CN104988109B - 一种分离与培养红豆杉干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤；(1)将红豆杉嫩枝经消毒后切割得到外植体切片；(2)外植体切片在1.0‑10.0mg.L‑1的柠檬酸溶液中浸泡0.5‑2.0分钟，后放置在含有0.5‑4.0mg.L‑1的2,4‑二氯苯氧乙酸、0.5‑4.0mg.L‑1萘乙酸和0.5％‑5％椰乳的B5培养基上；(3)将增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养；(4)继代培养基为B5培养基，另添加0.5‑4.0mg.L‑1的2,4‑二氯苯氧乙酸、0.5‑4.0mg.L‑1萘乙酸、10‑200毫克/升的腐殖酸钠、0.5‑4.0毫克/升的硝酸银和75‑200毫克/升的二硫苏糖醇，每两周继代一次。该方法通过分离及培养干细胞来获取紫杉醇，干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，所以后期培养中如果采用干细胞将可以避免愈伤细胞的缺点。
Description
技术领域
本发明属于干细胞分离及培养技术，具体涉及一种分离与培养红豆杉干细胞的方法。
背景技术
从药用植物红豆杉中提取的紫杉醇对于多种癌症的治疗有着重要的应用价值和前景。由于野生红豆杉是珍稀保护植物，法律禁止砍伐。目前生产上通过大量种植红豆杉的办法为分离提取紫杉醇提供原料。但由于红豆杉生长周期长，占用耕地，并且受地域气候的限制；又由于只有红豆杉树皮中才含有紫杉醇，且含量极低，大约10吨树皮中才能提取1公斤紫杉醇，所以这种传统的生产技术的成本极高。另外，提炼紫杉醇的过程中，由于有外加的化学溶剂，导致提炼后余下不能清除的有毒残余物，超出指定的剂量而影响治疗的功效。
为解决上述问题，在过去十多年中,针对通过离体悬浮培养红豆杉的细胞来生产紫杉醇做了大量的研究和尝试，这种方法有望不受红豆杉生长季节的限制就可以通过规模化生产来获得紫杉醇。通常取红豆杉的茎或叶片为外植体在特定培养基上培养，经过脱分化阶段诱导愈伤组织，再进一步悬浮培养愈伤细胞来生产紫杉醇。
目前已有的技术在分离红豆杉细胞时，均采用已经分化的组织器官为外植体，通过离体培养阶段的培养(脱分化过程)将其诱导为具有分化能力的愈伤细胞。但这种细胞的本质是来源于已经分化的体细胞，所以分裂能力有限，遗传性状不稳定，抗逆能力不强。在过去的悬浮培养中发现，经常会出现细胞系退化，分裂能力弱，很难放大培养体积,并且随着培养体积的放大,细胞中紫杉醇的含量逐渐降低。所以,过去将红豆杉愈伤细胞工业化悬浮培养的尝试尚未成功。
针对已有的红豆杉愈伤细胞悬浮培养体系中愈伤细胞的缺点，本发明则注重分离和培养红豆杉的干细胞。因为干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，所以后期培养中如果采用干细胞将可以避免愈伤细胞的缺点。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种分离及培养红豆杉干细胞的方法，该方法通过分离及培养干细胞来获取紫杉醇，干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，所以后期培养中如果采用干细胞将可以避免愈伤细胞的缺点。
为达到上述目的，本发明的技术方案是这样实现的：
一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，包括以下步骤；
(1)将红豆杉嫩枝经过消毒处理后从嫩枝上切割包含周皮、韧皮部和形成层在内的外植体切片；
(2)将外植体切片在1.0-10.0mg.L-1的柠檬酸溶液中浸泡0.5-2.0分钟，然后放置在含有0.5-4.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5-4.0mg.L-1萘乙酸和0.5％-5％椰乳的B5培养基上，20-25℃黑暗下培养，至外植体形成层明显增殖；
(3)将形成层明显增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养；
(4)继代培养基为B5培养基，另外添加0.5-4.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5-4.0mg.L-1萘乙酸、10-200毫克/升的腐殖酸钠、0.5-4.0毫克/升的硝酸银和75-200毫克/升的二硫苏糖醇，每两周继代一次。
红豆杉嫩枝采用直径为1厘米的嫩枝。
步骤(2)中，柠檬酸溶液优选2.0-8.0mg.L-1。
步骤(2)中，外植体切片在柠檬酸溶液中浸泡1.0-1.5分钟。
步骤(2)和/或步骤(4)中的2,4-二氯苯氧乙酸优选2.0-4.0mg.L-1。
步骤(2)和/或步骤(4)中的萘乙酸优选2.0-4.0mg.L-1。
步骤(2)中的椰乳优选2.0％-4.0％。
优选，50-100毫克/升的腐殖酸钠，更优选，100毫克/升的腐殖酸钠。
优选，1.0-2.0毫克/升的硝酸银，更优选，2.0毫克/升的硝酸银。
优选，100-150毫克/升的二硫苏糖醇，更优选，100毫克/升的二硫苏糖醇。
柠檬酸溶液可以起到防止褐化的作用。
2,4二氯苯氧乙酸、萘乙酸均属于生长素的一种，生长素是诱导干细胞生长的关键激素，对干细胞诱导比率具有明显的影响。单独使用其中一种生长素诱导干细胞生长的比例非常低，而两种生长素配合使用可以诱导较高比例的外植体切片增殖干细胞，
椰乳、腐殖酸钠可以显著促进细胞的增殖。
二硫苏糖醇与硝酸银可有效的抑制红豆杉干细胞褐化。
本发明相对于现有技术具有以下实质性特点和进步：
(1)该方法通过分离及培养干细胞来获取紫杉醇。干细胞是处于未分化状态的细胞，具有无限分裂的能力，所以后期培养中可以避免愈伤细胞的缺点，短期内可以得到大量的干细胞，有利于紫杉醇的大量生产。
(2)该方法中培养基中加入2,4二氯苯氧乙酸、萘乙酸这两种生长素组合进行培养，其可以诱导较高比例的外植体切片增殖干细胞。椰乳、腐殖酸钠的加入也加快了红豆杉干细胞的增殖速度，短期内可得到大量的干细胞，有利于紫杉醇的大量生产。
(3)二硫苏糖醇与硝酸银的加入有效的抑制了红豆杉干细胞褐化，短期内可得到大量的干细胞，有利于紫杉醇的大量生产。
附图说明
图1为本发明红豆杉外植体切断图；
图2为本发明红豆杉形成层干细胞诱导增殖图；
图3为本发明红豆杉干细胞继代增殖图；
图4为紫杉醇乙腈溶液标准工作曲线；
图5为紫杉醇测定色谱图，其中A：空白溶液；B：纯品；C:供试样品。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
红豆杉干细胞的分离和培养：
(1)首先将直径为1厘米的红豆杉嫩枝先后经过1％次氯酸钠消毒处理5分钟和0.1％的升汞消毒处理10分钟，然后在显微镜下从嫩枝上切割包含周皮、韧皮部和形成层在内的外植体切片(见附图1)。采用的消毒处理方法是现有技术中常用的，实际上还可以采用其他可适用的消毒方法。
(2)将外植体切片在5.0mg.L-1的柠檬酸溶液中浸泡1分钟，然后放置在含有2.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、2.0mg.L-1萘乙酸和1.0％椰乳的B5培养基上，20-25℃黑暗下培养。由于该培养基适合形成层干细胞的快速分裂，导致形成层干细胞团增殖(见附图2)，这种干细胞团质地致密，表面光滑平整。
(3)两周后将形成层明显增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养。
(4)继代培养基为B5培养基，另外添加4.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、3.0mg.L-1萘乙酸、100毫克/升的腐殖酸钠、2.0毫克/升的硝酸银和100毫克/升的二硫苏糖醇，该继代培养基可以显著抑制红豆杉干细胞的褐化，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞(见附图3)。
干细胞中紫杉醇含量的检测，其采用的检测方法为现有技术。
紫杉醇标准曲线线性方程为y＝43.2x-29.4(r＝0.9995)，定量范围为5ng-1000ng，见图4。与标曲样品在相同色谱条件下对提取容易进行检测(见图5)，根据标准曲线线性方程，计算稀释溶液浓度为711μg/mL。按稀释倍数与取样量计算，红豆杉干细胞中紫杉醇含量约为1.57mg/g.DW，即干细胞中紫杉醇的含量为0.157％(干重含量)。
实施例2
生长素是诱导干细胞生长的关键激素，对干细胞诱导比率具有明显的影响。2,4二氯苯氧乙酸、萘乙酸均属于生长素的一种。
根据表1中2,4二氯苯氧乙酸、萘乙酸的量，按照实施1中步骤(1)-(2)的过程进行外植体的培养，并将增殖的外植体取出，分离干细胞，其结果见表1。
表1：不同生长素组合对红豆杉干细胞诱导的影响
注:本表结果为三次试验的结果平均值。
从表1中的结果看，本实施例中所用的2,4二氯苯氧乙酸和萘乙酸两种生长素之间有一定的协同作用，单独使用其中一种生长素诱导干细胞生长的比例非常低，而两种生长素配合使用可以诱导较高比例的外植体切片增殖干细胞，每种生长素的浓度范围在0.5-4毫克/升之间比较好，优选2.0-4.0毫克/升。在步骤(4)的继代培养中，2,4二氯苯氧乙酸、萘乙酸同样起到同样的促生长作用，其每种生长素的浓度范围同样在0.5-4毫克/升之间比较好，优选2.0-4.0毫克/升。
实施例3
按照表2中腐殖酸钠的量，其他组分含量不变，分别根据实施例1的分离和培养步骤进行干细胞的培养，其结果见表2。
表2：不同浓度的腐殖酸钠对红豆杉干细胞增殖的影响
注:本表结果为三次试验的结果平均值。
从表2的结果中可以看出，在培养基中加入腐殖酸钠，可加快红豆杉干细胞的增殖速度。随着腐殖酸钠浓度的增加，红豆杉外植体切片上增殖的干细胞团的鲜重逐渐增加，腐殖酸钠在浓度为100毫克/升可以达到最好效果，继续增加腐殖酸钠浓度反而对干细胞增殖有一定的抑制作用。
实施例4
按照表3中硝酸银的量，其他组分含量不变，分别根据实施例1的分离和培养步骤进行干细胞的培养，其结果见表3。
表3：硝酸银对红豆杉干细胞褐化和生长的影响
注:本表结果为四次试验的结果平均值。
褐化：植物组织培养中所说的褐化是指在外植体诱导初分化或再分化过程中，自身组织从表面想培养基释放褐色物质以至培养基逐渐变成褐色，外植体也随之进一步变褐而死亡的现象。
由于红豆杉干细胞在培养过程中很容易褐化，因此抑制褐化有利于获得大量的干细胞。
由表3可知，硝酸银对红豆杉干细胞褐化具有一定的抑制作用，且浓度在2.0毫克/升可以很好地达到抑制红豆杉干细胞褐化的效果。
实施例5
按照表4中二硫苏糖醇的量，其他组分含量不变，分别根据实施例1的分离和培养步骤进行干细胞的培养，其结果见表4。
表4：二硫苏糖醇与硝酸银对红豆杉干细胞褐化和生长的影响
注:本表结果为三次试验的结果平均值
二硫苏糖醇具有抗氧化的作用，从表4的结果可以知道，二硫苏糖醇与硝酸银配合对红豆杉干细胞褐化具有一定影响，特别是100毫克/升的二硫苏糖醇与2.0毫克/升的硝酸银组合效果最佳，可以显著抑制褐化，培养出的干细胞为白色，并且生长旺盛。
实施例6
红豆杉干细胞的分离和培养：
(1)首先将直径为1厘米的红豆杉嫩枝先后经过1％次氯酸钠消毒处理5分钟和0.1％的升汞消毒处理10分钟，然后在显微镜下从嫩枝上切割包含周皮、韧皮部和形成层在内的外植体切片。
(2)将外植体切片在1.0mg.L-1的柠檬酸溶液中浸泡2分钟，然后放置在含有3.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、1.0mg.L-1萘乙酸和5％椰乳的B5培养基上，20-25℃黑暗下培养。由于该培养基适合形成层干细胞的快速分裂，导致形成层干细胞团增殖，这种干细胞团质地致密，表面光滑平整。
(3)两周后将形成层明显增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养。
(4)继代培养基为B5培养基，另外添加2.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、4.0mg.L-1萘乙酸、50毫克/升的腐殖酸钠、1.0毫克/升的硝酸银和150毫克/升的二硫苏糖醇，该继代培养基可以显著抑制红豆杉干细胞的褐化，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
经检测(采用实施例1中的检测方法进行检测)，干细胞中紫杉醇的含量为0.148％(干重含量)。
实施例7
红豆杉干细胞的分离和培养：
(1)首先将直径为1厘米的红豆杉嫩枝先后经过1％次氯酸钠消毒处理5分钟和0.1％的升汞消毒处理10分钟，然后在显微镜下从嫩枝上切割包含周皮、韧皮部和形成层在内的外植体切片。
(2)将外植体切片在2.5mg.L-1的柠檬酸溶液中浸泡1.5分钟，然后放置在含有1.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、3.0mg.L-1萘乙酸和4％椰乳的B5培养基上，20-25℃黑暗下培养。由于该培养基适合形成层干细胞的快速分裂，导致形成层干细胞团增殖，这种干细胞团质地致密，表面光滑平整。
(3)两周后将形成层明显增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养。
(4)继代培养基为B5培养基，另外添加2.5mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、3.0mg.L-1萘乙酸、70毫克/升的腐殖酸钠、1.5毫克/升的硝酸银和120毫克/升的二硫苏糖醇，该继代培养基可以显著抑制红豆杉干细胞的褐化，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
经检测(采用实施例1中的检测方法进行检测)，干细胞中紫杉醇的含量为0.14％(干重含量)。
实施例8
红豆杉干细胞的分离和培养：
(1)首先将直径为1厘米的红豆杉嫩枝先后经过1％次氯酸钠消毒处理5分钟和0.1％的升汞消毒处理10分钟，然后在显微镜下从嫩枝上切割包含周皮、韧皮部和形成层在内的外植体切片。
(2)将外植体切片在7.0mg.L-1的柠檬酸溶液中浸泡1分钟，然后放置在含有0.5mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、5.0mg.L-1萘乙酸和2％椰乳的B5培养基上，20-25℃黑暗下培养。由于该培养基适合形成层干细胞的快速分裂，导致形成层干细胞团增殖，这种干细胞团质地致密，表面光滑平整。
(3)两周后将形成层明显增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养。
(4)继代培养基为B5培养基，另外添加1.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、3.5mg.L-1萘乙酸、60毫克/升的腐殖酸钠、1.5毫克/升的硝酸银和130毫克/升的二硫苏糖醇，该继代培养基可以显著抑制红豆杉干细胞的褐化，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
经检测(采用实施例1中的检测方法进行检测)，干细胞中紫杉醇的含量为0.154％(干重含量)。
实施例9
红豆杉干细胞的分离和培养：
(1)首先将直径为1厘米的红豆杉嫩枝先后经过1％次氯酸钠消毒处理5分钟和0.1％的升汞消毒处理10分钟，然后在显微镜下从嫩枝上切割包含周皮、韧皮部和形成层在内的外植体切片。
(2)将外植体切片在10.0mg.L-1的柠檬酸溶液中浸泡0.5分钟，然后放置在含有5.0mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5mg.L-1萘乙酸和3％椰乳的B5培养基上，20-25℃黑暗下培养。由于该培养基适合形成层干细胞的快速分裂，导致形成层干细胞团增殖，这种干细胞团质地致密，表面光滑平整。
(3)两周后将形成层明显增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养。
(4)继代培养基为B5培养基，另外添加2.5mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、1.5mg.L-1萘乙酸、80毫克/升的腐殖酸钠、1.2毫克/升的硝酸银和150毫克/升的二硫苏糖醇，该继代培养基可以显著抑制红豆杉干细胞的褐化，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
经检测(采用实施例1中的检测方法进行检测)，干细胞中紫杉醇的含量为0.139％(干重含量)。
实施例10
红豆杉干细胞的分离和培养：
(1)首先将直径为1厘米的红豆杉嫩枝先后经过1％次氯酸钠消毒处理5分钟和0.1％的升汞消毒处理10分钟，然后在显微镜下从嫩枝上切割包含周皮、韧皮部和形成层在内的外植体切片。
(2)将外植体切片在9.0mg.L-1的柠檬酸溶液中浸泡0.5分钟，然后放置在含有2.5mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、4.0mg.L-1萘乙酸和0.5％椰乳的B5培养基上，20-25℃黑暗下培养。由于该培养基适合形成层干细胞的快速分裂，导致形成层干细胞团增殖，这种干细胞团质地致密，表面光滑平整。
(3)两周后将形成层明显增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养。
(4)继代培养基为B5培养基，另外添加0.5mg.L-1的2,4-二氯苯氧乙酸、5.0mg.L-1萘乙酸、90毫克/升的腐殖酸钠、1.7毫克/升的硝酸银和140毫克/升的二硫苏糖醇，该继代培养基可以显著抑制红豆杉干细胞的褐化，每两周继代一次，短期内可以获得大量的干细胞。
经检测(采用实施例1中的检测方法进行检测)，干细胞中紫杉醇的含量为0.151％(干重含量)。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (10)
1.一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：包括以下步骤；
(1)将红豆杉嫩枝经过消毒处理后从嫩枝上切割包含周皮、韧皮部和形成层在内的外植体切片；
(2)将外植体切片在1.0-10.0毫克/升的柠檬酸溶液中浸泡0.5-2.0分钟，然后放置在仅含有0.5-4.0毫克/升的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5-4.0毫克/升萘乙酸和0.5％-5％椰乳的B5培养基上，20-25℃黑暗下培养，至外植体形成层明显增殖；
(3)将形成层明显增殖的外植体取出，分离干细胞并转移到转继代培养基上培养；
(4)继代培养基为B5培养基，另外仅添加0.5-4.0毫克/升的2,4-二氯苯氧乙酸、0.5-4.0毫克/升萘乙酸、10-200毫克/升的腐殖酸钠、0.5-4.0毫克/升的硝酸银和75-200毫克/升的二硫苏糖醇，每两周继代一次。
2.如权利要求1中所述的一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：红豆杉嫩枝采用直径为1厘米的嫩枝。
3.如权利要求1中所述的一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中，柠檬酸溶液优选2.0-8.0毫克/升。
4.如权利要求1中所述的一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中，外植体切片在柠檬酸溶液中浸泡1.0-1.5分钟。
5.如权利要求1中所述的一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：步骤(2)和/或步骤(4)中的2,4-二氯苯氧乙酸优选2.0-4.0毫克/升。
6.如权利要求1中所述的一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：步骤(2)和/或步骤(4)中的萘乙酸优选2.0-4.0毫克/升。
7.如权利要求1中所述的一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：步骤(2)中的椰乳优选2.0％-4.0％。
8.如权利要求1中所述的一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：优选，50-100毫克/升的腐殖酸钠。
9.如权利要求1中所述的一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：优选，1.0-2.0毫克/升的硝酸银。
10.如权利要求1中所述的一种分离与培养红豆杉干细胞的方法，其特征在于：优选，100-150毫克/升的二硫苏糖醇。
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