.63
비교예 3	84.97	82.12	64.45	52.02
비교예 4	72.54	69.21	54.63	68.45
비교예 5	86.43	84.21	61.35	56.89
비교예 6	83.24	81.15	56.23	63.43
비교예 7	85.11	84.42	52.46	56.45
비교예 8	65.75	64.18	46.63	49.12
비교예 9	95.56	97.63	86.34	82.46
비교예 10	95.34	92.45	83.25	83.35
비교예 11	94.66	91.23	86.21	82.34
비교예 12	95.23	92.56	83.45	83.66

표 3의 결과를 참고하면, 실시예 1 내지 4의 추출물을 Human Keratinocyte cell과 Human Fibroblast cell에 고농도로 처리하였을 때도 세포 독성은 확인되지 않았다. 그러나, 비교예 3 내지 8의 추출물은 세포독성이 나타나, 이후의 실험에서는 이 시료는 제외하고, 세포 독성이 나타나지 않은 실시예 1 내지 4와 비교예 1, 2, 9~12를 이용해 실험을 진행하였다.

실험예 3 : 항산화 효능 평가 - ROS(Reactive oxygen species) 소거능

실시예 1 내지 4와 비교예 1, 2, 9~12 추출물의 항산화 효능을 평가하기 위해 각질형성세포인 HaCaT cell (Human keratinocyte cell)에서 ROS 생성량을 측정하였다.

이를 위해 HaCaT cell을 96 웰 플레이트 (well plate)에 3x10⁴cells/well로 분주하고 24시간 배양 후 각 well을 serum free 배지로 교체하고 각각의 복합 추출물을 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 이때 비교군으로는 강력한 항산화제로 알려져 있는 녹차추출물 유래 EGCG (Epigallocatechin gallate)를 5ppm으로 처리하였다. 배양 후 ROS 염색을 위하여 DCFDA (D6883, Sigma-Aldrich, Germany)를 처리하여 암반응하였고, H₂O₂70μM을 15분 추가 처리하여 ROS (Reactive oxygen species) 생성을 유도하였다. 모든 시료 처리 후 Fluorescence 485/528 (excitation/emission) nm 파장에서 측정하였다. 측정 결과는 ROS 생성량/ 세포 생존율 x 100 (%)로 계산하여 표 4, 도 1에 나타내었다.

100 ppm 추출물 시료	ROS 활성 (%)
무처리군	54.86
H₂O₂	100.0

H₂O₂ + 실시예 1	56.96
H₂O₂ + 실시예 2	57.93
H₂O₂ + 실시예 3	52.53
H₂O₂ + 실시예 4	58.02

H₂O₂ + 비교예 1	74.18
H₂O₂ + 비교예 2	93.08
H₂O₂ + 비교예 9	82.25
H₂O₂ + 비교예 10	84.12
H₂O₂ + 비교예 11	92.52
H₂O₂ + 비교예 12	85.52

H₂O₂+ EGCG	65.57

도 1을 참고하면 H₂O₂를 이용해 ROS 생성을 유도한 후 실시예 1 내지 4의 추출물 처리시 ROS 소거능이 현저하게 줄어드는 것으로 관찰된다. 그러나 비교예 1 및 2와 비교예 9~12의 추출물은 ROS 활성을 낮추는 효과가 거의 없거나 미미한 것으로 나타났다.

실험예 4 : 피부 진정 효능 평가

피부 진정 효능을 평가하기 위해 각질형성세포인 HaCaT cell (human keratinocyte cell)에서 염증성 사이토카인 IL-1α 발현 억제 효과를 분석하였다.

이를 위해 HaCaT cell을 6 well plate에 7.5 x 10⁵cells/well의 농도로 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이 후 Plate에서 배지를 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline)로 1회 세척하고, FBS가 첨가되지 않은 무혈청(Serum-free) DMEM 배지로 교환하였다. 다음으로, 각질세포 간 지질의 구조를 변형시켜 피부 장벽 손상을 유도하기 위해 SDS (sodium dodecyl sulfate) (10㎍/ml)를 처리한 뒤, 각각의 복합 추출물을 100ppm으로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거한 뒤 PBS (phosphate buffered saline)로 1회 세척하여 배지 성분을 제거한 뒤 QIAzol^® (QIAGENL^®, USA)를 처리하여 Cell lysis 진행 후 제조사 QIAGENL^®에서 제공하는 protocol에 따라서 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Qubit^® fluorometer with RNA BR Assay kit를 이용하여 정량한 뒤 cDNA 합성 Kit (qPCRBIO cDNA Synthesis Kit, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 Kit의 방법에 따라 실험을 수행하였다. 합성된 cDNA는 각각의 Primer를 이용하여 Real-time quantitative PCR (RT-qPCR)에 사용되었다. RT-qPCR은 Real-time PCR Kit (2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX, PCR BIOSYSTEMS, London, UK)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time qPCR 조건은 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 30초, 40 사이클로 진행하였다. 이에 대한 결과는 표 5, 도 2에 나타내었다.

시료 처리군 (100 ppm 추출물)	IL-1α의 유전자 발현양 (%)
무처리군	55.84±4.05
SDS	100.00±4.08

SDS + 실시예 1	56.14±3.31
SDS + 실시예 2	58.52±3.50
SDS + 실시예 3	52.40±2.34
SDS + 실시예 4	57.02±4.65

SDS + 비교예 1	76.75±2.22
SDS + 비교예 2	85.56±2.41
SDS + 비교예 9	92.03±3.22
SDS + 비교예 10	94.45±2.05
SDS + 비교예 11	83.35±1.52
SDS + 비교예 12	85.33±2.33

표 5 및 도 2를 참고하면 각질형성세포에서 염증 및 면역에 관여하는 유전자의 활동을 자극하는 사이토카인 중 하나인 Interleukin 1-alpha (IL-1α)에 대해 각 추출물을 처리한 바, 실시예 1 내지 4의 추출물에서는 매우 현저한 IL-1α의 유전자 발현 억제가 관찰된다. 따라서 본 발명의 추출물이 피부 진정 효능이 뛰어난 화장료 조성물임이 확인된다.

실험예 5 : 피부 보습 효능 평가

피부 보습 효능을 평가하기 위해 각질형성세포인 HaCaT cell (human keratinocyte cell)에서 히알루론산을 생성하는 역할을 하는 효소인 HAS2와 물의 이동통로를 제공하는 단백질인 AQP3 유전자 발현 증가 효과를 분석하였다.

HaCaT cell을 6 well plate에 7.5 x 10⁵cells/well의 농도로 10% FBS가 첨가된 DMEM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 Plate에서 배지를 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline)로 1회 세척하고, FBS가 첨가되지 않은 무혈청(Serum-free) DMEM 배지로 교환한 후, 각각의 추출물을 100ppm으로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 양성대조군으로 Retinoic acid (1μM)를 사용하였다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거한 뒤 PBS (phosphate buffered saline)로 1회 세척하여 배지 성분을 제거한 뒤 QIAzol^® (QIAGENL^®, USA)를 처리하여 Cell lysis 진행 후 제조사 QIAGENL^®에서 제공하는 protocol에 따라서 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Qubit^® fluorometer with RNA BR Assay kit를 이용하여 정량한 뒤 cDNA 합성 Kit (qPCRBIO cDNA Synthesis Kit, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 Kit의 방법에 따라 실험을 수행하였다. 합성된 cDNA는 각각의 Primer를 이용하여 Real-time quantitative PCR (RT-qPCR)에 사용되었다. RT-qPCR은 Real-time PCR Kit (2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time qPCR 조건은 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 30초, 40 사이클로 진행하였다. 이에 대한 결과는 표 6, 도 3에 나타내었다.

시료 처리군 (100 ppm 추출물)	유전자 발현양 (%)
시료 처리군 (100 ppm 추출물)	HAS2	AQP3
무처리군	100.00	100.00

실시예 1	242.14±4.27	157.47±4.97
실시예 2	255.45±1.52	161.36±4.45
실시예 3	245.32±3.56	154.03±2.60
실시예 4	226.56±2.34	156.20±1.63

비교예 1	164.24±3.97	133.54±4.87
비교예 2	125.53±1.45	125.63±2.33
비교예 9	134.02±1.10	132.35±3.44
비교예 10	129.65±2.52	123.40±1.58
비교예 11	135.24±2.66	136.66±2.29
비교예 12	123.53±1.34	120.24±3.40

Retinoic acid (1μM)	178.87±5.33	134.28±5.14

상기 표 6과 도 3을 참고하면 각질형성세포에서 피부 보습 및 장벽에 중요한 역할을 하는 히알루론산 합성효소 2(Hyaluronan synthase 2, HAS2)와 아쿠아포린-3(Aquaporin 3, AQP3)에 대해 실시예 1 내지 4의 추출물 처리시 각 유전자의 발현이 매우 증가함을 알 수 있다.

따라서 본 발명의 추출물이 피부 진정 보습이 뛰어난 화장료 조성물임이 확인된다.

실험예 6 : 피부 주름 개선 평가

피부 주름 개선 효능을 평가하기 위해 섬유아세포 CCD1064sk cell (human Fibroblast cell)에서 Anti-aging에 기본이 되는 세가지 유전자 COL1A1, COL3A1, Elastin 발현 증가 효과를 분석하였다. CCD1064sk cell을 6 well plate에 5 x 10⁵cells/well의 농도로 10% FBS가 첨가된 IMDM 배지를 이용하여 37℃, 5% CO₂배양기에서 24시간 동안 배양하였다. 이후 Plate에서 배지를 제거한 후 PBS (phosphate buffered saline)로 1회 세척하고, FBS가 첨가되지 않은 무혈청(Serum-free) IMDM 배지로 교환한 후, 각각의 추출물을 100ppm으로 처리하여 24시간 동안 배양하였다. 양성대조군으로는 콜라겐 합성 효소 활성에 도움을 주는 Ascorbic acid (100ppm)를 처리해주었다. 배양이 끝난 후 배양액을 제거한 뒤 PBS (phosphate buffered saline)로 1회 세척하여 배지 성분을 제거한 뒤 QIAzol^® (QIAGENL^®, USA)를 처리하여 Cell lysis 진행 후 제조사 QIAGENL^®에서 제공하는 protocol에 따라서 RNA를 분리하였다. 분리된 RNA를 Qubit^® fluorometer with RNA BR Assay kit를 이용하여 정량한 뒤 cDNA 합성 Kit (qPCRBIO cDNA Synthesis Kit, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 사용하여 cDNA를 합성하였다. cDNA 합성은 Kit의 방법에 따라 실험을 수행하였다. 합성된 cDNA는 각각의 Primer를 이용하여 Real-time quantitative PCR (RT-qPCR)에 사용되었다. RT-qPCR은 Real-time PCR Kit (2x qPCRBIO SyGreen Blue mix Lo-ROX, PCRBIOSYSTEMS, London, UK)를 이용하여 유전자를 증폭한 후 증폭산물을 정량 분석하였다. Real-time qPCR 조건은 모두 95℃에서 5초, 60℃에서 30초, 40 사이클로 진행하였다. 이에 대한 결과는 표 7, 도 5 내지 도 7에 나타내었다.

시료 처리군 (100 ppm 추출물)	유전자 발현양 (%)
시료 처리군 (100 ppm 추출물)	COL1A1	COL3A1	ELASTIN
무처리군	100	100	100

실시예 1	158.91±2.11	142.43±2.15	159.40±3.11
실시예 2	152.53±2.31	152.52±1.53	154.66±3.40
실시예 3	166.04±1.53	145.63±2.10	155.03±2.39
실시예 4	156.63±2.64	146.45±2.25	153.46±2.57

비교예 1	125.44±2.37	121.74±3.54	124.27±4.48
비교예 2	125.53±1.45	115.63±2.33	124.45±3.25
비교예 9	114.02±1.10	112.35±3.44	118.24±4.32
비교예 10	129.65±2.52	123.40±1.58	119.03±5.43
비교예 11	115.24±2.66	116.66±2.29	126.52±2.04
비교예 12	123.53±1.34	110.24±3.40	113.36±5.25

Ascorbic acid (100ppm)	123.12±2.45	134.45±1.42	142.73±4.88

표 7, 도 5 내지 도 7을 참고하면 Collagen type 1 (COL1A1), Collagen type 3 (COL3A1) 및 ELASTIN에 대해, 실시예 1 내지 4의 추출물 처리 시, 각 유전자의 발현이 현저히 증가되는 것이 확인되어 피부 주름 개선 효능이 뛰어난 화장료 조성물임이 확인된다.

Claims

병풀, 어성초, 위치하젤, 황금 및 식이유황의 복합 천연물 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 진정용 화장료 조성물로서,
상기 추출물이 피부 각질세포 간의 지질 구조가 변형으로 인해, 피부장벽이 손상된 피부를 진정하는 효능; 및, 피부 주름개선 효능;이 있는 것을 특징으로 하는 피부 진정용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 추출물이 피부장벽의 손상으로 증가된 IL-1α(Interleukin-1α)의 발현을 저해하는 것을 특징으로 하는 피부 진정용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물이 ROS(Reactive oxygen species) 소거능이 우수한 것을 특징으로 하는 피부 진정용 화장료 조성물.
제1항에 있어서,
상기 추출물이 피부 보습 효능이 있는 것을 특징으로 하는 피부 진정용 화장료 조성물.
제5항에 있어서,
상기 추출물이 히알루론산 합성효소 2(Hyaluronan synthase 2) 및 아쿠아포린-3(Aquaporin 3) 중 1종 이상 유전자의 발현을 증강시키는 것을 특징으로 하는 피부 진정용 화장료 조성물.
삭제
제1항에 있어서,
상기 추출물이 제1형콜라겐(Collagen type 1), 제3형콜라겐(Collagen type 3) 및 엘라스틴(ELASTIN)으로 이루어진 군 중 1종 이상 유전자의 발현을 증강시키는 것을 특징으로 하는 피부 진정용 화장료 조성물.