JPH05336985A - タキサン類化合物の製造方法 - Google Patents
タキサン類化合物の製造方法Info
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- JPH05336985A JPH05336985A JP4177405A JP17740592A JPH05336985A JP H05336985 A JPH05336985 A JP H05336985A JP 4177405 A JP4177405 A JP 4177405A JP 17740592 A JP17740592 A JP 17740592A JP H05336985 A JPH05336985 A JP H05336985A
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- Japan
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- culture
- compound
- taxanes
- taxus
- carboxylic acid
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
- C12P17/02—Oxygen as only ring hetero atoms
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- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】
【目的】 抗腫瘍活性を有するタキサン類化合物の生産
性を著しく向上させたタキサン類化合物の製造方法を提
供する。 【構成】 タクサス属植物（Taxus sp.)に起源を有する
細胞を芳香族カルボン酸または芳香族アミノ酸を添加し
た培地で培養し、この培養物からタキサン類化合物を回
収する。
性を著しく向上させたタキサン類化合物の製造方法を提
供する。 【構成】 タクサス属植物（Taxus sp.)に起源を有する
細胞を芳香族カルボン酸または芳香族アミノ酸を添加し
た培地で培養し、この培養物からタキサン類化合物を回
収する。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、タクサス属植物に起源
を有する培養細胞を培養し、この培養物からタキサン骨
格を有する植物成分を生産し、回収することからなるタ
キサン類化合物の製造方法に関する。さらに詳しくは、
本発明は、タクサス属植物起源の細胞の培養物であるカ
ルスまたは液体培養細胞から高収率でタキサン類化合物
を生産し、回収する方法に関する。
を有する培養細胞を培養し、この培養物からタキサン骨
格を有する植物成分を生産し、回収することからなるタ
キサン類化合物の製造方法に関する。さらに詳しくは、
本発明は、タクサス属植物起源の細胞の培養物であるカ
ルスまたは液体培養細胞から高収率でタキサン類化合物
を生産し、回収する方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】従来、タクサス属植物 (Taxus sp.)植物
体中に、タキソールおよびその各種誘導体が存在するこ
とが知られていた。また、これらのタキソール化合物類
がメラノーマＢ１６を含む種々のセルラインにおいて高
い抗腫瘍活性を示すことが知られており、タキソール化
合物類の抗腫瘍成分としての有効性についての各種の臨
床試験の結果が報告されている。
体中に、タキソールおよびその各種誘導体が存在するこ
とが知られていた。また、これらのタキソール化合物類
がメラノーマＢ１６を含む種々のセルラインにおいて高
い抗腫瘍活性を示すことが知られており、タキソール化
合物類の抗腫瘍成分としての有効性についての各種の臨
床試験の結果が報告されている。
【０００３】これらのタキソール化合物類を用いた薬理
試験および商業規模での化学療法には大量のタキソール
化合物類が必要とされるが、天然起源のタキソール化合
物類を大量に生産することはこれまで行われていない。
タキソール化合物類は、複雑な構造の化合物であり、化
学合成による生産もこれまで行われていない。従って、
タキソールの各種誘導体の調製も、その出発材料は天然
起源のものが用いられている。
試験および商業規模での化学療法には大量のタキソール
化合物類が必要とされるが、天然起源のタキソール化合
物類を大量に生産することはこれまで行われていない。
タキソール化合物類は、複雑な構造の化合物であり、化
学合成による生産もこれまで行われていない。従って、
タキソールの各種誘導体の調製も、その出発材料は天然
起源のものが用いられている。
【０００４】しかしながら、タキソールおよびその各種
誘導体を含有するタクサス属植物は、特殊な植物であ
り、成長が遅く、人工的な栽培も行われていない状況に
ある。また、タキソール化合物類の生産には大量のタク
サス属植物のバルクが必要とされるだけでなくバルクか
らタキソール化合物類を分離、回収するのに複雑な工程
が必要とされ、また、回収された生産物が変異し易いな
どの問題点があった。
誘導体を含有するタクサス属植物は、特殊な植物であ
り、成長が遅く、人工的な栽培も行われていない状況に
ある。また、タキソール化合物類の生産には大量のタク
サス属植物のバルクが必要とされるだけでなくバルクか
らタキソール化合物類を分離、回収するのに複雑な工程
が必要とされ、また、回収された生産物が変異し易いな
どの問題点があった。
【０００５】また、最近になって、タクサス属植物の生
組織を特定の培地で培養することによりタキサン骨格を
含むアルカロイド化合物を生産させ、これを分離、回収
することも研究されている。これは、タクサス属植物の
生組織を用いて組織培養法によりタキサン骨格を含むア
ルカロイド化合物を生産する点で従来の天然バルク抽出
法に比較して新しい生産技術であると言える。
組織を特定の培地で培養することによりタキサン骨格を
含むアルカロイド化合物を生産させ、これを分離、回収
することも研究されている。これは、タクサス属植物の
生組織を用いて組織培養法によりタキサン骨格を含むア
ルカロイド化合物を生産する点で従来の天然バルク抽出
法に比較して新しい生産技術であると言える。
【０００６】しかしながら、従来報告されているもの
は、アルカロイド化合物の生産性が充分なものではな
く、薬剤試験および化学療法など薬剤成分が大量に必要
とされる応用、利用研究およびその実用化のためには目
的化合物の生産性が低い点で全く不充分なものであり、
これらタキサン骨格を含むアルカロイド化合物を高い生
産性をもって生産することが可能な新しい生産技術を開
発することが強く要請されている状況にあった。
は、アルカロイド化合物の生産性が充分なものではな
く、薬剤試験および化学療法など薬剤成分が大量に必要
とされる応用、利用研究およびその実用化のためには目
的化合物の生産性が低い点で全く不充分なものであり、
これらタキサン骨格を含むアルカロイド化合物を高い生
産性をもって生産することが可能な新しい生産技術を開
発することが強く要請されている状況にあった。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】このような状況に鑑み
て、本発明者らは、抗腫瘍成分として有用性の高いタキ
ソール類およびバッカテイン類などのタキサン類化合物
を高い生産性をもって生産することが可能な新しい生産
技術を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた
結果、タクサス属植物に起源を有する細胞を特定の成分
を添加した培地を用いて培養することにより、従来のタ
クサス属植物の組織培養法に比較してタキサン類化合物
の生産性が著しく向上することを見い出し、本発明を完
成するに至った。
て、本発明者らは、抗腫瘍成分として有用性の高いタキ
ソール類およびバッカテイン類などのタキサン類化合物
を高い生産性をもって生産することが可能な新しい生産
技術を開発することを目標として鋭意研究を積み重ねた
結果、タクサス属植物に起源を有する細胞を特定の成分
を添加した培地を用いて培養することにより、従来のタ
クサス属植物の組織培養法に比較してタキサン類化合物
の生産性が著しく向上することを見い出し、本発明を完
成するに至った。
【０００８】すなわち、本発明は、抗腫瘍活性を示すタ
キソール類およびバッカテイン類などのタキサン類化合
物をタクサス属植物の細胞培養法により著しく高い生産
性で生産することが可能なタキサン類化合物の新規製造
方法を提供することを目的とするものである。
キソール類およびバッカテイン類などのタキサン類化合
物をタクサス属植物の細胞培養法により著しく高い生産
性で生産することが可能なタキサン類化合物の新規製造
方法を提供することを目的とするものである。
【０００９】さらに、本発明は、タクサス属植物の細胞
を組織培養することにより、従来の組織培養法に比較し
て著しく生産性の向上したタキサン類化合物の新規製造
方法を提供することを目的とするものである。
を組織培養することにより、従来の組織培養法に比較し
て著しく生産性の向上したタキサン類化合物の新規製造
方法を提供することを目的とするものである。
【００１０】
【課題を解決するための手段】このような目的を達成す
るための本発明は、次のようなタキサン類化合物の製造
方法に関する。タクサス属植物 (Taxus sp.)に起源を有
する培養細胞を芳香族カルボン酸及び／または芳香族ア
ミノ酸を添加した培地で培養し、この培養物からタキサ
ン骨格を有する植物成分を回収することを特徴とするタ
キサン類化合物の製造方法。
るための本発明は、次のようなタキサン類化合物の製造
方法に関する。タクサス属植物 (Taxus sp.)に起源を有
する培養細胞を芳香族カルボン酸及び／または芳香族ア
ミノ酸を添加した培地で培養し、この培養物からタキサ
ン骨格を有する植物成分を回収することを特徴とするタ
キサン類化合物の製造方法。
【００１１】培養細胞の起源として用いるタクサス属植
物としては、タクサス ブレビホリア（Taxus brevifol
ia）、タクサス カナデンシス（T.canadensis) 、タク
サスx メジア cv.ヒクシー(T. ｘ media cv.hicksi
i)、タクサス クスピダータ (T. cuspidata) などが例
示される。タクサス属植物の培養細胞の誘導原料として
利用する植物の部位としては、根、葉、胚、幹、メリス
テムなど植物組織の適宜の細胞が対象となり、タクサス
属植物の生組織を含む切片の形で用いられる。切片の切
り出し部位としては、新芽、若い葉、成熟した種子の中
身、内部の胚、赤色の仮種皮、緑色の仮種皮などが用い
られる。
物としては、タクサス ブレビホリア（Taxus brevifol
ia）、タクサス カナデンシス（T.canadensis) 、タク
サスx メジア cv.ヒクシー(T. ｘ media cv.hicksi
i)、タクサス クスピダータ (T. cuspidata) などが例
示される。タクサス属植物の培養細胞の誘導原料として
利用する植物の部位としては、根、葉、胚、幹、メリス
テムなど植物組織の適宜の細胞が対象となり、タクサス
属植物の生組織を含む切片の形で用いられる。切片の切
り出し部位としては、新芽、若い葉、成熟した種子の中
身、内部の胚、赤色の仮種皮、緑色の仮種皮などが用い
られる。
【００１２】本発明においてはタクサス属植物の培養細
胞として植物切片から誘導して得られるカルス、カルス
を液体培地中で培養することにより得られる液体培養細
胞、カルスあるいは液体培養細胞を担体に固定化した固
定化細胞およびタクサス属植物から誘導される分化器官
を用いることができる。
胞として植物切片から誘導して得られるカルス、カルス
を液体培地中で培養することにより得られる液体培養細
胞、カルスあるいは液体培養細胞を担体に固定化した固
定化細胞およびタクサス属植物から誘導される分化器官
を用いることができる。
【００１３】カルスの誘導には上記植物切片を滅菌処理
し、これをカルス誘導成分を含有する寒天培地などの固
体培地で培養することにより行われる。切片の滅菌は、
エタノールによる表面滅菌、次亜鉛素酸水溶液による処
理および滅菌した蒸留イオン交換水による洗浄などによ
り行う。カルス誘導成分を含有する培地は、ガンボルグ
(Gamborg) B5、ムラシゲ−スクーグ(Murashige-Skoog)
、ニッチ・ニンチ(Nitch & Nitch) などのような無機
塩類およびビタミン類を含有する基礎培地に、炭素源と
してショ糖、グルコースなどの糖類；２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（2,4-D)、ナフタレン酢酸(NAA) 、イン
ドール酪酸、インドール酢酸などのオーキシン類化合
物、、ベンジルアデニン、カイネチン等のサイトカイニ
ン類などを始めとする植物ホルモン；褐変防止剤および
寒天、カラギーナンなどのゲル化剤を添加して構成す
る。一般に生成したフェノール類化合物が酸化して生じ
るキノン類が重合して着色物質になるため培養の過程で
褐変が生起するが、褐変防止剤を添加することにより培
養物の褐変が防止される。また、植物ホルモンの濃度も
カルスの誘導効率、褐変および増殖に影響する。植物ホ
ルモンの使用量は用いる培地、培養条件に応じて決定さ
れるが、例えば、オーキシンとサイトカイニンについて
は、０から４mg/Lのオーキシンと０から４mg/Lのサイト
カイニンを含有する培地を用いることが好ましい。通常
15℃乃至30℃の培養温度で、上記切片を固体培地に２週
間乃至８週間静置培養することによりカルスが誘導され
る。
し、これをカルス誘導成分を含有する寒天培地などの固
体培地で培養することにより行われる。切片の滅菌は、
エタノールによる表面滅菌、次亜鉛素酸水溶液による処
理および滅菌した蒸留イオン交換水による洗浄などによ
り行う。カルス誘導成分を含有する培地は、ガンボルグ
(Gamborg) B5、ムラシゲ−スクーグ(Murashige-Skoog)
、ニッチ・ニンチ(Nitch & Nitch) などのような無機
塩類およびビタミン類を含有する基礎培地に、炭素源と
してショ糖、グルコースなどの糖類；２，４−ジクロロ
フェノキシ酢酸（2,4-D)、ナフタレン酢酸(NAA) 、イン
ドール酪酸、インドール酢酸などのオーキシン類化合
物、、ベンジルアデニン、カイネチン等のサイトカイニ
ン類などを始めとする植物ホルモン；褐変防止剤および
寒天、カラギーナンなどのゲル化剤を添加して構成す
る。一般に生成したフェノール類化合物が酸化して生じ
るキノン類が重合して着色物質になるため培養の過程で
褐変が生起するが、褐変防止剤を添加することにより培
養物の褐変が防止される。また、植物ホルモンの濃度も
カルスの誘導効率、褐変および増殖に影響する。植物ホ
ルモンの使用量は用いる培地、培養条件に応じて決定さ
れるが、例えば、オーキシンとサイトカイニンについて
は、０から４mg/Lのオーキシンと０から４mg/Lのサイト
カイニンを含有する培地を用いることが好ましい。通常
15℃乃至30℃の培養温度で、上記切片を固体培地に２週
間乃至８週間静置培養することによりカルスが誘導され
る。
【００１４】このようにして誘導されたカルスを上記組
成の固体培地上でさらに培養し充分に増殖させる。また
このようにして得られるカルスを液体培地中で培養する
ことにより液体培養細胞が得られる。液体培地は上記の
培地からゲル化剤を除去した成分により調製する。液体
培養条件は通常15℃から30℃の条件で実施する。また主
として通気を目的として、フラスコ培養の場合には振盪
条件下で、またジャー型培養器では通気攪拌条件下で培
養する。さらに、水不溶性の担体に培養細胞を固定する
ことも可能である。また上記カルス誘導およびカルス増
殖の過程で分化器官が誘導されることがあるが、誘導さ
れた分化器官に関しても上記組成の固体培地または液体
培地に置床し上記の培養条件で充分に増殖させる。
成の固体培地上でさらに培養し充分に増殖させる。また
このようにして得られるカルスを液体培地中で培養する
ことにより液体培養細胞が得られる。液体培地は上記の
培地からゲル化剤を除去した成分により調製する。液体
培養条件は通常15℃から30℃の条件で実施する。また主
として通気を目的として、フラスコ培養の場合には振盪
条件下で、またジャー型培養器では通気攪拌条件下で培
養する。さらに、水不溶性の担体に培養細胞を固定する
ことも可能である。また上記カルス誘導およびカルス増
殖の過程で分化器官が誘導されることがあるが、誘導さ
れた分化器官に関しても上記組成の固体培地または液体
培地に置床し上記の培養条件で充分に増殖させる。
【００１５】本発明におけるタキサン類化合物の生産を
目的とする固体培養は、芳香属カルボン酸及び／または
芳香属アミノ酸を上記の培地に添加して得られる培地に
培養細胞を置床して行う。培養は暗所に培養物を静置
し、15℃から30℃前後で通常20日から 100日間実施す
る。このように固体培養した培養細胞からタキサン類化
合物を直接抽出し、精製してもよいが、この培養細胞を
芳香族カルボン酸及び／または芳香族アミノ酸を含有す
る液体培養用の培地に添加して液体培養を行い、培養細
胞および培養液上清中にタキサン類化合物を生産せし
め、これを抽出し精製することも可能である。さらに必
要に応じて、この液体培養物を別の液体培地あるいは固
体培地に再度移してタキサン類化合物を生産させること
も可能である。
目的とする固体培養は、芳香属カルボン酸及び／または
芳香属アミノ酸を上記の培地に添加して得られる培地に
培養細胞を置床して行う。培養は暗所に培養物を静置
し、15℃から30℃前後で通常20日から 100日間実施す
る。このように固体培養した培養細胞からタキサン類化
合物を直接抽出し、精製してもよいが、この培養細胞を
芳香族カルボン酸及び／または芳香族アミノ酸を含有す
る液体培養用の培地に添加して液体培養を行い、培養細
胞および培養液上清中にタキサン類化合物を生産せし
め、これを抽出し精製することも可能である。さらに必
要に応じて、この液体培養物を別の液体培地あるいは固
体培地に再度移してタキサン類化合物を生産させること
も可能である。
【００１６】本発明において固体培地および液体培地に
添加する芳香族アミノ酸類化合物とは、ベンゼン環等の
芳香族性官能基部分とアミノ基、イミド基などおよびこ
れらの塩からなる含窒素部分およびカルボン酸、カルボ
ン酸塩、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カル
ボン酸アミド、カルボン酸イミド、カルボン酸ハロゲン
化物などからなるカルボン酸部分を一分子内に有する化
合物である。例えば芳香族性官能基部分として、フェニ
ル基およびモノヒドロキシフェニル基を有するフェニル
アラニンやチロシンおよび２−アミノ−２−フェニルプ
ロピオン酸および２−アミノ−２−ヒドロキシフェニル
プロピオン酸などが例示できる。また本発明で用いられ
る芳香族カルボン酸とは、ベンゼン環等の芳香族性官能
基部分に直接カルボニル基部分が結合して形成されるカ
ルボン酸およびその誘導体である。芳香族性官能基部分
がベンゼン環の場合を例にとれば、安息香酸、安息香酸
塩、安息香酸エステル、安息香酸無水物、安息香酸アミ
ド、塩化ベンゾイルなどが例示できる。芳香族アミノ酸
および芳香族カルボン酸の双方において、カルボン酸塩
としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カ
ルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属で形成さ
れる塩でもよい。またこれらの化合物のなかに、不斉炭
素原子が存在し、光学活性体を形成することがある。本
発明では、ラセミ体であってもあるいはこのような光学
異性体であっても用いることができる。このような化合
物を培地中に添加することによりタキサン類化合物の生
産性を著しく向上することができる。このように、二次
代謝産物の生産性を向上させる上で前記化合物の培養物
への添加は、きわめて有効である。これらの化合物は培
地に対し、0.001mM から 100mM以下添加することが好ま
しい。添加量が 0.001mM以下だとタキサン類化合物の生
産性を向上することができず、添加量が 100mM以上だと
かえって培養細胞の増殖を阻害するので好ましくない。
またこれらの芳香族カルボン酸および／または芳香族ア
ミノ酸の添加方法は、培養細胞の培養初期から添加する
ことも可能であるし、また培養の途中から添加すること
も可能である。添加する際には、上記の芳香族カルボン
酸および／または芳香族アミノ酸を単独で添加すること
も可能であるし、適切な界面活性剤や溶剤に溶解した後
添加することもできる。本発明において前記芳香族カル
ボン酸及び／または芳香族アミノ酸、例えばフェニルア
ラニンを培地に0.01mM添加すると特にタキソールおよび
バッカテインIII の含量の増加が著しい。
添加する芳香族アミノ酸類化合物とは、ベンゼン環等の
芳香族性官能基部分とアミノ基、イミド基などおよびこ
れらの塩からなる含窒素部分およびカルボン酸、カルボ
ン酸塩、カルボン酸エステル、カルボン酸無水物、カル
ボン酸アミド、カルボン酸イミド、カルボン酸ハロゲン
化物などからなるカルボン酸部分を一分子内に有する化
合物である。例えば芳香族性官能基部分として、フェニ
ル基およびモノヒドロキシフェニル基を有するフェニル
アラニンやチロシンおよび２−アミノ−２−フェニルプ
ロピオン酸および２−アミノ−２−ヒドロキシフェニル
プロピオン酸などが例示できる。また本発明で用いられ
る芳香族カルボン酸とは、ベンゼン環等の芳香族性官能
基部分に直接カルボニル基部分が結合して形成されるカ
ルボン酸およびその誘導体である。芳香族性官能基部分
がベンゼン環の場合を例にとれば、安息香酸、安息香酸
塩、安息香酸エステル、安息香酸無水物、安息香酸アミ
ド、塩化ベンゾイルなどが例示できる。芳香族アミノ酸
および芳香族カルボン酸の双方において、カルボン酸塩
としては、ナトリウム、カリウム等のアルカリ金属、カ
ルシウム、マグネシウム等のアルカリ土類金属で形成さ
れる塩でもよい。またこれらの化合物のなかに、不斉炭
素原子が存在し、光学活性体を形成することがある。本
発明では、ラセミ体であってもあるいはこのような光学
異性体であっても用いることができる。このような化合
物を培地中に添加することによりタキサン類化合物の生
産性を著しく向上することができる。このように、二次
代謝産物の生産性を向上させる上で前記化合物の培養物
への添加は、きわめて有効である。これらの化合物は培
地に対し、0.001mM から 100mM以下添加することが好ま
しい。添加量が 0.001mM以下だとタキサン類化合物の生
産性を向上することができず、添加量が 100mM以上だと
かえって培養細胞の増殖を阻害するので好ましくない。
またこれらの芳香族カルボン酸および／または芳香族ア
ミノ酸の添加方法は、培養細胞の培養初期から添加する
ことも可能であるし、また培養の途中から添加すること
も可能である。添加する際には、上記の芳香族カルボン
酸および／または芳香族アミノ酸を単独で添加すること
も可能であるし、適切な界面活性剤や溶剤に溶解した後
添加することもできる。本発明において前記芳香族カル
ボン酸及び／または芳香族アミノ酸、例えばフェニルア
ラニンを培地に0.01mM添加すると特にタキソールおよび
バッカテインIII の含量の増加が著しい。
【００１７】増殖したカルスを液体培地で培養する際
に、液体懸濁培養を行なってもよいが、さらにガラス繊
維を培養液中に介在させ、培養細胞をガラス繊維に吸着
固定化して培養することによりタキサン類化合物の生産
性が著しく向上する。ガラス繊維の形態としては、如何
なるものでもよく、適宜の成型体が用いられる。このよ
うにして得られた培養細胞及び培養液上清を乾燥し、こ
れからタキサン類化合物を抽出し、必要に応じて精製す
る。
に、液体懸濁培養を行なってもよいが、さらにガラス繊
維を培養液中に介在させ、培養細胞をガラス繊維に吸着
固定化して培養することによりタキサン類化合物の生産
性が著しく向上する。ガラス繊維の形態としては、如何
なるものでもよく、適宜の成型体が用いられる。このよ
うにして得られた培養細胞及び培養液上清を乾燥し、こ
れからタキサン類化合物を抽出し、必要に応じて精製す
る。
【００１８】すなわち、生産されたタキサン類化合物
を、ジクロロメタン、メタノール、ヘキサン抽出などに
より抽出し、分離、回収する。分離、回収には、抽出、
カラム分離等従来化合物の分離精製に用いられている通
常の方法が用いられる。また、この抽出液を乾燥してこ
れをタキサン類化合物として用いてもよいし、さらにタ
キサン類化合物を単離してもよい。目的化合物のタキサ
ン類化合物の分析にはＨＰＬＣ分析などが用いられる。
目的化合物のタキサン類化合物としては、以下の式で示
されるタキソール (I)、セファロマニン (II) 、１０−
デアセチルセファロマニン (III)、バカテインIII (I
V)、１０−デアセチルバカテインIII(Ｖ) など化合物が
あげられる。
を、ジクロロメタン、メタノール、ヘキサン抽出などに
より抽出し、分離、回収する。分離、回収には、抽出、
カラム分離等従来化合物の分離精製に用いられている通
常の方法が用いられる。また、この抽出液を乾燥してこ
れをタキサン類化合物として用いてもよいし、さらにタ
キサン類化合物を単離してもよい。目的化合物のタキサ
ン類化合物の分析にはＨＰＬＣ分析などが用いられる。
目的化合物のタキサン類化合物としては、以下の式で示
されるタキソール (I)、セファロマニン (II) 、１０−
デアセチルセファロマニン (III)、バカテインIII (I
V)、１０−デアセチルバカテインIII(Ｖ) など化合物が
あげられる。
【００１９】
【化１】
【００２０】
【化２】
【００２１】
【化３】
【００２２】本発明の実施例を示すと次のとおりであ
る。
る。
【実施例１】タクサス クスピダータ(Taxus cuspidat
a) の若い幹の切片を用いた。これらの切片を蒸留水で
洗浄し、70％エタノールで表面殺菌を30〜60秒行い、
1.5％次亜塩素酸ナトリウム（数滴のTween 20添加) に2
0〜30分浸漬し、さらに滅菌した蒸留イオン交換水で３
回洗浄して切片の滅菌を行った。この切片をガンボルグ
Ｂ５基本培地にショ糖２％、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸１mg/Lを添加した滅菌培地のプラスチック・プレ
ート上で、25℃、暗黒条件下で静置して培養することに
よりカルスを誘導させた。培養15日目にガンボルグＢ５
基本培地にショ糖２％、２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸１mg/Lを添加した新鮮な培地に植え継ぎ、同様の培地
を用いてカルスを増減させた。35日目、すなわち最初に
培養を開始してから50日目にフェニルアラニンを、ガン
ボルグＢ５基本培地にショ糖２％、２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸１mg/Lを添加した培地に、0(対照）、0.1,
1.0,10.0, 100.0mM 添加し、これをオートクレーヴ滅
菌を行い、この培地を用い、プラスチックプレート上で
暗黒条件下で25℃で25日間カルスを本培養した。
a) の若い幹の切片を用いた。これらの切片を蒸留水で
洗浄し、70％エタノールで表面殺菌を30〜60秒行い、
1.5％次亜塩素酸ナトリウム（数滴のTween 20添加) に2
0〜30分浸漬し、さらに滅菌した蒸留イオン交換水で３
回洗浄して切片の滅菌を行った。この切片をガンボルグ
Ｂ５基本培地にショ糖２％、２，４−ジクロロフェノキ
シ酢酸１mg/Lを添加した滅菌培地のプラスチック・プレ
ート上で、25℃、暗黒条件下で静置して培養することに
よりカルスを誘導させた。培養15日目にガンボルグＢ５
基本培地にショ糖２％、２，４−ジクロロフェノキシ酢
酸１mg/Lを添加した新鮮な培地に植え継ぎ、同様の培地
を用いてカルスを増減させた。35日目、すなわち最初に
培養を開始してから50日目にフェニルアラニンを、ガン
ボルグＢ５基本培地にショ糖２％、２，４−ジクロロフ
ェノキシ酢酸１mg/Lを添加した培地に、0(対照）、0.1,
1.0,10.0, 100.0mM 添加し、これをオートクレーヴ滅
菌を行い、この培地を用い、プラスチックプレート上で
暗黒条件下で25℃で25日間カルスを本培養した。
【００２３】最初の培養開始後55日目に新鮮なカルス
0.5ｇを取り出し、−20℃で凍結し、これを２mlのヘキ
サン中で破砕した後、25℃、12時間、ヘキサン抽出を行
った。2,500×ｇ、20分間遠心分離処理して沈澱を取り
出し、１mlのメタノール：ジクロロメタン（１：１）
で、室温、１時間、超音波条件下に抽出し、これを 2,5
00×ｇ、20分間遠心分離して上澄み（粗抽出液）を得、
これを、25℃で乾燥し、１mlのジクロロメタンに溶解し
たものに１mlの蒸留水を添加し10秒間混合した後、2,50
0×ｇ、20分間遠心分離してジクロロメタン層を得た。
これを25℃で乾燥し、 500μl のメタノールに溶解し、
0.45μm の濾紙でろ過してＨＰＬＣ試料を調製した。Ｈ
ＰＬＣ分析で確認したところ、タキソール、バッカテイ
ン類が検出された。タキソール、バッカテイン類の含量
を図１及び図２に示す。タキソール含量は、フェニルア
ラニン0.100mM 添加した場合、乾燥細胞を基準にして
0.041％であり、またバッカテイン類の含量は0.005 ％
であった。
0.5ｇを取り出し、−20℃で凍結し、これを２mlのヘキ
サン中で破砕した後、25℃、12時間、ヘキサン抽出を行
った。2,500×ｇ、20分間遠心分離処理して沈澱を取り
出し、１mlのメタノール：ジクロロメタン（１：１）
で、室温、１時間、超音波条件下に抽出し、これを 2,5
00×ｇ、20分間遠心分離して上澄み（粗抽出液）を得、
これを、25℃で乾燥し、１mlのジクロロメタンに溶解し
たものに１mlの蒸留水を添加し10秒間混合した後、2,50
0×ｇ、20分間遠心分離してジクロロメタン層を得た。
これを25℃で乾燥し、 500μl のメタノールに溶解し、
0.45μm の濾紙でろ過してＨＰＬＣ試料を調製した。Ｈ
ＰＬＣ分析で確認したところ、タキソール、バッカテイ
ン類が検出された。タキソール、バッカテイン類の含量
を図１及び図２に示す。タキソール含量は、フェニルア
ラニン0.100mM 添加した場合、乾燥細胞を基準にして
0.041％であり、またバッカテイン類の含量は0.005 ％
であった。
【００２４】
【発明の効果】本発明は、タクサス属植物に起源を有す
る細胞を芳香族カルボン酸及び／または芳香族アミノ酸
を添加した培地で培養し、この培養物からタキサン類化
合物を回収することを特徴とするものであり、このこと
により、従来の組織培養と比較してタキサン類化合物の
生産性を著しく向上させることができる。
る細胞を芳香族カルボン酸及び／または芳香族アミノ酸
を添加した培地で培養し、この培養物からタキサン類化
合物を回収することを特徴とするものであり、このこと
により、従来の組織培養と比較してタキサン類化合物の
生産性を著しく向上させることができる。
【図１】実施例１によってタクサス クスピダータを培
養したときのフェニルアラニン添加濃度と同細胞のタキ
ソール含量（％）との関係を示す。
養したときのフェニルアラニン添加濃度と同細胞のタキ
ソール含量（％）との関係を示す。
【図２】フェニルアラニン添加濃度とバッカテイン類の
含量（％）との関係を示す。
含量（％）との関係を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/04 Ｃ１２Ｒ 1:91）
Claims (1)
- 【請求項１】 タクサス属植物（Taxus sp.)に起源を有
する培養細胞を芳香族カルボン酸及び／または芳香族ア
ミノ酸を添加した培地で培養し、この培養物からタキサ
ン骨格を有する植物成分を回収することを特徴とするタ
キサン類化合物の製造方法。
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4177405A JP2967532B2 (ja) | 1992-06-11 | 1992-06-11 | タキサン類化合物の製造方法 |
| EP19930304457 EP0577274A3 (en) | 1992-06-11 | 1993-06-08 | Process for preparing taxane compounds |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP4177405A JP2967532B2 (ja) | 1992-06-11 | 1992-06-11 | タキサン類化合物の製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH05336985A true JPH05336985A (ja) | 1993-12-21 |
| JP2967532B2 JP2967532B2 (ja) | 1999-10-25 |
Family
ID=16030361
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP4177405A Expired - Fee Related JP2967532B2 (ja) | 1992-06-11 | 1992-06-11 | タキサン類化合物の製造方法 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0577274A3 (ja) |
| JP (1) | JP2967532B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7264951B1 (en) | 1992-02-20 | 2007-09-04 | Phyton, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| US8338143B2 (en) | 1996-05-24 | 2012-12-25 | Phyton Holdings, Llc | Enhanced production of paclitaxel and taxanes by cell cultures of Taxus species |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2092849C (en) * | 1992-04-07 | 2003-11-18 | Paul M. Cino | Callus cell induction and the preparation of taxanes |
| CN1209168A (zh) * | 1995-12-12 | 1999-02-24 | 施凯姆公司 | 由植物细胞培养物生产植物化学物质的生产和筛选方法 |
| TW200304947A (en) * | 2002-02-08 | 2003-10-16 | Bristol Myers Squibb Co | Compositions and methods for latering biosynthesis of taxanes and taxane-related compounds |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5019504A (en) * | 1989-03-23 | 1991-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Production of taxol or taxol-like compounds in cell culture |
| US5407816A (en) * | 1992-02-20 | 1995-04-18 | Phyton Catalytic, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of taxus species |
-
1992
- 1992-06-11 JP JP4177405A patent/JP2967532B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-06-08 EP EP19930304457 patent/EP0577274A3/en not_active Withdrawn
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7264951B1 (en) | 1992-02-20 | 2007-09-04 | Phyton, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of Taxus species |
| US8338143B2 (en) | 1996-05-24 | 2012-12-25 | Phyton Holdings, Llc | Enhanced production of paclitaxel and taxanes by cell cultures of Taxus species |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0577274A3 (en) | 1994-05-25 |
| JP2967532B2 (ja) | 1999-10-25 |
| EP0577274A2 (en) | 1994-01-05 |
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |