JP3331204B2 - 半連続培養によるタキソールの大量生産方法 - Google Patents
半連続培養によるタキソールの大量生産方法Info
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
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Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明はイチイ(Taxus)属植
物の細胞培養物由来のタキソールの大量生産方法に関す
る。より具体的には、イチイ属植物細胞の半連続培養に
よる、タキソールを高収率で大量生産する方法に関す
る。
物の細胞培養物由来のタキソールの大量生産方法に関す
る。より具体的には、イチイ属植物細胞の半連続培養に
よる、タキソールを高収率で大量生産する方法に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】タキサンはタキサン骨格を有するジテル
ペン化合物である。例えば、タイヘイヨウイチイ(Taxus
brevifolia)の樹皮より単離されたタキソールは、タキ
サン環を有する最初に同定された化合物として有名であ
り、白血病および癌の治療に有効である。最近、タキソ
ールは微小管の解重合を抑制することにより卵巣癌、乳
癌および肺癌患者のそれぞれ約30%、50%および20%を治
すことが可能であると報告された(E.K. Rowinskyら, J.
Natl. Cancer. Inst., 82:1247-1259 (1990) 参照)。
ペン化合物である。例えば、タイヘイヨウイチイ(Taxus
brevifolia)の樹皮より単離されたタキソールは、タキ
サン環を有する最初に同定された化合物として有名であ
り、白血病および癌の治療に有効である。最近、タキソ
ールは微小管の解重合を抑制することにより卵巣癌、乳
癌および肺癌患者のそれぞれ約30%、50%および20%を治
すことが可能であると報告された(E.K. Rowinskyら, J.
Natl. Cancer. Inst., 82:1247-1259 (1990) 参照)。
【０００３】他方、タキソールを調製するため、全化学
合成法、半合成法および抽出法が用いられてきた。しか
し、全化学合成法はタキソールの複雑な化学構造から予
想できるように非常に高価な試薬を必要とし、また収率
もそれほど高くないので、本分野では実際には使用され
ていない。10-デアセチルバッカチンIII等の前駆体を用
いる半合成法は、イチイ属植物からタキソール前駆体を
単離精製し、さらにタキソール前駆体をタキソールへ変
換する複雑で多数の工程を本質的に必要とするため、幾
つかの欠点がある。この点で、タキソールをイチイ属植
物から直接単離することができる抽出法は経済的な利点
を有するため、本分野で普及した。しかし、この方法は
タキソールを精製するために大量のイチイの樹を本質的
に必要とし、それは最終的には深刻な環境破壊を引き起
こす、という意味でさほど満足すべきものでないことが
示された。
合成法、半合成法および抽出法が用いられてきた。しか
し、全化学合成法はタキソールの複雑な化学構造から予
想できるように非常に高価な試薬を必要とし、また収率
もそれほど高くないので、本分野では実際には使用され
ていない。10-デアセチルバッカチンIII等の前駆体を用
いる半合成法は、イチイ属植物からタキソール前駆体を
単離精製し、さらにタキソール前駆体をタキソールへ変
換する複雑で多数の工程を本質的に必要とするため、幾
つかの欠点がある。この点で、タキソールをイチイ属植
物から直接単離することができる抽出法は経済的な利点
を有するため、本分野で普及した。しかし、この方法は
タキソールを精製するために大量のイチイの樹を本質的
に必要とし、それは最終的には深刻な環境破壊を引き起
こす、という意味でさほど満足すべきものでないことが
示された。
【０００４】したがって、全化学合成法、半合成法およ
び抽出法の、世界中の化学療法用途にタキソールを提供
する能力は保証されていない；そこで、タキソール生産
の別の手段を研究し、開発する強い理由が存在する。上
記の問題を解決するための有望な別の手段として、タキ
ソール生産のための細胞培養が本分野で提案された。細
胞培養に基づくタキソール生産方法は、先行技術と違っ
て、以下の利点を有する。第１に、胴枯れ病や害虫等に
よる損害によるイチイ植物供給の変動に関わらず、タキ
ソールが安定した方法で生産できる。第２に、細胞培養
物を大きなバイオリアクターの中で増殖させ、そして培
養条件を操作することによってそこからタキソールを大
量に生産させることができる。第３に、他の先行技術の
方法と比較して、細胞培養物はより単純な範囲の化合物
を生成するので、分離および精製がかなり単純化され
る。第４に、他の方法に較べ、細胞培養プロセスは急激
な需要の変化に迅速に適合できる。第５に、細胞培養プ
ロセスにより、タキソールおよびタキソールに変換可能
なバッカチン等のタキサン前駆体を生産できる。
び抽出法の、世界中の化学療法用途にタキソールを提供
する能力は保証されていない；そこで、タキソール生産
の別の手段を研究し、開発する強い理由が存在する。上
記の問題を解決するための有望な別の手段として、タキ
ソール生産のための細胞培養が本分野で提案された。細
胞培養に基づくタキソール生産方法は、先行技術と違っ
て、以下の利点を有する。第１に、胴枯れ病や害虫等に
よる損害によるイチイ植物供給の変動に関わらず、タキ
ソールが安定した方法で生産できる。第２に、細胞培養
物を大きなバイオリアクターの中で増殖させ、そして培
養条件を操作することによってそこからタキソールを大
量に生産させることができる。第３に、他の先行技術の
方法と比較して、細胞培養物はより単純な範囲の化合物
を生成するので、分離および精製がかなり単純化され
る。第４に、他の方法に較べ、細胞培養プロセスは急激
な需要の変化に迅速に適合できる。第５に、細胞培養プ
ロセスにより、タキソールおよびタキソールに変換可能
なバッカチン等のタキサン前駆体を生産できる。
【０００５】培養した植物細胞を用いてタキソールを生
産する方法が本分野で記述されている。USP 5,019,504
はタイヘイヨウイチイの培養細胞を用いてタキソールお
よびその誘導体を生産する方法を開示している。しか
し、ここに記載されたタキソールの収率は 1〜3 mg/L
で、これは産業上の利用には不十分である。そのうえ、
細胞培養によるタキソールの生産は不安定で、選択によ
り高生産性の一次細胞が得られた場合でも、継代培養に
よってその含量を維持することは困難である (E.R.M.Wi
ckremesineら, World Congress on Cell and Tissue Cu
lture (1992) 参照)。
産する方法が本分野で記述されている。USP 5,019,504
はタイヘイヨウイチイの培養細胞を用いてタキソールお
よびその誘導体を生産する方法を開示している。しか
し、ここに記載されたタキソールの収率は 1〜3 mg/L
で、これは産業上の利用には不十分である。そのうえ、
細胞培養によるタキソールの生産は不安定で、選択によ
り高生産性の一次細胞が得られた場合でも、継代培養に
よってその含量を維持することは困難である (E.R.M.Wi
ckremesineら, World Congress on Cell and Tissue Cu
lture (1992) 参照)。
【０００６】USP 5,015,744は、タキソールの生合成に
おける前駆体であるバッカチンIIIからの半合成法を教
示する。植物組織培養の使用により、バッカチンIII等
の半合成プロセスのための原料が生成されうる。したが
って、植物組織培養は上記の半合成法によるタキソール
の生産方法にも利用することができる。W0 93/17121
は、培地の組成、増殖速度、および生産速度等を変えな
がらイチイ属植物の細胞を培養することによるタキソー
ルの生産方法を提案する。中国イチイ(Taxus chinensi
s)の場合、18日の培養で24.1mg/Lのタキソールが得ら
れ、バイオマスは2.5日毎に２倍になる。
おける前駆体であるバッカチンIIIからの半合成法を教
示する。植物組織培養の使用により、バッカチンIII等
の半合成プロセスのための原料が生成されうる。したが
って、植物組織培養は上記の半合成法によるタキソール
の生産方法にも利用することができる。W0 93/17121
は、培地の組成、増殖速度、および生産速度等を変えな
がらイチイ属植物の細胞を培養することによるタキソー
ルの生産方法を提案する。中国イチイ(Taxus chinensi
s)の場合、18日の培養で24.1mg/Lのタキソールが得ら
れ、バイオマスは2.5日毎に２倍になる。
【０００７】これらの特許はすべて、バッチ培養を採用
することによるタキソールの大量生産方法を記述してい
る。タキソール生産性細胞系の半連続培養について、上
記特許には何の教示もなく、また予想できるものでもな
い。このような状況下で、USP 5,407,816は、中国イチ
イの細胞を栄養培地に接種して懸濁物を形成し、次にこ
の懸濁物を培養して懸濁培養物を形成し、次にこれを別
の栄養培地で継代培養し、生産性培養物を形成したとこ
ろ、この培養物は最終的に153 mg/Lの収量でタキソール
およびタキサンを生じる、と記述している。この方法は
タキソールの生産性をかなり改善したが、この方法は組
成が非常に複雑な多数の栄養培地を本質的に必要とし、
またかなり限定された増殖条件のもとで高い生産性が実
現される、という意味でさほど満足すべきものではない
ことが示された。
することによるタキソールの大量生産方法を記述してい
る。タキソール生産性細胞系の半連続培養について、上
記特許には何の教示もなく、また予想できるものでもな
い。このような状況下で、USP 5,407,816は、中国イチ
イの細胞を栄養培地に接種して懸濁物を形成し、次にこ
の懸濁物を培養して懸濁培養物を形成し、次にこれを別
の栄養培地で継代培養し、生産性培養物を形成したとこ
ろ、この培養物は最終的に153 mg/Lの収量でタキソール
およびタキサンを生じる、と記述している。この方法は
タキソールの生産性をかなり改善したが、この方法は組
成が非常に複雑な多数の栄養培地を本質的に必要とし、
またかなり限定された増殖条件のもとで高い生産性が実
現される、という意味でさほど満足すべきものではない
ことが示された。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】したがって、工業的用
途に使用できるかどうかを決める重大な因子である高い
生産性という要求を満たすことのできる、タキソール生
産のための実用的で簡素な方法を開発する必要が継続し
ている。本発明によれば、新規なタキソール生産性細胞
系Taxus chinensis SYG-1の半連続培養により、タキソ
ールを高い効率で生産できることが見いだされた。した
がって、本発明の第１の目的は半連続培養によるタキソ
ールの大量生産方法を提供することである。
途に使用できるかどうかを決める重大な因子である高い
生産性という要求を満たすことのできる、タキソール生
産のための実用的で簡素な方法を開発する必要が継続し
ている。本発明によれば、新規なタキソール生産性細胞
系Taxus chinensis SYG-1の半連続培養により、タキソ
ールを高い効率で生産できることが見いだされた。した
がって、本発明の第１の目的は半連続培養によるタキソ
ールの大量生産方法を提供することである。
【０００９】本発明の別の目的は、中国イチイから単離
された新規なタキソール生産性細胞系を提供することで
ある。本発明の上記および他の目的、ならびに特徴は、
添付の図面と共に提供される以下の説明により明らかに
なるであろう。
された新規なタキソール生産性細胞系を提供することで
ある。本発明の上記および他の目的、ならびに特徴は、
添付の図面と共に提供される以下の説明により明らかに
なるであろう。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明者らは先ず中国イ
チイから誘導されたカルスをベースとしてタキソール生
産性細胞系を開発し、そしてその細胞系を本分野で公知
の細胞系と比較した。タキソール生産性細胞系の形態、
生理および増殖条件の比較研究から、新たに開発された
細胞系はタキソール生産性、タキソール分泌様式、等に
鑑みて先行技術の細胞系と幾分異なった、新規な細胞系
であることが確認された。したがって、この細胞系をTa
xus chinensis SYG-1 (以後便宜のため「SYG-1」と呼
ぶ)と名付け、Korean Collection for Type Cultures
(KCTC)、国際寄託機関(IDA)に受託番号 KCTC 0232BPの
もとに1996年3月14日に寄託した。
チイから誘導されたカルスをベースとしてタキソール生
産性細胞系を開発し、そしてその細胞系を本分野で公知
の細胞系と比較した。タキソール生産性細胞系の形態、
生理および増殖条件の比較研究から、新たに開発された
細胞系はタキソール生産性、タキソール分泌様式、等に
鑑みて先行技術の細胞系と幾分異なった、新規な細胞系
であることが確認された。したがって、この細胞系をTa
xus chinensis SYG-1 (以後便宜のため「SYG-1」と呼
ぶ)と名付け、Korean Collection for Type Cultures
(KCTC)、国際寄託機関(IDA)に受託番号 KCTC 0232BPの
もとに1996年3月14日に寄託した。
【００１１】次に、発明者らは本発明の細胞系の増殖条
件を最適化し、そしてSYG-1細胞はB5培地、最も好まし
くは20μM NAA(ナフトキシ酢酸)、0.4μM BAP(6-ベンジ
ルアミノプリン)、1 g/Lカゼイン加水分解物および30g/
Lスクロースを補充したB5培地で、温度24℃の条件下
で、攪拌速度150 rpmで良好に増殖することを確認し
た。他方、タキソールの生産性に対するAgN03、NH4-ク
エン酸塩およびマルトースの効果もまた検討し、そして
発明者らはこれらの添加はタキソールの生産性をかなり
向上させると結論した。
件を最適化し、そしてSYG-1細胞はB5培地、最も好まし
くは20μM NAA(ナフトキシ酢酸)、0.4μM BAP(6-ベンジ
ルアミノプリン)、1 g/Lカゼイン加水分解物および30g/
Lスクロースを補充したB5培地で、温度24℃の条件下
で、攪拌速度150 rpmで良好に増殖することを確認し
た。他方、タキソールの生産性に対するAgN03、NH4-ク
エン酸塩およびマルトースの効果もまた検討し、そして
発明者らはこれらの添加はタキソールの生産性をかなり
向上させると結論した。
【００１２】
【発明の実施の形態】本発明によれば、下記の工程を含
んでなるSYG-1の半連続培養を用いることにより、タキ
ソールを高い収率で調製することが可能である。すなわ
ち: (i)イチイ属植物細胞を1〜10%(w/v)の糖を含有する培地
に接種し、これをインキュベートし；そして(ii)上記の
工程(i)で得られた培養物の1/10から1/2容量を新鮮な培
地に移して上記の工程(i)を繰り返し、残りの培養物に1
〜10%(w/v)の糖を添加し、そしてタキソールの最大生産
時までインキュベートする工程である。
んでなるSYG-1の半連続培養を用いることにより、タキ
ソールを高い収率で調製することが可能である。すなわ
ち: (i)イチイ属植物細胞を1〜10%(w/v)の糖を含有する培地
に接種し、これをインキュベートし；そして(ii)上記の
工程(i)で得られた培養物の1/10から1/2容量を新鮮な培
地に移して上記の工程(i)を繰り返し、残りの培養物に1
〜10%(w/v)の糖を添加し、そしてタキソールの最大生産
時までインキュベートする工程である。
【００１３】培養の始めに、AgN03をイチイ属植物細胞
培養物に添加し、これを10〜20日間、より好ましくは10
〜15日間、1〜15μM、より好ましくは5〜10μMの濃度で
インキュベートすることができる。さらに、NH4-クエン
酸塩およびマルトースを、インキュベーション開始後5
〜30日目に、より好ましくは5〜10日目に、それぞれ1〜
15 mM、より好ましくは1〜10 mM、および1〜10%(w/v)、
より好ましくは1〜5%(w/v)の濃度で培養物に添加するこ
とができる。
培養物に添加し、これを10〜20日間、より好ましくは10
〜15日間、1〜15μM、より好ましくは5〜10μMの濃度で
インキュベートすることができる。さらに、NH4-クエン
酸塩およびマルトースを、インキュベーション開始後5
〜30日目に、より好ましくは5〜10日目に、それぞれ1〜
15 mM、より好ましくは1〜10 mM、および1〜10%(w/v)、
より好ましくは1〜5%(w/v)の濃度で培養物に添加するこ
とができる。
【００１４】インキュベーション開始後5〜30日目に、
全培養物の1/10から1/2容量を新鮮な培地（この内容物
は培養の始めに用いられたものと同じである）を含有す
る別のフラスコに移し、培養サイクルを開始する。次
に、全培養物の9/10から1/2に相当する残りの培養物
に、1〜10%(w/v)、より好ましくは1〜5%(w/v)のマルト
ースを添加し、30〜60日間インキュベートする。この間
にタキソールの生産が最大となる。この時、インキュベ
ーションは24℃で、攪拌速度150 rpmで、暗条件下で行
われる。
全培養物の1/10から1/2容量を新鮮な培地（この内容物
は培養の始めに用いられたものと同じである）を含有す
る別のフラスコに移し、培養サイクルを開始する。次
に、全培養物の9/10から1/2に相当する残りの培養物
に、1〜10%(w/v)、より好ましくは1〜5%(w/v)のマルト
ースを添加し、30〜60日間インキュベートする。この間
にタキソールの生産が最大となる。この時、インキュベ
ーションは24℃で、攪拌速度150 rpmで、暗条件下で行
われる。
【００１５】本発明の方法に用いられるイチイ属植物
は、タイヘイヨウイチイ、カナダイチイ(Taxus canaden
sis)、イチイ(Taxus cuspidata)、セイヨウイチイ(Taxu
s baccata)、メキシコイチイ(Taxus globosa)、フロリ
ダイチイ(Taxus floridana)、インドイチイ(Taxus wall
ichiana)、タクスス・メディア(Taxus media)および中
国イチイを含むが、本発明者らによって新たに開発され
たTaxus chinensis SYG-1が最も好ましく用いられる。
本発明の方法によれば、タキソールの生産性を改善する
ためAgN03、NH4-クエン酸塩およびマルトースを添加す
る半連続培養にTaxus chinensis SYG-1を用いた場合、
インキュベーション開始後42〜49日目に300 mg/Lという
レベルのタキソール生産性が観察される。
は、タイヘイヨウイチイ、カナダイチイ(Taxus canaden
sis)、イチイ(Taxus cuspidata)、セイヨウイチイ(Taxu
s baccata)、メキシコイチイ(Taxus globosa)、フロリ
ダイチイ(Taxus floridana)、インドイチイ(Taxus wall
ichiana)、タクスス・メディア(Taxus media)および中
国イチイを含むが、本発明者らによって新たに開発され
たTaxus chinensis SYG-1が最も好ましく用いられる。
本発明の方法によれば、タキソールの生産性を改善する
ためAgN03、NH4-クエン酸塩およびマルトースを添加す
る半連続培養にTaxus chinensis SYG-1を用いた場合、
インキュベーション開始後42〜49日目に300 mg/Lという
レベルのタキソール生産性が観察される。
【００１６】タキソールの定量分析 Taxus chinensis SYG-1の培養物から本発明の方法によ
って生産されたタキソールは、下記の表1に記載の特定
の条件のもとで高速液体クロマトグラフィーを用いて定
量的にアッセイされる。
って生産されたタキソールは、下記の表1に記載の特定
の条件のもとで高速液体クロマトグラフィーを用いて定
量的にアッセイされる。
【００１７】
【表１】
【００１８】本発明を以下の実施例においてさらに説明
するが、それらは本発明の範囲を制限するものではな
い。
するが、それらは本発明の範囲を制限するものではな
い。
【００１９】
【実施例】実施例1：中国イチイからのカルスの誘導お
よびその特徴付け 本発明の細胞系は、カルス誘導によって中国イチイから
単離された。ホルモンを含有する適切な培地を用いて植
物組織をインキュベートすると、未分化細胞であるカル
スが誘導された。中国イチイの樹皮、葉、幹および根由
来の組織を水道水で洗浄し、次亜塩素酸カルシウム溶液
で20〜30分間滅菌した。次に、滅菌した組織を蒸留水で
2〜3回洗浄し、長さ1 cmに刻み、そして20μM NAA(ナフ
トキシ酢酸)、0.4μM BAP (6-ベンジルアミノプリン)、
1 g/Lカゼイン加水分解物および30 g/Lスクロースを0.2
%(w/w)ゼライト(gelite)で固形化した後に補充したB5培
地(Gamborgら, Can. J. Biochem., 46:417-421 (1968)
参照)に移し、24〜26℃で2〜6週間暗条件下でインキュ
ベートし、目的のカルスを誘導した。
よびその特徴付け 本発明の細胞系は、カルス誘導によって中国イチイから
単離された。ホルモンを含有する適切な培地を用いて植
物組織をインキュベートすると、未分化細胞であるカル
スが誘導された。中国イチイの樹皮、葉、幹および根由
来の組織を水道水で洗浄し、次亜塩素酸カルシウム溶液
で20〜30分間滅菌した。次に、滅菌した組織を蒸留水で
2〜3回洗浄し、長さ1 cmに刻み、そして20μM NAA(ナフ
トキシ酢酸)、0.4μM BAP (6-ベンジルアミノプリン)、
1 g/Lカゼイン加水分解物および30 g/Lスクロースを0.2
%(w/w)ゼライト(gelite)で固形化した後に補充したB5培
地(Gamborgら, Can. J. Biochem., 46:417-421 (1968)
参照)に移し、24〜26℃で2〜6週間暗条件下でインキュ
ベートし、目的のカルスを誘導した。
【００２０】カルスを本分野で周知の幾つかの培地、例
えばMS (Murashige T. および F. Skoog F., Physiol.
Plant, 5:473 (1962) 参照)、SH (SchenkおよびHilderb
randt, Can. J. Bot., 50:199-204 (1972) 参照)、WPM
(LloydおよびMccown, Int. Plant Prop. Soc. Proc., 3
0:421-427 (1981) 参照)およびB5培地(前出)にそれぞれ
移して、肉眼でカルスの増殖パターンを観察することに
より、カルスの増殖培地を選択した。上の結果から、カ
ルスは20μM NAA、0.4μM BAPおよび2 g/Lカゼイン加水
分解物を含有するB5培地で良好な増殖を示すことが確認
された。
えばMS (Murashige T. および F. Skoog F., Physiol.
Plant, 5:473 (1962) 参照)、SH (SchenkおよびHilderb
randt, Can. J. Bot., 50:199-204 (1972) 参照)、WPM
(LloydおよびMccown, Int. Plant Prop. Soc. Proc., 3
0:421-427 (1981) 参照)およびB5培地(前出)にそれぞれ
移して、肉眼でカルスの増殖パターンを観察することに
より、カルスの増殖培地を選択した。上の結果から、カ
ルスは20μM NAA、0.4μM BAPおよび2 g/Lカゼイン加水
分解物を含有するB5培地で良好な増殖を示すことが確認
された。
【００２１】次に、このようにして誘導した細胞系につ
いて、形態、生理および増殖条件に関する研究を行い、
そして本分野で公知の細胞系と比較した。結果を下記の
表2および3にまとめた。表2および3から分かるように、
本発明において開発された細胞系は、タキソール生産性
およびタキソール分泌様式、等の点で先行技術の細胞系
と区別される特徴を有する。したがって、この細胞系を
Taxus chinensis SYG-1と名付け、Korean Collection f
or Type Cultures (KCTC)、国際寄託機関(IDA)に受託番
号 KCTC 0232BPのもとに1996年3月14日に寄託した。
いて、形態、生理および増殖条件に関する研究を行い、
そして本分野で公知の細胞系と比較した。結果を下記の
表2および3にまとめた。表2および3から分かるように、
本発明において開発された細胞系は、タキソール生産性
およびタキソール分泌様式、等の点で先行技術の細胞系
と区別される特徴を有する。したがって、この細胞系を
Taxus chinensis SYG-1と名付け、Korean Collection f
or Type Cultures (KCTC)、国際寄託機関(IDA)に受託番
号 KCTC 0232BPのもとに1996年3月14日に寄託した。
【００２２】
【表２】
【００２３】
【表３】
【００２４】実施例2：SYG-1の懸濁培養 SYG-1の懸濁培養に最も好ましい培地を選択するため、
この細胞系をそれぞれMS、SH、WPMおよびB5培地に移
し、実施例1と同様に増殖パターンを観察した。その結
果、SYG-1細胞はカルス同様、20μM NAA、0.4μM BAPお
よび2 g/Lカゼイン加水分解物を含有するB5培地で良好
に増殖した。さらに、SYG-1細胞は24℃の温度で、攪拌
速度150 rpmで良好に増殖することも確認された。
この細胞系をそれぞれMS、SH、WPMおよびB5培地に移
し、実施例1と同様に増殖パターンを観察した。その結
果、SYG-1細胞はカルス同様、20μM NAA、0.4μM BAPお
よび2 g/Lカゼイン加水分解物を含有するB5培地で良好
に増殖した。さらに、SYG-1細胞は24℃の温度で、攪拌
速度150 rpmで良好に増殖することも確認された。
【００２５】固形化培地の場合は、ピンセットで組織の
一部を移しながらカルスの連続培養を4週間毎に行っ
た。カルスの一片を固形培地のプレート上で維持した。
次に、固形培地上で維持したカルスを少量のB5培地に接
種し、細胞が増殖して培養物の全容量が増加するにつ
れ、少量の培地を培養物に補充した。次に、良好に増殖
した細胞系を500 mlの三角フラスコに入れた改変B5培地
中で1/5(v/v)の比率で希釈し、2週間ごとに懸濁培養培
地に接種した。
一部を移しながらカルスの連続培養を4週間毎に行っ
た。カルスの一片を固形培地のプレート上で維持した。
次に、固形培地上で維持したカルスを少量のB5培地に接
種し、細胞が増殖して培養物の全容量が増加するにつ
れ、少量の培地を培養物に補充した。次に、良好に増殖
した細胞系を500 mlの三角フラスコに入れた改変B5培地
中で1/5(v/v)の比率で希釈し、2週間ごとに懸濁培養培
地に接種した。
【００２６】実施例3：タキソール生産性に対するAgN03
の効果 AgN03は、植物細胞の成長および二次代謝物の生産に影
響を及ぼす植物ホルモン、エチレンのアンタゴニストで
あることが周知である。したがって、本発明者らは SYG
-1の懸濁培養におけるAgN03のタキソール生産性に対す
る効果を試験した。250mlの三角フラスコに、10μMのAg
N03および25 mlの14日齢細胞培養物を含有する75 mlのB
5培地を注ぎ、実施例2と同様にインキュベートした。次
に、タキソールの生産性をAgN03を含まない対照と比較
した(図1参照)。図1から分かるように、AgN03を培地に
加えた時(−●−)のタキソール生産量98.95 mg/Lは、対
照(−○−)の4.7倍であることが明確に確認された。
の効果 AgN03は、植物細胞の成長および二次代謝物の生産に影
響を及ぼす植物ホルモン、エチレンのアンタゴニストで
あることが周知である。したがって、本発明者らは SYG
-1の懸濁培養におけるAgN03のタキソール生産性に対す
る効果を試験した。250mlの三角フラスコに、10μMのAg
N03および25 mlの14日齢細胞培養物を含有する75 mlのB
5培地を注ぎ、実施例2と同様にインキュベートした。次
に、タキソールの生産性をAgN03を含まない対照と比較
した(図1参照)。図1から分かるように、AgN03を培地に
加えた時(−●−)のタキソール生産量98.95 mg/Lは、対
照(−○−)の4.7倍であることが明確に確認された。
【００２７】実施例4：タキソール生産性に対するNH4-
クエン酸塩の効果 NH4-クエン酸塩を添加した後、SYG-1の懸濁培養におけ
るタキソールの生産性をモニターした。250 mlの三角フ
ラスコに75 mlのB5培地を注ぎ、この培地に25mlの14日
齢細胞培養物を接種して、実施例2に記載の増殖条件と
同一の条件でインキュベートした。9日間のインキュベ
ーション後、5 mMのNH4-クエン酸塩を培養物に加え、NH
4-クエン酸塩を添加しなかった対照とタキソール生産性
を比較した(図2参照)。図2から分かるように、NH4-クエ
ン酸塩を培地に加えた時(−●−)のタキソール生産量は
約103.6 mg/Lで、これは対照(−○−)の4.9倍であるこ
とが確認された。
クエン酸塩の効果 NH4-クエン酸塩を添加した後、SYG-1の懸濁培養におけ
るタキソールの生産性をモニターした。250 mlの三角フ
ラスコに75 mlのB5培地を注ぎ、この培地に25mlの14日
齢細胞培養物を接種して、実施例2に記載の増殖条件と
同一の条件でインキュベートした。9日間のインキュベ
ーション後、5 mMのNH4-クエン酸塩を培養物に加え、NH
4-クエン酸塩を添加しなかった対照とタキソール生産性
を比較した(図2参照)。図2から分かるように、NH4-クエ
ン酸塩を培地に加えた時(−●−)のタキソール生産量は
約103.6 mg/Lで、これは対照(−○−)の4.9倍であるこ
とが確認された。
【００２８】実施例5：タキソール生産性に対するマル
トースの効果 植物細胞培養物における糖濃度の増加は、二次代謝物生
産の増加をもたらすことがよく知られている。例えば、
3%(w/v)スクロースおよび5%(w/v)マンニトールの添加が
Daucus(ニンジン属)carotaのカルス培養におけるアント
シアニンの生産性を改善したことが報告されている(Kno
bloch, K.-H.ら, Zeiteshrift fur Natruforschung, 35
c:55-556 (1981) 参照)。また、88 mMスクロースおよび
165 mMマンニトールは、Vitis(ブドウ属)viniferaの懸
濁培養におけるアントシアニンの生産性を増大させた(R
ajendran, L. ら, Biotechnology Letters, 14(8): 707
-712 (1992) 参照)。他方、ある濃度を超えて糖を添加
した場合、恐らく浸透圧のためと思われる、増殖および
二次代謝物生産の低下もまた報告されている(Do, C. B.
および Cormier, F., Plant Cell Reports, 9:500-504
(1990) 参照)。SYG-1へのマルトース添加の効果を評価
した。
トースの効果 植物細胞培養物における糖濃度の増加は、二次代謝物生
産の増加をもたらすことがよく知られている。例えば、
3%(w/v)スクロースおよび5%(w/v)マンニトールの添加が
Daucus(ニンジン属)carotaのカルス培養におけるアント
シアニンの生産性を改善したことが報告されている(Kno
bloch, K.-H.ら, Zeiteshrift fur Natruforschung, 35
c:55-556 (1981) 参照)。また、88 mMスクロースおよび
165 mMマンニトールは、Vitis(ブドウ属)viniferaの懸
濁培養におけるアントシアニンの生産性を増大させた(R
ajendran, L. ら, Biotechnology Letters, 14(8): 707
-712 (1992) 参照)。他方、ある濃度を超えて糖を添加
した場合、恐らく浸透圧のためと思われる、増殖および
二次代謝物生産の低下もまた報告されている(Do, C. B.
および Cormier, F., Plant Cell Reports, 9:500-504
(1990) 参照)。SYG-1へのマルトース添加の効果を評価
した。
【００２９】250 mlの三角フラスコに75 mlのB5培地を
注ぎ、この培地に25 mlの14日齢細胞培養物を接種し
て、実施例2に記載の増殖条件と同一の条件でインキュ
ベートした。次に、2%(w/v)および3%(w/v)のマルトース
をそれぞれインキュベーション開始後9日目および21日
目に培養物に添加した。そして、タキソールの生産性を
マルトースを含有しない対照と比較した(図3参照)。図3
から分かるように、マルトースを培地に加えた時(−●
−)のタキソール生産量は112.75 mg/Lで、これは対照
(−○−)の5.3倍であることが確認された。
注ぎ、この培地に25 mlの14日齢細胞培養物を接種し
て、実施例2に記載の増殖条件と同一の条件でインキュ
ベートした。次に、2%(w/v)および3%(w/v)のマルトース
をそれぞれインキュベーション開始後9日目および21日
目に培養物に添加した。そして、タキソールの生産性を
マルトースを含有しない対照と比較した(図3参照)。図3
から分かるように、マルトースを培地に加えた時(−●
−)のタキソール生産量は112.75 mg/Lで、これは対照
(−○−)の5.3倍であることが確認された。
【００３０】実施例6：SYG-1の半連続培養 実施例2から5で得られた結果に基づいて、SYG-1の半連
続培養を用いてタキソールを調製した。250 mlの三角フ
ラスコに80 mlの増殖培地と20 mlの14日齢SYG-1培養物
を加え、そして培養の始めに10μM AgN03を加え、次に5
mM NH4-クエン酸塩および2%(w/v)マルトースをインキ
ュベーション開始後9日目に加えた。インキュベーショ
ン開始後21日目に、全培養物の1/5容量に相当する20 ml
の培養物を80 mlの新鮮な培地を含有する別のフラスコ
に移し、別の培養サイクルを開始させた。次に、全培養
物の4/5容量に相当する80mIの残った培養物に、3%(w/v)
マルトースを添加し、さらに21日間インキュベートし
た。この期間にタキソール生産は最大となる。この時、
インキュベーションは24℃で、攪拌速度150 rpmで実施
した。培養物サンプルを採取し、定期的に微生物汚染を
チェックした。また、培養物中に生産されたタキソール
の量を上記のように高速液体クロマトグラフィー(HPLC,
Waters,U.S.A.)を用いて測定した。その結果、微生物
汚染は観察されず、また、42日間インキュベーションし
た後のタキソール生産性は284 mg/Lであることが確認さ
れた(図4参照)。図4から分かるように、タキソール濃度
は培養サイクルを繰り返すにつれ増大した。
続培養を用いてタキソールを調製した。250 mlの三角フ
ラスコに80 mlの増殖培地と20 mlの14日齢SYG-1培養物
を加え、そして培養の始めに10μM AgN03を加え、次に5
mM NH4-クエン酸塩および2%(w/v)マルトースをインキ
ュベーション開始後9日目に加えた。インキュベーショ
ン開始後21日目に、全培養物の1/5容量に相当する20 ml
の培養物を80 mlの新鮮な培地を含有する別のフラスコ
に移し、別の培養サイクルを開始させた。次に、全培養
物の4/5容量に相当する80mIの残った培養物に、3%(w/v)
マルトースを添加し、さらに21日間インキュベートし
た。この期間にタキソール生産は最大となる。この時、
インキュベーションは24℃で、攪拌速度150 rpmで実施
した。培養物サンプルを採取し、定期的に微生物汚染を
チェックした。また、培養物中に生産されたタキソール
の量を上記のように高速液体クロマトグラフィー(HPLC,
Waters,U.S.A.)を用いて測定した。その結果、微生物
汚染は観察されず、また、42日間インキュベーションし
た後のタキソール生産性は284 mg/Lであることが確認さ
れた(図4参照)。図4から分かるように、タキソール濃度
は培養サイクルを繰り返すにつれ増大した。
【００３１】
【発明の効果】上に明確に説明され、かつ実証されてい
るように、本発明はイチイ属植物の半連続培養による、
タキソールを高収率で大量生産する方法に関する。本発
明によれば、タキソールの生産性を改善するためAgN
03、NH4-クエン酸塩およびマルトースを添加する半連続
培養にTaxus chinensis SYG-1を用いた場合、インキュ
ベーション開始後40〜50日目に300 mg/Lというレベルの
タキソール生産性が観察された。
るように、本発明はイチイ属植物の半連続培養による、
タキソールを高収率で大量生産する方法に関する。本発
明によれば、タキソールの生産性を改善するためAgN
03、NH4-クエン酸塩およびマルトースを添加する半連続
培養にTaxus chinensis SYG-1を用いた場合、インキュ
ベーション開始後40〜50日目に300 mg/Lというレベルの
タキソール生産性が観察された。
【図１】図１は、タキソール生産性に対するAgN03の効
果を示すグラフである。
果を示すグラフである。
【図２】図２は、タキソール生産性に対するNH4-クエン
酸塩の効果を示すグラフである。
酸塩の効果を示すグラフである。
【図３】図３は、タキソール生産性に対するマルトース
の効果を示すグラフである。
の効果を示すグラフである。
【図４】図４は、培養サイクルにしたがった、SYG-1の
半連続培養におけるタキソールの生産性を示すグラフで
ある。
半連続培養におけるタキソールの生産性を示すグラフで
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 スタールフット・ロイ・ウイリアム アメリカ合衆国 94002 カリフォルニ ア ベルモント、 コロネット・ブルバ ード 2320 (72)発明者 キム・サンイク 大韓民国 139−220 ソウル ノウン ク、 チュンゲェドン、 ダエリムビュ クサン・アパート 102−605 (72)発明者 ユン・ジェオンホワン 大韓民国 305−348 タエジョン、 ユ ソンク、 ホワムドン 63−２ (72)発明者 ソン・ボンキュ 大韓民国 305−390 タエジョン ユソ ンク、 ジェオンミンドン 462−４、 チェオングナラエ・アパート 109− 303 (72)発明者 キム・ジンヒュン 大韓民国 302−222 タエジョン、 セ オク、 サムチュンドン、 ソージュ ン・アパート ３−303 (72)発明者 ソン・ジュンセオ 大韓民国 305−390 タエジョン、 ユ ソンク、 ジェオンミンドン 462−４ チェオングナラエ・アパート 104− 305 (72)発明者 ホン・セウンスー 大韓民国 305−390 タエジョン、 ユ ソンク、 ジェオンミンドン 462−４ チェオングナラエ・アパート 109− 404 (72)発明者 リー・ヒュンソー 大韓民国 158−070 ソウル、 ヤンチ ュンク、 シンジュンドン 328、 モ クドンシンシガジ・アパート 1331− 603 審査官 本間 夏子 (56)参考文献 特開 平８−56680（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−140690（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−205881（ＪＰ，Ａ) 特開 平８−154693（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12P 17/02 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
Claims (6)
- 【請求項１】 イチイ属の植物に由来する植物細胞を、
１〜１５μＭのＡｇＮＯ3及び１〜１０％（ｗ／ｖ）の
糖が含まれている培地で培養した後、タキソールを回収
することを特徴とする、タキソールの大量生産方法 - 【請求項２】 ＡｇＮＯ3の濃度が１〜１０μＭであ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 ＡｇＮＯ3の濃度が５〜１０μＭであ
る、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 イチイ属の植物細胞の培養が半連続培養
であることを特徴とする請求項１から３のいずれかに記
載の方法。 - 【請求項５】 イチイ属植物はタイヘイヨウイチイ（Ta
xus brevifolia)、カナダイチイ（Taxus canadensis)、
イチイ（Taxus cuspidata)、セイヨウイチイ(Taxus bac
cata)、メキシコイチイ(Taxus globosa)、フロリダイチ
イ(Taxusfloridana)、インドイチイ(Taxus wallichian
a)、タクスス・メディア(Taxus media)及び中国イチイ
(Taxus chinensis)からなる群より選択された１種であ
ることを特徴とする、請求項１から４のいずれかに記載
の方法。 - 【請求項６】 イチイ属の植物は、Taxus Chinensis SY
G-1(KCTC 0232BP)であることを特徴とする、請求項５に
記載の方法。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1019950010204A KR960037826A (ko) | 1995-04-27 | 1995-04-27 | 택서스속 식물세포의 반연속식 배양방법 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
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|---|---|
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ID=19413178
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| JP2000036519A Expired - Lifetime JP3331204B2 (ja) | 1995-04-27 | 2000-02-15 | 半連続培養によるタキソールの大量生産方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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| DE69735059T2 (de) | 1996-05-24 | 2006-08-31 | Phyton, Inc. | Erhöhte produktion von taxanen durch zellkulturen von taxus-arten |
| TW200304947A (en) * | 2002-02-08 | 2003-10-16 | Bristol Myers Squibb Co | Compositions and methods for latering biosynthesis of taxanes and taxane-related compounds |
| WO2006129988A1 (en) * | 2005-06-03 | 2006-12-07 | Samyang Genex Corporation | Mass production of secondary metabolite in plant cell culture by treatment of saccharide mixture in medicum |
| EP2966165A1 (en) | 2009-04-03 | 2016-01-13 | DianaPlantSciences S.A.S. | Production and extraction of procyanidins from plant cell cultures |
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| CN105349592B (zh) * | 2015-12-09 | 2018-11-27 | 天津艾赛博生物技术有限公司 | 代谢互补的植物细胞系混种培养生产次级代谢产物的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
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| US5019504A (en) * | 1989-03-23 | 1991-05-28 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture | Production of taxol or taxol-like compounds in cell culture |
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| US5407816A (en) * | 1992-02-20 | 1995-04-18 | Phyton Catalytic, Inc. | Enhanced production of taxol and taxanes by cell cultures of taxus species |
| EP0633719A4 (en) * | 1992-04-01 | 1995-12-20 | Union Camp Corp | PROCESS FOR INDUCING SOMATIC EMBRYOGENESIS IN THE -i (TAXUS) AND PRODUCTION OF ALKALOIDS CONTAINING A TAXANE CORE ACCORDING TO THIS PROCESS. |
| US5279953A (en) * | 1992-06-24 | 1994-01-18 | Esca Genetics Corporation | In vivo production of taxanes |
| DE69426692T2 (de) * | 1993-11-15 | 2001-06-21 | Mitsui Chemicals Inc | Methode zur herstellung von taxan-diterpen und methode zum einten von kulturzellen, die taxan-diterpen in hohen ausbeuten herstellen |
-
1995
- 1995-04-27 KR KR1019950010204A patent/KR960037826A/ko active IP Right Grant
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- 1996-04-27 CN CNB011448776A patent/CN1184322C/zh not_active Expired - Lifetime
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- 1996-04-27 WO PCT/KR1996/000060 patent/WO1996034110A1/en active IP Right Grant
-
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