CN101696436B - 培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基，以B5培养基为基础配方，通过正交优化试验得到用于培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基。本发明的专用培养基与B5培养基进行基本成分对比生产时，专用培养基中紫杉醇的含量是B5培养基4.2倍；当接入高密度红豆杉植物细胞，在培养过程中添加硝酸银、水杨酸、壳聚糖、甲基茉莉酮酸、柠檬酸三铵、硫酸镧、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和赖氨酸进行组合试验，能进一步提高紫杉醇的含量，缩短细胞生产周期，细胞培养到第31天时，紫杉醇的含量最高为285.15mg/L，是B5培养基中紫杉醇最高含量的81倍，实现采用专用培养基培养红豆杉植物细胞来高效率生产紫杉醇。
Description
技术领域
本发明属于生物技术或生物制药领域，涉及一种培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基。
背景技术
目前常用于培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的培养基为B5培养基，但梅兴国等科学家通过试验后发现，在B5培养基中培养红豆杉植物细胞时，容易出现变红变褐现象，造成培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的含量较低，因此提出采用两步培养方法来培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇，首先在生长培养基中快速生长得到一定生物量的红豆杉植物细胞，然后转入生产培养基中进行紫杉醇生产得到高含紫杉醇的细胞培养物，由于B5培养基成分复杂，还没有设计或优化出一种培养红豆杉植物细胞促进紫杉醇合成的专用生产培养基，两步培养生产紫杉醇的方法普遍选择B5培养基作为生产培养基，仍然没有解决培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇时含量较低的问题。
发明内容
本发明的目的就是提供一种既能显著提高培养红豆杉植物细胞生产的紫杉醇含量，又能缩短红豆杉植物细胞生产周期的专用培养基。
本发明可以通过以下方式来实现：培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基是每升水中含有2.0～3.5g KNO3、75～300mg CaCl2·2H2O、62.5～250mg MgSO4·7H2O、20～95mg NaH2PO4·2H2O、2.5～10mg KI、10～270mg H3BO3、10～50mg MnSO4·H2O、6～100mg ZnSO4·7H2O、0.005～0.05mg Na2MoO4·2H2O、0.1～10mg CuSO4·5H2O、0.1～10mg CoCl2·6H2O、50～200mg肌醇、0.001～0.5mg烟酸、0.5～5mg维生素B6、0.001～0.5mg维生素B1、1～20mg NAA、0.2～1mg 6-BA、0.2～1mg GA3、30～60g碳源、0.84～3.34mg硝酸银、0.1～10mg水杨酸、0.1～10mg壳聚糖、11.2～44.9mg甲基茉莉酮酸、0.6～2.4g柠檬酸三铵、50～585.6mg谷氨酰胺、0.1～10mg La2(SO4)3·9H2O、1～50mg苯丙氨酸、1～50mg氨基乙酸、1～50mg色氨酸和1～50mg赖氨酸。
本发明进一步的技术方案是：专用培养基是每升水中含有2.75g KNO3、150mg CaCl2·2H2O、125mg MgSO4·7H2O、42.5mg NaH2PO4·2H2O、5mg KI、 90mg H3BO3、30mg MnSO4·H2O、80mg ZnSO4·7H2O、0.01mg Na2MoO4·2H2O、1mg CuSO4·5H2O、1mg CoCl2·6H2O、100mg肌醇、0.01mg烟酸、1mg维生素B6、0.01mg维生素B1、8mg NAA、0.5mg 6-BA、0.5mg GA3、45g碳源、1.67mg硝酸银、1mg水杨酸、1mg壳聚糖、22.4mg甲基茉莉酮酸、1.2g柠檬酸三铵、292.8mg谷氨酰胺、2mg La2(SO4)3·9H2O、10mg苯丙氨酸、10mg氨基乙酸、15mg色氨酸和10mg赖氨酸。
所述的碳源是蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖中的一种或两种及其两种以上的物质。
本发明的专用培养基与B5培养基进行基本成分对比生产时，在B5培养基中培养36天后紫杉醇最高含量为3.5mg/L，在专用培养基中培养36天后紫杉醇最高含量为14.6mg/L，专用培养基中紫杉醇的含量是B5培养基4.2倍，效果显著，试验结果见表11；在专用培养基中接入高密度红豆杉植物细胞，培养过程中添加硝酸银、水杨酸、壳聚糖、甲基茉莉酮酸、柠檬酸三铵、La2(SO4)3·9H2O、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸、和赖氨酸进行组合试验，可以进一步提高紫杉醇的含量，并缩短细胞生产周期，细胞培养31天后紫杉醇含量最高为285.15mg/L，是B5培养基中紫杉醇含量的81倍，并且生产周期缩短了5天，实现通过专用培养基来培养红豆杉植物细胞高效率生产紫杉醇，试验结果见表12。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明作进一步的说明，但其不代表为本发明的唯一实施方式。
实施例一
培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基是每升水中含有2.0g KNO3、75mg CaCl2·2H2O、62.5mg MgSO4·7H2O、20mg NaH2PO4·2H2O、2.5mg KI、10mg H3BO3、10mg MnSO4·H2O、6mg ZnSO4·7H2O、0.005mg Na2MoO4·2H2O、0.1mg CuSO4·5H2O、0.1mg CoCl2·6H2O、50mg肌醇、0.001mg烟酸、0.5mg维生素B6、0.001mg维生素B1、1mg NAA、0.2mg 6-BA、0.2mg GA3、30g葡萄糖或果糖或者是麦芽糖、0.84mg硝酸银、0.1mg水杨酸、0.1mg壳聚糖、11.2mg甲基茉莉酮酸、0.6g柠檬酸三铵、50mg谷氨酰胺、0.1mg La2(SO4)3·9H2O、1mg苯丙氨酸、1mg氨基乙酸、1mg色氨酸和1mg赖氨酸。
实施例二
培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基是每升水中含有3.5gKNO3、300mg CaCl2·2H2O、250mg MgSO4·7H2O、95mg NaH2PO4·2H2O、10mg KI、270mg H3BO3、50mg MnSO4·H2O、100mg ZnSO4·7H2O、0.05mg Na 2MoO4·2H2O、10mg CuSO4·5H2O、10mg CoCl2·6H2O、200mg肌醇、0.5mg烟酸、5mg维生素B6、0.5mg维生素B1、20mg NAA、1mg 6-BA、1mg GA3、60g蔗糖或乳糖或者是半乳糖、3.34mg硝酸银、10mg水杨酸、10mg壳聚糖、44.9mg甲基茉莉酮酸、2.4g柠檬酸三铵、585.6mg谷氨酰胺、10mg La2(SO4)3·9H2O、50mg苯丙氨酸、50mg氨基乙酸、50mg色氨酸和50mg赖氨酸。
实施例三
培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基是每升水中含有2.75gKNO3、150mg CaCl2·2H2O、125mg MgSO4·7H2O、42.5mg NaH2PO4·2H2O、5mgKI、90mg H3BO3、30mg MnSO4·H2O、80mg ZnSO4·7H2O、0.01mg Na 2MoO4·2H2O、1mg CuSO4·5H2O、1mg CoCl2·6H2O、100mg肌醇、0.01mg烟酸、1mg维生素B6、0.01mg维生素B1、8mg NAA、0.5mg 6-BA、0.5mg GA3、45g碳源、1.67mg硝酸银、1mg水杨酸、1mg壳聚糖、22.4mg甲基茉莉酮酸、1.2g柠檬酸三铵、292.8mg谷氨酰胺、2mg La2(SO4)3·9H2O、10mg苯丙氨酸、10mg氨基乙酸、15mg色氨酸和10mg赖氨酸。碳源是蔗糖与葡萄糖及果糖，碳源也可以是麦芽糖与乳糖及半乳糖；蔗糖、葡萄糖与果糖可以是任意质量比，麦芽糖、乳糖与半乳糖也可以是任意质量比。
本发明的专用培养基培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的试验
1、红豆杉植物细胞来源和种子继代培养条件
供试材料为实验室诱导筛选并继代培养保存的中国红豆杉细胞株，以B5为基本培养基，添加1mg/L NAA、0.2mg/L 6-BA、30g/L蔗糖、100mg/L Vc和292.8mg/L谷氨酰胺作为继代培养基。继代时采用1000ml三角瓶内装400ml继代培养基，接入继代培养14天的红豆杉植物细胞，然后将三角瓶置于22～26℃恒温室内的摇床上，以120rpm转速进行振荡培养，细胞培养14天后作为种子来做正交优化试验。
2、含有紫杉醇的红豆杉植物细胞培养液样品的测定方法
2.1培养液中紫杉醇含量的测定
取10ml培养液加入10ml二氯甲烷，萃取3次，合并萃取液，减压回收二氯甲烷，干物质用甲醇溶解定容后，用HPLC检测。
2.2紫杉醇含量的HPLC测定方法
采用Waters HPLC，分离柱是反相硅胶柱，反相硅胶柱为Nova-Pak C184μm 150mm×3.9mm，流动相为甲醇∶乙腈∶水体积比为29∶27∶44，反相硅胶柱温度35℃，流速1ml/min，洗脱时间11min，在227nm处用紫外检测器检测，紫杉醇定量采用外标法，每次进样量为5μL，紫杉醇标准品为SIGMA公司生产。
3、专用培养基优化方法
100ml培养基装入250ml三角瓶内，培养基根据选取的正交试验表配方配制，其中维生素C、谷氨酰胺、柠檬酸三铵、甲基茉莉酮酸、水杨酸、La2(SO4)3·9H2O、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和赖氨酸采用0.22μm滤膜无菌过滤后加入，继代培养14天的中国红豆杉细胞种子用80目不锈钢过滤器无菌过滤后接入培养基中，在23～27℃、120rpm摇床转速及黑暗下进行生产培养，在细胞培养过程中添加硝酸银、甲基茉莉酮酸、壳聚糖、柠檬酸三铵、谷氨酰胺、水杨酸、La2(SO4)3·9H2O、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和赖氨酸，继续培养到第30～40天收获，取样检测紫杉醇含量。
4、专用培养基正交优化试验
100ml培养基装入250ml三角瓶内，以B5培养基为基础配方，根据表1和表2的L18(37)正交试验表配制出不同成分的生产培养基，添加30g/L蔗糖、8mg/L NAA和0.5mg/L 6-BA，并无菌过滤加入100mg/L Vc和292.8mg/L谷氨酰胺，无菌过滤接入相当于9.3g/L干重的继代培养14天的中国红豆杉植物细胞，当细胞培养到第21天时，添加La2(SO4)3·9H2O、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和赖氨酸，继续培养到第38天收获，取样检测培养液中紫杉醇含量。
试验结果见表2：比较合适的培养基成分为：大于3g/L KNO3、0mg/L(NH4)2SO4、150mg/L CaCl2·2H2O、45g/L蔗糖、30～50mg/L MnSO4·H2O、0.25～1mg/L CuSO4·5H2O、2mg/L La2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L赖氨酸。
初步优化后的培养基配方为：3.0g/L KNO3、250mg/L MgSO4·7H2O、170mg/L NaH2PO4·2H2O、0mg/L(NH4)2SO4、150mg/L CaCl2·2H2O、10mg/L MnSO4·H2O、3.75mg/L KI、3mg/L H3BO3、2.5mg/L ZnSO4·7H2O、0.25mg/L Na2MoO4·2H2O、0.025mg/L CoCl2·6H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、100mg/L维生素C、100 mg/L肌醇、1mg/L维生素B1、0.1mg/L维生素B6、0.1mg/L烟酸、8mg/L NAA、0.5mg/L 6-BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/L La2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L赖氨酸、27.8mg/L FeSO4·7H2O、37.3mg/L Na2-EDTA·2H2O，定容后调pH5.8。
表1L18(37)正交实验设计表
注：表1中I、II和III为水平序号；其中A表示KNO3，浓度分别为3g/L、1.5g/L和0g/L；B表示(NH4)2SO4，浓度分别为536mg/L、134mg/L和0mg/L；C表示CaCl2·H2O，浓度分别为300mg/L、150mg/L和75mg/L；D表示蔗糖，浓度分别为30g/L、45g/L和60g/L；E表示MnSO4·H2O，浓度分别为50mg/L、30mg/L和20mg/L；F表示CuSO4·5H2O，浓度分别为1.0mg/L、0.25mg/L和0.05mg/L；G表示La2(SO4)3·9H2O、苯丙氨酸、氨基乙酸、色氨酸和赖氨酸的不同浓度组合，组合1含有0.2mg/L La2(SO4)3·9H2O、5mg/L苯丙氨酸、5mg/L氨基乙酸、5mg/L色氨酸、5mg/L赖氨酸；组合2含有2mg/L La2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L赖氨酸；组合3含有10mg/L La2(SO4)3·9H2O、50mg/L苯丙氨酸、50mg/L氨基乙酸、50mg/L色氨酸、50mg/L赖氨酸。
表2正交试验优化结果
注：1表2中1、2和3为水平序号；2I代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。
5、专用培养基正交优化试验
采用250ml三角瓶，以步骤4初步优化后的培养基配方为基本培养基，内装100ml根据表3和表4的L27(313)正交试验表所配制出的不同成分生产培养基，无菌过滤加入100mg/L Vc和292.8mg/L谷氨酰胺，无菌过滤接入相当于4.6g/L、6.9g/L和2.5g/L干重的继代培养14天的中国红豆杉植物细胞，当细胞培养到第21天时，添加2mg/L La2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L赖氨酸，继续培养到第31天收获，取样检测培养液中紫杉醇含量。
试验结果见表4：比较合适的培养基成分为：3g/L KNO3、125～500mg/LMgSO4·7H2O、85～340mg/L NaH2PO4·2H2O、27.8mg/L FeSO4·7H2O、37.3mg/LNa2-EDTA·2H2O、2.25mg/L KI、大于9mg/L H3BO3、大于6mg/L ZnSO4·7H2O、0.25～0.75mg/L Na 2MoO4·2H2O、小于0.5mg/L GA3、50～200mg/L肌醇、0.25mg/L CoCl2·6H2O。
继续优化后的培养基为：3.0g/L KNO3、250mg/L MgSO4·7H2O、170mg/LNaH2PO4·2H2O、0mg/L(NH4)2SO4、150mg/L CaCl2·2H2O、10mg/L MnSO4·H2O、2.25mg/L KI、9mg/L H3BO3、6mg/L ZnSO4·7H2O、0.25mg/L Na2MoO4·2H2O、0.25mg/L CoCl2·6H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、100mg/L维生素C、100mg/L肌醇、1mg/L维生素B1、0.1mg/L维生素B6、0.1mg/L烟酸、8mg/L NAA、0.5mg/LGA3、0.5mg/L 6-BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/L La2(SO4)3·9H2O、 10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L赖氨酸、27.8mg/L FeSO4·7H2O、37.3mg/L Na2-EDTA·2H2O，定容后调pH5.8。
表3 L27(313)正交实验设计表
注：表3中I、II和III为水平序号，其中A表示KNO3，浓度分别为3g/L、6g/L和9g/L；B表示MgSO4·7H2O，浓度分别为125mg/L、250mg/L和500mg/L；C表示NaH2PO4·2H2O，浓度分别为85mg/L、170mg/L和340mg/L；D表示铁盐，浓度分别为2.5ml/L、5.0ml/L和10ml/L，相当于FeSO4·7H2O与Na2-EDTA·2H2O的浓度分别为13.9mg/L+18.7mg/L、27.8mg/L+37.3mg/L和55.6mg/L+74.6mg/L；E表示KI，浓度分别为0.75mg/L、2.25mg/L和6.75mg/L；F表示H3BO3，浓度分别为3mg/L、6mg/L和9mg/L；G表示ZnSO4·7H2O，浓度分别为2mg/L、6mg/L和18mg/L；H表示Na2MoO4·2H2O，浓度分别为0.25mg/L、0.75mg/L和2.25mg/L；I表示GA3，浓度分别为0mg/L、0.5mg/L和2mg/L；J表示肌醇，浓度分别为50mg/L、100mg/L和200mg/L；K表示CoCl2·6H2O，浓度分别为0.025mg/L、0.25mg/L和2.5mg/L；L表示误差项；M表示接种量，接种密度分别为鲜重56.5g/L，相当于干重为4.6g/L；鲜重84.7g/L，相当于干重为6.9g/L；鲜重24.5g/L，相当于干重为2.1g/L。
表4 正交试验优化结果
注：1表4中1、2和3为水平序号；2I代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。
6、专用培养基正交优化试验
采用250ml三角瓶，以步骤5继续优化后的培养基配方为基本培养基，内装100ml根据表5和表6的L18(37)正交试验表所配制出的不同成分生产培养基，并无菌过滤加入100mg/L Vc和292.8mg/L谷氨酰胺，无菌过滤接入相当于5.0g/L干细胞的继代培养14天的中国红豆杉植物细胞，当细胞培养到第21天时，添加2mg/L La2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L赖氨酸，继续培养到第27天收获，取样检测培养液中紫杉醇含量。
试验结果见表6：比较合适的培养基成分为：2.0～3.5g/L KNO3、3.45mg/LFeSO4·7H2O、4.66mg/LNa2-EDTA·2H2O、0.1mg/L烟酸、1mg/L维 生素B6、1mg/L维生素B1、0.01～0.25mg/L Na 2MoO4·2H2O、鲜重接种量大于113.6g/L，相当于干重大于9.3g/L。
继续优化后的培养基为：2.75g/L KNO3、250mg/L MgSO4·7H2O、170mg/LNaH2PO4·2H2O、0mg/L(NH4)2SO4、150mg/L CaCl2·2H2O、10mg/L MnSO4·H2O、2.25mg/L KI、9mg/L H3BO3、6mg/L ZnSO4·7H2O、0.01mg/L Na2MoO4·2H2O、0.25mg/L CoCl2·6H2O、0.025mg/L CuSO4·5H2O、100mg/L维生素C、100mg/L肌醇、1mg/L维生素B1、1mg/L维生素B6、0.1mg/L烟酸、8mg/LNAA、0.5mg/LGA3、0.5mg/L6-BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/LLa2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L赖氨酸、3.45mg/LFeSO4·7H2O、4.66mg/LNa2-EDTA·2H2O，定容后调pH5.8。
表5 L18(37)正交实验设计表
注：表5中I、II和III为水平序号，其中A表示KNO3，浓度分别为2.5g/L、3.0g/L和3.5g/L；B表示铁盐，浓度分别为0.625ml/L、1.25ml/L、2.5ml/L，相当于FeSO4·7H2O与Na2-EDTA·2H2O的浓度分别为3.48mg/L+4.67mg/L、6.95mg/L+9.35mg/L和13.9mg/L+18.7mg/L；C表示烟酸，浓度分别为0.1mg/L、1mg/L和10mg/L；D表示维生素B6，浓度分别为0.1mg/L、1mg/L和10mg/L；E表示维生素B1，浓度分别为0.1mg/L、1mg/L和10mg/L；F表示Na2MoO4·2H2O，浓度分别为0.01mg/L、0.05mg/L和0.25mg/L；G表示接种量，接种密度分别为鲜重59.5g/L，相当于干重为4.5g/L；鲜重86.6g/L，相当于干重为7.2g/L；鲜重113.6g/L，相当于干重为9.3g/L。
表6正交试验优化结果
注：1表6中1、2和3为水平序号；2I代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。
7、专用培养基正交优化试验
采用250ml三角瓶，以步骤6继续优化后的培养基配方为基本培养基，内装100ml根据表7和表8的L18(37)正交试验表所配制出的不同成分生产培养基，100mg/L Vc和292.8mg/L谷氨酰胺通过无菌过滤后加入，无菌过滤接入继代培养14天的中国红豆杉植物细胞，当细胞培养到第21天时，添加2mg/L La2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L赖氨酸，继续培养到第27天收获，取样检测培养液中紫杉醇含量。
试验结果见表8：比较合适的培养基成分为：1mg/L CuSO4·5H2O、1mg/LCoCl2·H2O、90mg/L H3BO3、0mg/L FeSO4·7H2O、0mg/L Na2-EDTA 2H2O、0.01mg/L维生素B1、0.01mg/L烟酸、45g/L蔗糖、100mg/L Vc和292.8mg/L谷氨酰胺。
继续优化后的培养基为：2.75g/L KNO3、250mg/L MgSO4·7H2O、85mg/LNaH2PO4·2H2O、0mg/L(NH4)2SO4、150mg/L CaCl2·2H2O、10mg/L MnSO4·H2O、2.25mg/L KI、90mg/L H3BO3、6mg/L ZnSO4·7H2O、0.01mg/L Na2MoO4·2H2O、 1mg/L CoCl2·6H2O、1mg/L CuSO4·5H2O、100mg/L维生素C、100mg/L肌醇、0.01mg/L维生素B1、1mg/L维生素B6、0.01mg/L烟酸、8mg/L NAA，0.5mg/LGA3、0.5mg/L 6-BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/L La2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L赖氨酸、0mg/LFeSO4·7H2O、0mg/L Na 2-EDTA·2H2O，定容后调pH5.8。
表7 L18(37)正交实验设计表
注：表7中I、II和III为水平序号，其中A表示接种量，接种密度分别为干重11.07g/L、15.65g/L和6.63g/L；B表示CuSO4·5H2O，浓度分别为1mg/L、2.5mg/L和5mg/L；C表示CoCl2·6H2O，浓度分别为0.1mg/L、0.3mg/L和0.9mg/L；D表示铁盐、维生素C和谷氨酰胺，浓度分别为0mg/L；0.5ml/L铁盐相当于2.73mg/L FeSO4·7H2O和3.78mg/L Na2-EDTA·2H2O；100mg/LVc+292.8mg/L谷氨酰胺；E表示烟酸和维生素B1，浓度分别为0mg/L+0mg/L、0.01mg/L+0.01mg/L和0.05mg/L+0.05mg/L；F表示H3BO3，浓度分别为90mg/L、180mg/L和270mg/L；G表示蔗糖，浓度分别为35g/L、40g/L和45g/L。
表8正交试验优化结果
注：1表8中1、2和3为水平序号，2I代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。
8、专用培养基配方正交试验
采用250ml三角瓶，以步骤7继续优化后的培养基配方为基本培养基，内装100ml根据表8和表9L9(34)正交试验表所配制出的不同成分生产培养基，100mg/L Vc和292.8mg/L谷氨酰胺采用无菌过滤后加入，无菌过滤接入继代培养14天的中国红豆杉植物细胞，接种量为287g/L，相当于13.7g/L干重，当细胞培养到第21天时，添加2mg/L La2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L赖氨酸，继续培养到第27天收获，取样检测培养液中紫杉醇含量。
试验结果见表10：比较合适的培养基成分为：80mg/L ZnSO4·7H2O、5mg/LKI、125mg/L MgSO4·7H2O、42.5mg/L NaH2PO4·2H2O。
继续优化后的培养基为：2.75g/L KNO3、125mg/L MgSO4·7H2O、42.5mg/LNaH2PO4·2H2O、0mg/L(NH4)2SO4、150mg/L CaCl2·2H2O、10mg/L MnSO4·H2O、5mg/L KI、90mg/L H3BO3、80mg/L ZnSO4·7H2O、0.01mg/L Na2MoO4·2H2O、1mg/LCoCl2·6H2O、1mg/L CuSO4·5H2O、100mg/L维生素C、100mg/L肌醇、0.01mg/L维生素B1、1mg/L维生素B6、0.01mg/L烟酸、8mg/L NAA、0.5mg/L GA3、0.5mg/L6-BA、45g/L蔗糖、292.8mg/L谷氨酰胺、2mg/L La2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸、10mg/L赖氨酸、0mg/LFeSO4·7H2O、0mg/L Na2-EDTA·2H2O，定容后调pH5.8。
表9 L9(34)正交实验设计表
注：表9中I、II和III为水平序号，其中A表示ZnSO4·7H2O，浓度分别为20mg/L、40mg/L和80mg/L；B表示KI，浓度分别为2.25mg/L、5mg/L和10mg/L；C表示MgSO4·7H2O，浓度分别为62.5mg/L、125mg/L和250mg/L；D表示NaH2PO4·2H2O，浓度分别为170mg/L、42.5mg/L和85mg/L。
表10正交试验优化结果
注：1表10中1、2和3为水平序号，2I代表水平1之和的平均值，II代表水平2之和的平均值，III代表水平3之和的平均值。
9、专用培养基基本成分和B5培养基对比试验
以步骤8优化出的生产培养基配方作为最终的生产培养基配方，即专用生产培养基，与B5培养基做对比试验，采用250ml三角瓶内装100ml专用培养基和B5培养基各10瓶，100mg/L Vc和292.8mg/L谷氨酰胺采用无菌过滤加入，无菌过滤接入继代培养14天的红豆杉植物细胞，接种量为鲜重274.8g/L，相当于干重为13.7g/L，当细胞培养到第21天时，添加2mg/LLa2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L赖氨酸，继续培养到第38天收获，从20天开始取样检测培养液中紫杉醇含量。
试验结果见表11：经过优化后的专用培养基比B5培养基更有利于紫杉 醇的积累，在B5培养基培养到36天时，紫杉醇含量最高为3.5mg/L，在专用培养基中培养到36天时，紫杉醇含量最高达到14.6mg/L，采用专用培养基进行生产培养时，培养液中紫杉醇含量是B5培养基4.2倍。
表11专用培养基与B5培养基培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的含量对比结果
| 培养时间(天) | 20 | 22 | 24 | 27 | 29 | 31 | 34 | 36 | 38 |
| B5培养基紫杉醇含量(mg/L) | 2.0 | 2.2 | 2.5 | 2.8 | 3.0 | 3.1 | 3.3 | 3.5 | 2.8 |
| 专用培养基紫杉醇含量(mg/L) | 11 | 11.3 | 11.5 | 11.6 | 13.6 | 14.0 | 14.2 | 14.6 | 10.95 |
10、专用培养基和促进剂组合试验
采用250L通气搅拌式不锈钢发酵罐，内装200L根据步骤8所优化出的专用培养基，接种量为150g/L鲜重细胞，相当于干重为13.0g/L，搅拌转速100r/min，通气量0.2vvm，培养温度23～25℃，无菌过滤加入100mg/LVc和292.8mg/L谷氨酰胺，培养的前30天加入1mg/L水杨酸、1.67mg/L硝酸银、1mg/L壳聚糖、22.4mg/L甲基茉莉酮酸、1.2g/L柠檬酸三铵、2mg/LLa2(SO4)3·9H2O、10mg/L苯丙氨酸、10mg/L氨基乙酸、15mg/L色氨酸和10mg/L赖氨酸，继续培养到第31天时胞内外紫杉醇含量总和为285.15mg/L，是B5培养基中紫杉醇最高含量的81倍，试验结果见表12。
表12专用培养基和促进剂组合试验结果
| 培养时间(天) | 22 | 24 | 27 | 29 | 31 | 34 | 36 |
| 胞内外紫杉醇总含量 (mg/L) | 102.71 | 122.59 | 197.05 | 218.18 | 285.15 | 257.25 | 249.43 |
Claims (3)
1.一种培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基，其特征在于专用培养基是每升水中含有2.0～3.5g KNO3、75～300mg CaCl2·2H2O、62.5～250mg MgSO4·7H2O、20～95mg NaH2PO4·2H2O、2.5～10mg KI、10～270mg H3BO3、10～50mg MnSO4·H2O、6～100mg ZnSO4·7H2、0.005～0.05mg Na2MoO4·2H2O、0.1～10mg CuSO4·5H2O、0.1～10mg CoCl2·6H2O、50～200mg肌醇、0.001～0.5mg烟酸、0.5～5mg维生素B6、0.001～0.5mg维生素B1、1～20mg NAA、0.2～1mg 6-BA、0.2～1mg GA3、30～60g碳源、0.84～3.34mg硝酸银、0.1～10mg水杨酸、0.1～10mg壳聚糖、11.2～44.9mg甲基茉莉酮酸、0.6～2.4g柠檬酸三铵、50～585.6mg谷氨酰胺、0.1～10mg La2(SO4)3·9H2O、1～50mg苯丙氨酸、1～50mg氨基乙酸、1～50mg色氨酸和1～50mg赖氨酸。
2.根据权利要求1所述的培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基，其特征在于专用培养基是每升水中含有2.75g KNO3、150mg CaCl2·2H2O、125mg MgSO4·7H2O、42.5mg NaH2PO4·2H2O、5mg KI、90mg H3BO3、30mg MnSO4·H2O、80mg ZnSO4·7H2、0.01mg Na2MoO4·2H2O、1mg CuSO4·5H2O、1mg CoCl2·6H2O、100mg肌醇、0.01mg烟酸、1mg维生素B6、0.01mg维生素B1、8mg NAA、0.5mg 6-BA、0.5mg GA3、45g碳源、1.67mg硝酸银、1mg水杨酸、1mg壳聚糖、22.4mg甲基茉莉酮酸、1.2g柠檬酸三铵、292.8mg谷氨酰胺、2mgLa2(SO4)3·9H2O、10mg苯丙氨酸、10mg氨基乙酸、15mg色氨酸和10mg赖氨酸。
3.根据权利要求1或2所述的培养红豆杉植物细胞生产紫杉醇的专用培养基，其特征在于碳源是蔗糖、葡萄糖、果糖、麦芽糖、乳糖、半乳糖中的一种或两种及其两种以上的物质。
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