JPS5940440B2 - 抗腫瘍性物質の製造法 - Google Patents
抗腫瘍性物質の製造法Info
- Publication number
- JPS5940440B2 JPS5940440B2 JP55074926A JP7492680A JPS5940440B2 JP S5940440 B2 JPS5940440 B2 JP S5940440B2 JP 55074926 A JP55074926 A JP 55074926A JP 7492680 A JP7492680 A JP 7492680A JP S5940440 B2 JPS5940440 B2 JP S5940440B2
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- JP
- Japan
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- cells
- substance
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- plant
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- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は式
(式中Rは水素または水酸基を示す。
)で示されるディテルペノイド・トリエポキサイドに属
する抗腫瘍性物質の製造法に関する。
する抗腫瘍性物質の製造法に関する。
本発明物質は米国のカブチャン(S、M。
Kupchan )らにより1972年ににしきぎ科植
物であるクロス層より単離された化合物(R=Hのとき
トリプトライド、R=OHのときトリブデイオライドと
命名されている)で、L−1210およびP−388白
血病さらにはヒトの腫瘍細胞であるKB細胞などに対し
て強力な阻止効果が認められた物質である。
物であるクロス層より単離された化合物(R=Hのとき
トリプトライド、R=OHのときトリブデイオライドと
命名されている)で、L−1210およびP−388白
血病さらにはヒトの腫瘍細胞であるKB細胞などに対し
て強力な阻止効果が認められた物質である。
従って本発明物質は抗癌性物質として極め工期時されて
いる化合物である。
いる化合物である。
本発明物質は上記カブチャンらの報告
(Journal of American Chem
ical 5ceiety94.7194〜7195.
1972)にクロス層からの採取法が記載され℃いるが
、生産量は極微量であり生産のための栽培に時間が力へ
る。
ical 5ceiety94.7194〜7195.
1972)にクロス層からの採取法が記載され℃いるが
、生産量は極微量であり生産のための栽培に時間が力へ
る。
本発明者らは、本発明物質の生産について研究を行った
結果、トリプテリギウム・ウィルフォルディ(クロス層
)を組織培養することによって本発明物質を速やかにか
つ多量に衰運することができることを見出し本発明を完
成した。
結果、トリプテリギウム・ウィルフォルディ(クロス層
)を組織培養することによって本発明物質を速やかにか
つ多量に衰運することができることを見出し本発明を完
成した。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明によれば、トリブテリギウム属に属する植物の茎
2葉、芽1種子その他の部分から組織片または細胞群を
無菌的に取り出して培養し、無定形の細胞群いわゆるカ
ルスを誘導し、これを固体上gよび液体培養基中で好気
的に培養して増殖せしめれば、組織培養物たとえば増殖
したカルス、増殖した細胞、一部または完全に分化した
細胞ならびに培養基に本発明物質が生産蓄積されるので
該組織培養物および/または培養基から本発明化合物を
採取することができる。
2葉、芽1種子その他の部分から組織片または細胞群を
無菌的に取り出して培養し、無定形の細胞群いわゆるカ
ルスを誘導し、これを固体上gよび液体培養基中で好気
的に培養して増殖せしめれば、組織培養物たとえば増殖
したカルス、増殖した細胞、一部または完全に分化した
細胞ならびに培養基に本発明物質が生産蓄積されるので
該組織培養物および/または培養基から本発明化合物を
採取することができる。
本発明に用いる植物はトリプテリギウム属に属し、本発
明物質を生産する能力を有するものであればいかなるも
のでもよい。
明物質を生産する能力を有するものであればいかなるも
のでもよい。
トリプテリギウム属植物としてはトリプテリギウム・ウ
ィルフォルディ(Triptergium ’Wi 1
fordi i )+ )リブテリギウム・レゲリー(
T、regelii )+ )リプテリギウム・フオレ
ステイ(T、 forrestii )などがあげられ
る。
ィルフォルディ(Triptergium ’Wi 1
fordi i )+ )リブテリギウム・レゲリー(
T、regelii )+ )リプテリギウム・フオレ
ステイ(T、 forrestii )などがあげられ
る。
これら植物の記載は、トリブテリギウム・ウィルフォル
ディ(クロス層)は、大井次三部著′日本植物誌′36
4ページ、昭和40年全文堂にその他は、R−Brun
ing et al。
ディ(クロス層)は、大井次三部著′日本植物誌′36
4ページ、昭和40年全文堂にその他は、R−Brun
ing et al。
PbVtochemi −5try 17,1821
−58(1978)に記載がある。
−58(1978)に記載がある。
より好適にはトリプテリギウム・ウィルフォルディが用
いられる。
いられる。
以下に本発明の組織培養法の詳細を述べる。
まず、トリプテリギウム属植物の茎9葉、根。
芽、果実その他の組織片または細胞群を材料とし、これ
を任意の大きさに切断し、表面を脱イオン水で洗浄し、
ついで例えば次亜塩素酸ソーダ、エチルアルコールなど
で殺菌したのち、殺菌水でよく洗う。
を任意の大きさに切断し、表面を脱イオン水で洗浄し、
ついで例えば次亜塩素酸ソーダ、エチルアルコールなど
で殺菌したのち、殺菌水でよく洗う。
このように表面殺菌した小片をたとえばムラシゲースク
ーグス氏培地(Murashige T、 andSk
oog F 、’ Physiol 、 P lant
arum ’ 15巻、473−497ページ(196
2年))に砂糖31!/dt、 カイネチ:/IRI
/l、2.4−ジクロロフェノキシ酢酸11117/l
および寒天0.8t/dtを加えた寒天培地上忙置床後
、約2週間一定温度(15〜35℃)で培養するとカル
スが誘導される。
ーグス氏培地(Murashige T、 andSk
oog F 、’ Physiol 、 P lant
arum ’ 15巻、473−497ページ(196
2年))に砂糖31!/dt、 カイネチ:/IRI
/l、2.4−ジクロロフェノキシ酢酸11117/l
および寒天0.8t/dtを加えた寒天培地上忙置床後
、約2週間一定温度(15〜35℃)で培養するとカル
スが誘導される。
上記の如くにして誘導されるカルスは固体培養基上、ま
たは液体培養基中にて、通常微生物の培養を行うのと同
様な操作を応用し工さらに培養できる。
たは液体培養基中にて、通常微生物の培養を行うのと同
様な操作を応用し工さらに培養できる。
たとえば培養の際は振盪培養法または無菌空気を通気し
つつ培養するタンク培養法により行うことができる。
つつ培養するタンク培養法により行うことができる。
これらの培養基組成としては、たとえば上述の培地を利
用できるが、これに限定されるものではなく、植物組織
培養用培地である、ホワイト(White )氏、ガン
ボーク(Garnborg )氏、ニッチ(Njtch
)氏その他(植物細胞組織培養、実際・応用・展望−理
工学社、1979年原田宏属国嶺穆氏編)を用いること
が可能であり、炭素源としでM(シュークロース)の代
りにクルコース、7ラクトース、マンノース、糖蜜、で
ん粉その他を用いることができる。
用できるが、これに限定されるものではなく、植物組織
培養用培地である、ホワイト(White )氏、ガン
ボーク(Garnborg )氏、ニッチ(Njtch
)氏その他(植物細胞組織培養、実際・応用・展望−理
工学社、1979年原田宏属国嶺穆氏編)を用いること
が可能であり、炭素源としでM(シュークロース)の代
りにクルコース、7ラクトース、マンノース、糖蜜、で
ん粉その他を用いることができる。
また酵母エキス、ペプトン、肉エキス、カザミノ酸など
も加えることができる。
も加えることができる。
カイネチンの代りに、ベンジルアデニンのヨウな他のサ
イトカイニン類、24−ジクロロフェノキシ酢酸の代り
にインドール酢酸、ナフタレン酢酸などの生育調節物質
を使用することもできる。
イトカイニン類、24−ジクロロフェノキシ酢酸の代り
にインドール酢酸、ナフタレン酢酸などの生育調節物質
を使用することもできる。
種々の無機微量成分は、天然物を利用したり、脱イオン
水の代りに水道水を用いることで足りる場合は、必ずし
も添加する必要はない。
水の代りに水道水を用いることで足りる場合は、必ずし
も添加する必要はない。
培養基のpHは、4.0〜8.5が好適で、培養温度は
25〜35℃が適しており、培養期間は通常1〜2週間
である。
25〜35℃が適しており、培養期間は通常1〜2週間
である。
か(して培養し増殖した細胞群(カルス)、分化した植
物細胞を濾過して集め、ホモゲナイザーなどにより細胞
を破壊し、濾過あるいは遠心機などで得た上澄液あるい
はF液中より、あるいは培養物から細胞群や植物細胞を
除去して得た培養F液から本発明物質を分離することが
できる。
物細胞を濾過して集め、ホモゲナイザーなどにより細胞
を破壊し、濾過あるいは遠心機などで得た上澄液あるい
はF液中より、あるいは培養物から細胞群や植物細胞を
除去して得た培養F液から本発明物質を分離することが
できる。
これらの分離法は、カブチャン(Kupchan )ら
の方法(ジャーナルOオプOアメリカンOケミカルOン
サイエテイ、94巻7194ページ 1972年)を利
用することができるが、発明者らは次の方法によった。
の方法(ジャーナルOオプOアメリカンOケミカルOン
サイエテイ、94巻7194ページ 1972年)を利
用することができるが、発明者らは次の方法によった。
培養細胞からの分離法の一つは、細胞を凍結乾燥しこれ
に95%のエチルアルコールを加え、ソックスレー抽出
器を用いたりあるいはビーカーOフラスコその他の容器
で加温するなどして、抽出を行う。
に95%のエチルアルコールを加え、ソックスレー抽出
器を用いたりあるいはビーカーOフラスコその他の容器
で加温するなどして、抽出を行う。
抽出液を減圧濃縮後水とn−ヘキサンを加えて分液戸斗
を用いてよく振り、不純物なn−ハキサン層に転溶して
除く。
を用いてよく振り、不純物なn−ハキサン層に転溶して
除く。
分離法の二として、細胞の抽出液や培養F液を材料とし
℃用いる時には、これらの液にn−ヘキサンを加えて不
純物をこの層に転溶させる。
℃用いる時には、これらの液にn−ヘキサンを加えて不
純物をこの層に転溶させる。
いずれの場合でもn−ヘキサンを用いる分配操作は二、
三度繰り返し、できる限りn−ヘキサン可溶な不純物を
除いた方がよい。
三度繰り返し、できる限りn−ヘキサン可溶な不純物を
除いた方がよい。
次に水層区分に酢酸エチルを加え1分液F斗を用いて分
配を行い、酢酸エチル層を集める。
配を行い、酢酸エチル層を集める。
この操作も二、三度繰り返した方がよい。
かくして得られた酢酸エチル層を減圧濃縮し、高速液体
クロマトグラフィー(使用カラム、Unisil OC
18日本分光社製、ソルベント系30%エタノール)を
用いて、本発明の抗腫瘍性物質(トリブディオライドと
トリプトライド)を分取することができる。
クロマトグラフィー(使用カラム、Unisil OC
18日本分光社製、ソルベント系30%エタノール)を
用いて、本発明の抗腫瘍性物質(トリブディオライドと
トリプトライド)を分取することができる。
このようにして得られた二種のジテルペノイド◎トリエ
ポキサイドはKB、L 1210.p−388など各
種腫瘍細胞の生育を抑えることが確かめられ、特にKB
細胞は、これらの精姿、培養時の定量などの際に恒常的
な定量法の一つとして使用された。
ポキサイドはKB、L 1210.p−388など各
種腫瘍細胞の生育を抑えることが確かめられ、特にKB
細胞は、これらの精姿、培養時の定量などの際に恒常的
な定量法の一つとして使用された。
トリプトライドの元素分析値より計算して得た分子式は
C2oH2406、融点は226℃、比旋光度[(X)
D−=−154’ (cO,369,CH2C,/、)
UV吸収の極大値は218 nmで、すべて文献値と一
致した。
C2oH2406、融点は226℃、比旋光度[(X)
D−=−154’ (cO,369,CH2C,/、)
UV吸収の極大値は218 nmで、すべて文献値と一
致した。
またマススペクトルはm/e360.16(M+)を与
え、nmrの結果も文献値と一致した。
え、nmrの結果も文献値と一致した。
一方、トリプデイオライドの分子式は
C20H24o□、融点210℃、比旋光度(α、)
25=−138° (e 0.139.CH2C42)
、UVの吸収極大は217nmで、文献値と一致した。
25=−138° (e 0.139.CH2C42)
、UVの吸収極大は217nmで、文献値と一致した。
マススペクトルm/e377、I 6 (M+1 )士
。
。
nmrの結果も同様に得られた物質がトリプディオライ
ドであることを示した。
ドであることを示した。
これらの結果から組織培養法で得られた細胞の生産物は
親植物の生産するトリプディオライドとトリプトライド
と同じ物質であることが分る。
親植物の生産するトリプディオライドとトリプトライド
と同じ物質であることが分る。
なおこれらの物質の定量は、上述のKB細胞の生育阻止
法で行うほか、薄層クロマトグラフィーで物質を分離後
、セリツク・アンモニウム硫酸液の噴霧・加熱後みられ
る螢光の強さから、あるいは高速液体クロマトグラフィ
ーによる218nmのUV吸光度測定値から算出したも
のである。
法で行うほか、薄層クロマトグラフィーで物質を分離後
、セリツク・アンモニウム硫酸液の噴霧・加熱後みられ
る螢光の強さから、あるいは高速液体クロマトグラフィ
ーによる218nmのUV吸光度測定値から算出したも
のである。
以下に実施例を述べる。
実施例 1
約1副位の長さに切ったクロメルの茎を、次亜塩素酸ソ
ーダ液(有効塩素3%)10分間浸漬して殺菌する。
ーダ液(有効塩素3%)10分間浸漬して殺菌する。
この殺菌洗浄したクロメルの茎を、ムラシゲ・スクーグ
氏培地にシュークロース31/dt、カイネチン1〜/
l、 24 D*1m1i/l、寒天0.8?/d
tを含む培地107(pH6,3)に試験管1本当り1
個置床し、28℃で約1ケ月培養する。
氏培地にシュークロース31/dt、カイネチン1〜/
l、 24 D*1m1i/l、寒天0.8?/d
tを含む培地107(pH6,3)に試験管1本当り1
個置床し、28℃で約1ケ月培養する。
茎の切断面より形成されてきたカルス全量を、同じ組成
の培地10rnlに移植する。
の培地10rnlに移植する。
さらに28℃で1ケ月間培養し増殖したカルスを集め凍
結乾燥する。
結乾燥する。
このようにして集メたカルスの乾燥物202に95係エ
チルアルコール200ゴを加え、ソックスレー抽出器を
用いて6時間抽出を行う。
チルアルコール200ゴを加え、ソックスレー抽出器を
用いて6時間抽出を行う。
この操作を3回繰り返して得られたエチルアルコール部
分約600mを減圧下で濃縮乾固してから水を50rn
I!加え、できる限り溶かす。
分約600mを減圧下で濃縮乾固してから水を50rn
I!加え、できる限り溶かす。
これにn−ヘキサン50mを加え分液F斗で振り、不純
分を除く。
分を除く。
さらに2回同様に操作して水層を集め、これに酢酸エチ
ル50rIllを加え、目的物質を酢酸エチル層に分液
沖斗を用いて移す。
ル50rIllを加え、目的物質を酢酸エチル層に分液
沖斗を用いて移す。
この操作をさらに2度繰返して酢酸エチル層を集め、減
圧濃縮したのちUnisibQC18のカラム、30%
エタノールを用いて高速液体クロマトグラフィーを行う
。
圧濃縮したのちUnisibQC18のカラム、30%
エタノールを用いて高速液体クロマトグラフィーを行う
。
標準品と同一部位に現われるピーク(検出はUV218
nm )を集め濃縮して、トリプデイオライド0.6〜
、トリプトライド0.1 qを得た。
nm )を集め濃縮して、トリプデイオライド0.6〜
、トリプトライド0.1 qを得た。
実施例 2
実施例1で得られたカルス(新鮮重量として約22)を
、ムラシゲ・スクーグ氏培地にカイネチン1〜/11ナ
フlレン酢酸1mfl/l、シュークロース397dt
を含む液体培地100/7Z7!!の入った300rn
l容三角フラスコに植え、毎分180回転、28℃、暗
黒下で2週間娠と5培養する。
、ムラシゲ・スクーグ氏培地にカイネチン1〜/11ナ
フlレン酢酸1mfl/l、シュークロース397dt
を含む液体培地100/7Z7!!の入った300rn
l容三角フラスコに植え、毎分180回転、28℃、暗
黒下で2週間娠と5培養する。
その生育は、培地1ゴ当り15〜(乾物量→に達する。
細胞を戸別して集め、細胞および培養F液中の目的物を
定量したところ、細胞中にトリプディオライド、トリプ
トライドがそれぞれ0.20μ?。
定量したところ、細胞中にトリプディオライド、トリプ
トライドがそれぞれ0.20μ?。
0.04μ?(各々培地1−当りに換算)、培養戸液中
にトリプデイオライド、トリプトライドがそれぞれ0.
25μF、0.05μ?(各々培地1ゴ当’)K換算)
が含まれていた。
にトリプデイオライド、トリプトライドがそれぞれ0.
25μF、0.05μ?(各々培地1ゴ当’)K換算)
が含まれていた。
実施例 3
実施例2の液体培地組成のナフタレン酢酸の代りに24
−ジクロロフェノキシ酢酸0.5〜/lを含む培地を用
い、実施例2と同様に培養したところ、細胞中にトリブ
ディオライド、トリプトライドがそれぞれ0.14μr
、o、05μ?(各々培地1rnl当りに換算)、戸液
中にそれぞれ0.20μ?。
−ジクロロフェノキシ酢酸0.5〜/lを含む培地を用
い、実施例2と同様に培養したところ、細胞中にトリブ
ディオライド、トリプトライドがそれぞれ0.14μr
、o、05μ?(各々培地1rnl当りに換算)、戸液
中にそれぞれ0.20μ?。
0.08μ?(各々培地1m当り)が生成された。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1式 (但し、式中Rは水素または水酸基を示す。 )で示されるディテルペノイド・トリエポキサイドに属
する抗腫瘍性物質を生産する能力を有し、トリプテリギ
ウム属に属する植物を、固体もしくは液体培養基に組織
培養し組織培養物中および/または培養基に該抗腫瘍性
物質を生成蓄積せしめ、該組織培養物および/または培
養基から該抗腫瘍性物質を採取することを特徴とする上
記式で示される抗腫瘍性物質の製造法。 2 該植物がトリプテリギウム・ウィルフォルディに属
する植物であることを特徴とする特許請求の範囲1の製
造法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP55074926A JPS5940440B2 (ja) | 1980-06-05 | 1980-06-05 | 抗腫瘍性物質の製造法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP55074926A JPS5940440B2 (ja) | 1980-06-05 | 1980-06-05 | 抗腫瘍性物質の製造法 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPS572699A JPS572699A (en) | 1982-01-08 |
JPS5940440B2 true JPS5940440B2 (ja) | 1984-09-29 |
Family
ID=13561447
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP55074926A Expired JPS5940440B2 (ja) | 1980-06-05 | 1980-06-05 | 抗腫瘍性物質の製造法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPS5940440B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0421966Y2 (ja) * | 1984-09-14 | 1992-05-19 |
Families Citing this family (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP4444357B1 (ja) | 2008-11-20 | 2010-03-31 | 株式会社東芝 | 締め付け固定装置、モジュール取り付け構造および情報処理装置 |
FR2952072B1 (fr) * | 2009-11-05 | 2013-09-27 | Pf Medicament | Procede de production de triptolide |
-
1980
- 1980-06-05 JP JP55074926A patent/JPS5940440B2/ja not_active Expired
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH0421966Y2 (ja) * | 1984-09-14 | 1992-05-19 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPS572699A (en) | 1982-01-08 |
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