JP3162217B2 - タキサン型ジテルペンの製造方法 - Google Patents

タキサン型ジテルペンの製造方法

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Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、卵巣癌、乳癌、肺癌等
の治療薬として期待されるタキソールを含むタキサン型
ジテルペンの製造方法に関する。
【0002】
【従来の技術】卵巣癌、乳癌、肺癌等の治療薬として期
待されるタキソール(Taxol) は、イチイ科イチイ属植物
であるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifolia NUTT) よ
り単離同定されたタキサン型ジテルペンであり、活性と
関連する複雑なエステルグループを有している。タキソ
ールはタイヘイヨウイチイ植物体中のいたる部分にも存
在し、その含量は樹皮で最も高いことが報告されてい
る。現在、タキソールの製造は天然の又は栽培された植
物体中から採取することにより行われているが、イチイ
属植物は地上20cmの高さに成長するのに10年以上
かかる生育の遅い植物であり、また樹皮を剥ぐと木が枯
れてしまうことから容易に大量のタキソールを得ること
は困難である。もし、タキソール又はタキソールの前駆
物質であるバッカチンIII(baccatin III )等のタキサン
型ジテルペンの合成が組織培養を利用して行うことがで
きれば、樹木を伐採することなく、大量のタキソールを
容易に得ることができるので有利である。
【0003】これまでの植物の培養細胞を利用したタキ
ソールの生産法については、タイヘイヨウイチイ(Taxus
brevifolia NUTT) 培養細胞による生産法が特許(米国
特許第5019504 号)になっており、タキソール生産量は
1 〜3mg/l と記載されている。一方、タキソール生産法
の先行技術としては、タキソール生合成前駆体であるバ
ッカチンIII からの半合成法がHoltonらによって特許に
なっている(米国特許第5015744 号)。組織培養法は大
量の植物組織を必要としないことから、更にタキソール
生産に有利である。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、植物組織培
養によるタキサン型ジテルペンの簡便な製造方法を提供
することを目的とする。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、鋭意研究
の結果、タキサン型ジテルペンを産生する植物の培養細
胞又は培養組織の組織培養培地中にココナツミルクを添
加して組織培養を行うと、培養物中のタキサン型ジテル
ペン生産性が向上することを見出し、本発明を完成する
に至った。
【0006】即ち、本発明のタキサン型ジテルペンの製
造方法は、タキサン型ジテルペンを産生する植物の培養
細胞又は培養組織の組織培養培地中にココナツミルクを
添加して組織培養を行い、培養物よりタキサン型ジテル
ペンを採取することを特徴とするものである。本発明の
製造方法の対象となるタキサン型ジテルペンとしては、
タキサン骨格を有するジテルペンであれば特に制限はな
く、例えばタキソール、バッカチンIII 、セファロマニ
ン、10−デアセチルバッカチンIII が挙げられる。
【0007】本発明の製造方法において組織培養に用い
られるタキサン型ジテルペンを産生する植物としては、
例えば、セイヨウイチイ(Taxus baccata LINN)、イチイ
(T.cuspidata SIEB.et ZUCC) 、キャラボク(T. cuspida
ta SIEB.et ZUCC var. nanaREHDER)、タイヘイヨウイチ
イ(T. brevifolia NUTT)、カナダイチイ( T. canadiens
is MARSH) 等のイチイ属植物が挙げられる。
【0008】前記植物の組織培養は、本発明によりココ
ナツミルクを添加する以外は、従来普通の手段によって
行うことができる。ココナツミルクは、培地における濃
度が1〜50%、好ましくは5〜20%になる量で使用
される。従来、タキサン型ジテルペン産生植物の組織培
養において培地添加物としてココナツミルクを使用した
例は報告されておらず、ココナツミルクを使用する本発
明の組織培養方法によってタキサン型ジテルペンの産生
量が増大することは予想外のことであった。
【0009】本発明で使用される培地は、前記ココナツ
ミルクの他に、普通の培地成分を含有する。このような
成分として一般に炭素源及び無機成分が用いられ、これ
に植物ホルモン類、ビタミン類を添加し、更に必要に応
じてアミノ酸類を添加することができる。炭素源として
は、シュクロース、マルトース、ラクトース等の二糖
類、グルコース、フルクトース、ガラクトース等の単糖
類、デンプンあるいはこれら糖源の2種類以上を適当な
比率で混合したものを使用できる。
【0010】無機成分としては、例えばリン、窒素、カ
リウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マン
ガン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。
【0011】植物ホルモンとしては、例えばインドール
酢酸(IAA) 、ナフタレン酢酸(NAA)、2, 4−ジクロロ
フェノキシ酢酸(2,4-D) 等のオーキシン類、カイネチ
ン、ゼアチン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類
が用いられる。ビタミン類としては、例えばビオチン、
チアミン(ビタミンB1 )、ピリドキシン(ビタミンB
6 )、パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用
いられる。
【0012】アミノ酸類としては、例えばグリシン、フ
ェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等
を添加できる。一般に前記の各成分は、炭素源が約1 〜
約30g/l 、無機成分が約0.1 μM ないし100mM 、植物ホ
ルモン類が約0.01〜約10μM 、ビタミン類及びアミノ酸
類がそれぞれ約0.1 〜約100mg/l の濃度で用いられる。
【0013】本発明の組織培養に用いられる培地として
は、従来から知られている植物の組織培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962 年) 〔Murashig
e &Skoog 〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965
年) 〔Linsmaier Skoog 〕の培地、ウッディー・プラン
ト・メディウム(1981 年) 〔Woody Plant Medium〕の培
地、ガンボルグ〔Gamborg 〕のB−5培地、三井のM−
9培地等に前記の植物ホルモンを添加し、更に必要に応
じて前記した炭素源、ビタミン類、アミノ酸等を添加し
て調製される培地を例示できるが、この中でも特にウッ
ディー・プラント・メディウムの培地を用いて調製され
る培地が好ましい。
【0014】本発明には液体培地及び寒天やゲランガム
等を通常0.1 〜1 %含有する固形培地のいずれも使用で
きるが、通常は液体培地が好ましい。本発明の組織培養
においては、上記植物の根、生長点、葉、茎、種子、花
粉、葯、がく等の組織片又は細胞、あるいはこれらを上
記培地あるいは他の従来の培地によって組織培養して得
られる培養細胞又は培養組織を使用することができる。
上記培養組織は組織又はカルスから分化して得られるシ
ュート(shoot) や不定根を含む。
【0015】これらの組織又は細胞を本発明によりココ
ナツミルクを添加した培地を用いて組織培養すると、無
添加と比較してタキサン型ジテルペンの高生産性培養組
織又は培養細胞が得られる。この培養組織又は培養細胞
から、メタノール等の有機溶媒による抽出によってタキ
サン型ジテルペンを分離することができる。本発明の組
織培養の好ましい一例としては、次の方法が挙げられ
る。
【0016】先ず、イチイ属植物の植物体、例えば根、
生長点、葉、茎、種子等から採取される植物片を殺菌処
理後、ゲランガムで固めたウッディー・プラント・メデ
ィウムの固体培地上に置床し、10〜35℃で14〜60日程度
経過させて組織片の一部をカルス化させる。このように
して得られたカルスを継代培養すると生育速度が漸次高
まり安定化したカルスが得られる。ここで、安定化した
カルスとは、培養中にカルスの一部がシュートや根に分
化しないでカルスの状態を保持する性質をもち細胞の生
育速度が均質であるものをいう。なお、安定化したカル
スを得るまでの培養では、細胞の死滅を防止する観点か
ら、培地にココナツミルクを存在させない方が好まし
い。
【0017】この安定化したカルスを増殖に適した液体
培地、例えばウッディー・プラント・メディウムの液体
培地に移して増殖させる。液体培地において更に生育速
度が高められる。本発明では、この安定化したカルス又
は該カルスを構成する細胞は、ココナツミルクを含有す
る固体培地又は液体培地で培養される。本発明の組織培
養における培養温度としては、通常は約10〜約35℃、特
に約23〜28℃が増殖速度が大きいので好適である。ま
た、培養期間としては、14〜42日間が好適である。
【0018】本発明の製造方法において液体培地を用い
た場合には、培養終了後に培養組織又は培養細胞をデカ
ンテーション又は濾過等の方法によって培地から分離
し、このものから目的とするタキサン型ジテルペンを有
機溶媒による抽出等の方法によって分離することができ
る。
【0019】
【実施例】以下、実施例及び比較例により本発明を更に
具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。 (実施例1)ナフタレン酢酸を10-5M の濃度になるよう
に添加したウッディー・プラント・メディウムの固体培
地(ゲランガム0.25重量%)に、前もって2 %アンチホ
ルミン溶液又は70%エタノール溶液等で滅菌処理したセ
イヨウイチイ(Taxus baccataLINN)の茎の一部を置床
し、25℃で暗所にて静置培養してセイヨウイチイカルス
を得た。次に、このカルス0.1g(新鮮重)を、上記成分
を同じ濃度で添加したウッディー・プラント・メディウ
ムの液体培地1ml 入りのφ18mmウェルに移し、ロータリ
ーシェーカー上で旋回培養(振幅25mm、120rpm)し、2
1日毎に植えつぎ、該カルスの生育速度を速めた。
【0020】このようにして得られた培養細胞0.1g(新
鮮重)を、上記成分を同じ濃度で添加し、更に終濃度
0.5%になるようにココナツミルク(Taiwan Horticu
lturalCo., Ltd.製、Mfd date 1.JUN.1991 )を添加し
たウッディー・プラント・メディウムの液体培地1ml入
りのφ18mmウェルに移して25℃で14日間振盪培養し
た。
【0021】培養終了後、セイヨウイチイ培養細胞を濾
過により採取し、凍結乾燥した後、その乾燥重量を測定
し、液体培地1L当たりの培養細胞の生育重量を求め
た。得られた乾燥カルスからメタノール等を用いてタキ
サン型ジテルペンを抽出し、高速液体クロマトグラフィ
ーを用いて標準品タキソール、セファロマニン、バッカ
チンIII と比較定量することによってタキサン型ジテル
ペン収量を測定した。その結果を表1に示す。
【0022】(比較例1)実施例1において、ココナツ
ミルクを添加しない培地を用いた以外は該実施例と同様
に操作した。その結果を表1に示す。 (実施例2)実施例1において、添加したココナツミル
クの終濃度が1%である以外は該実施例と同様に操作し
た。その結果を表1に示す。
【0023】(実施例3)実施例1において、添加した
ココナツミルクの終濃度が5%である以外は該実施例と
同様に操作した。その結果を表1に示す。 (実施例4)実施例1において、添加したココナツミル
クの終濃度が10%である以外は該実施例と同様に操作
した。その結果を表1に示す。
【0024】(実施例5)実施例1において、添加した
ココナツミルクの終濃度が20%である以外は該実施例
と同様に操作した。その結果を表1に示す。 (実施例6)実施例1において、添加したココナツミル
クの終濃度が50%である以外は該実施例と同様に操作
した。その結果を表1に示す。
【0025】(実施例7)実施例1において、添加した
ココナツミルクの終濃度が60%である以外は該実施例
と同様に操作した。その結果を表1に示す。 (比較例2)比較例1において、培養期間を28日間と
した以外は該比較例と同様に操作した。その結果を表1
に示す。
【0026】(実施例8)実施例4において、培養期間
を28日間とした以外は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表1に示す。 (比較例3)比較例1において、培養期間を42日間と
した以外は該比較例と同様に操作した。その結果を表1
に示す。
【0027】(実施例9)実施例4において、培養期間
を42日間とした以外は該実施例と同様に操作した。そ
の結果を表1に示す。
【0028】
【表1】
【0029】
【発明の効果】本発明によれば、タキサン型ジテルペン
産生植物の組織培養によって、大量のタキソールを簡便
に得ることが可能になった。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (58)調査した分野(Int.Cl.7,DB名) C12P 7/62 - 17/02 C12N 5/04 BIOSIS(DIALOG) CA(STN) JICSTファイル(JOIS) REGISTRY(STN) WPI(DIALOG)

Claims (3)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 タキサン型ジテルペンを産生する植物の
    培養細胞又は培養組織の組織培養培地中に5〜20%の
    濃度になるようにココナツミルクを添加して組織培養を
    行い、培養物よりタキサン型ジテルペンを採取すること
    を特徴とするタキサン型ジテルペンの製造方法。
  2. 【請求項2】 タキサン型ジテルペンを産生する植物が
    イチイ属植物であることを特徴とする請求項1記載の方
    法。
  3. 【請求項3】 タキサン型ジテルペンがタキソール、バ
    ッカチンIII、セファロマニン又は10−デアセチルバッ
    カチンIIIであることを特徴とする請求項1記載の方
    法。
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IL127062A (en) 1996-05-24 2005-09-25 Phyton Inc Enhanced production of taxanes by cell cultures of taxus species
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