CN111172093A - 一种提高Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基及其制备方法，属于微生物培养技术领域。本发明公开的一种提高Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基，包括马铃薯170‑230g/L，葡萄糖15‑25g/L，琼脂17‑23g/L，甘氨酸0.05‑0.15g/L，氯化钙4‑6g/L。本发明的培养基能够缩短Esteya vermicola的生长周期，提高Esteya vermicoa的产孢量，特别是提高具有粘附并致死松材线虫的新月形孢子的比例，提高孢子在自然环境中抗干旱胁迫、紫外光线胁迫能力。

Description

一种提高Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基及其 制备方法

技术领域

本发明涉及微生物培养技术领域，更具体的说是涉及一种提高松材线虫 内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基及其制备方法。

背景技术

松材线虫病(Pine wilt disease)是一种由松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)引起的松树快速枯萎死亡、连片毁灭的危险性病害。由于危害严 重、防治困难而受到世界各国的高度重视，被列为重要的危险性森林病害， 并被40多个国家立法为重点检疫对象。松材线虫主要通过天牛成虫在健康树 上补充营养和在衰弱树上产卵所造成的伤口侵入寄主松树体内。目前我国松 材线虫病已扩散到江苏、浙江、安徽、福建、江西、山东、湖北、湖南、广 东、广西、重庆、四川、贵州、云南等14个省、192个县(市)、674个乡镇， 毁灭松林500多万亩，给国民经济造成巨大损失。

松材线虫病的防控已成为世界性难题，但目前缺少行之有效的防治方法。 世界上普遍采取的措施是切断传播源和传播途径，阻止松材线虫的传播。目 前采用的方法有砍伐病木，切断传播源；利用诱捕剂诱杀松褐天牛，空中与 地面喷洒化学药剂如噻虫啉、杀螟松乳剂等防治天牛，应用天牛的捕食性或 寄生性天敌如肿腿蜂(Scleroderma spp.)、花绒寄甲(Dastarcus longulus)、 朽木坚甲(Alleculafuliginosa)和啄木鸟(Dendrocops spp.)等防治天牛，以 及利用白僵菌等真菌防治天牛等；树干注射化学药剂如阿维菌素、虫线清、植物提取剂苦豆碱等防治松材线虫；利用马尾松、火炬松和日本黑松杂交， 选育抗病品种等方法。由于松褐天牛危害的隐蔽性，化学防治一般难于奏效， 而且会造成环境污染、对非靶标生物的毒副作用，同时由于树干注射等防治 方法的局限性，一种防治效率高、操作性强、绿色环保的防治方法成为迫切 需求。

利用微生物农药防治松材线虫病是当前国际上的研究热点。Esteya vermicola是世界上第一个被报道的松材线虫内寄生真菌。该菌能产生新月形 和杆状两种不同类型的孢子，其中新月形的孢子对松材线虫具有很高的侵染 活力。室内平板测定、野外注射试验和温室喷洒试验均验证了Esteya vermicola 具有优异的防治松材线虫病的效果。

Esteya vermicola真菌在传统固体培养上生长速度较慢，产孢率不高，特 别是具有粘附并致死松材线虫的新月形孢子比例不高，影响了Esteya vermicola真菌的工厂化生产产率。同时孢子在自然环境中受到干旱、高温、 紫外光线照射等影响，孢子萌发率、生存率大大降低，严重降低了生物防治 真菌的使用效果。因此，提供一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola 生长速度及抗逆性的培养基及其制备方法是本领域技术人员亟需解决的问 题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola 生长速度及抗逆性的培养基及其制备方法，缩短Esteya vermicola的生长周期， 提高Esteyavermicoa的产孢率，特别是提高具有粘附并致死松材线虫的新月 形孢子的比例，提高孢子在自然环境中抗干旱胁迫、紫外光线胁迫能力。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养 基，具体组成如下：马铃薯170-230g/L，葡萄糖15-25g/L，琼脂17-23g/L， 甘氨酸0.05-0.15g/L，氯化钙4-6g/L；pH为6-9。

进一步，一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆 性的培养基，具体组成如下：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L， 甘氨酸0.1g/L，氯化钙5g/L；pH为6-9。

进一步，所述马铃薯为去皮马铃薯。

进一步，所述pH为7。

进一步，一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆 性的培养基的制备方法，具体步骤如下：

(1)将马铃薯去皮切碎，加水煮沸，纱布过滤，收集滤液；

(2)加入葡萄糖、琼脂、甘氨酸、氯化钙，加蒸馏水，调节pH值，定 容；

(3)将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下高压灭菌20min，得到培 养基。

进一步，步骤(2)加水煮沸30min。

进一步，一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆 性的培养基在培养松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola中的应用，具体为： 将Esteyavermicola接种到培养基上培养，培养温度为23-31℃，培养时间为 7-14天。

进一步，培养温度为26℃，培养时间为7天。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种提 高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基及其制备 方法，该培养基提高了松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola的生长速度，缩 短了培育时间；提高了松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola的产孢率，特别 是具有粘附并致死松材线虫的新月形孢子的比例明显升高；提高了孢子在自 然环境中抗干旱胁迫、紫外光线胁迫能力，为松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola的使用提供了有利条件。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所 描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发 明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的 所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养 基的制备方法，具体步骤如下：

(1)将马铃薯去皮切碎，加1L水，煮沸30min，纱布过滤，收集滤液；

(2)加入葡萄糖20g、琼脂20g、甘氨酸0.1g、氯化钙5g，加蒸馏水， 调节pH值至7，定容至1L；

(3)将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下高压灭菌20min，得到培 养基。

将培养基在无菌条件下倒入培养皿中，待培养皿中的培养基凝固后，覆 盖直径稍小于培养皿的灭菌玻璃纸；然后将活化的松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola转接到覆盖有玻璃纸的培养基上，接种10个平皿。接种后在26℃ 培养箱中黑暗培养。

待培养15天后，用直尺量取并统计菌落直径。并将真菌菌落从覆盖玻璃 纸的固体培养基上刮下来，收集大量的菌落，并分为两部分，每部分5个平 皿。5个平皿的菌落放到60℃烘箱中，持续烘干两天，称重，并记录真菌菌 落干重。另外5个平皿的菌落转到50ml离心管中，加入0.5％吐温80，加入 几粒玻璃珠。放到振荡器上震荡，用血球计数板统计产孢量及新月形孢子比 例。

对比例1

参照实施例1中培养基的配制方法以及统计方法，在另外3组培养基中 分别加入丝氨酸、L-蛋氨酸和L-亮氨酸，各100μg/ml，以不加入氨基酸为对 照组。每组进行3次重复试验处理。

检测实施例1、对比例1中菌落直径、菌落干重、产孢量以及新月形孢子 占总孢子比率，结果见表1。

表1培养基中添加不同氨基酸的情况下真菌生长和产孢情况

注：表中数值为平均值±标准误(n＝3)，同行数据后上方的字母表示在 0.05水平上差异显著。

实施例2

分别按照实施例1和对比例1中培养基的配制方法，在培养基中分别加 入甘氨酸、丝氨酸、L-蛋氨酸，L-亮氨酸，各100μg/ml，以不加入氨基酸为 对照组。接种真菌后，将200μl约2000条松材线虫加在生长8天的菌落上面。 Esteya vermicola真菌的新月形孢子粘附在线虫体表，以头部、尾部为主，并 刺穿线虫的体表和肌肉层，吸收养分并萌发菌丝产生孢子，最终耗尽线虫的 养分使其致死。10小时在显微镜下观察并统计松材线虫粘附率，28小时观察 并统计松材线虫致死率，结果见表2。每组进行3次重复试验处理。

表2培养基中添加不同氨基酸的情况下线虫的粘附率和死亡率

注：表中数值为平均值±标准误(n＝3)，同行数据后上方的字母表示在 0.05水平上差异显著。

实施例3

分别按照实施例1和对比例1中培养基的配制方法，在培养基中分别加 入甘氨酸、丝氨酸、L-蛋氨酸，L-亮氨酸，各100μg/ml，以不加入氨基酸为 对照组。接种真菌8天后，收集Esteya vermicola菌落的孢子。将收集到的不 同氨基酸培养基培养的孢子悬浮液200μl，均匀的加入到培养皿底部。在25℃ 下分别暴露0.5，1，8，24小时。之后加入1ml的无菌水，用玻璃棒搅拌孢子。 吸取200μl孢子悬浮液，加入水琼脂上，培养24小时后检测孢子的萌发率。

将Esteya vermicola真菌转接到在加入四种不同氨基酸培养基中，培养8 天后，收集Esteya vermicola菌落的孢子。将Esteya vermicola孢子涂布在水琼 脂培养基上。将涂布孢子的培养基放在紫外灯G40T10下分别照射2,4,6,8 分钟，以不照射紫外灯作为对照组。将紫外灯照射处理的培养基放在培养箱 中26℃黑暗培养24小时，统计孢子的萌发率，结果见表3。每组进行3次重 复试验处理。

表3培养基中添加不同氨基酸的情况下孢子的萌发率

注：表中数值为平均值±标准误(n＝3)，同行数据后上方的字母表示在 0.05水平上差异显著。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用 本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易 见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下， 在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例， 而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (8)

1.一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基，其特征在于，具体组成如下：马铃薯170-230g/L，葡萄糖15-25g/L，琼脂17-23g/L，甘氨酸0.05-0.15g/L，氯化钙4-6g/L；pH为6-9。

2.根据权利要求1所述的一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基，其特征在于，具体组成如下：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L，琼脂20g/L，甘氨酸0.1g/L，氯化钙5g/L。

3.根据权利要求1或2所述的一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基，其特征在于，所述马铃薯为去皮马铃薯。

4.根据权利要求1或2所述的一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基，其特征在于，所述pH为7。

5.根据权利要求1-4任一项所述的一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基的制备方法，其特征在于，具体步骤如下：

(1)将马铃薯去皮切碎，加水煮沸，纱布过滤，收集滤液；

(2)加入葡萄糖、琼脂、甘氨酸、氯化钙，加蒸馏水，调节pH值，定容；

(3)将定容后的溶液于121℃，1.05×10⁵Pa下高压灭菌20min，得到培养基。

6.根据权利要求5所述的一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基的制备方法，其特征在于，步骤(2)加水煮沸30min。

7.根据权利要求1-6任一项所述的一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基在培养松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola中的应用，其特征在于，将Esteya vermicola接种到培养基上培养，培养温度为23-31℃，培养时间为7-14天。

8.根据权利要求7所述的一种提高松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola生长速度及抗逆性的培养基在培养松材线虫内寄生真菌Esteya vermicola中的应用，其特征在于，培养温度为26℃，培养时间为7天。