DE69827705T2

DE69827705T2 - Verfahren zur Herstellung von Diterpene vom Taxanetyp

Info

Publication number: DE69827705T2
Application number: DE69827705T
Authority: DE
Inventors: Yukihito Kuga-gun Yukimune; Kouichi Kuga-gun Matsubara; Yasuhiro Kuga-gun Hara
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1997-06-25
Filing date: 1998-06-25
Publication date: 2005-11-03
Anticipated expiration: 2018-06-26
Also published as: CA2241569A1; EP0887419A2; EP0887419B1; KR100287465B1; KR19990007236A; DE69827705D1; US6428989B1; CA2241569C; ES2236868T3; EP0887419A3; CN1094933C; CN1209431A

Description

Hintergrund der Erfindung
1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ, einschließlich Taxol, das als therapeutisches Mittel bei Eierstockkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs und dergleichen nützlich ist.
2. Stand der Technik
Taxol, das als therapeutisches Mittel gegen Eierstockkrebs, Brustkrebs, Lungenkrebs usw. nützlich ist, ist ein Diterpen vom Taxan-Typ, das aus der Pacific Eibe (Taxus brevifolia NUTT), einer Pflanze, die zur Gattung Taxus, der Familie Taxaceae, gehört, isoliert und identifiziert wurde. Diese Verbindung hat eine komplexe Estergruppe, die mit ihrer Aktivität in Beziehung steht. Taxol kann in jedem Teil des Pflanzenkörpers von Pacific Eibe festgestellt werden, und es wurde berichtet, dass der Taxolgehalt in der Rinde am höchsten ist. Derzeit wird Taxol von natürlichen oder kultivierten Bäumen gesammelt. Taxus-Pflanzen sind jedoch langsam wachsende Pflanzen, die mehr als 10 Jahre benötigen, um eine Höhe von 20 cm über dem Boden zu erreichen. Darüber hinaus führt das Abschälen der Rinde zum Tod der Bäume. Es ist daher schwierig, große Taxolmengen zu erhalten. Wenn es möglich sein würde, Taxol und Diterpene vom Taxan-Typ, wie Baccatin III (ein Vorläufer von Taxol) unter Verwendung von Zellkultur zu synthetisieren, würde dies sehr vorteilhaft sein, um große Mengen dieser Verbindungen leicht zu erhalten, ohne die Bäume zu ernten.
Als Stand der Technik für die Taxolherstellung wird im US-Patent Nr. 5,015,744, erteilt an Holton et al., ein semi-synthetisches Verfahren offenbart, um Taxol aus Baccatin III oder 10-Deacetylbaccatin III, einem Vorläufer bei der Biosynthese von Taxol, herzustellen. In Europa und den USA wurde Taxol, das von dieser Semi-Synthese abstammt, genehmigt und wird klinisch verwendet. Unter Verwendung eines Pflanzenzellkulturverfahrens ist es möglich, Rohmaterialien für die Semi-Synthese, wie Baccatin III, herzustellen, das zur Taxolherstellung durch das oben beschriebene semi-synthetische Verfahren verwendet werden kann.
Als ein Verfahren zur Taxolherstellung unter Verwendung von kultivierten Pflanzenzellen wurde ein Verfahren in den USA (US-Patent Nr. 5,019,504) patentiert, bei dem Taxol aus kultivierten Zellen der Pacific Eibe (Taxus brevifolia NUTT) hergestellt wurde. Gemäß diesem Verfahren betrifft die Taxolausbeute jedoch 1 bis 3 mg/ml, das für die industrielle Herstellung nicht ausreichend ist. Darüber hinaus ist die Taxolproduktivität durch Zellkultur instabil. Obgleich eine Primärzelle mit hoher Produktivität durch Selektion erhalten werden kann, ist es schwierig, den Taxolgehalt der Zelle durch Subkultur zu erhalten [E. R. M. Wickremesine et al., World Congress on Cell and Tissue Culture (1992)].
Verschiedene Verfahren wurden bei unterschiedlichen Bedingungen ausprobiert, um die Produktivität von Taxol zu verbessern. Zum Beispiel können aufgezählt werden: ein Verfahren, bei dem kultivierte Zellen von Taxus chinensis, die einen hohen Taxolgehalt aufweisen, verwendet werden (US-Patent Nr. 5,407,816); ein Verfahren, bei dem ein kontinuierliches Kultivierungsverfahren eingesetzt wird (unveröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 7-255495); und ein Verfahren, bei dem Methyljasmonat, eine Information-Transmissionssubstanz, zu dem Medium gegeben wird (unveröffentlichte japanische Patentanmeldung Nr. 8-33490, EP 0 683 232 ). Jedoch ist keines der oben beschriebenen Verfahren in der Praxis umgesetzt worden. Darüber hinaus ist eine Verbesserung der Produktivität gewünscht.
Kultivierte Zellen von Pflanzen bilden keine einzelnen Zellen, sondern bilden Zellcluster, die von 10 Mikrometer bis mehreren Millimetern variieren, auch dann wenn sie in einem flüssigen Medium unter Rühren kultiviert wurden, da im allgemeinen die Zellwände an die die einzelnen Zellen anhaften, stabil und fest sind. Bei Laubpflanzen, wie Taxus-Pflanzen, die erfindungsgemäß verwendet werden, ist die intrazelluläre Haftung durch die Entwicklung von Sekundärzellwänden, wie Lignin, besonders stark.
Die neueste Forschung betreffend die Herstellung von sekundären Stoffwechselprodukten bei kultivierten Pflanzenzellen haben gezeigt, dass sich die sekundären Stoffwechselprodukte in Abhängigkeit von der Größe dieser Zellcluster unterscheiden [Y. Yamada und Y. Fujita, Handbook of Plant Cell Culture, Band 1, herausgegeben von D. A. Evans et al., Macmillan Publishing Co., New York, S. 717–728 (1983); Y. Hara et al., Planta Med., 55, S. 151–154 (1989)]. Es ist jedoch nicht über die Beziehung zwischen der Teilchengröße dieser Zellcluster und der Produktivität von Diterpenen vom Taxan-Typ berichtet worden.
Auf der anderen Seite offenbart das US-Patent Nr. 5,344,775 die folgenden Vorgehensweisen als Verfahren zum Erhalt von kleinen Zellclustern einer Taxus-Pflanze, bestehend aus 1 bis 10 Zellen:

(i) Bereitstellen von Fragmenten aus Callusgewebe aus Taxus-Explantaten, enthaltend meristematisches Gewebe, das physikalisch auf einem Trägerkulturmedium, enthaltend α-Naphthalinessigsäure als Auxin, und 6-Benzylaminopurin als Cytokinin, physikalisch gestützt wird;
(ii) Kultivieren des Callusgewebes in einem flüssigen Medium, enthaltend das Auxin und das Cytokinin, um eine Suspension aus einer Mehrzahl von Clustern von 1 bis 10 Zellen, die eingeschränkte intrazelluläre Haftung aufweisen, herzustellen;
(iii) Auftragen der Zellen, die von der Zellsuspension entfernt wurden, auf eine Oberfläche eines Trägerkulturmediums, enthaltend das Auxin und das Cytokinin; und
(iv) Wachsen lassen der plattierten Zellen aus Schritt (iii) auf dem Trägerkulturmedium aus Pseudocalluszellen, wobei die Pseudocalluszellen eine lose amorphe Zellanhäufung sind, der differenzierte vaskuläre Gewebe oder Organgewebe und definierte meristematische Zonen fehlen, und die Zellanhäufung intrazellulär schlecht haftet, deutliche Zerfallsneigung aufweist und in zahlreiche einzelne Zellen und kleinere Zellcluster zerfällt, wenn sie mechanisch zerstört wird, wobei im Zellwachstumsmedium die Pseudocalluszellen eine Anfangsrate der Verdoppelung der Masse zeigen, die größer als die Massenverdopplung des Callusgewebes aus Schritt (i) ist und die Eigenschaft entfalten höhere Taxanmengen herzustellen, als die, die durch Callusgewebe aus Schritt (i) hergestellt werden.

Es ist aber äußerst schwierig, kleine Zellanhäufungen zu erhalten, die aus 1 bis 10 Zellen bestehen und die wachsen können oder sekundäre Stoffwechselprodukte herstellen können. (Kultivierte Zellen der Taxus-Pflanzen haben gewöhnlich einen Durchmesser von 20 bis 30 μm und folglich wird der Durchmesser der Zellaggregationen bestehend aus 10 Zellen auf weniger als 100 μm geschätzt.) Es ist unmöglich, solche Aggregationen zu erhalten, es sei denn, das Medium und die Kulturbedingungen werden derart kombiniert wie es in dem oben erwähnten US-Patent beschrieben ist.
Bei kultivierten Zellen einer Vielzahl von Taxus-Pflanzen, einschließlich bei den erfindungsgemäß verwendeten Zellen, können keine kleinen Cluster aus 1 bis 10 gesunden Zellen erhalten werden durch einfaches Verstärken der Rührbedingungen, die bei der Flüssigkultur eingesetzt werden. Durch Fraktionierung unter Verwendung eines Siebes, das 100 μm-Öffnungen aufweist, ist es möglich, die Trümmer von gealterten Zellen allein zu erhalten, die nicht die Fähigkeit besitzen, zu wachsen oder sekundäre Stoffwechselprodukte herzustellen.
Daher ist der Hauptpunkt bei der Trennung von kleinen Zellanhäufungen, wie es in dem obigen US-Patent offenbart ist, die Herstellung eines solchen Callusgewebes, das leicht kleine Zellanhäufungen freisetzt. Daher unterscheidet sich dieses Patent im Grundgedanken und Verfahren von dem erfindungsgemäßen, bei dem Schüttelbedingungen und Rührbedingungen definiert werden, um kleine Zellanhäufungen freizusetzen. Mit anderen Worten, gemäß der Beschreibung des obigen US-Patentes fallen die Schüttel- und Rührbedingungen des Patents, um kleine Anhäufungen, bestehend aus 1 bis 10 gesunden Zellen, freizusetzen, innerhalb des Bereichs der herkömmlichen Verfahren. Anders als die erfindungsgemäßen Bedingungen reichen die in dem US-Patent eingesetzten Bedingungen nicht über den Bereich von Bedingungen hinaus, die bei herkömmlicher Zellkultivierung verwendet werden.
Unter Berücksichtigung tatsächlicher industrieller Kultivierungsverfahren ist bei jedem der oben beschriebenen Verfahren zu erwarten, dass die Produktivität der letztlich erhaltenen Diterpene vom Taxan-Typ erhöht ist, indem die sogenannte Kultur mit zwei Schritten eingesetzt wird, wobei Vorkultur und Hauptkultur bei unterschiedlichen Bedingungen durchgeführt werden. Die Vorkultur wird durchgeführt, um die Zellen wachsen zu lassen, und die Hauptkultur wird durchgeführt, um die Diterpene vom Taxan-Typ, die von Interesse sind, wie Taxol, herzustellen. Bei der Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ durch herkömmliche Zellkulturverfahren wurde die Verbesserung der Bedingungen in der Hauptkultur hervorgehoben, wie es in den oben beschriebenen drei Patenten, die die Verbesserung der Taxolproduktivität betreffen, deutlich wird. Zum Beispiel wird ein Auslöser oder eine Informations-Transmissionssubstanz zugegeben oder das Kultivierungsverfahren wird verbessert. In Bezug auf die Vorkultur sind keine speziellen Bedingungen, die die Verbesserung der Endproduktivität einer Verbindung von Interesse betrachten, bekannt.
Eine Aufgabe der Vorkultur ist es, die Wachstumsrate der Zellen zu erhöhen, so dass so viele Zellen wie möglich zu der Hauptkultur zugeführt werden. Gleichzeitig ist es für die Vorkultur erforderlich, die latente Fähigkeit von Zellen, Diterpene vom Taxan-Typ herzustellen, zu erhöhen, so dass die Zellen, wenn sie überführt werden, ausreichend Diterpene in der Hauptkultur herstellen werden. Die Bedeutung der Vorkulturbedingungen aus der Sicht der Erhöhung der latenten Fähigkeit der Zellen ist, wie oben beschrieben, bis jetzt noch nicht erkannt worden.
EP-A-0 727 492 offenbart Verfahren zur Herstellung von Diterpen vom Taxan-Typ durch Pflanzenkultur. Die Zellen werden in einer Sauerstoff-angereicherten Umgebung vorkultiviert und anschließend in Gegenwart von Coronatinsäuren schüttelkultiviert, wobei die Schüttelkultur mit einem Rotationsschüttler bei 120 U/min durchgeführt wurde. Diese Verfahren unterscheiden sich von dem erfindungsgemäßen Verfahren, da das Verfahren von EP A-0 727 492 sich nicht auf die Auswahl von Zellen auf der Basis der Größe der Zellanhäufung bezieht.
Im allgemeinen können als Parameter zur Kontrolle und Regulierung der Sauerstoffzufuhr zu den Pflanzenzellen oder dergleichen in Suspensionskultur der Stoffübergangsvolumenkoeffizient (k_La) und die gelöste Sauerstoffkonzentration (DO) beispielsweise aufgeführt werden. Die Schüttelrate und die Gaszufuhrrate können nicht universell verwendet werden, da sie durch die Größe des Kulturbehälters und die Menge des verwendeten Mediums beeinträchtigt sind, obgleich sie einfach in diesem Sinne zu bestimmen und von Vorteil sind. Daher sind dies völlig bedeutungslose Parameter in Bezug auf die Kultivierungstechnik. Es hat sich gezeigt, dass die Produktivität eines Erzeugnisses von Interesse (Menge der Anhäufung/Zelle) durch k_La und DO bei betriebsmäßiger Kultivierung beeinflusst ist [Y. Fujita & Y. Hara, Agric. Biol. Chem., 49, S. 2071–2075 (1985)]. Der Einfluss dieser Parameter bei der Vorkultur ist bis zum heutigen Datum jedoch nicht untersucht worden.
Aufgaben und Zusammenfassung der Erfindung
Eine erfindungsgemäße Aufgabe ist es, die Produktivität der Diterpene vom Taxan-Typ bei Verfahren zu verbessern, die solche durch Kultivieren von Pflanzenzellen herstellen.
Als Ergebnis intensiver und umfangreicher Forschungsexperimente, die auf die Lösung der oben gestellten Aufgabe gerichtet sind, haben die Erfinder festgestellt, dass beim Kultivieren von Diterpen vom Taxan-Typ herstellenden Pflanzenzellen die Verwendung von kleinen Zellanhäufungen die Produktivität der Diterpene vom Taxan-Typ erhöht. Dadurch wurde die Erfindung bereitgestellt.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ durch Kultivieren von Zellen einer Diterpen vom Taxan-Typ erzeugenden Pflanze, wobei das Verfahren umfasst:

(1) Durchführen der folgenden beiden Schritte (a) und (b), so dass der Gehalt der Zellcluster mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 0,12 bis 1,6 mm 65% oder mehr des Gesamtfrischegewichts der Zellen wird:
(a) Durchführen mindestens eines Vorgangs zum Entfernen von Zellclustern, die anders als Zellcluster mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 0,12 bis 1,6 mm sind, mit einem Sieb und/oder einem Filter
(i) während dem Kultivieren der 2. bis 10. Kultur vor der Hauptkultur zur Herstellung von Diterpenen von Taxan-Typ, und/oder
(ii) zur Zeit des Zelltransfers, der am Anfang jedes der 2. bis 10. Kulturen vor der Hauptkultur durchgeführt wird;
(b) Kultivieren der Pflanzenzellen unter einer Rührgeschwindigkeit von 30 bis 180 U/min nach Schritt (a), worin das Durchführen beider Schritte (a) und (b) zu einer Zellkultur führt, worin 65% oder mehr des Gesamtfrischegewichts der Zellen in der resultierenden Zellkultur Zellcluster mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 0,12 bis 1,6 mm sind, und worin die resultierende Zellkultur der Hauptkultur zur Verfügung gestellt wird; und
(2) Rückgewinnen des Diterpens oder der Diterpene vom Taxan-Typ aus der resultierenden Hauptkultur.

Die Zellanhäufung, die sich für die Diterpenherstellung eignet, weist einen durchschnittlichen Durchmesser im Bereich von 0,12 mm bis 1,6 mm, bevorzugt von 0,12 mm bis 1,0 mm, auf, wobei der mittlere Durchmesser dargestellt wird durch einen Zwischenwert zwischen der Hauptachse und der Nebenachse der Zellanhäufung.
Bevorzugt wird das Verhältnis der Zellcluster, die sich zur Diterpenherstellung eignen, auf 65% oder höher, insbesondere 80% oder höher, im Verhältnis zum Gesamtfrischegewicht der Zellen erhöht.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Diagramm, das einen Kolben zeigt, der mit Platten am Boden ausgestattet ist, die als Prallplatten dienen.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung
Hiernach wird die Erfindung detaillierter beschrieben.
Beispiele von Diterpen vom Taxan-Typ herstellenden Pflanzen, die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, umfassen Taxuspflanzen, wie Europäische Eibe (Taxus baccata LINN), Japanische Eibe (T. cuspidata SIEB. und ZUCC), Kyaraboku (T. Cuspidata SIEB. und ZUCC var. nana REHDER), Pacific Eibe (T. brevifolia NUTT), Kanadische Eibe (T. canadensis MARSH), Chinese Eibe (T. cinensis), Himalaysche Eibe (T. wallichiana ZUCC) und T. media. Unter diesen sind die Europäische Eibe and T. media besonders bevorzugt.
Zunächst wird ein Explantat aus einem Teil der Taxus-Pflanze entnommen, z. B. einer Wurzel, einem Sproßscheitel, einem Blatt, einem Stiel, Samen oder dergleichen, wird sterilisiert, auf ein Woody-Pflanzenmedium (hiernach als "WP-Medium" bezeichnet) aufgelegt, mit Gelangummi fest werden und bei 10 bis 35°C 14 bis 60 Tage gehalten, so dass ein Teil des Gewebestückes sich zu einem Callus verändert. Das Subkultivieren des so erhaltenen Callus beschleunigt die Wachstumsrate nach und nach unter Erhalt eines sterilisierten Callus. Der Ausdruck "sterilisierter Callus" betrifft einen Callus, der in einem Calluszustand während der Kultur verbleibt, ohne Differenzierung in Trieben oder Wurzeln zu zeigen, wobei die Zellen eine gleichförmige Wachstumsrate aufweisen.
Ein solcher sterilisierter Callus wird in ein Flüssigmedium übertragen, das sich zum Wachstum eignet (z. B. flüssiges WP-Medium). Anschließend wird die Wachstumsrate weiter beschleunigt (die Vorkultur in diesem Zustand wird insbesondere als "Wachstumskultur" bezeichnet).
Erfindungsgemäß werden die folgenden Schritte durchgeführt, um aus diesen sterilisierten Zellen der Zahl der Zellanhäufungen zu erhöhen, die sich zur Herstellung von Diterpenen von Taxan-Typ eignen.
Im ersten Schritt werden große Zellanhäufungen durch Sieben der kultivierten Zellen entfernt. Dieser Entfernungsvorgang kann mit einem Filter anstatt mit einem Sieb oder durch eine Kombination aus Sieb und Filter durchgeführt werden. Die Öffnung des Siebes ist nicht besonders eingeschränkt, solange das Sieb die großen Zellanhäufungen entfernt. Zur Verbesserung der Wirksamkeit der Produktivität des Erzeugnisses von Interesse ist die Öffnung bevorzugt 1410 μm oder weniger, insbesondere bevorzugt 840 μm oder weniger.
Da Anhäufungen von kultivierten Zellen einer Taxuspflanze nicht sphärisch sind, können solche Zellanhäufungen mit einer Nebenachse kleiner als die oben erwähnte Öffnung durch jedes der obigen Siebe hindurchtreten. Der mittlere Durchmesser der Zellanhäufung, der ein solches Sieb durchfließt und der als Zwischenwert der Hauptachse und der Nebenachse der Zellanhäufung bezeichnet wird, ist 1,6 mm oder weniger, wenn die Öffnung 1410 μm beträgt und 1,0 mm oder weniger, wenn die Öffnung 840 μm beträgt. Solche Zellanhäufungen, die durch ein Sieb mit einer 100 μm-Öffnung hindurchtreten und einen mittleren Durchmesser von 0,12 mm oder weniger aufweisen, können entweder aus der Zellanhäufung entfernt werden oder darin verbleiben, da sowohl ihre Fähigkeit zu wachsen als auch ihre Fähigkeit, Diterpene vom Taxan-Typ herzustellen, deutlich verringert sind.
Der Zeitpunkt, die kultivierten Zellen zu sieben, kann entweder während der Vorkultur stattfinden oder zum Zeitpunkt der Zellübertragung aus einer Vorkultur zu der darauffolgenden Vorkultur. Angesichts der Bedienungseffizienz und Wirtschaftlichkeit ist der Zeitpunkt der Zellübertragung bevorzugt. Es ist bevorzugt, einen Vorgang, bei dem große Zellanhäufungen entfernt werden, zumindest einmal während der Kultivierung der 2. bis 10. Kultur vor der Hauptkultur zur Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ durchzuführen und/oder zum Zeitpunkt der Zellübertragung, die zu Beginn jeder 2. bis 10. Kultur durchzuführen. Obgleich es möglich ist, den Siebvorgang zum Zeitpunkt der Zellübertragung von der Vorkultur zur Hauptkultur durchzuführen, ist das Sieben zu diesem Zeitpunkt angesichts der Kulturkosten und der Abfallbeseitigungskosten von Nachteil, da die Zellmenge der Vorkultur kurz vor der Hauptkultur groß ist, wodurch die Möglichkeit der Verunreinigung durch Mikroorganismen während des Siebvorganges hoch ist und die Menge der zu beseitigenden großen Zellanhäufungen ebenfalls groß ist.
WO 95/14103 ( EP 0 683 232 ) offenbart ein Verfahren, bei dem Zellen durch Teilchengröße zum Zeitpunkt der Zellübertragung aus der Vorkultur zur Hauptkultur fraktioniert werden. Die Fraktionierung wird durchgeführt, um die Genauigkeit der Untersuchungen zu erhöhen, und das in dieser Offenbarung beschriebene Verfahren unterscheidet sich vollständig vom erfindungsgemäßen Verfahren in seinem Gedanken und in der Vorgehensweise. Das heißt, da die erfindungsgemäße Wirkung, das Verhältnis solcher Zellanhäufungen, die sich zur Herstellung von Diterpen vom Taxan-Typ eignen, durch Sieben zu erhöhen gewöhnlich von ungefähr 2 bis ungefähr 10 Generationen dauert, ohne einen ähnlichen Vorgang zum Zeitpunkt der Zellübertragung nach dem Siebvorgang durchzuführen, ist es nicht notwendig, den Vorgang nochmals zum Zeitpunkt der Zellübertragung von der Vorkultur zur Hauptkultur durchzuführen.
Wenn das Sieben der kultivierten Zellen während der Kultur durchgeführt wird, können die Zellen aus dem Kulturbehälter zum Sieben einmal herausgenommen werden. Alternativ kann ein Sieb oder Filter in eine Kulturvorrichtung eingeführt werden, so dass die großen Zellanhäufungen automatisch entfernt werden können. Es ist ebenfalls möglich, den obigen Siebvorgang regulär durchzuführen, wenn die Zellen in ein frisches Medium übertragen werden, um dadurch eine Gruppe von stabilen kleinen Zellanhäufungen zu erhalten.
Der Ausdruck "Vorkultur", der hier verwendet wird, betrifft eine Kultur, die hauptsächlich durchgeführt wird, um Samenzellen wachsen zu lassen, die zur Hauptkultur zugeführt werden und um die Kulturskala in Schritten gemäß dem Anstieg der Zellmenge zu erhöhen. Zur Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ wird die Vorkultur gewöhnlich 2–10 Mal durchgeführt. Der Ausdruck "Hauptkultur", wie er hier verwendet wird, betrifft eine Kultur, die durchgeführt wird, um das Erzeugnis von Interesse, d. h. die Terpene vom Taxan-Typ, herzustellen.
Im zweiten Schritt werden Zellen unter Bedingungen kultiviert, um eine starke Bewegung zu bewirken (hiernach als "starke Bewegungsbedingungen" bezeichnet), die die einzelnen Zellen nicht beschädigen, um große Zellanhäufungen zu zerkleinern unter Erhalt von kleinen Zellanhäufungen. Der Ausdruck "starke Bewegungsbedingungen", wie er hier verwendet wird, betrifft solche Bedingungen, unter denen Zellanhäufungen zerkleinert werden, so dass das Verhältnis von kleinen Zellanhäufungen mit einem mittleren Durchmesser gewöhnlich im Bereich von 0,12 mm bis 1,6 mm, bevorzugt von 0,12 mm bis 1,0 mm, gewöhnlich 65% oder mehr, bevorzugt 80% oder mehr, im Verhältnis zum Gesamtfrischegewicht der Zellen beträgt.
Solche Bewegungsbedingungen können erreicht werden, indem die Rotationsgeschwindigkeit der Impeller erhöht wird oder deren Form verändert wird, oder durch Installieren von Prallplatten in dem Kulturbehälter. Die Kultivierung unter solchen Bedingungen kann entweder in der Hauptkultur zur Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ oder in der Vorkultur durchgeführt werden. Während der Kultivierungsdauer kann die Bewegungsintensität für eine bestimmte Dauer oder über die Kultivierungsdauer erhöht sein.
Um die obigen Bewegungsbedingungen durch Anstieg der Rotationsgeschwindigkeit der Impeller zu erreichen, können Impeller vom Schaufeltyp, deren Durchmesser 1/2 des inneren Durchmessers des Kulturbehälters und deren Höhe 1/4 der Tiefe der Kulturflüssigkeit beträgt, verwendet werden, z. B. bei einer Geschwindigkeit von 30 bis 180 U/min, bevorzugt 40 bis 120 U/min, sofern die Zellen normale intrazelluläre Haftungsintensität aufweisen.
Um die obigen Bewegungsbedingungen durch Ändern der Form der Impeller zu erreichen, werden z. B. hohle Impeller vom Schaufeltyp, Drehtyp oder Turbinentyp verwendet.
Um die obigen Bewegungsbedingungen durch Einführen von Prallplatten in den Kulturbehälter zu erreichen, wird die Streckdistanz von der inneren Wandoberfläche des Kulturbehälters zum Ende der Prallplatte erhöht und/oder die Zahl der installierten Prallplatten wird erhöht.
Die so erhaltenen Zellcluster werden in die Hauptkultur übertragen, um die Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ zu gewährleisten.
Erfindungsgemäß bedeutet der Ausdruck "latente Fähigkeit herzustellen", die Fähigkeit der Zellen, große Mengen an Diterpenen vom Taxan-Typ herzustellen, wenn sie in ein neues Medium übertragen werden. Mit anderen Worten bedeutet dieser Ausdruck Kapazität als Samenzellen (Inokulum).
Diterpene vom Taxan-Typ sind nicht besonders beschränkt, solange sie ein Taxanskelett aufweisen. Spezifische Beispiele umfassen Taxol, 10-Deacetyltaxol, 7-Epitaxol, Baccatin III, 10-Deacetylbaccatin III, 7-Epibaccatin III, Cephalomannin, 10-Deacetylcephalomannin, 7-Epicaphalomannin, Baccatin VI, Taxan 1a, Xylosylcaphalomannin, Xylosyltaxol, Taxol C, 10-Deacetyltaxol C, Taxisin I, Taxisin II, Taxin I, Taxin II und Taxagifin.
Beispiele des verwendeten Medium zum erfindungsgemäßen Kultivieren der Zellen umfassen bekannte Medien, die herkömmlich bei der Kultivierung von Pflanzenzellen eingesetzt werden, wie Murashige & Skoog Medium (1962), Linsmaier Skoog Medium (1965), Woody Plant Medium (1981), Gamborgs B-5-Medium, M9-Medium von Fujita et al.
Phytohormone und wenn möglich Kohlenstoffquellen, anorganische Komponenten, Vitamine, Aminosäuren und dgl. können zu diesen Medien gegeben werden.
Als Kohlenstoffquellen können Disaccharide wie Saccharose, Maltose und Lactose; Monosaccharide wie Glucose, Fructose und Galactose; Stärke; oder Mischungen aus zwei oder mehreren dieser Zuckerquellen in einem geeigneten Verhältnis verwendet werden.
Als anorganische Komponenten umfassen spezifische Beispiele Phosphor, Stickstoff, Kalium, Calcium, Magnesium, Schwefel, Eisen, Mangan, Zink, Bor, Kupfer, Molybdän, Chlor, Natrium, Iod und Kobalt. Diese Komponenten können in der Form als Kaliumnitrat, Natriumnitrat, Calciumnitrat, Kaliumchlorid, Kaliummonohydrogenphosphat, Kaliumdihydrogenphosphat, Calciumchlorid, Magnesiumsulfat, Natriumsulfat, Eisen(II)-sulfat, Eisen(III)-sulfat, Mangansulfat, Zinksulfat, Borsäure, Kupfersulfat, Natriumolybdat, Molybdäntrioxid, Kaliumiodid, Kobaltchlorid und dgl. zugegeben werden.
Als Phytohormone können z. B. Indolessigsäure (IAA), Naphthalinessigsäure (NAA) und 2,4-Dichlorhenoxyessigsäure-(2,4-D) und Cytokinin, wie Kinetin, Zeatin und Dihydrozearin, verwendet werden.
Als Vitamine können Biotin, Thiamin (Vitamin B1), Pyridoxin (Vitamin B6), Pantothensäure, Inositol, Nikotinsäure und dgl. verwendet werden.
Als Aminosäuren können zugefügt werden: Glycin, Phenylalanin, Leucin, Glutamin, Cystein und dergleichen.
Im allgemeinen werden die anorganischen Komponenten jeweils in einer Konzentration von ungefähr 0,1 M bis 100 mM, die Kohlenstoffquelle in einer Konzentration von ungefähr 1 bis 30 g/l; die Phytohormone in einer Konzentration von ungefähr 0,01 bis 10 M; und die Vitamine und Aminosäuren in einer Konzentration von ungefähr 0,1 bis 100 mg/l zugegeben.
Bei der erfindungsgemäßen Zellkultur kann ein Gewebestück oder Zellen aus einer Wurzel, einem Sproßscheitel, einem Blatt, einem Stiel, einem Samen, einem Pollen, einem Staubbeutel, einem Blütenkelch usw. von der oben erwähnten Pflanze oder von den kultivierten Zellen, die durch Kultivieren eines solchen Gewebestückes oder solcher Zellen in dem oben beschriebenen Medium oder einem herkömmlichen Medium verwendet werden.
Diterpene vom Taxan-Typ können aus den so erhaltenen kultivierten Geweben, kultivierten Zellen und/oder Medium durch Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel, wie Methanol, isoliert werden. Alternativ ist es ebenfalls möglich, die Terpene vom Taxan-Typ kontinuierlich zu gewinnen, indem es ermöglicht wird, dass ein geeignetes Absorptionsmittel und organisches Lösungsmittel zusammen in dem Medium vorhanden sind.
Erfindungsgemäß kann die Produktivität der Diterpene vom Taxan-Typ weiter verbessert werden, indem eine Jasmonsäure oder ein Jasmonsäurederivat, wie Methyljasmonat, wie es in EP 0 683 232 offenbart ist, ein Imino- oder Aminoderivat von Jasmonsäuren, wie es in EP 0 727 492 offenbart ist, Coronatin oder ein Coronatinderivat, wie Coronafacinsäure, wie es in EP 0 727 492 offenbart ist, eine Verbindung, enthaltend ein Schwermetall und/oder Schwermetallionen, wie es in EP 0 683 232 offenbart ist, Amine, wie es in EP 0 683 232 offenbart ist, oder ein cyclisches Polysaccharid, wie Cyclodextrin, wie es in EP 0 727 492 offenbart ist, zu dem Medium als Herstellungsförderungsmittel zugegeben werden.
Als Kulturtemperatur, die bei der erfindungsgemäßen Zellkultur eingesetzt wird, wird gewöhnlich ungefähr 10 bis 35°C verwendet. Insbesondere bevorzugt ist 23 bis 28°C, da die größte Wachstumsrate bei diesen Temperaturen erreicht wird. Als Kultivierungsdauer sind 7 bis 42 Tage bevorzugt.
Wenn ein flüssiges Medium im erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahren verwendet wird, werden die kultivierten Zellen aus dem Medium durch Dekantieren oder Filtrieren nach Beendigung der Kultivierung getrennt. Anschließend kann das Diterpen (können die Diterpene) vom Taxan-Typ von den Zellen und/oder dem Medium getrennt werden, durch z. B. Extraktion mit einem organischen Lösungsmittel.
Als Verfahren zum Erhöhen der erfindungsgemäßen Wirkung kann das erfindungsgemäße Verfahren zusammen mit dem in EP 0 683 232 beschriebenen Verfahren durchgeführt werden. Bei dem letzteren Verfahren werden Zellen in eine Vielzahl von Schichten gemäß ihrer spezifischen Schwerkraft fraktioniert, und Zellen, die mindestens in einer der Schichten enthalten sind, werden kultiviert.
Es ist auch möglich, die Produktivität zu verbessern, indem darüber hinaus bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die Hauptkulturbedingungen, die in EP 0 683 232 offenbart sind, eingesetzt werden, d. h. die Kultur wird durchgeführt, indem die Sauerstoffkonzentration in einer Gasphase in einem Kulturbehälter auf weniger als die Sauerstoffkonzentration in der Atmosphäre zum Anfangszeitpunkt der Kultur eingestellt wird oder indem die gelöste Sauerstoffkonzentration in einem Flüssigkeitsmedium, das mit den Geweben und/oder Zellen in Kontakt ist, auf weniger als die gesättigte gelöste Sauerstoffkonzentration bei der Temperatur, bei der die Zellen kultiviert werden, aus dem Anfangsstadium der Kultur eingestellt wird.
Wirkung der Erfindung
Erfindungsgemäß ist es möglich, große Mengen an Diterpenen vom Taxan-Typ leicht durch Kultivieren von Zellen einer Diterpen vom Taxan-Typ erzeugenden Pflanze zu erhalten.
Bevorzugte erfindungsgemäße Ausführungsformen
Die Erfindung wird hiernach insbesondere unter Bezugnahme auf die folgenden Beispiele und Vergleichsbeispiele beschrieben. Der erfindungsgemäße Umfang ist allerdings durch diese Beispiele nicht eingeschränkt.
Beispiel 1
Wirkung der Schüttelgeschwindigkeit der Vorkultur bei der Fraktionierung von Zellclustern mit Sieben
(1) Vorkultur
Ein Embryo wurde aseptisch aus Samen von Taxus media, das mit 2% Antiforminlösung oder 70% Ethanollösung sterilisiert ist, isoliert. Ein Teil des Embryos wurde auf festes WP-Medium (enthaltend 0,25 Gew.-% Gelangummi), das mit α-Naphthalinessigsäure in einer Konzentration von 10^–5 M ergänzt worden war, gelegt und mit einem Autoklaven sterilisiert. Die statische Kultivierung wurde an einem dunklen Ort bei 25°C unter Erhalt eines Callus durchgeführt. Daraufhin wurden 4 g (Frischgewicht) dieses Callus in einen 300 ml Kolben, enthaltend 100 ml flüssiges WP-Medium, das mit α-Naphthalinessigsäure bei der gleichen Konzentration wie oben beschrieben ergänzt worden war, übertragen und mit einem Autoklaven sterilisiert (hiernach als "Standardmedium" bezeichnet), und kreisförmige Schüttelkulturen wurden auf einem Rundschüttler (Amplifizierung: 25 mm; 100 U/min) durchgeführt. Der Callus wurde alle 14 Tage fünfmal insgesamt subkultiviert, um die Wachstumsrate zu beschleunigen. Die so erhaltenen Zellen wurden "Standardzellen" genannt.
Die Standardzellen wurden in einen Kolben unter den gleichen Bedingungen wie oben beschrieben übertragen und auf einen Rundschüttler des gleichen Typs 14 Tage bei einer Schüttelgeschwindigkeit von 170 U/min kultiviert.
(2) Sieben
Die resultierenden Zellen wurden nacheinander gemäß der Größe der Zellcluster unter Verwendung von nicht-rostenden Sieben mit 1410 μm, 840 μm und 500 μm Öffnungen fraktioniert. Anschließend wurden die Verhältnisse der Trockengewichte der einzelnen Zellen bestimmt.
Auf der anderen Seite wurden die Standardzellen zu Vergleichszwecken dem gleichen Siebverfahren unterworfen zum Fraktionieren der Zellanhäufungen nach der Größe, ohne das die Schüttelkultur bei 170 U/min durchgeführt wird. Die Frischgewichtsverhältnisse der einzelnen Fraktionen wurden anschließend bestimmt. Die Ergebnisse beider Siebverfahren sind in Tabelle 1 aufgeführt.
Tabelle 1 Teilchengrößenverteilung (%) in den Zellen, die bei 170 U/min und den Zellen, die bei 100 U/min kultiviert wurden.
Beispiel 2
Taxolproduktivität der Zellen, die von jeder einzelnen Teilchengrößenfraktion abstammen
2 g (Frischgewicht) von jedem der in Beispiel 1 erhaltenen vier Fraktionen wurden in einen 100 ml-Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 20 ml Standardmedium, das 100 μm Methyljasmonat enthält, das als Beschleunigungsmittel zur Herstellung von Diterpen vom Taxan-Typ dient, übertragen. Anschließend wurde die Schüttelkultur auf einen Rundschüttler des gleichen Typs wie oben beschrieben, der auf 100 U/min eingestellt worden war, an einem dunklen Ort bei 25°C 14 Tage lang durchgeführt (Hauptkultur).
Nach der Beendigung der Kultivierung wurden die Zellen durch Filtrierung geerntet und gefriergetrocknet. Das Trockengewicht der Zellen wurde gemessen, um das Gewicht der kultivierten Zellen pro Liter flüssigem Medium zu bestimmen. Diterpene vom Taxan-Typ wurden aus dem trockenen Callus mit Methanol oder dgl. extrahiert und quantitativ bestimmt durch Vergleichen mit Standardprodukten unter Verwendung von Hochdruckflüssigkeitschromatographie, um die Taxolausbeute dadurch zu bestimmen. Diterpene vom Taxan-Typ wurden ebenfalls aus dem Kulturfiltrat mit Dichlormethan extrahiert, gefolgt von der gleichen quantitativen Bestimmung, wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2 Taxol-Produktivität der Zellen, die von jeder einzelnen Teilchengrößenfraktion abstammen
Tabelle 2 zeigt, dass je kleiner die Maschengröße eines rostfreien Edelstahlsiebes ist, je größer ist die Taxolausbeute in solchen Zellen, die mit dem Sieb fraktioniert wurden.
Beispiel 3
Wirkung der Schüttelgeschwindigkeit in der Vorkultur bei der Taxolherstellung
(1) Vorkultur
4 g (Frischgewicht) Standardzellen, die in Beispiel 1 beschrieben sind, wurden in einen 300 ml Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 100 ml Standardmedium, übertragen und die Schüttelkultur wurde auf einem Rundschüttler des gleichen Typs wie oben beschrieben, der auf 170 U/min eingestellt worden war, an einem dunklen Ort bei 25°C 14 Tage lang durchgeführt.
(2) Hauptkultur
Die resultierenden Zellen wurden aus dem flüssigen Medium durch Filtrierung getrennt. Anschließend wurden 2 g (Frischgewicht) der Zellen in einen 100 ml Erlenmeyer-Kolben, enthaltend 20 ml Standardmedium, das 100 μM Methyljasmonat enthält, übertragen. Die Schüttelkultur wurde auf einem Rundschüttler des gleichen Typs wie oben beschrieben, der auf 100 U/min eingestellt worden war, an einem dunklen Ort bei 25°C 14 Tage lang durchgeführt. Die resultierenden Zellen und das Medium wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben behandelt, gefolgt von der Bestimmung der Trockenzellausbeute und der Taxolausbeute.
Auf der andere Seite wurden die gleichen Vorgänge durchgeführt, außer dass die Schüttelgeschwindigkeit des Rundschüttlers in der Vorkultur auf 100 U/min und 80 U/min eingestellt wurde, gefolgt von der Bestimmung der Trockenzellausbeute und der Taxolausbeute.
Darüber hinaus wurden die gleichen Vorgänge durchgeführt, außer dass der Kolben, der in der Vorkultur verwendet wurde, mit Falten, die als Prallplatten dienen, ausgestattet ist, um die Rührintensität zu erhöhen (siehe 1). Anschließend wurden das Trockenzellgewicht und die Taxolausbeute bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 zusammengefasst.
Tabelle 3
Tabelle 3 zeigt, dass sich die Taxolausbeute mit dem Anstieg der Schüttelgeschwindigkeit in der Vorkultur erhöht.
Beispiel 4
Wirkung der Rührgeschwindigkeit in der Hauptkultur bei der Taxolherstellung und Wirkung desselben auf die Teilchengröße der Zellanhäufungen
Ein Liter Standardmedium, enthaltend 100 μM Methyljasmonat und 100 g (Frischgewicht) Standardzellen wurden in einen Gefäßfermentator, der mit modifizierten Impellern vom Schaufeltyp ausgestattet ist, und auf eine Rührgeschwindigkeit von 40 U/min, 60 U/min oder 80 U/min eingestellt worden ist, übertragen. Die Zellen wurden in der Dunkelheit bei 25°C 14 Tage kultiviert, wobei 1%ige CO₂-enthaltende Luft bei einer Geschwindigkeit von 0,1 vvm zugeführt wurde. Ein Teil der resultierenden Zellen und das Medium wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben behandelt, um die Trockenzellausbeute und die Taxolausbeute zu bestimmen. Die verbleibenden Zellen wurden mit einem Sieb mit einer Öffnung von 840 U/min gesiebt und das Verhältnis der Zellen mit kleiner Teilchengröße, die durch dieses Sieb hindurchleiten, wurde bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4
Tabelle 4 zeigt, dass sich die Taxolausbeute mit dem Anstieg der Rührgeschwindigkeit in der Hauptkultur erhöht. Darüber hinaus erhöht sich bei solchen Zellen, die bei einer hohen Rührgeschwindigkeit kultiviert wurden, das Verhältnis von kleinen Zellanhäufungen im Bruttofrischgewicht der Zellen.
Beispiel 5
Wirkung der Fraktionierung der Zellanhäufung mit einem Sieb bei der Taxolherstellung
Aus den in Beispiel 1 beschriebenen Standardzellen wurden Zellanhäufungen, die durch ein Edelstahlsieb mit einer 1410 μm- oder 840 μm-Öffnung passieren, entfernt. Die verbleibenden Zellen wurden aus dem flüssigen Medium durch Filtrierung getrennt. 4 g (Frischgewicht) der resultierenden Zellen wurden in einen 300 ml-Erlenmeyer-Kolben, der 100 ml Standardmedium enthält, übertragen und unter Schütteln auf einem Rundschüttler des gleichen Typs wie oben beschrieben, der auf 100 U/min eingestellt worden war, an einem dunklen Ort bei 25°C 14 Tage kultiviert. Die gesamten erhaltenen Zellen wurden aus dem flüssigen Medium durch Filtrierung getrennt. 2 g der resultierenden Zellen wurden in einen 100 ml Erlenmeyer-Kolben, der 200 ml Standardmedium enthält, enthaltend 100 μM Methyljasomonat, übertragen und unter Schütteln auf einem Rundschüttler des gleichen Typs wie oben beschrieben, der auf 100 U/min eingestellt worden war, an einem dunklen Ort bei 25°C 14 Tage kultiviert. Die resultierenden Zellen und das Medium wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 beschrieben behandelt, um die Trockenzellausbeute und die Taxolausbeute zu bestimmen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Auf der anderen Seite wurden die Standardzellen auf die gleiche Weise wie oben beschrieben behandelt, außer dass die Entfernung der großen Zellanhäufungen mit einem Sieb nicht durchgeführt wurde. Anschließend wurden die Trockenzellausbeute und die Taxolausbeute bestimmt. Die Ergebnisse sind ebenfalls in Tabelle 5 aufgeführt.
Tabelle 5 Taxolproduktivität jeder Gruppe von Zellanhäufungen
Tabelle 5 zeigt, dass Zellen, die mit einem Sieb mit einer kleineren Öffnung zum Zeitpunkt der Zellübertragung und der Zellkultur fraktioniert worden war, mehr Taxol herstellen.
Beispiel 6
Teilchengrößenverteilung bei Zellen, die mit Sieben mit Öffnungen von 500 μm oder weniger fraktioniert worden waren, und Taxol-Produktivität der resultierenden Fraktionen
Die Standardzellen, die in Beispiel 1 erhalten wurden, wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 gesiebt, außer dass Siebe mit Öffnungen von 500 μm, 250 μm und 100 μm verwendet wurden. Bei jeder resultierenden Fraktion wurde das Verhältnis von Zelltrockengewicht bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6 gezeigt.
Tabelle 6 Teilchengrößenverteilung (%) bei Zellen, die bei 170 U/min und bei Zellen, die bei 100 U/min kultiviert wurden
Solche Zellen, die durch das 100 μm-Sieb passieren, wurden unter einem Mikroskop untersucht. Es wurde festgestellt, dass unabhängig von der Schüttelgeschwindigkeit alle Populationen gealterte Zellen sind, die braun oder Zellreste davon sind, obgleich eine sehr geringe Zahl von Anhäufungen aus 1 bis 10 Zellen bestand. Diese Zellen wurden auf die gleiche Weise wie in Beispiel 2 nochmals kultiviert, aber kein neuer Zellwachstum oder keine neue Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ wurden beobachtet.
Obgleich bestätigt wurde, dass die Fraktion, die mit dem 500 μm-Sieb fraktioniert wurde, eine verbesserte Taxol- Produktivität in Beispiel 2 bewirkt, haben sich solche Zellen, die darin enthalten sind und durch das 100 μm-Sieb passieren, als ungeeignet für die erfindungsgemäße Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ erwiesen.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Diterpenen vom Taxan-Typ durch Kultivieren von Zellen einer Diterpen vom Taxan-Typ erzeugenden Pflanze, das Verfahren umfassend: (1) Durchführen der folgenden beiden Schritte (a) und (b), so daß der Gehalt der Zellcluster mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 0,12 bis 1,6 mm 65% oder mehr des Gesamtfrischegewichts der Zellen wird: (a) Durchführen mindestens eines Vorgangs zum Entfernen von Zellclustern, die anders als Zellcluster mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 0,12 bis 1,6 mm sind, mit einem Sieb und/oder einem Filter (i) während dem Kultivieren der 2. bis 10. Kultur vor der Hauptkultur zur Herstellung von Diterpenen von Taxan-Typ, und/oder (ii) zur Zeit des Zelltransfers, der am Anfang jedes der 2. bis 10. Kulturen vor der Hauptkultur durchgeführt wird; (b) Kultivieren der Pflanzenzellen unter einer Rührgeschwindigkeit von 30 bis 180 U/min nach Schritt (a), worin das Durchführen beider Schritte (a) und (b) zu einer Zellkultur führt, worin 65% oder mehr des Gesamtfrischegewichts der Zellen in der resultierenden Zellkultur Zellcluster mit einem mittleren Durchmesser im Bereich von 0,12 bis 1,6 mm sind, und worin die resultierende Zellkultur der Hauptkultur zur Verfügung gestellt wird; und (2) Rückgewinnen des Diterpens oder der Diterpene vom Taxan-Typ aus der resultierenden Hauptkultur.
Verfahren gemäß Anspruch 1, worin die Zellcluster mit geeigneter Größe zur Diterpen-Herstellung einen mittleren Durchmesser von 0,12 bis 1,0 mm besitzen.
Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 2, worin der Gehalt der Zellcluster mit geeigneter Größe zur Diterpen-Herstellung auf 80 oder mehr Gew.-%, bezogen auf das Gesamtfrischegewicht der Zellen, erhöht wird.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Diterpen vom Taxan-Typ mindestens eines von Taxol, 10-Deacetyltaxol, 7-Epitaxol, Baccatin III, 10-Deacetylbaccatin III, 7-Epibaccatin III, Cephalomannin, 10-Deacetylcephalomannin, 7-Epicephalomannin, Baccatin VI, Taxan 1a, Xylosylcephalomannin, Xylosyltaxol, Taxol C, 10-Deacetyltaxol C, Taxicin I, Taxicin II, Taxin I, Taxan II und Taxagifin ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Diterpen vom Taxan-Typ erzeugende Pflanze eine Pflanze ist, die zum Genus Taxus gehört.
Verfahren gemäß Anspruch 5, worin die Pflanze, die zum Genus Taxus gehört, Taxus media oder Taxus baccata ist.
Verfahren gemäß einem der vorangehenden Ansprüche, worin ein Jasmonsäurederivat oder ein Coronatinderivat in der Hauptkultur als Beschleunigungsmittel für die Diterpen vom Taxan-Typ Erzeugung verwendet wird, worin das Jasmonsäurederivat mindestens eines von Jasmonsäuren, Alkylestern von Jasmonsäuren und Imino- oder Aminoderivaten von Jasmonsäuren ist, und worin das Coronatinderivat Coronatin und/oder Coronafacinsäure ist.