ES2236868T3 - Metodos para producir diterpenos del tipo taxano. - Google Patents
Metodos para producir diterpenos del tipo taxano.Info
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Abstract
LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE A UN METODO DE PRODUCCION DE DITERPENOS DE TIPO TAXANO, MEDIANTE EL CULTIVO DE CELULAS DE UNA PLANTA PRODUCTORA DE DITERPENO DE TIPO TAXANO. DICHO METODO CONSISTE EN INCREMENTAR EL CONTENIDO DE AGRUPACIONES CELULARES DE TAMAÑO ADECUADO PARA LA PRODUCCION DE DITERPENO EN EL CULTIVO, MEDIANTE: (A) SEPARACION FISICA DE AL MENOS ALGUNAS DE LAS AGRUPACIONES CELULARES GRANDES, ANTES DEL CULTIVO PRINCIPAL; Y/O (B) CULTIVAR DICHAS CELULAS VEGETALES BAJO CONDICIONES DE AGITACION FUERTE. LA PRESENTE INVENCION SE REFIERE ASIMISMO A UN METODO DE PRODUCCION DE DITERPENOS DE TIPO TAXANO, MEDIANTE EL CULTIVO DE CELULAS DE UNA PLANTA PRODUCTORA DE DITERPENO DE TIPO TAXANO. DICHO METODO CONSISTE EN: (A) PRECULTIVAR LAS CELULAS VEGETALES EN UN MEDIO ENRIQUECIDO EN OXIGENO; (B) SUMINISTRAR LAS CELULAS RESULTANTES A UN CULTIVO PRINCIPAL, PARA PRODUCIR DITERPENOS DE TIPO TAXANO; Y (C) RECUPERAR LOS DITERPENOS DE TIPO TAXANO A PARTIR DEL CULTIVO RESULTANTE.
Description
Métodos para producir diterpenos del tipo
taxano.
La presente invención se refiere a métodos para
producir diterpenos del tipo taxano incluyendo taxol, que es útil
como agente terapéutico para el cáncer de ovarios, cáncer de mama,
cáncer del pulmón y sus análogos.
El Taxol es útil como agente terapéutico para el
cáncer de ovarios, cáncer de mama, cáncer del pulmón, etcétera. Es
un diterpeno del tipo taxano, aislado e identificado en la
Pacific yew (Taxus brevifolia NUTT), una planta que
pertenece al género Taxus, de la familia Taxaceae.
Este compuesto tiene un grupo éster complejo relacionado con su
actividad. El Taxol se puede encontrar en cualquier parte del
cuerpo de la planta Pacific yew, y se ha informado que el
contenido de taxol más alto está en su corteza. Actualmente, taxol
es colectado en árboles naturales o cultivados. Sin embargo, las
plantas Taxus son plantas lentas en crecer que tardan más de
10 años para alcanzar una altura de 20 cm. sobre el nivel del
suelo. Adicionalmente, el pelado de la corteza tiene como
consecuencia la muerte de los árboles. Por tanto, es difícil
obtener una cantidad grande de taxol. Si fuera posible sintetizar
taxol y los diterpenos del tipo taxano como el bacatin III (un
precursor del taxol) utilizando el cultivo de células, esto sería
muy ventajoso para poder obtener fácilmente grandes cantidades de
estos compuestos, sin tener que cosechar los
árboles.
árboles.
Como estado anterior de la técnica de producción
del taxol, en la patente de los EE.UU. Nº. 5.015.744, otorgada a
nombre de Holton et al, se revela un método semisintético
para producir taxol a partir de bacatin III o de
10-deacetil bacatin III, un precursor en la
biosíntesis de taxol. En Europa y los EE.UU., se ha aprobado y
usado clínicamente el taxol obtenido de esta semisíntesis. Usando
un método de cultivo de las células de la planta, es posible
producir materias primas para la semisíntesis, como el bacatin,
que se pueden utilizar para la producción posterior del taxol por
el proceso semisintético descrito anteriormente.
Como un método de producción del taxol usando
células cultivadas de la planta, en los EE.UU. se ha patentado un
método (la patente de los EE.UU. Nº 5.019.504), en el cual el taxol
se produce a partir de células cultivadas de la Pacific yew
(Taxus brevifolia NUTT). Sin embargo, según este método, el
rendimiento a taxol es 1-3 mg/l, lo que es
insuficiente para la producción industrial. Además, es inestable la
productividad del taxol por medio del cultivo de células. Aunque
por selección se puede obtener una célula primaria de alta
productividad, es difícil mantener el contenido de taxol en la
célula a través del subcultivo [E.R.M. Wickremesine et al.,
World Congress on Cell and Tissue Culture (1992)].
En diferentes circunstancias se han probados
diversos métodos para mejorar la productividad al taxol. Por
ejemplo, se puede enumerar un método, en el que se usan células
cultivadas del Taxus chinensis, las cuales tienen un alto
contenido de taxol, patente de los EE.UU. Nº 5.407.81); un método
que usa un proceso de cultivo ininterrumpido (publicación de
patente japonesa aún sin examinar Nº 7-255495); y
un método en el que el jasmonato de metilo, una sustancia de
transmisión de información, se añade al medio (publicación de
patente japonesa sin examinar Nº. 8-33490, y la
solicitud de patente europea EP0683232). Sin embargo, no se ha
puesto en la práctica ninguno de los métodos anteriormente
descritos. Así, es deseable una mejora adicional de la
productividad.
Las células cultivadas de plantas no formarán
células solas, sino que producirán grupos (clusters) de
varias decenas de micrómetros a varios milímetros de tamaño,
incluso cuando se cultiven en un medio líquido con agitación porque,
en general, las paredes celulares que adhieren las células
individuales son firmes y sólidas. En las plantas de ornamentación
como las plantas Taxus, usadas en la presente invención, la
adherencia intercelular es particularmente fuerte como consecuencia
del desarrollo de paredes celulares secundarias como la lignina.
Las investigaciones recientes con respecto a la
producción de metabolitos secundarios en células de plantas
cultivadas han mostrado que los metabolitos secundarios varían
dependiendo del tamaño de estos grupos ("clusters") de
células [Y. Yamada & Y. Fujita, Handbook of Plant Cell
Culture, vol. 1, edited by D.A. Evans et al., Macmillan
Publishing Co., New York, pp. 717-728 (1983); Y.
Nara et al., Planta Med., 55, pp.
151-154 (1989)]. Sin embargo, no se ha hecho ningún
informe sobre la relación entre el tamaño de partículas de esos
grupos de células y la productividad de los diterpenos del tipo
taxano.
Por otro lado, la patente de los EE.UU. Nº
5.344.775 revela los siguientes procesos como un método para
obtener grupos pequeños a partir de células de una planta
Taxus que conste de 1-10 células:
(i) Proporcionar fragmentos de tejido de callo de
explantes de Taxus que contengan tejido meristemático
físicamente soportado sobre un medio de cultivo soporte que
contenga el ácido
\alpha-naftaleno-acético como una
auxina, y la 6-bencilamino purina como una
citoquinina;
ii) Cultivar el tejido de callo en un medio
líquido que contenga la auxina y la citoquinina para producir una
suspensión de una pluralidad de grupos de 1-10
células que tengan una adherencia intercelular limitada;
iii) Colocar en placas las células retiradas de
la suspensión de células sobre una superficie de un medio de
cultivo de soporte que contenga la auxina y la citoquinina; y
iv) El dejar crecer las células colocadas en las
placas del paso (iii) sobre los cultivos del medio de soporte forma
las células del pseudocallo, siendo las células del pseudocallo una
agregación holgada y amorfa de células que carecen de tejidos
vasculares u orgánicos diferenciados y carecen de zonas
meristemáticas definidas, teniendo la agregación de células una
pobre adherencia intercelular, friabilidad extrema, y que cuando se
perturban mecánicamente caen en numerosas células individuales y
pequeños grupos de células separadas, mostrando las células del
pseudocallo una velocidad inicial de duplicación másica en el medio
de crecimiento de células que es más grande que la duplicación
másica de tejidos del callo del paso (i), y que presentan la
propiedad de producir niveles más altos de taxanos que los
producidos por los tejidos del callo del paso (i).
Sin embargo, es sumamente difícil obtener
pequeños conjuntos de células que consistan en 1-10
células y que aún puedan crecer o producir metabolitos secundarios.
(Las células cultivadas de la plantas Taxus son generalmente
de 20-30 \mum de diámetro y, por lo tanto, el
diámetro de un conjunto de células que conste de 10 células se
estima que sea menor que 100 \mum) Es imposible obtener tales
agregaciones a menos que el medio y las condiciones de cultivo sean
combinados minuciosamente tal como se revela en la patente de los
EE.UU. antes mencionada.
En las células cultivadas de varias plantas
Taxus, incluyendo las células utilizadas por los presentes
inventores, no se pueden obtener grupos pequeños de
1-10 células sanas, simplemente intensificando las
condiciones de agitación empleadas en el cultivo líquido. Lo que sí
se puede obtener por fraccionamiento, usando un tamiz de 100 \mum
de abertura son los detritos de células envejecidas solas, que no
tienen la habilidad de crecer o producir metabolitos
secundarios.
Por lo tanto, el asunto principal de la
separación de grupos de células pequeñas, como se revela en la
patente de los EE.UU. mencionada anteriormente, reside en la
preparación de un tejido de callo tal que libere fácilmente grupos
de células pequeñas. Por lo tanto, esta patente es diferente en su
idea básica y proceso de la presente invención, la cual define las
condiciones de vibración y agitación para liberar grupos de células
pequeños. En otras palabras, según la especificación de la patente
de los EE.UU. anteriormente mencionada, las condiciones de
vibración y agitación de la patente para liberar grupos pequeños que
consten de 1-10 células sanas caen dentro del
intervalo de los métodos convencionales. A diferencia de las
condiciones de la presente invención, las condiciones empleadas en
esa patente de los EE.UU. no se encuentran fuera del intervalo de
las condiciones usas en el cultivo convencional de
células.
células.
Además, teniendo en cuenta los procesos de
cultivos verdaderos, industriales, se espera en cualquiera de los
métodos anteriormente descritos el incremento de la productividad
de los diterpenos del tipo taxano finalmente obtenidos al emplear
el cultivo denominado en dos pasos, en los que el precultivo y
cultivo principal son llevados a cabo en condiciones diferentes. El
precultivo se lleva a cabo con el propósito del crecimiento de
células, y el cultivo principal se lleva a cabo con el propósito de
producir diterpenos del tipo taxano de interés, como el taxol. En
la producción de diterpenos del tipo taxano por los métodos
convencionales de cultivo de células, la mejora de las condiciones
en el cultivo principal se ha enfatizada como se ve en las 3
patentes antes mencionadas, que se relacionan con la mejora de la
productividad de taxol. Por ejemplo, un elicitor o sustancia de
transmisión de información es añadida; o el proceso de cultivo es
mejorado. Con respecto al precultivo, no se conocen ningunas
condiciones específicas preferibles para la mejora de la
productividad final de un compuesto de interés.
Como funciones del precultivo, el primero es
incrementar la velocidad de crecimiento de las células con el
propósito de que las células sean proporcionadas al cultivo
principal, tantas como sea posible. Al mismo tiempo, el precultivo
es necesario para incrementar la habilidad latente en las células
para producir diterpenos del tipo taxano con el propósito de que las
células, cuando se trasladen, produzcan eficientemente diterpenos
en el cultivo principal. Sin embargo, no se ha reconocido en
absoluto la importancia de las condiciones de precultivo desde el
punto de vista de incrementar la habilidad latente en las células
tal, como se ha descrito anteriormente.
La solicitud
EP-A-0 727 492 revela los métodos de
producir diterpenos del tipo taxano por el cultivo de la planta.
Las células se precultivan en un ambiente enriquecido con oxígeno y
luego se remueven y cultivan en presencia de ácidos coronatinos, el
cultivo se remueve en presencia de ácidos coronatinos, el cultivo
se remueve en un recipiente rotatorio a 120 r.p.m. Estos métodos son
diferentes del método de la presente solicitud, ya que el método de
la solicitud EP-A-0 727 492 no se
refiere a la selección de células en base a las dimensiones de
las
células.
células.
En general, como parámetros para controlar o
regular el suministro de oxígeno a las células de la planta, u
análogos de oxígeno al cultivo en suspensión, por ejemplo, se
pueden enumerar el coeficiente volumétrico de transferencia de masa
(k_{La}) y la concentración de oxígeno disuelto (DO). La velocidad
de agitación y la velocidad de alimentación no se pueden usar
universalmente, ya que están influidos por la forma de la vasija de
cultivo y la cantidad del medio usado, aunque se consideren
fácilmente resueltos y ventajosos en este sentido. Por tanto, son
totalmente parámetros desprovistos de significado en relación con
la ingeniería de cultivos. Se ha conocido que la productividad de un
producto de interés (cantidad de acumulación/célula) está influida
por k_{La} y DO en el cultivo total [Y. Fujita & Y.. Nara,
Agric. Biol. Chem., 49, pp. 2071-2075
(1985)]. Sin embargo, la influencia de estos parámetros en el
precultivo no se ha analizado hasta la fecha.
Es un objeto de la invención mejorar la
productividad de los diterpenos del tipo taxano en los métodos para
producir éste por cultivo de células de plantas.
Como consecuencia de investigaciones intensivas y
extensivas dirigidas hacia la solución de la meta anterior, los
presentes inventores han descubierto que en el cultivo de células
de plantas productoras de diterpenos del tipo taxano, el uso de
pequeños grupos de células incrementa la productividad de los
diterpenos del tipo taxano. Por lo tanto, se ha logrado la presente
invención.
La presente solicitud se refiere a un método para
producir diterpenos del tipo taxano por medio del cultivo de
células de una planta productora de diterpenos del tipo taxano,
método que comprende
(1) Realizar los siguientes pasos, ambos (a) como
(b), de forma que el contenido de grupos de células que tengan un
diámetro promedio que se encuentren en el intervalo de 0,12 mm a
1,6 mm resulte 65% o más del peso bruto fresco de las células:
- (a)
- realizar al menos una operación para retirar con un tamiz y/o un filtro los grupos de células, excepto los grupos de células que tengan un diámetro promedio que se encuentre en el intervalo 0,12 mm a 1,6 mm
- (i)
- durante el cultivo a los 2º hasta el 10º cultivos antes del cultivo principal para la producción de diterpenos del tipo taxano, y/o
- (ii)
- en el momento de la transferencia de células llevada a cabo al principio de cada uno de dichos 2º a 10º cultivos antes de el cultivo principal.
- (b)
- Cultivo de las células de la planta después del paso (a) a una velocidad de agitación de 30 a 180 r.p.m.
en lo que realizar ambos, los pasos
(a) y (b), dan como resultado un cultivo de células, en los que 65%
o más del peso bruto fresco de células en dicho cultivo resultante
son grupos de células que tienen un diámetro promedio que se
encuentra en el intervalo de 0,12 mm a 1,6 mm, y en lo que dicho
cultivo resultante se suministra al cultivo principal de células;
y
(2) recuperar el diterpeno o diterpenos del tipo
taxano del cultivo principal resultante.
El grupo de células apropiado por su tamaño para
la producción de diterpenos tiene un diámetro promedio que se
encuentra en el intervalo de 0,12 mm a 1,6 mm, preferentemente de
0,12 mm a 1,0 mm, diámetro promedio que está representado por un
valor intermedio entre el eje mayor y el eje menor del grupo de
células.
Preferentemente, la proporción de los grupos de
células apropiadas por sus tamaños para la producción de diterpenos
se aumenta a 65% o mayor, especialmente 80% o mayor, en relación
con el peso bruto fresco de las células.
Fig. 1 Es un diagrama que muestra un matraz
provisto de pliegues en la parte inferior que sirven de bafles.
A continuación, la presente invención será
descrita en detalle.
Los ejemplos de plantas productoras de diterpenos
del tipo taxano, para ser usadas en el método de producción de la
invención, incluyen plantas Taxus como tejos europeos
(Taxus baccata LINN), tejos japoneses (T.
cuspidata SIEB. et ZUCC), Kyaraboku (T.
cuspidata SIEB. ET ZUCC var nana RENDER), tejos del
Pacífico (T. brevifolia NUTT), tejos canadienses
(T. canadensis MARSH), tejos chinos (T.
Chinensis), tejos del Himalaya (T.
wallichiana ZUCC) y T media. Entre todos, los
tejos europeos y T media son particularmente preferibles.
Primero, se esteriliza un explante tomado de una
parte de las plantas Taxus como una raíz, punto en
crecimiento, hoja, tallo, semillas o análogos, se pone sobre el
medio Woody Plant Medium (de aquí en adelante denominado
"Medio WP") se solidifica con goma gelan, y se mantiene a
10-35ºC durante 14-60 días con el
propósito de que una parte de la pieza de tejido se vuelva un callo.
El subcultivo del callo así obtenido acelera gradualmente su
velocidad de crecimiento hasta producir un callo estabilizado. El
término "callo estabilizado" se refiere a un callo que queda
en un estado de callo durante el cultivo, sin mostrar una
diferenciación en retoños o raíces, y cuyas células tengan una
velocidad de crecimiento uniforme.
Un callo así estabilizado es transferido a un
medio líquido apropiado para el crecimiento (por ejemplo., el medio
WP líquido). Luego, la velocidad de crecimiento es acelerada
adicionalmente (el precultivo en esta etapa se denomina
particularmente "cultivo en crecimiento").
Según la invención, son llevados a cabo los pasos
siguientes para incrementar los grupos de células apropiados para
la producción de diterpenos del tipo taxano a partir de estas
células estabilizadas.
En el primer paso, los grupos grandes de células
son retirados tamizando las células cultivadas. Esta operación de
retiro puede llevada a cabo por medio de un filtro en lugar de un
tamiz, o con una combinación de tamiz y filtro. Las aberturas del
tamiz no están particularmente limitadas, ya que el tamiz puede
retirar grupos grandes de células. Teniendo en cuenta la eficiencia
en la mejora de la productividad del producto de interés, las
aberturas se encuentran preferentemente en 1410 \mum o menores,
más preferentemente 840 \mum o menores.
Debido a que los grupos de células cultivadas de
una planta Taxus no son esféricos, aquellos grupos de células que
tengan un eje menor más corto que las aberturas mencionadas, pueden
pasar por cada uno de los tamices antes mencionados. El diámetro
promedio del grupo de células capaz de pasar cada tamiz, que es
representado por un valor intermedio del eje mayor y el eje menor
del grupo de células es 1,6 mm o menor cuando la abertura es 1410
\mum y 1,0 mm o menor cuando la abertura es 840 \mum. Estos
grupos de células que pueden pasar de un tamiz con 100 \mum de
abertura y que tiene un diámetro promedio 0,12 mm o menor se pueden
retirar de la población de células o dejar allí, porque tanto su
habilidad de crecer como su habilidad de producir diterpenos del
tipo taxano están marcadamente reducidas.
El momento de tamizar las células cultivadas
podría ser tanto durante el precultivo, o en el momento de la
transferencia de células de un precultivo al precultivo siguiente.
En vista de la eficiencia operacional y la economía, es preferible
el momento de la transferencia de células. Es preferente que una
operación de retirar los grupos de células grandes sea llevada a
cabo por lo menos una vez durante el cultivo al 2 a 10º cultivo
antes del cultivo principal para la producción de diterpenos del
tipo taxano, y/o antes del momento de la transferencia de células,
llevada a cabo al principio de cada uno de los 2º a 10º cultivos.
Aunque es posible realizar una operación de tamizado en el momento
de la transferencia de células del precultivo al cultivo principal,
el tamizado en este momento sería desventajoso en vista del coste
del cultivo y coste de la eliminación del material desechado,
porque la cantidad de células es grande en el precultivo
inmediatamente antes del cultivo principal; la posibilidad de
contaminación por microorganismos durante la operación de tamizado
es alta; y la cantidad de grupos de células grandes que deben ser
descartadas también es grande.
El documento WO 95/14103 (solicitud de patente
europea EP 683232) revela un método en el que las células son
fraccionadas por su tamaño de partículas en el momento de la
transferencia de células del precultivo al cultivo principal. Sin
embargo, el fraccionamiento se realiza con el propósito de
incrementar la exactitud de los experimentos, y el método de esta
referencia es totalmente diferente del método usado en la presente
invención en su idea y operación. Es decir, ya que el efecto de la
presente invención es incrementar por tamizado la proporción de los
grupos de células apropiadas para la producción de diterpenos del
tipo taxano, el tamizado generalmente dura desde 2 a aproximadamente
10 generaciones, sin realizar una operación similar en el momento
de la transferencia de células posterior a la operación de
tamizado, por lo tanto, no resultará necesario realizar esta
operación de nuevo en el momento de la transferencia de células del
precultivo al cultivo principal.
Cuando el tamizado de las células cultivadas se
realiza durante el cultivo, las células se pueden sacar fuera de la
vasija de cultivo para tamizarlas.
Alternativamente, se pueden incluir un tamiz o un
filtro en los aparatos de cultivo con el propósito de que los
grupos grandes de células se pueden retirar automáticamente. Es
también posible realizar la anterior operación de tamizado con
regularidad cuando las células sean transferidas a un medio fresco
para así obtener una agrupación de pequeños grupos estables de
células.
El término "Precultivo" usado en la presente
solicitud se refiere al cultivo que se realiza principalmente con
el propósito de hacer crecer células semillas que deben ser
proporcionadas al cultivo principal, y el cual debe incrementar por
etapas la escala del cultivo según el aumento en la cantidad de
células. Para la producción de diterpenos del tipo taxano,
generalmente, el precultivo se realiza 2-10
veces.
El término "Cultivo principal" usado en la
presente solicitud se refiere al cultivo que finalmente se realiza
con el propósito de producir el producto de interés - diterpenos
del tipo taxano.
En el segundo paso, las células son cultivadas en
condiciones para provocar una agitación fuerte (referidas en lo
adelante como "condiciones de agitación fuertes"), las que no
dañarían a las células individuales, para así desmenuzar los grupos
grandes de células para producir pequeños grupos de células. El
término "condiciones de agitación fuertes" usado en la presente
solicitud se refiere a aquellas condiciones, en las que los grupos
de células sean desmenuzados con el propósito de que la proporción
de grupos de células pequeños, que tengan un diámetro promedio, que
generalmente se encuentra en el intervalo de 0,12 mm a 1,6 mm,
preferentemente de 0,12 mm a 1,0 mm, alcance generalmente los 65% o
más, preferiblemente 80% o más en relación al peso bruto fresco de
las células.
Tales condiciones de agitación se pueden
conseguir incrementando la velocidad de rotación de los impelentes o
modificando su forma, o instalando bafles en la vasija de cultivo.
El cultivo en condiciones de agitación tales puede ser llevado a
cabo en cualquier cultivo principal o precultivo para la producción
de diterpenos del tipo taxano. Durante el período de cultivo, la
intensidad de la agitación puede ser incrementada en un periodo
específico o en todo el periodo de cultivo.
Para conseguir las condiciones de agitación
señaladas más arriba incrementando la velocidad de rotación de los
impelentes, se pueden usar impelentes del tipo de remo cuyo
diámetro sea 1/2 del diámetro interior de la vasija de cultivo y la
altura sea 1/4 de la profundidad del líquido de cultivo, por
ejemplo, a una velocidad de 30-180 r.p.m,
preferentemente 40-120 rpm, cuando las células
tienen una intensidad normal de adherencia intercelular.
Para conseguir las condiciones de agitación
señaladas más arriba modificando la forma de los impelentes, por
ejemplo, se usan los impelentes huecos del tipo remo, del tipo
tornillo o del tipo turbina.
A fin de lograr las anteriores condiciones de
agitación instalado bafles en la vasija de cultivo, se aumenta la
distancia de estiramiento a partir de la superficie de la pared
interior de la vasija de cultivo hasta el final del bafle y/o se
debe incrementar el número de bafles instalados.
Los grupos de células así obtenidos se
suministran al cultivo principal, el cual se lleva a cabo con el
propósito de la producción de diterpenos del tipo taxano.
En la presente invención, el término "habilidad
latente de producción" representa la habilidad de las células
para producir cantidades mayores de diterpenos del tipo taxano
cuando son transferidas a un nuevo medio. En otras palabras, este
término representa la capacidad como células de semillas
(inoculum).
El diterpeno del tipo taxano no está
particularmente limitado mientras tenga un esqueleto de taxano. Los
ejemplos concretos incluyen taxol, 10-deacetiltaxol,
7-epitaxol, bacatin III,
10-deacetil-bacatin III,
7-epibacatin III, cefalomanina,
10-deacetil-cefalomanina,
7-epicefalomanina, bacatin VI, taxano, xilosil
cefalomanina, xilosil taxol, taxol C,
10-deacetiltaxol C, taxisinas I, de taxisina II,
taxina, taxina II y taxagifina.
Los ejemplos de medios que deben ser usados para
el cultivo de células en la presente invención incluyen aquellos
medios conocidos que convencionalmente han sido usados para el
cultivo de células de plantas, como el medio Murashige &
Skoog (1962), medio Linsmaier Skoog (1965) medio Woody
Plant (1981), medio B-5 Gamborg, medio
M-9 Fujita et al.
A estos medios se pueden añadir fitohormonas y,
si es necesario, fuentes de carbono, componentes inorgánicos,
vitaminas, aminoácidos y análogos.
Como fuentes de carbono, se pueden usar
disacáridos como sacarosa, maltosa y lactosa; monosacáridos como
glucosa, fructosa y galactosa; almidón, o una mezcla de dos o más
de estas fuentes de azúcar en una proporción apropiada.
Los ejemplos específicos de componentes
inorgánicos incluyen fósforo, nitrógeno, potasio, calcio, magnesio,
azufre, hierro, manganeso, zinc, boro, cobre, molibdeno, cloro,
sodio, yodo y cobalto. Estos componentes se pueden añadir en forma
de compuestos tales como nitrato de potasio, nitrato de sodio,
nitrato de calcio, cloruro de potasio, fosfato monácido de potasio,
fosfato diácido de potasio, cloruro de calcio, sulfato de magnesio,
sulfato de sodio, sulfato ferroso, sulfato férrico, sulfato de
manganeso, sulfato de zinc, ácido bórico, sulfato de cobre,
molibdato de sodio, trióxido de molibdeno, yoduro de potasio,
cloruro de cobalto y sus análogos.
Como fitohormonas, se pueden usar, por ejemplo,
auxina como ácido indol-acético (IAA, por las siglas
de su expresión inglesa, Indoleacetic Acid), ácido
naftaleno-acético (NAA, por las siglas de su
expresión inglesa, Naphthaleneacetic Acid) y ácido
2,4-diclorofenoxi-acético
(2,4-D, por el acrónimo de la expresión inglesa,
Dichlorophenoxy Acetic Acid); y citoquininas como quinetina,
zeatina y dihidrozeatina.
Se pueden usar como vitaminas, biotina, tiamina
(vitamina B1), piridoxina (vitamina B6), ácido pantoténico,
inositol, ácidos nicotínicos y análogos.
Se pueden añadir como aminoácidos, glicina,
fenilalanina, leucina, glutamina, cisteína y sus análogos.
En general, los componentes inorgánicos son
usados en una concentración de aproximadamente 0,1
M-100 mM; las fuentes de carbono en una
concentración de aproximadamente 1-30 g/litro; las
fitohormonas en una concentración de aproximadamente
0,01-10 M; y las vitaminas y aminoácidos en
concentraciones de aproximadamente 0,1-100
mg/litro, respectivamente.
En el cultivo de células de la presente
invención, se pueden usar una pieza de tejido o células de una
raíz, punto en crecimiento, hoja, tallo, semillas, polen, anter,
cáliz, etc., de la planta anteriormente mencionada, o células
cultivadas obtenidas del cultivo de una pieza o células de tejidos
en el medio antes mencionado o un medio convencional.
Los diterpenos del tipo taxano pueden ser
separados a partir de los tejidos cultivados, de células cultivadas
y/o medio, así obtenidos por extracción con un disolvente orgánico
como el metanol. Alternativamente, también es posible recuperar
continuamente diterpenos del tipo taxano permitiendo que coexistan
en el medio un adsorbente y disolvente orgánico apropiados.
En la presente invención, la productividad a
diterpenos del tipo taxano puede ser mejorada adicionalmente
añadiendo al medio, como agente promotor de producción un ácido
jasmónico o un derivado de ácido jasmónico como jasmonato de
metilo, como se revela en la solicitud de patente europea EP 683232;
un derivado amino o imino de ácidos jasmónicos como se revela en EP
727492; coronatina o un derivado de coronatina como el ácido
coronafácico como se revela en el documento EP 727492; un compuesto
que contiene un metal pesado y/o ión de metal pesado como se revela
en EP 683232; aminas como se revela en el documento EP 683232; o un
polisacárido cíclico como la ciclodextrina como se revela en la
solicitud de patente europea EP 727492.
Como temperatura de cultivo para emplear en el
cultivo de células de la presente invención, generalmente se usa
aproximadamente 10-35ºC. Particularmente es
preferible 23-28ºC debido a la gran velocidad de
crecimiento conseguida a estas temperaturas. Como período de
cultivo, son preferibles de 7-42 días.
Cuando un medio líquido es usado en el método de
cultivo de la presente invención, las células cultivadas son
separadas del medio por decantación o filtración después de la
terminación del cultivo. Luego, el(os) diterpeno(s)
del tipo taxano de interés puede(n) ser separado(s)
de las células y/o el medio, por ejemplo, por extracción con un
disolvente orgánico.
Como método de aumentar adicionalmente el efecto
de la presente invención, se puede dar el uso del método de la
presente invención conjuntamente con el método revelado en el
documento EP 683232. En este último método, las células son
fraccionadas en una pluralidad de capas según sus pesos específicos,
y son cultivadas al menos las células contenidas en una de las
capas.
Es también posible mejorar adicionalmente la
productividad, empleando en la presente invención las condiciones
de cultivo principal reveladas actualmente en la EP 683232, i.e.,
el cultivo se realiza controlando la concentración de oxígeno
existente desde el ambiente inicial en fase gaseosa en una vasija de
cultivo a una menor que la correspondiente concentración de oxígeno
en la atmósfera, o controlando la concentración de oxígeno,
disuelto en un medio fluido que está en contacto con los tejidos
y/o las células, a una menor que la concentración saturada de
oxígeno disuelto a esa temperatura, a la que las células fueron
cultivadas en el escenario inicial de el cultivo.
Según la presente invención, se hace posible
obtener fácilmente grandes cantidades de diterpenos del tipo taxano
por cultivo de células de una planta productora de diterpenos del
tipo taxano.
A continuación, la presente invención será
descrita más específicamente con referencia a los siguientes
ejemplos y ejemplos comparativos. Sin embargo, el alcance de la
presente invención no está limitado a estos ejemplos.
Se separó asépticamente un embrión de una semilla
de Taxus media esterilizada con una solución al 2% de
antiformina o una solución al 70% de etanol. Una parte del embrión
fue puesta sobre medio WP sólido (que contenía 0,25% en peso de
goma gelan) complementado con ácido
naftaleno-acético a una concentración de 10^{-5}
M esterilizada en autoclave. Fue llevado a cabo el cultivo estático
en un lugar oscuro a 25ºC a fin de obtener un callo.
Posteriormente, 4 g (peso fresco) de este callo fue trasladado a un
matraz de 300 ml que contenía 100 ml del medio líquido WP,
complementado con ácido
\alpha-naftaleno-acético a la
misma concentración descrita anteriormente y esterilizado en
autoclave (en lo adelante denominado el "nivel estándar"), y
fue llevado a cabo el cultivo en batido giratorio en un removedor
rotatorio (amplificación: 25 mm; a 100 r.p.m). El callo fue
subcultivado cada 14 días, 5 veces en total para acelerar la
velocidad de crecimiento. Las células así obtenidas se denominan
"células estándar".
Las células estándar fueron transferidas a un
matraz en las mismas condiciones como se describieron
anteriormente, y se cultivaron en un removedor rotatorio del mismo
tipo durante 14 días a una velocidad agitación de 170 r.p.m.
\newpage
Las células resultantes fueron fraccionadas
sucesivamente según su tamaño en grupos de células usando tamices
inoxidables de 1410 \mum, 840 \mum y 500 \mum de aberturas.
Luego, fueron determinadas las proporciones de peso fresco de las
fracciones individuales.
Por otro lado, con el propósito de comparación,
las células estándar fueron sometidas al mismo procedimiento de
tamizado sin realizar el cultivo con removido a 170 r.p.m para su
fraccionado por el tamaño de los grupos de células. Luego, fueron
determinadas las proporciones de peso fresco de las fracciones
individuales. Los resultados de ambos procedimientos de tamizado son
mostrados en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
Se transfirieron dos gramos (peso fresco) de cada
una de las 4 fracciones obtenidas en el Ejemplo 1 a un matraz
Erlenmeyer de 100 ml, que contenía 20 ml del medio usual
conteniendo 100 \muM de jasmonato de metilo, el cual es un agente
promotor para la producción de diterpenos del tipo taxano. Luego fue
llevado a cabo el cultivo por agitación en un recipiente rotatorio
del mismo tipo, como se describió más arriba programado para 100
r.p.m en un lugar oscuro a 25ºC durante 14 días (cultivo
principal).
Después de la terminación del cultivo, las
células fueron recogidas por filtración y liofilizadas. Fue medido
el peso seco de las células para determinar el peso de las células
cultivadas por litro del medio líquido. Los diterpenos del tipo
taxano fueron extraídos del callo deshidratado con metanol o
análogo, y fueron determinados cuantitativamente por comparación con
productos usuales usando cromatografía líquida de gran rendimiento;
para determinar así el rendimiento a taxol. También los diterpenos
del tipo taxano fueron extraídos del filtrado de cultivo con
diclorometano, seguido por la misma determinación cuantitativa como
se describe más arriba. Los resultados se muestran en la
Tabla 2.
Tabla 2.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla 2 muestra que mientras más pequeño sea
el tamaño de la malla de un tamiz de acero inoxidable, mayor será
el rendimiento a taxol en las células fraccionadas por el
tamiz.
Cuatro gramos (peso fresco) de las células
estándar descritas en el Ejemplo 1 fueron transferidos a un matraz
Erlenmeyer de 300 ml que contenía 100 ml del medio usual, y la
agitación del cultivo fue llevada a cabo en un recipiente rotatorio
del mismo tipo como se describió más arriba programado para 170
r.p.m en un lugar oscuro a 25ºC durante 14 días.
Las células resultantes fueron separadas del
medio líquido por filtración. Luego, 2 g (peso fresco) de las
células fueron transferidos al matraz Erlenmeyer de 100 ml, que
contenía 20 ml del medio usual conteniendo 100 \muM del
jasmonato de metilo. La agitación del cultivo fue llevada a cabo en
un recipiente rotatorio del mismo tipo como se describió más arriba
programado para 100 r.p.m en un lugar oscuro a 25ºC durante 14
días. Las células resultantes y el medio fueron tratados de la
misma manera como se describió en el Ejemplo 2, seguido por la
determinación del rendimiento a células secas y el rendimiento a
taxol.
Por otro lado, las mismas operaciones fueron
llevadas a cabo, excepto que la velocidad de agitación del
recipiente rotatorio en precultivo fue puesta a 100 r.p.m y 80
r.p.m, seguido por la determinación del rendimiento a células secas
y el rendimiento a taxol.
Adicionalmente, las mismas operaciones fueron
llevadas a cabo excepto que el matraz usado en el precultivo estaba
provisto con pliegues que sirven de bafles a fin de incrementar la
intensidad de la agitación (véase la Fig. 1). Luego, fueron
determinados el rendimiento a células secas y el rendimiento a
taxol. Los resultados son resumidos en la
Tabla 3.
Tabla 3.
La Tabla 3 muestra que el rendimiento a taxol
aumenta a medida que aumenta la velocidad de agitación en el
precultivo.
Un litro del medio usual que contiene 100 \muM
de jasmonato de metilo y 100 g (peso fresco) de células estándar
fue transferido a un frasco fermentador provisto con impelentes
modificado del tipo de remo puesto a una velocidad de agitación de
40 r.p.m, 60 r.p.m o 80 r.p.m. Las células fueran cultivadas
mientras se alimentaba aire conteniendo 1% de CO_{2}, a una
velocidad de 0,1 pm en la oscuridad a 25ºC durante 14 días. Una
parte de las células resultantes y el medio fueron tratados de la
misma manera como se describe en el Ejemplo 2 para determinar el
rendimiento a células secas y el rendimiento a taxol. Las células
remanentes fueron tamizadas con un tamiz de aberturas de 840 \mum,
y fue determinada la proporción de células del tamaño de partículas
pequeñas que pasaban por este tamiz. Los resultados son mostrados
en el Tabla 4.
\hskip0,5cm * Células que pasan a través de un
tamiz de 840 \mu de aberturas.
La Tabla 4 muestra que el rendimiento a taxol se
incrementa a medida que aumenta la velocidad de agitación en el
cultivo principal. Además, en aquellas células cultivadas con una
agitación más alta, aumenta la proporción de grupos pequeños de
células en el peso bruto fresco de células.
De las células estándar descritas en el Ejemplo
1, fueron retirados grupos de células que pasaban a través de un
tamiz de acero inoxidable de 1410 \mum o 840 \mum. de
aberturas. Luego, las células remanentes fueron separadas del medio
líquido por filtración. Cuatro gramos (peso fresco) de las células
resultantes fueron transferidos a un matraz Erlenmeyer de 300 ml,
conteniendo 100 ml del medio estándar, y cultivados por agitación
en un recipiente rotatorio del mismo tipo como se describió más
arriba programado para 100 rpm en un lugar oscuro a 25ºC durante 14
días. Las células enteras obtenidas fueron separadas del medio
líquido por filtración. Dos gramos de las células resultantes fueron
transferidos a un matraz Erlenmeyer de 100 ml que contenía 20 ml
del medio usual, conteniendo 100 \muM de jasmonato de metilo, y
fueron cultivados y removidos en un recipiente rotatorio del mismo
tipo como se describió más arriba programado para 100 rpm en un
lugar oscuro a 25ºC durante 14 días. Las células resultantes y el
medio fueron tratados de la misma manera como se describió en el
Ejemplo 2 para determinar el rendimiento a células secas y el
rendimiento a taxol. Los resultados son mostrados en el Tabla 5.
Por otro lado, las células estándar fueron
tratadas de la misma manera como se describió más arriba excepto
que no fue llevado a cabo el retiro con un tamiz de los grupos
grandes de células. Luego, fueron determinados el rendimiento a
células secas y el rendimiento a taxol. Los resultados también son
mostrados en la Tabla 5.
La Tabla 5 muestra en el precultivo que las
células fraccionadas en el momento de la transferencia de células
con un tamiz de aberturas más pequeñas producen más taxol.
Las células estándar obtenidas en el Ejemplo 1
fueron tamizadas de la misma manera como en el Ejemplo 1, excepto
que fueron usados tamices de 500 \mum, 250 y 100 \mum de
aberturas. Para cada una de las fracciones resultantes, fue
determinada la proporción de peso de células frescas. Los resultados
son mostrados en la Tabla 6.
Aquellas células que pasaron a través del tamiz
de 100 \mum fueron examinadas con un microscopio. Como resultado,
fue descubierto que, sin tomar en consideración la velocidad de
agitación, todas éstas fueron poblaciones de células envejecidas
transformadas en marrón o sus detritos, aunque fue observado un
número muy pequeño de grupos que constaban de 1-10
células. Estas células fueron recultivadas de la misma manera como
en el Ejemplo 2, pero no fue observado ningún nuevo crecimiento de
células o producción de diterpenos del tipo taxano en absoluto.
Así, aunque fue confirmado que la fracción
fraccionado con el tamiz de 500 \mum tenía una productividad
mejorada a taxol en el Ejemplo 2, aquellas células contenidas allí
y que pasaron el tamiz de 100 \mum se reconocía que eran
inadecuadas para la producción de diterpenos del tipo taxano de la
presente invención.
Claims (7)
1. Un método para producir diterpenos del tipo
taxano por cultivo de células de una planta productora de
diterpenos del tipo taxano, método que comprende:
(1) Realizar ambos de los siguientes pasos, (a) y
(b), de forma que el contenido de grupos de células que tengan un
diámetro promedio en el intervalo 0,12 mm a 1,6 mm se vuelva un 65%
o más del peso bruto fresco de las células:
- (a)
- realizar al menos una operación para retirar con un tamiz y/o filtro los grupos de células, excepto los grupos de células que tengan un diámetro promedio que se encuentre en el intervalo de 0,12 mm a 1,6 mm.
- (i)
- durante el cultivo en el 2º hasta el 10º cultivo, antes del cultivo principal para la producción de diterpenos del tipo taxano, y/o
- (ii)
- en el momento de la transferencia de células llevada a cabo al principio de cada uno de dichos 2º a 10º cultivos antes del cultivo principal;
- (b)
- cultivo de las células de la planta después del paso (a) a una velocidad de agitación de 30 a 180 r.p.m,
en el que realizar los pasos (a) y
(b) da como resultado un cultivo de células, en el cual 65% o más
del peso bruto fresco de células en dicho cultivo resultante de
células son grupos de células que tienen un diámetro promedio que
se encuentra en el intervalo 0,12 mm a 1,6 mm, y en el que dicho
cultivo resultante de células se proporciona al cultivo principal;
y
(2) recuperar el diterpeno o diterpenos del tipo
taxano del cultivo principal resultante.
2. Un método según la reivindicación 1, en el que
los grupos de células del tamaño apropiado para la producción de
diterpenos tienen un diámetro promedio de 0,12 mm a 1,0 mm.
3. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 2, en el que el contenido de grupos de células
del tamaño apropiado para la producción de diterpenos se aumenta a
80% en peso o más en relación al peso bruto fresco de las
células.
4. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que el diterpeno del tipo
taxano es por lo menos uno de taxol,
10-deacetiltaxol, 7-epitaxol,
bacatin III, 10-deacetilbacatin III,
7-epibacatin III, cefalomanina,
10-deacetil-cefalomanina,
7-epicefalomanina, bacatin VI; taxano la,
xilosil-cefalomanina, xilosil-taxol,
taxol C; 10-deacetiltaxol C, taxicina I, taxicina
II, taxina I, taxina II y taxagifina.
5. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes en el que la planta que produce
diterpenos del tipo taxano es una planta que pertenece al género
Taxus.
6. Un método según la reivindicación 5, en el que
la planta que pertenece al género Taxus es Taxus
media o Taxus baccata.
7. Un método según una cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, en el que un derivado del ácido
jasmónico o un derivado de la coronatina son usados en el cultivo
principal como un agente promotor para la producción de diterpenos
del tipo taxano, en el que el derivado del ácido jasmónico es al
menos uno de los ácidos jasmónico, ésteres de alquilos de ácidos
jasmónicos y derivados imino o amino de ácidos jasmónicos, y en el
que el derivado de la coronatina es coronatina y/o ácido
coronafácico.
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