Hintergrund der Erfindung
Technisches Gebiet
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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Massenherstellung von Taxol
aus einer Kultur von Pflanzenzellen der Gattung Taxus, genauer ein Verfahren
zur Massenherstellung von Taxol mittels semi-kontinuierlicher Kultur von
Pflanzenzellen der Gattung Taxus mit hoher Ausbeute.
Beschreibung des Standes der Technik
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Taxane sind Dieterpenverbindungen, welche ein Taxanskelett enthalten. Zum
Beispiel ist das aus der Rinde der pazifischen Eibe, Taxus brevifolia, isolierte
Taxol, welches wirksam ist für die Behandlung von Leukämie und Krebs, berühmt
als die erste identifizierte Verbindung mit einem Taxanring. Kürzlich wurde
berichtet, dass Taxol fähig ist, etwa 30%, 50% und 20% von Eileiter-, Brust- und
Lungenkrebspatienten respektive, durch Inhibierung der Depolymerisation der
Mikrotubuli (vergleiche. E. K. Rowinsky et al.. J. National Cancer Institute,
82: 1247-1259 (1990)) zu heilen.
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Andererseits wurden chemische Vollsynthese-, Halbsynthese- und
Extraktionsverfahren eingesetzt, um Taxol darzustellen.
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Das chemische Vollsyntheseverfahren wurde jedoch noch nicht in der Praxis im
Stand der Technik angewendet, da dieses sehr teure chemische Reagenzien
verlangt und die Ausbeute nicht so hoch ist, was aufgrund der komplizierten
chemischen Struktur von Taxol erwartet werden kann.
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Das Halbsyntheseverfahren, welches Vorstufen, wie beispielsweise
10-Deacetylbaccatin III verwendet, hat einige Nachteile gezeigt, da es im wesentlichen
komplizierte und mehrfache Schritte der Isolierung und Reinigung der Taxolvorstufen
aus der Pflanze der Gattung Taxus sowie die Umwandlung der Vorstufen in Taxol
erfordert.
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Unter diesem Gesichtspunkt hat sich das Extraktionsverfahren, durch welches
Taxol aus Pflanzen der Gattung Taxus in direkter Art und Weise isoliert werden
kann, im Stand der Technik durchgesetzt, da dieses den Vorteil der
Wirtschaftlichkeit besitzt. Jedoch hat sich genanntes Verfahren in dem Sinne als weniger
befriedigend herausgestellt, dass es im wesentlichen eine große Menge an
Eibebäumen benötigt, um Taxol zu reinigen, was letzenendes zu einer ernsthaften
Umweltzerstörung führt.
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Dementsprechend ist die Fähigkeit des chemischen Vollsynthese-, Halbsynthese-
und Extraktionsverfahrens zur Erbringung von Taxol zur weltweiten
chemotherapeutischen Verwendung nicht sichergestellt; und es gibt starke Argumente, die
für die Erforschung und Entwicklung alternativer Mittel zur Taxolproduktion
sprechen.
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Als eine vielversprechende Alternative zur Lösung genannter Probleme wurde im
Stand der Technik das Zellkulturverfahren zur Taxolproduktion vorgeschlagen.
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Das Zellkultur-basierende Verfahren zur Taxolproduktion hat, im Gegensatz zum
Stand der Technik, die folgenden wie nachstehend genannten Vorteile: erstens,
Taxol kann in einer stetigen Art und Weise produziert werden, unabhängig von
der Fluktuation des Bestandes an Eibepflanzen, bedingt durch den Schaden
durch Brand/Mehltau sowie schädliche Insekten, usw. zweitens, Zellkulturen
können in großen Bioreaktoren herangezogen werden, von denen Taxol
umfangreich produziert werden kann, mittels Beeinflußung der Kulturbedinungen;
drittens, Zellkulturen erzeugen ein einfacheres Spektrum an Verbindungen, im
Vergleich zu anderen Verfahren im Stand der Technik, und vereinfachen somit
beträchtlich die Trennung und Aufreinigung; viertens, ein Zellkulturverfahren kann
an schnelle Veränderungen im Bedarf besser als die andere Verfahren angepaßt
werden; fünftens, ein Zellkulturverfahren kann zum einen Taxol erzeugen, als
auch Taxanvorläufer, wie beispielsweise Baccatin, welches in Taxol umgewandelt
werden kann.
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Verfahren zur Herstellung von Taxol unter Verwendung gezüchteter
Pflanzenzellen wurden im Stand der Technik beschrieben:
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USP 5,019,504 offenbart ein Verfahren zur Herstellung von Taxol und seinen
Derivaten unter Verwendung gezüchteter Zellen von Taxus brevifolia. Jedoch
beträgt die darin beschriebene Taxolausbeute 1-3 mg/L, was für die industrielle
Anwendung nicht ausreichend ist. Außerdem ist die Produktion von Taxol durch
die Zellkultur unbeständig, und selbst wenn eine Ausgangszelle von hoher Produktivität
mittels Selektion erhalten werden kann, ist es dennoch schwierig,
deren Gehalt durch Subkultivierung zu erhalten. (vergleiche: E. R. M. Wickremesine
et al., World Congress on Cell and Tissue Culture (1992)).
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USP 5,015,744 lehrt ein halbsynthetisches Verfahren, ausgehend von Baccatin
III, welches eine Vorstufe in der Biosynthese von Taxol darstellt. Durch die
Verwendung der Pflanzengewebekultur kann ein Rohmaterial für das
halbsynthetische Verfahren, wie beispielsweise Baccatin III, erzeugt werden, somit kann die
Pflanzengewebekultur ebenso zur Taxolproduktion durch das oben genannte
halbsynthetische Verfahren verwendet werden.
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WO 93/17121 bietet ein Verfahren zur Taxolproduktion mittels Zellkultur einer
Pflanze der Gattung Taxus, bei gleichzeitiger Veränderung der Zusammensetzung
des Mediums, der Wachstumsrate und der Produktionsratte, usw. Im Fall von
Taxus chinensis können 24,1 mg/L Taxol in 18 Tagen Anzucht erhalten werden,
und die Biomasse verdoppelt sich alle 2,5 Tage.
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All diese Patente beschreiben Verfahren zur Massenherstellung von Taxol unter
Verwendung diskontinuierlicher Kulturen; es gibt keine Lehre in den genannten
Patenten über halbkontinuierliche Kulturen einer taxolproduzierenden Zelllinie,
noch werden diese vorweggenommen.
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Unter den Umständen beschreibt USP 5,407,816, dass Taxus chinensis Zellen in
einem Nährmedium angeimpft werden, um eine Suspension zu bilden, welche
anschließend kultiviert wird, um eine Suspensionskultur zu ergeben, welche dann
in einem anderen Nährmedium subkultiviert wird, um eine Produktionskultur zu
bilden, und welche letztendlich Taxol und Taxane in einer Ausbeute von 135
mg/L ergibt. Das genannte Verfahren hat die Produktivität von Taxol beträchtlich
verbessert, jedoch sich in dem Sinne als weniger befriedigend herausgestellt,
dass es im wesentlichen so viele Nährmedien benötigt, deren
Zusammensetzungen so kompliziert sind, und dass hohe Produktivität unter eher limitierenden
Wachstumsbedingungen erreicht werden kann.
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Daher gibt es einen anhaltenden Bedarf, ein praktisches und einfaches Verfahren
zur Herstellung von Taxol zu entwickeln, das fähig ist, die Forderung nach einer
hohen Produktivität zu erfüllen, die ein kritischer Faktor dafür ist, ob es in
industriellen Anwendungen eingesetzt werden kann oder nicht.
Zusammenfassung der Erfindung
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In Übereinstimmung mit vorliegender Erfindung wurde herausgefunden, dass
Taxol durch semi-kontinuierliche Kultur einer neuen taxolproduzierenden Zelllinie,
Taxus chinensis SYG-1, mit einem hohen Grad an Effizienz erzeugt werden kann.
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Ein primäres Ziel der vorliegenden Erfindung ist deshalb, ein Verfahren zur
Massenherstellung von Taxol mittels semi-kontinuierlicher Kultur vorzusehen. Das
andere Ziel vorliegender Erfindung ist es, eine neuartige taxolproduzierende
Zelllinie, isoliert aus Taxus chinensis, vorzusehen.
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Das oben genannte primäre Ziel wird durch ein Verfahren nach Anspruch 1
erreicht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Die obigen und andere Ziele und Merkmale vorliegender Erfindung werden durch
die folgenden Beschreibungen offensichtlich werden, die in Verbindung mit den
begleitenden Zeichnungen vorliegen, in welchen:
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Fig. 1 ein Diagramm ist, das den Effekt von AgNO&sub3; auf die Taxolproduktivität
zeigt.
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Fig. 2 ein Diagramm ist, das den Effekt von NH&sub4;-Citrat auf die
Taxolproduktivität zeigt.
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Fig. 3 ein Diagramm ist, das den Effekt von Maltose auf die Taxolproduktivität
zeigt.
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Fig. 4 ein Diagramm ist, das die Produktivität von Taxol in der
semi-kontinuierlichen Kultur von SYG-1 im Einklang mit dem Kulturzyklus zeigt.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die Erfinder entwickelten zuerst eine taxolproduzierende Zellinie, basierend auf
dem Callus induziert aus Taxus chinensis, und verglichen die Zelllinie mit
denen, die im Stand der Technik bekannt waren. Aus den Vergleichsstudien der
morphologischen Bedingungen, physiologischen Bedingungen und Wachstumsbedingungen
der taxolproduzierenden Zelllinien wurde festgestellt, dass die neu
entwickelte Zelllinie eine neuartige ist, die etwas von denen im Stand der
Technik abweicht, in Bezug auf Taxolproduktivität, Modus der Taxolsekretion, usw.
Dementsprechend wurde die Zelllinie Taxus chinensis SYG-1 (im nachfolgenden
zur Erleichterung in Bezug genommen als "SYG-1") benannt und bei einer
Internationalen Hinterlegungsbehörde (IDA), der Koreanischen Sammlung für
Kulturtypen (KCTC). Korea Research Institute of Bloscience and Biotechnology, am 14.
März 1996, unter der Zugangsnummer KCTC 0232BP hinterlegt.
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Anschließend optimierten die Erfinder die Wachstumsbedingung der Zellinie
vorliegender Erfindung und stellten fest, dass: SYG-1 Zellen bestens auf B5 Medium
wachsen, am meisten bevorzugt B5 Medium ergänzt mit 20 uM
NAA(Naphthoxyessigsäure), 0,4 uM BAP(6-Benzylaminopurin), 1 g/L
Caseinhydrolysat und 30 g/L Saccharose, unter einer Temperaturbedingung von 24ºC, und
einer Rührgeschwindgkeit von 150 UpM. Auf der anderen Seite wurden auch
Auswirkungen von AgNO&sub3;, NH&sub4;-Citrat und Maltose auf die Produktivität von
Taxol untersucht und die Erfinder schlossen, dass deren Zugabe die Produktivität
von Taxol außerordentlich verbesserte.
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Nach vorliegender Erfindung kann Taxol mit hoher Ausbeute erzeugt werden,
durch Einsatz einer semi-kontinuierlichen Kultur von SYG-1, wobei dies umfaßt:
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(i) Animpfen von Pflanzenzellen der Gattung Taxus in einem Medium, enthaltend
1 bis 10 Gew.-% (w/v) Zucker, und Inkubation davon; und,
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ii) Überimpfen 1/10 bis 1/2 des Volumens der in Schritt (1) erhaltenen Kultur in
ein frisches Medium und Wiederholung von Schritt (1), Zugabe von 1 bis 10 Gew.-
% (w/v) Zucker zum Rest der Kultur und Inkubation bis zur Zeit der maximalen
Produktion von Taxol.
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Zu Beginn der Kultur kann AgNO&sub3; zu der Kultur der Pflanzenzellen der Gattung
Taxus zugegeben werden, welche für 10 bis 20 Tage inkubiert wird, noch
bevorzugter 10 bis 15 Tage, in einer Konzentration von 1 bis 15 uM, noch bevorzugter
5 bis 10 uM. Weiterhin können NH&sub4;-Citrat und Maltose zu der Kultur nach 5 bis
30 Tagen, noch bevorzugter 5 bis 10 Tagen Inkubation gegeben werden, in einer
Konzentration von 1 bis 15 mM, noch bevorzugter 1 bis 10 mM und 1 bis 10
Gew.-% (w/v), noch bevorzugter 1 bis 5 Gew.-% (w/v), respektive.
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Nach 5 bis 30 Tagen Inkubation werden 1/10 bis 1/2 des Volumens der
Gesamtkultur in eine andere Flasche überimpft, die frisches Medium enthält, dessen
Bestandteile die gleichen sind, wie die zu Beginn der Kultur eingesetzten, und ein
Kulturzyklus wird gestartet. Anschließend wurde der Restkultur, äquivalent zu
9/10 bis 1/2 des Volumens der Gesamtkultur, 1 bis 10 Gew.-%, noch
bevorzugter 1 bis 5 Gew.-% Maltose zugegeben, und diese für 30 bis 60 Tage inkubiert, in
denen die Taxolproduktion maximiert wird. Zu diesem Zeitpunkt wurde die
Inkubation bei 24ºC, Rührgeschwindigkeit von 150 UpM im Dunkeln durchgeführt.
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Die Pflanze der Gattung Taxus, welche in dem Verfahren der vorliegenden
Erfindung eingesetzt wird, beinhaltet Taxus brevifolia, Taxus canadensis, Taxus
cuspidata, Taxus baccata, Taxus globosa, Taxus floridana, Taxus wallichiana,
Taxus media und Taxus chinensis, jedoch wird Taxus chinensis SYG-1, die neu
von den Erfindern entwickelt wurde, am meisten bevorzugt hierin eingesetzt.
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Nach dem Verfahren der vorliegenden Erfindung wird eine Produktivität von
Taxol bis zu der Menge von 300 mg/L, nach 42 bis 49 Tagen Inkubation,
beobachtet, wenn Taxus chinensis SYG-1 in einer semi-kontinuierlichen Kultur
eingesetzt wird, unter Zugabe von AgNO&sub3;, NH&sub4;-Citrat und Maltose, um die
Produktivität von Taxol zu verbessern.
Quantitative Analyse von Taxol
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Taxol, welches aus der Kultur von Taxus SYG-1 gemäß dem Verfahren
der vorliegenden Erfindung produziert wird, wird durch den Einsatz von
Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC) unter einer spezifischen Bedingung,
beschrieben in Tabelle 1 unten, quantitativ untersucht.
Tabelle 1: Bedingung für die quantitative Untersuchung von Taxol
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Messgerät HPLC (Waters, U.S.A)
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Säule Capcell Pack C&sub1;&sub8; UG 120 (Länge: 250 mm,
Innendurchmesser: 4,6 mm)
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Säulentemperatur 40ºC
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Mobile Phase CH&sub3;CN: Wasser (20-100% Gradient)
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Fluidgeschwindigkeit 1,0 ml/min
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Injektionsvolumen 10 ul
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Detektor UV (227 nm), ATTE = 3
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Die vorliegende Erfindung wird weiter in den folgenden Beispielen illustriert, welche
nicht so verstanden werden sollten, dass sie den Umfang der Erfindung
beschränken.
Beispiel 1: Induktion und Charakterisierung des Callus von Taxus chinensis
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Die Zelllinie der vorliegenden Erfindung wurde aus Taxus chinensis mittels
Callusinduktion isoliert. Als Pflanzengewebe auf einem geeigneten Medium,
enthaltend ein Hormon, inkubiert wurde, wurde eine undifferenzierte Zelle des Callus
induziert: Gewebe aus Rinde, Nadeln, Stielen und Wurzeln von Taxus chinensis
wurden mit Leitungswasser gewaschen und mit Calciumhypochlorid-Lösung für
20 bis 30 Minuten sterilisiert. Anschließend wurde das sterilisierte Gewebe mit
destilliertem Wasser 2 bis 3 mal gewaschen, bis auf eine Länge von 1 cm
zerkleinert, in ein B5 Medium überführt (vergleiche: Gamborg et al., Can. J. Biochem.,
46: 417-421 (1968)), ergänzt mit 20 uM NAA(Naphthoxyessigsäure), 0,4 uM BAP(6-
Benzylaminopurin), 1 g/L Caseinhydrolysat und 30 g/L Saccharose nach
Verfestigung mit 0,2% (w/w) Gelit, und bei einer Temperatur von 24 bis 26ºC für 2 bis
6 Wochen bei Dunkelheit inkubiert, um den interessierenden Callus zu
induzieren.
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Das Wachstumsmedium für den Callus wurde ausgewählt durch Übertragung des
Callus auf mehrere, im Stand der Technik wohl bekannte Medien, z. B., MS
(vergleiche: Murashige, T. und F. Skoog, F., Physiol. Plant, 5: 473(1972)), SH
(vergleiche: Schenk und Hilderbrandt, Can. J. Bot., 50: 199-204(1972)), WPM (vergleiche:
Lloyd und Mccown, Int. Plant. Prop. Soc. Proc., 30: 421-427(1981)) und B5
Medium (vergleiche: Supra) respektive, und Beobachten des Wachstumsmusters des
Callus mit bloßem Auge. Aus den obigen Ergebnissen wurde festgestellt, dass der
Callus gutes Wachstum auf B5 Medium, enthaltend 20 uM NAA, 0,4 uM BAP und
2 g/L Caseinhydrolysat, zeigte.
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Anschließend wurden Untersuchungen zur Morphologie, Physiologie und
Wachstumsbedingung für die somit induzierte Zelllinie erstellt, und verglichen mit
denen, bekannt aus dem Stand der Technik; und die Ergebnisse wurden in Tabelle
2 und 3 unten zusammengefaßt. Wie aus Tabellen 2 und 3 hervorgeht, wurde
festgestellt, dass die Zellinie, welche gemäß der Erfindung entwickelt wurde, ein
Unterscheidungsmerkmal gegenüber den anderen aus dem Stand der Technik
besitzt, in Bezug auf Taxolproduktivität und den Modus der Taxolsekretion, usw.
Dementsprechend wurde die Zelllinie Taxus chinensis SYG-1 genannt und bei
einer Internationalen Hinterlegungsbehörde (IDA), der Koreanischen Sammlung für
Kulturtypen (KCTC), am 14. März 1996, unter der Zugangsnummer KCTC
0232BP hinterlegt.
Tabelle 2: Morphologie und Wachstumgsbedingung von Taxus chinensis SYG-1
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Taxus chinensis SYG-1 Charakteristika
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Größe 50-150 um
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Beweglichkeit (-)
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Agglutination schwach
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Aggregation (+)
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Anpassung an
Scherbeanspruchung stark
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Farbe der Kultur schwach braun
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Kulturtemperatur 24ºC
Tabelle 3: Vergleich der Charakteristika der Zelllinien der Erfindung und des
Standes der Technik
Beispiel 2: Suspensionskultur von SYG-1
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Um das am meisten bevorzugte Medium für die Suspensionskultur von SYG-1
auszuwählen, wurde die Zelllinie auf MS (Murashige und Skoog Medium), SH
(Schenk und Hildebrandt Medium), WPM (Woody Pflanzenmedium) und B5
(Gamborg's B5 Medium) respektive, übertragen, und das Wachstumsmuster analog zu
Beispiel 1 beobachtet, was ergab, dass die SYG-1 Zelle gut auf B5 Medium,
enthaltend 20 uM NAA. 0,4 uM BAP und 2 g/L Caseinhydrolysat, wuchs, genauso
wie der Callus. Zusätzlich wurde ebenso festgestellt, dass die SYG-1 Zelle bei
einer Temperatur von 24ºC und einer Rührgeschwindigkeit von 150 UpM gut
wuchs.
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Eine Serienkultur des Callus wurde, im Fall eines verfestigten Mediums, alle 4
Wochen erzeugt, unter Übertragung eines Teiles des Gewebes mit Hilfe von Pinzetten:
Ein Stück des Callus wurde auf der Platte mit dem festen Medium
zurückbehalten. Anschließend wurde der Callus, welcher auf dem festen Medium
zurückbehalten wurde, in einem kleinen Volumen B5 Medium angeimpft, und
geringe Mengen an Medium der Kultur zugesetzt, während die Zellen wuchsen, um
das Gesamtvolumen der Kultur zu vergrößern. Anschließend wurden gut
gewachsene Zelllinien in dem modifizierten B5 Medium, enthalten in einem 500 ml
Erlenmeyer-Kolben, verdünnt, in einem Verhältnis von 1/5 (v/v), und alle zwei
Wochen in ein Suspensionskulturmedium angeimpft.
Beispiel 3: Auswirkung von AgNO&sub3; auf die Taxolproduktivität
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Es war wohl bekannt, dass AgNO&sub3; ein Antagonist des Pflanzenhormons Ethylen
ist, welches das Zellwachstum und die Produktion von sekundärem Metabolit
beeinflußt. Dementsprechend testeten die Erfinder den Einfluß von AgNO&sub3; auf die
Taxolproduktion in einer Suspensionskultur von SYG-1.
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In einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben wurden 75 ml B5 Medium eingebracht,
enthaltend 10 uM AgNO&sub3;, und 25 ml einer 14 Tage alten Zellkultur wurden in
diesem Medium angeimpft, und in analoger Art und Weise, wie in Beispiel 2
beschrieben, inkubiert. Anschließend wurde die Produktivität von Taxol mit einer
Kontrolle verglichen, die kein AgNO&sub3; enthält (vergleiche: Fig. 1). Wie aus Fig.
1 hervorgeht, wurde klar festgestellt, dass die Menge an produziertem Taxol
98,95 mg/L, wenn AgNO&sub3; zum Medium zugegeben wurde (- -), 4,7 mal der
Kontrolle (-O-) entsprach.
Beispiel 4: Auswirkung von NH&sub4;-Citrat auf die Taxolproduktivität
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Die Produktvität von Taxol in einer Suspensionskultur von SYG-1 wurde
beobachtet, nach Zugabe von NH&sub4;-Citrat. In einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben wurden
75 ml B5 Medium eingebracht, und 25 ml einer 14 Tage alten Zellkultur wurden
in diesem Medium angeimpft, und unter denselben Wachstumsbedingungen wie
in Beispiel 2 beschrieben, inkubiert. Anschließend wurden 9 Tage nach
Inkubation 5 mM NH&sub4;-Citrat zur Kultur gegeben, und die Taxolproduktivität verglichen
mit einer Kontrolle, in welcher kein NH&sub4;-Citrat zugegeben wurde (vergleiche:
Fig. 2). Wie aus Fig. 2 hervorgeht, wurde festgestellt, dass die Menge an
produziertem Taxol etwa 103,6 mg/L betrug, wenn NH&sub4;-Citrat zu dem Medium gegeben
wurde (- -), was 4,9 mal der Kontrolle (-O-) entsprach.
Beispiel 5: Auswirkung von Maltose auf die Taxolproduktivität
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Es war wohl bekannt, dass die Zunahme der Zuckerkonzentration in der
Pflanzenzellkultur zu einer Zunahme der Produktion von Sekundärmetaboliten führt.
Z. B. wurde berichtet, dass: Zugabe von 3% (w/v) Saccharose und 5% (w/v)
Mannitol die Produktion von Antocyanin in einer Calluskultur von Daucus carota
verbesserte (vergleiche: Knobloch, K. -H., et al., Zeitschrift für Naturforschung,
35c: 55-556 (1981)); und 88 mM Saccharose und 165 mM Mannitol die
Antocyaninproduktion in einer Suspensionskultur von Vitis Vinifera (vergleiche:
Rajendran, L., et al., Biotechnology Letters, 14(8):707-712(1992)) erhöhten. Auf der
anderen Seite wurde auch ein Abfall im Wachstum und der Produktion von
Sekundärmetaboliten beobachtet, wenn die Menge an Zucker über eine bestimmte
Konzentration hinausgehend zugegeben wurde, möglicherweise aufgrund von
osmotischem Streß (vergleiche: Do, C. B., und Cormier, F., Plant Cell Reports,
9: 500-504(1990)).
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Die Auswirkung der Maltosenzugabe zu SYG-1 wurde untersucht. In einen 250
ml Erlenmeyer-Kolben wurden 75 ml B5 Medium eingebracht, und 25 ml einer
14 Tage alten Zellkultur wurden in diesem Medium angeimpft, und unter
denselben Wachstumsbedingungen wie in in Beispiel 2 beschrieben, inkubiert.
Anschließend wurden 2% (w/v) und 3% (w/v) Maltose nach 9 Tagen und 21 Tagen
Inkubation respektive zu der Kultur zugegeben und die Produktivität von Taxol
mit einer Kontrolle, welche keine Maltose enthielt (vergleiche: Fig. 3) verglichen.
Wie aus Fig. 3 hervorgeht, wurde festgestellt, dass die Menge an Taxol 122,75
mg/L betrug, wenn Maltose zum Medium zugegeben wurde (- -), was 5,3 mal der
Kontrolle (-O-) entsprach.
Beispiel 6: Semi-kontinuierliche Kultur von SYG-1
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Basierend auf den Ergebnissen, erhalten in den Beispielen 2-5, wurde Taxol
durch Anwendung einer semi-kontinuierlichen Kulture von SYG-1 erzeugt.
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In einen 250 ml Erlenmeyer-Kolben wurden 80 ml Wachstumsmedium gegeben
und 20 ml einer 14 Tage alten SYG-1 Kultur, 10,uM AgNO&sub3; wurden zu Beginn der
Kultur zugegeben, gefolgt von der Zugabe von 5 mM NH&sub4;-Citrat und 2% (w/v)
Maltose nach 9 Tagen Inkubation. Nach 21 Tagen Inkubation wurden 20 ml
Kultur, äquivalent zu 1/5 Volumen der Gesamtkultur, in einen anderen Kolben,
enthaltend 80 ml frisches Medium, überführt, um einen weiteren Kulturzyklus zu
starten. Anschließend wurden zu 80 ml der Restkultur, ent sprechend 4/5
Volumen der Gesamtkultur, 3% (w/v) Maltose gegeben, und für weitere 21 Tage
inkubiert, in denen die Taxolproduktion maximiert wurde. Zu diesem Zeitpunkt
wurde die Inkubation bei 24ºC und einer Rührgeschwindigkeit von 150 UpM
ausgeführt. Proben der Kultur wurden periodisch entnommen, und auf mikrobielle
Kontamination untersucht. Die Menge an produziertem Taxol in der Kultur
wurde weiterhin durch Einsatz von Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC,
Waters, USA), wie oben beschrieben, festgestellt. Als ein Ergebnis wurde keinerlei
mikrobielle Kontamination beobachtet und die Produktion von Taxol nach 42
Tagen Inkubation wurde mit 284 mg/L (vergleiche: Fig. 4) festgestellt.
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Wie aus Fig. 4 ersehen werden kann, wurde die Taxolkonzentration gesteigert
wenn die Kulturzyklen wiederholt wurden.
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Wie klar durch das Obige illustriert und gezeigt wurde, erbringt die vorliegende
Erfindung ein Verfahren zur Massenherstellung von Taxol mittels
semikontinuierlicher Kultur von Pflanzen der Gattung Taxus mit hoher Ausbeute. Nach
vorliegender Erfindung wurde eine Produktivität von Taxol in Höhe von 300 mg/L,
nach 14 bis 15 Tagen Inkubation beobachtet, wenn chinensis SYG-1 in
einer semi-kontinuierlichen Kultur eingesetzt wurde, unter Zugabe von AgNO&sub3;,
NH&sub4;-Citrat und Maltose, um die Produktion von Taxol zu verbessern.