JPH01500401A - 植物培養における二次代謝産物生産の誘導方法及びその手段 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物培養における二次代謝産物生産の 誘導方法及びその手段 肢」し虹互 本発明は植物由来の二次代謝産物に関し、そしてさらに詳しくは、これらの代謝 産物を生産するために植物細胞を誘導する方法及び手段に関する。

背」」［止 植物により生産される多（の化学物質が、それらが細胞機能に必須であるために 一次代謝産物として分類されている。

−次代謝産物は植物集団中に普遍的に存在し、そして植物により生産される化学 物質の大部分を構成するが、他の化合物は二次代謝産物として分類され、そして それらの種々の用途のため、科学的研究及び商業的利用の両者の焦点となってい る。

幾つかの場合において、二次代謝産物は、例えば微生物感染、ＵＶ照射、機械的 損傷により、並びに有機物質及び無機物質による処理により誘導されるストレス に応答して幾つかの植物において生産される。この様なストレス条件下で生産さ れる二次代謝産物のバラエティ−は多様であり、そしてアルカロイド類、テルペ ノイド類、フラボノイド類、カロチノイド類、フェノール系化合物類及びグリコ シド類を包含する。

一層重要な、医薬として有用な二次代謝産物にはアルカロイド類、ステロイドホ ルモン類、強心配糖化及び抗生物質類があり、この内インドールアルカロイド類 が特に興味深い。アルカロイドは多くの化合物を包含し、その内の少なくとも幾 つかは医薬的価値を有することが知られている。例えば、インドールアルカロイ ドであるアジマリシン（ａｊａ＋ａｌ　１ｃｉｎｅ）は抗高血圧剤／精神安定剤 として機能することが知られている。

さらに・、ビンクリスチン（ν１ｎｃｒｉｓｔｉｎｅ）及びビンブラスチン（ν １ｎｂｌａｓｔｉｎｅ）は癌の治療において許容される。ビンブラスチン及びビ ンクリスチンの両者の前駆体であるカサランチン（ｃａｔｈａｒａｎｔｈｉｎｅ ）もまた二次代謝産物として生産され、そしてそれらの化合物の製造における出 発材料として価値がある。

しかしながら、すべての二次代謝産物がすべての植物により大量に生産されるわ けではない。代謝産物の種類は植物の種に大きく依存する０例えば幾つかのイン ドールアルカロイドは最も一般的にカサランサス・ロゼウス（Ｃａｔｈａｒａｎ ｔｈｕｓｒｏｓｅｕｓ）　（マダガスカル・ツルニチソウ　（Ｍａｄａｇａｓｃ ａｒ　ｐｅｒｉ−ｗｉｎｋｌｅ）　、ビンカ・ロゼア（■μ徂朋μ狙）及びロク ネラ・ロゼア（Ｌｏｃｈｎｅｒａ　ｒｏμ狙）としても知られている〕から抽出 される。さらに、モルフィナン（ｍｏｒｐｈｉｎａｎ）アルカロイド、例えばモ ルフイン（＋＋＋ｏｒｐｈｉｎｅ）及びコディン（ｃｏｄｅｉｎｅ）　はケシ〔 パパベール・ソムニフェルム（ハＰ■躾ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）　）から抽出さ れ、そしてシンコナ（Ｃｔｎｃｈｏｎａ）アルカロイド、例えばキニン（ｑｕｉ ｎｉｎｅ）及び関連するキノリンアルカロイドはシンコナ・サクシルブラ（Ｃｉ ｎｃｈｏｎａ　５ｕｃｃｉｒｕｂｒａ）及び類縁種に由来する。明らかな通り、 二次代謝産物がそれに由来する植物は該代謝産物を遺伝的に発現することができ なければならず、そして該代謝産物の合成に携わるために特定の代謝刺激物質に 対して感受性でなければならない。

現在、二次代謝産物は本来の植物から抽出される。しかしながら、しばしば、目 的とする代謝産物は通常低い濃度で存在し、このことが化学的抽出工程を退屈で 且つ冗長なものとしており、これがこれらの化合物の幾つかの比較的高いコスト に反映している。例えば、インドールアルカロイド類は典型的には乾燥したカサ ランサス・ロゼウス植物中に存在し、該アルカロイド類はこれらの植物から通常 約０．０００３％（乾燥重量基準）の濃度で誘導される。ビンクリスチン及び／ 又はビンブラスチンをこれらの植物から抽出するコストは、これらの化合物の販 売価格を約ｓ、ｏｏｏドル／ｇに上昇せしめ（１９８３）、キニン及びコディン はそれぞれ約１００ドル／及び６５０ドル／ｋｇと評価される。

アルカロイドを抽出する方法の効率を改良する方法が考案されているが、植物組 織培養の出現が有用な代替技法を提供した。植物Ｍｉ織培養（ｐｔｃ）法を使用 することによって、二次代謝産物を生産する植物細胞の能力を操作し、そしてそ れ由に本来の植物収穫物に基礎を置く労働力を要する抽出工程を軽減することが できる。

植物Ｍｉ織培養は、培養物全体に栄養を循環せしめる必要性と植物細胞の壊れや すさとの間の均衡を達成するレベルの撹拌を用い、栄養培地中に浮遊した植物細 胞の集団の増殖を伴う。しかしながら、すべての植物がこの手法に対して従順な わけではな（、そしてまた培地条件もこの方法の成功における重要な因子である 。ｐｔｃ技法の利点は、明確にされた環境、栄養条件等の増殖条件に対して制御 を実施することができる点にある。さらに、培養液内に刺激物質を循環させるこ とができることにより、刺激物質をカルスに適用することにより最も外側の細胞 のみが効果を受けるのに比べて、刺激物質がより多数の個々の細胞又は細胞塊に 接触することができる。

ｐｔｃを用いて、所望の二次代謝産物を生産するように幾つかの植物種を誘導す る可能性が研究されている０例えば、＠Ｐｈｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　”　Ｖ ｏｌ、２０．　Ｎｌ１８　、　ｐｐ１８４１−１８４３（１９８１）　。

Ｌｅｅ等は、ある種のインドールアルカロイドを生産するＣ。

ロゼウス培養物の能力に対する２−ジエチルアミノエチル−２，４−ジクロロフ ェニルエーテルを包含する特定のアミンの効果を開示している。アジマリシン及 びカサランチンの生産の増加が注目された。しかしながら、アルカロイド誘２１ 剤として使用される５種類の非常に関連する化学物質の内、３種類のみが有意な 有用性を示したことに注目するのが有意義である。これらの密接な構造の類似性 にもかかわらず、５種類の誘導剤の内２種類は実質的に無視できる結果を示した 。

さらに、上記のアミンは５　ｐｐｍ以下の濃度では良好な結果を示したが、より 高い濃度は増殖狙害を生じさせ、そしてアルカロイドの合成を減少せしめた。

Ｐｌａｎｔａ　Ｍｅｄｉｃａ（１９８４）において、Ｅｉｌｅｒｔ等はルタ・グ ラベォレンス（Ｒｕｔａ　肛肥ｅｏｌｅ旦）の浮遊培養からの、抗微生物アルカ ロイドであるルタクリドンエボキシド（ｒｕｔａｃｒｉｄｏｎｅｅｐｏｘｉｄｅ ）及びヒドロキシルククリドンエボキシド（ｈｙｄｒｏｘｙ−ｒｕｔａｃｒｉｄ ｏｎｅ　ｅｐｏｘｉｄｅ）の生産を誘導する試みを開示している。

生きている遊離の又は固定化された酵母の、あるいは死んだロドトルラ・ルブラ （勤皇■ｔｏｒｕｌａ　ｒｕｂｒａ）の細胞又はその粗細砲撃画分の懸濁液の添 加により、これらは注目の抗微生物化合物の生産の増加を示す。キトサン及びア ルギン酸は他の系においては誘導剤として有用であることが証明されているが、 いずれも目的とする応答を誘導することができなかったという結果が注目される 。

Ｐｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ　２６　：　１１０１−１１１０ （１９８５）において、ハフトリ及びオークは、特にバナジン酸ナトリウム（Ｎ ａ：＋ＶＯａ）の存在下でレフトビーン（Ｒｅｄ　Ｂｅａｎ）　（ビンガ・アン グラリス（狙且註　ｕｐ山圧堕）〕の浮遊培養物を増殖せしめる実験の結果を開 示している。彼らは、バナジン酸化合物がイソフラボングルコシド（ｉｓｏｆｌ ａｖｏｎｅ　ｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）　、ジアドゼインジグルコシド（ｄｉａｄｚ ｅｉｎ　ｄｉｇｌｕｃｏｓｉｄｅ）の生産を増強するこができることを示す結果 を示している。しかしながら、他の化合物は目的の結果を生じさせることができ ず、そしてなお他のものは二次代謝産物の生産に抑制効果を示した。

従って、種々の植物種と組み合わせて多数の誘導剤が研究されているが、これら の結果は、現在のところ活性のいずれのパターンも予想することができないとい う結論を示している。このことは、限定的ではないが、Ｃ，ロゼウスがインドー ルアルカロイドを生産する様に誘導される系において特に明らかである。

光皿夏皿玉 この発明の１つの目的は適当な植物細胞による二次代謝産物の生産を誘導するこ とができる物質を同定することである。

この発明の他の目的は植物の細胞による二次代謝産物の生産を増強することがで きる方法を提供することである。

この発明の他の目的は、植物細胞からの二次代謝産物の生産を誘導し、そして次 に回収する方法を提供することである。

培養懸濁物に添加された場合に培養された植物細胞中での二次代謝産物の合成を 誘導するのに十分な浸透圧をもたらす化合物はこの発明の範囲内である。種々の 浸透圧により惹起されるストレスは合成の増加に寄与すると信じられる。

浸透圧ストレスを生じさせるために植物細胞懸濁物に添加される化合物は非常に 広範囲の化合物から選択され得る。一般に、これらの化合物はイオン性ストレス 誘導化合物及び有機ストレス誘導化合物として分類される。いずれの場合にも、 浮遊液へのこれらの添加の最終結果は細胞と周囲培地との間の浸透圧ストレスの 発生である。

イオン性ストレス誘導剤は好ましくは溶液中でイオン化することができるハロゲ ン塩である。さらに好ましくはこれらの塩は周期律表におけるＩ族又は■族のハ ロゲン塩である。

有機ストレス誘導剤には糖アルコール及び糖酸が包含され、これにはガラクチノ ール、キシリトール、グリセロール、マンニトール及びイノシトール並びにその 種々の誘導体が包含され、これにはホスファチジルイノシトール、フィチン酸及 びそのエステル、シリトール（ｓｃｙｌ　１４　ｔｏｌ）、フィトール、アルド ン酸、アルダル酸（ａｌｄａｒｉｃ　ａｃｉｄ）　、ウロン酸、そして特にソル ビトールが含まれる。ソルビトールは特に、二次代謝産物の有意な収量を誘導し 、そしてそれ故に好ましい。

また、浸透圧ストレスによってではない手段によって二次代謝産物を誘導するた めに作用する化合物もこの発明の範囲内にある。この発明のこの観点は、種々の 植物生長調節化合物及び化学構造において又は生化学的機能において関連する化 合物の任意の１つ又は組み合わせが補充された浮′ｔ１液中で植物細胞を培養す ることを含んで成る。アブシジン酸（ａｂｓｃｉ−ｓｓｉｅ　ａｃｉｄ　；　Ａ ＢＡ）が特に有用であるが、使用され得る他の関連化合物には抗−ジベレリン化 合物、例えば２′−イソプロピル−４’−（）リスチルアンモニウムクロリド） −５’−メチルフェニルピペリジンカルボキシレート、β−クロロエチルトリメ チルアンモニウムクロリド及びトリブチル−２゜４−ジクロロベンジルホスホニ ウムクロリドが含まれる。この発明において有用な他のＡＢＡ−関連化合物には Ｎ−（ジメチルアミノ）桂皮酸、４′−ジヒドロバセイン酸（４′−ｄｉｈｙｄ ｒｏｐｈａｓｅｉｃ　ａｃｉｄ）、パセイン酸（ｐｈａｓｅｉｃ　ａｃｉｄ）及 びルヌラリン酸（ｌｕｎｕｌａｒｉｃ　ａｃｉｄ）が含まれる。

従って、この発明の１つの観点から、植物細胞に浸透圧的にストレスを与えるこ とを含んで成る、植物細胞による二次代謝産物の合成を誘導する方法が提供され る。

この発明の他の観点は、植物生長調節化合物又は関連するその様な化合物の存在 下で前記の細胞を増殖せしめることを含んで成る、植物細胞による二次代謝産物 の生産を誘導する方法を構成する。好ましくは、植物細胞は調節剤が補充された 浮遊液中で培養される。

この発明に従う条件下で植物細胞を培養した後、生化学抽出分野において今日確 立されている化学的手順を用いて、目的とする−又は複数の代謝産物を回収する ことができる。

幾つかの代謝産物は植物細胞により増殖培地に分泌されるので、これらの代謝産 物は、遠心分離及び濾過のごとき常用技術を用いて細胞を濃縮することにより細 胞自体から簡単に分離することができる０次に、代謝産物を含有する液は、透析 のごとき技法により代謝産物をさらに濃縮するために処理することができ、ある いは標準的化学的抽出技法を直接使用した後に作用することができる。目的とす る代謝産物が植物細胞によって発現されるがしかしそれから分泌されない場合、 例えば大気圧又は浸透圧の上昇した圧力を用いて植物細胞を破壊し、又は破砕す る０次に、代謝産物を適当な溶剤中に抽出することができ、そして目的の二次代 謝産物の化学的抽出に先立って上に記載した手順を用いて幾分濃縮することがで きる。使用されるべき特定の化学的抽出手順は回収されるべき代謝産物の化学的 性質に依存するであろう。但し、−ｇにこの様な手順は溶剤、ｐＨ等の逐次的変 化を含み、そして当業者によりよく知られている。

従って、この発明の第二の観点は、この発明の誘導方法により生産された化合物 を回収することを含んで成る、植物細胞由来二次代謝産物を提供する方法を構成 する。

この発明の方法及び誘導剤を用いて植物細胞培養系中で生産される二次代謝産物 の内、セコロガニン（ｓｅｃｏｌｏｇａｎｉｎ）及びトリプトファン−由来スト リクトシジン（ｓｔｒｉｃｔｏｓｉｄｉｎｅ）、アジマリシン、ヨヒンビン（ｙ ｏｈｉｍｂｉｎｅ）　、タベルソニン（ｔａｂｅｒｓｏｎｉｎｅ）　、ビンドリ ン（ｖｉｎｄｏｌｉｎｅ）及びカサランチン並びにトリプタミンを包含するカサ ランシス・ロゼウスから得られるインドールアルカロイド；パパベール・ソムニ フエルム（ｂ１代肛ｓｏｍｎｉｆｅｒｕｍ）からのチロシン−由来モルフイン及 びコディン；パセリの細胞培養からのクマリンのごときフェニルアラニン−由来 化学物質；並びにジギタリス・ブルブレア（旦ｔｌ住堕匹圧肛並）又はり、ラナ タ（Ｄ。

１ａｎａｔａ）からのサポニンのごときメバロン酸−由来化学物質、例えばジギ タリス、が挙げられる。

この列挙は排他的なものとして揚出されるのではない。他の二次代謝産物の生産 が、それらが生来的である植物細胞中で誘導され得るようである。この発明は好 ましい観点においてＣ，ロゼウス由来のインドールアルカロイドであるカサラン チン、アジマリシン、タベルソニン及びビンドリンに関する。

この発明において使用される誘導物質アブシジン酸は次の構造式を有する： アブシジン酸は脱離促進（ａｂｓｃｉｓｓｉｏｎ−ａｃｃｅｌｅｒａｔｉｎｇ） 植物ホルモン、すなわち植物部分の分離、例えば秋期における茎からの葉の分離 、を促進するホルモンである。これは、その化学名称が５−（１−ヒドロキシ− ２，６，６−）リメチル＝４−オキソー２−シクロヘキセン−１−イル）−３− メチル−２，４−ペンタジェン酸であるドルミン（ｄｏｒ＋＋ｉｎ）としても知 られている商業的に入手可能な商品である。この薬剤の合成形及び種々のシス− トランス異性体もまた商業的に入手可能であり、そしてこの発明において使用さ れ得る。

前記のごとく、植物細胞の培養技法は知られており、そして好ましくはこの発明 において使用される。従って、常用の方法が使用され、この方法においては生き ている植物材料、例えば葉材料、茎材料、又は分裂組織が汚染防止のために表面 殺菌され、そして個々の細胞又は細胞群の小さい塊が、それらが適当な液体栄養 に移されるまで、増殖プレート中の寒天栄養基上で培養される。懸濁液が培養フ ラスコ中で連続的に撹拌されそして最後にバイオリアクターに移される。撹拌は “エアーリフト”法により適切に達成され、この方法においては培養物が上昇す る気泡の穏和な作用により混合される。

誘導剤を培地に添加するため、所望により誘導物質の溶液を適切にあらかじめ調 製し、増殖維持培地中の該物質の均一性を増強する０例えば、添加に先立ってこ の発明のすべての物質を水と混合することができる。アスコルビン酸は水、及び ＫＯＨのごとき塩基数滴と混合して必要であれば溶解を助けることができる。

痕跡量又は低レベルの目的二次代謝産物はこの発明の誘導剤の不存在下で培養さ れた植物細胞により一般に生成されるであろうが、低い収量はすでに知られてい る方法と比較して改良された抽出収量を可能にしない。さらに、誘導剤の不存在 下では、これらの代謝産物の生産のために必要とされる時間は比較的長く、３０ 日まで、又は４５日でさえある。これに対して、この発明の誘導剤の存在下での 植物細胞の培養は生産される二次代謝産物の量を増加せしめ、そしてその特定量 を得るために必要とされる時間を有意に短縮することができる。

Ｂｆ　するための最　のノ蛯 培養細胞が由来するＣ、ロゼウス系は、自明のことではあるが、植物組織培養を しなければならない。この様な系を得ることは当業者間でよ（知られており、そ して幾つかのこの様な系が現在存在すると信じられる。このことは、その細胞培 養環境内で耐えそして機能する能力を有する植物を提供する必要性を減するもの ではない。この能力を付与する特徴は当業界においてよく定義されていない。植 物組織培養が可能な細胞の存在はほとんど試行錯誤法によってのみ確認される。

従って、以後、この発明を例示するために本発明者により与えられた名称を有す る特定のセルラインが使用されるが、この発明の範囲はこれらの特定の植物系に 限定されるものではないことを認識すべきである。現在存在するか、又は容易に 創製されそして試験され得るタイプの他の系が、この明細書において報告するの と同一の一般的効率をもって機能するであろう。この発明における好ましいＣ， ロゼウス系はＪＷ？ｌ”　。

ＪＯＨ及びＬＢＨ−１命名される。系ＪＷＭ”及びＪＯＨはＰｌａｎｔＢｉｏｔ ｅｃｈｎｏｌｏｇｙ　Ｉｎ５ｔｊｔｕｔｅ、　５ａｓｋａｔｏｏｎ、　Ｓａｓｋ ｅｔｃｈｅｗａｎ、カナダにおいて開発された。系ＬＢＨ−１はＡ１１ｅｌｉｘ 　Ｉｎｃ、＋Ｍｉｓｓｉｓｓａｕｇａ、　０ｎｔａｒｉｏ、カナダにおいて開発 された。すべての系はもともとＣ，ロゼウス（Ｃ，ｒｏｓｅｕｓ）の朽から単離 されたものである。

Ｃ，ロゼウスは、すべての必要な代謝産物を含有する任意の液体培地中で培養す ることができ、その例にはＳＨ培地、ＬＳ培地及びＭＳ培地が含まれ、このすべ てが当業界において知られている。ＬＳ培地（Ｌｉｎｓ＋ｍａｉｒ及びＳｋｏｏ ｇ）はＰｈｙｓ。

Ｐｌａｎｔａｒｕｍ　（１Ｂ）　１９６４　ｐｐ、１００−１２７に、その成分 により記載されている。この発明において使用するために好ましいＳＨ培地（Ｓ ｈｅｎｃｋ−Ｈｉｌｄｅｒｂｒａｎｄｔ）の成分はＣａｎ、Ｊ、Ｂｏｔ、５０　 ：　１９５−２０４　（１９７２）に記載されている。この発明において好まし い培地であるＭＳ培地（Ｍｕｒａｓｈｉｇｅ及びＳｋｏｏｇ）の成分は当業者に よく知られている。この培地にシュークロース又はラクトースのごとき炭素源が 添加される。３％又は４％のシュークロースの添加が好ましいが、類似の濃度の ラクトースを使用することもできる。ＳＨ培地に添加される唯一の増殖調節剤は ２■／ｌの濃度のα−ナフタレン酢酸である。この培地はまた、細胞分裂におい て機能する合成サイトカイニンであるカイネチン（６−フルフリルアミノプリン ）を含有するのが適当である。

植物細胞は、選択された誘導剤調製物の誘導効果に対してそれらが一層感受性で あると予想される直線増殖期又は初期定常増殖期に集団が達するまで、ストレス を減少しそして光により誘導される二次代謝経路（例えば色素の形成）から栄養 をチャンネリング（ｃｈａｎｎｅ））させるために暗所で、あるいは好ましくは 光の中で増殖せしめる。すなわち、Ｃ，ロゼウス細胞懸濁液を、誘導剤の不存在 下で好ましくは３〜１ｏ日間、さらに好ましくは４〜６日間、試験された条件下 で増殖せしめる。交互する増殖条件が用いられる場合、直線増殖期又は初期定常 期の開始を特定するために細胞集団をモニターすることができる。さらに、誘導 は後期対数期及び他の増殖期における添加によって増強され得るから、誘導剤を 添加する前に直線期又は初期定常期に達することは絶対的に必須ではないことが 理解されよう。アルカロイドの収量を最大にするためにはできるだけ大きな細胞 集団を維持するのが望ましい。

Ｃ，ロゼウスの浮遊液が所望の増殖期に達した後、培養液中の所望の濃度を達成 するのに十分な量で誘導物質を導入する。

この発明において好ましい誘導物質は、イオン性浸透圧ストレス誘導剤としての ＮａＣ１，ＫＣｌ及びＦｅＣＡ’３；有機浸透圧ストレス誘導剤としてのソルビ トール、及び植物生長調節誘導剤としてのアブシジン酸（ＡＢＡ）である。

使用のために選択された場合、ＮａＣ１又はＫＣｌの最終培地濃度は最低の望ま しいレベルとして約０．１　Ｍが適当である。

より低いレベルは誘導目的に役立つことができるが、より高い濃度により得られ る短縮された時間内に増強された収量をもたらさないようである。ＮａＣｌ又は ＫＣｌの許容される上方濃度レベルは、その存在が培養された細胞内で生じさせ る浸透圧により指定される。すなわち言い換えれば、高い濃度で短い時間処理し ても高収量は得られない。従って、上限は原形質分離を生じさせる濃度よりわず かに低いものである。さらに好ましくは、ＮａＣ１及びＫＣ＃ハ、０．ＯＩＭ〜 １゜ＯＭ、そして理想的には約０．５Ｍの培地濃度を達成するように添加される 。

塩化第二鉄は、１０〜５００ｐｐＩｌ、より好ましくは２０〜２００ｐｐｍ。

そして理想的には約５０ｐｐｍの最終濃度を達成するように浮遊培地に添加する のが適当である。

ソルビトールの培地濃度は、ＮａＣｌ又はＫｃｌの添加に関して検討したように 、約０．０５Ｍから原形質分離が生ずる濃度よりわずかに低い最高濃度までであ る。好ましい培地濃度は０、１　Ｍ〜０．５Ｍの範囲であり、そして理想的には 約０．２　Ｍである。

後記の実験条件下で、アブシジン酸の理想的な濃度ば懸濁液６０−当り０．１■ 〜０゜５■の範囲である。誘導応答は不都合に低いが、０．０１■という低い濃 度を使用することができる。

０．５■／６０−において見られる効果の増強はほとんどないようであるが、０ ．５■／６０ｍより高い濃度を使用することもできる。

いずれかの誘導剤の添加の後、Ｃ，ロゼウスの細胞を一定時間培養して、誘導剤 が細胞と接しそしてインドールアルカロイドの生産を刺激するようにする。２〜 ５日間の期間が好ましい。但し、特に条件がこの明細書に記載する通りでない場 合、この好ましい期間の変更が許容される。培養物の増殖は好ましくは暗所で又 は光の中で続けられる。

培養期間の後、細胞を回収し、そして常用の技法を用いてアルカロイドを抽出す る。特定の技法は、回収されるべき特定の物質に依存するが、すべては当業界に おいて標準的なものである。

次に、例に言及しながら発明の具体的な態様を開示する。

これらの例において、６０−の細胞懸濁培養物を、３　ｗ　／　ｖ％シュークロ ース、２■／ｌのα−ナフタレン酸及び０．１■のカイネチンを含有する基本Ｍ Ｓ増殖培地に維持する。培養物を、照射されたロータリーシェーカー（１２０ｒ ｐｍ）上の２５０−エルレンマイヤーフラスコに維持し、そして１：５稀釈によ り１週間ごとに継代培養する。

アブシジン酸及びＤ−ソルビトールはシグマ社から入手し、そしてＮａＣＡ、Ｋ Ｃｆｆ及びＦｅＣβ３はフィッシャー・サイエンティフィック社から得た。

すべての誘導剤は蒸留水に溶解したストック溶液として調製し、その濃度は、ｌ ａｔ’のストック溶液を細胞懸濁培養物に添加した場合に所望の最終濃度が得ら れるようにした。

特にことわらない限り、各誘導剤は細胞懸濁液に、増殖サイクルの５日間に無菌 濾過溶液として添加し、そして細胞を３日後に回収した。細胞からインドールア ルカロイドを抽出するために標準的抽出法を使用した。カサランチン及びアジマ リシンの収量はＨＰＬＣ分析により定量した。他のアルカロイドの存在は、ＴＬ Ｃ分離の後に硫酸セリウムアンモニウムにより可視化することにより定性的に決 定した。

肛　ＡＢＡによる球１ ９９％純度の合成アブシジン酸を０．１〜２．０■／６〇−培養物の濃度範囲で 導入した。得られた結果を第１表〜第４表に示す。第１表は、細胞系ＪＯＨに適 用する場合に誘導過程に対してＡＢＡのタイプ及び濃度が有する効果を示す。９ ９％純度の（±）シス−トランス合成異性体が卓越した結果を示したが、ＡＢＡ のすべての形が好ましい誘導性を示した。

男」二表 異る等級／タイプのＡＢＡの効果 対照　１７．４　１．８ 第２表は系ＪＷＭ”に対する誘導応答へのＡ　Ｂ　Ａ　？１度の効果を示す。０ ．５■／６０−の培養物において最大応答が起こり、ン農度の増加に伴う変化は わずかであることが注目されよ」じし表 ０、１　５．８　２．６ ２、　Ｏ６，７８，０ 対照　４．２　１．６ 下記の第３表において、細胞片とＡＢＡへの暴露との関係を示す。３日以上の培 養増殖が最良の結果をもたらし、アジマリシンの濃度はその後低下することが注 目されよう。しかしながら、カサランチンの収量は培養増殖の６日目においても 上昇し続ける。第３表の結果は細胞系ＪＯＢ及び４日の誘導期間によるものであ る。

男バＬ表 ４　１７．５　２７．３　２８．２ 対照　２１．８　１３．５　６．２ ６２３゜０　３０．１　９．２ 対照　２２．７　１４．２　− 下記の第４表は１■のＡＢＡによる誘導に対する種々のセルラインの応答を示す 。各セルラインはＡ１１ｅｌｉｘ　Ｉｎｃ、又はＰｌａｎｔ　Ｂｉｏｌｏｇｙ　 Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　（Ｓａｓｋａｔｏｏｎ）（前記）から入手することができ る。すべてがＣ，ロゼウスに由来する。これらの結果から、系ＪＯＨ及びＬＢＨ −１が好ましいようである。

課しし表 おそらくまだラグ誘導期にあると思われるわずか１日の増殖後においてさえ、植 物細胞はＡＢＡへの暴露に対してアルカロイド生産の増加によって正に応答する ことが観察された。

しかしながら、アルカロイドの蓄積はある程度バイオマスに関連するので、バイ オマスのある程度の増加の後に細胞を誘導するのが好ましい。

１、ＮａＣｌにとｉ誘導 塩化ナトリウム濃度の範囲（０，１〜１．０ｇ／６０ａｆｆフラスコ）を下記の 第５表の系ＪＯＨにおけるアルカロイドの蓄積に対するそれらの効果について試 験した。高濃度のＮａＣｌはバイオマスを減少せしめ、従ってアルカロイドの収 量を減少せしめ、他方バイオマスに対する一層低い濃度の効果はカサランチン生 産の促進により相殺される。

第上表 １．０　５．１　３．４　１．３ ０．５　１２．５　７．１　５．６ ０．２　１６．４　１６．６　８．４ ０．１　１８．２　２１．６　７．２ 対照　２１．８　５．４　６．２ 系ＪＯＨの細胞に０．１又は０．２ｇのＫＣｌを添加した。アルカロイドの収量 に対する効果を第６表に示す。

０．２　２４．１　４２．３　１．８ ０．１　２４．３　８．６　０．９ 対照　２０．８　３．１　０．３ アルカロイドの蓄積に対する３■／ｌのＦｅＣｌ　、の効果を第７表に示す。系 ＪＯＨを使用した。

３■／６０Ｔ１１１培養物　１５．３　２８．０　？、９対照　２３．６　１７ ．４　１．８ ソルビト一ル濃度の範囲を、アルカロイドの蓄積に対するそれらの効果について 試験した（最終濃度０．１〜０．５　Ｍ　：１．１〜５．５ｇ／６０−培養物） 。系ＪＯＨに対するそれらの効果を下の第８表に示す。

０．５　１４．５　６．１　− ０、４　１４．６　１３．１　０．６ ０、３　１８．３　１４．９　１．７ ０、２　１５．４　２９．２　２．４ ０、１　１Ｂ、１　３０．７　０．６ 対照　２７．７　１８．９　− この発明に従って細胞培養物を誘導することにより得られる主たる利点は、アル カロイド（特にカサランチン）の収量がわずか８日間で、非誘導細胞であれば達 成するのに非常に長時間かかるであろうレベルに達することができ、時間及びコ ストの両方が節約されることである。

アルカロイドの生産をスケールアップするためにわずかな変更が必要とされるに 過ぎない。例えば、ＭＳ培地は、１■／ｌのα−ナフタレン酢酸及び０．１■／ １のカイネチンと共に、小スチールでは３％溶液が使用されるのに対して４％（ Ｗ／Ｖ）シュークロースにより好適に強化される。すべての細胞系及び化学物質 は同じままである。

開ｌ　よ　な憬　プロセス ＡＢＡを使用する３０Ｊパンチのため、好ましくは最終培養液中８．３３■／１ となるように溶液が調製される。ＩＩ！の蒸留水中に溶液を調製し、無菌濾過し 、そして無菌ビンから発酵槽に注入する。ＮａＣｌの溶液を１１の蒸留水中に調 製し、培養物中の最終濃度が３３．３３　ｇ　／　ｌとなるようにする。溶液を 無菌濾過し、そして無菌ビンから培養物に加える。

誘導は通常、培養期間の５〜７日目に行う。促進は通常２４時間以内に起こり、 そして７日まで続くことができる。

検出法は小規模研究のそれと同じである。

部己り表 ３０１実験　系ＪＯＨ−Ｃ，ロゼウス １ロゼウス１抱 １日　２１．４２ ２日　５３．２９ ５日　Ｂ９．８５０．１ ６日　１０９．２９　０．２０５ ７日　１２２．９８　７．５ ９日　２６０，２　１３．２２ １２日　３４０　２６．２５ 星土襄表 ３０１実験　ＪＯＢ（Ｍ） ＡＢＡを用いて７日目に誘導 ５日　０．２３　１２７ ６日　０．６２２　２０６．９ ７日　０．６４９　２３９．３ ８日　４４．２２　３２０．８３ ９日　８４．８６　３３３．５８ １０日　８５．２５　４０９．７５ １１日　４３．５３　４４２．２９ １２日　３Ｂ．５３　５５０．６１ 茅」二り表 １０１実験　系ＪＯＨ”−Ｃ，ｔ：Ｉガウス８日目の細胞１１を接種、ＡＢＡに より６日目に誘導０日　１８．６ ２日　２９．７１ ４日　６２．７４ ５日　１０５．８８ ６日　１９０．００ ８日　２５７．４５　６．３ １０日　２４９．８　４．６ １１日　２１？、　１　４．６ 国際調査報告 １１ｗｍ＋繰−−艶−ＰＣＴ／ＪＰ　８７１００５８３１＋ｍｍａｍｍ＋＾ｗｍ 拳＋１ｐＮ＊ＰＣＴ／ＪＰ８７１００５８３１１Ｔ、、＋６１　ｂａｈ＋、ｒｖ ｍ、ＰＣＬ’：？　８７１００５ａユ国際調査報告　ＪＰ　８７００５８３

Claims (19)

【特許請求の範囲】
1. １．細胞を浸透圧的にストレスすることを含んで成る、植物細胞による二次代謝 産物の合成を誘導する方法。
2. ２．前記細胞が懸濁培養され、そして前記浸透圧が該懸濁培養物に浸透圧ストレ ス量の化合物を添加することによって生ずる、請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．前記細胞がカサランサス・ロゼウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏｓｅｕ ｓ）の細胞である請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．前記化合物がイオン的に浸透圧ストレスを生じさせる化合物及び浸透圧スト レスを生じさせる有機化合物から選択される、請求の範囲第３項に記載の方法。
5. ５．前記化合物がハロゲン塩である、請求の範囲第３項に記載の方法。
6. ６．前記化合物が第Ｉ族又は第ＩＩ族元素のハロゲン塩である請求の範囲第５項 に記載の方法。
7. ７．前記化合物がＫＣｌ，ＮａＣｌ及びＦｅＣｌ３から選択される、請求の範囲 第５項に記載の方法。
8. ８．前記化合物が糖酸又は糖アルコールである、請求の範囲第３項に記載の方法 。
9. ９．前記化合物がマンニトール、キシリトール及びソルビトールから選択される 、請求の範囲第８項に記載の方法。
10. １０．前記化学物質がソルビトールである請求の範囲第３項に記載の方法。
11. １１．植物生長調節物質の存在下で細胞を増殖せしめることを含んで成る、植物 細胞による二次代謝産物の合成を誘導する方法。
12. １２．前記植物細胞を前記植物生長調節物質が補充された懸濁培養物中で増殖せ しめる、請求の範囲第１１項に記載の方法。
13. １３．前記植物生長調節物質が抗−ジベレリン化合物及びアブシジン酸から選択 される、請求の範囲第１２項に記載の方法。
14. １４．前記植物生長調節物質がアブシジン酸である、請求の範囲第１２項に記載 の方法。
15. １５．前記植物細胞がカサランサス・ロゼウス（Ｃａｔｈａｒａｎｔｈｕｓｒｏ ｓｅｕｓ）の細胞である、請求の範囲第１２項に記載の方法。
16. １６．前記植物細胞からインドールアルカロイドを抽出する段階をさらに含んで 成る、請求の範囲第３項に記載の方法。
17. １７．前記アルカロイドがカサランチン及びアジマリシンである請求の範囲第１ ６項に記載の方法。
18. １８．前記植物細胞からインドールアルカロイドを抽出する段階をさらに含んで 成る請求の範囲第１５項に記載の方法。
19. １９．前記抽出されたアルカロイドがカサランチン及びアジマリシンである、請 求の範囲第１８項に記載の方法。