CN1094933C - 生产紫杉烷型二萜的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通过培养能生产紫杉烷型二萜的植物的细胞以生产紫杉烷型二萜的方法，所述方法包括下列步骤(a)和(b)中的一个或两个以增加其大小适于生产二萜的那些细胞群体的比率：(a)在预培养用以提供给主培养以生产紫杉烷型二萜的细胞的过程中，或在细胞从一次预培养转移到下一次预培养时，用筛和/或滤器进行至少一次操作以除去大细胞群体；(b)在剧烈搅拌条件下培养细胞。本发明还公开了通过培养能生产紫杉烷型二萜的植物的细胞以生产紫杉烷型二萜的方法，所述方法包括在加富氧供给的条件下，在液体培养基中预培养细胞，将所得细胞提供给主培养以生产紫杉烷型二萜和从所得培养物中回收紫杉烷型二萜。根据本发明，可在培养能生产紫杉烷型二萜的植物的细胞时改善紫杉烷型二萜的生产力。

Description

生产紫杉烷型二萜的方法

本发明涉及生产包括紫杉醇的紫杉烷型二萜的方法，所述紫杉醇可用作卵巢癌，乳腺癌，肺癌等的治疗剂。

可用作卵巢癌，乳腺癌，肺癌等的治疗剂的紫杉醇是紫杉烷型二萜，它分离和鉴定自属于红豆杉科家族的红豆杉属的植物短叶红豆杉(Taxusbrevifolia NUTT)。此化合物具有与其活性相关的复合酯基团。在短叶红豆杉植物体的任何部分都可发现紫杉醇，据报道树皮中的紫杉醇含量最高。最近，从野生或栽培的树中收集到紫杉醇，然而，红豆杉植物是生长缓慢的植物，其地上部分花10年以上才能长高20cm，另外，剥去树皮会导致树的死亡，因此难以得到大量的紫杉醇。如果能利用细胞培养合成紫杉醇和紫杉烷型二萜，如浆果赤霉素III(紫杉醇的前体)，对于无需采树而轻易得到大量这些化合物非常有利。

有关紫杉醇生产的现有技术，授予Holton等人的美国专利5,015,744中公开了由紫杉醇生物合成的前体，即浆果赤霉素III或10-脱乙酰浆果赤霉素III生产紫杉醇的半合成法。在欧洲和美国，由这种半合成法得到的紫杉醇已经被批准并用于临床。通过使用植物细胞培养法，可以生产半合成所用的粗物质，如浆果赤霉素III，通过上述半合成法可将该物质用于紫杉醇的生产。

有关使用经培养的植物细胞生产紫杉醇的方法，在美国已有一个方法被授予专利权(美国专利5,019,504)，其中紫杉醇由经培养的短叶红豆杉(Taxusbrevifolia NUTT)细胞生产。然而，根据此方法，紫杉醇的产量是1-3mg/l，对于工业化生产而言这是不够的。此外，通过细胞培养的紫杉醇生产力也不稳定。尽管通过选择可得到高生产力的原代细胞，但通过传代培养难以维持细胞的紫杉醇含量(E.R.M.Wickremesine等人，细胞和组织培养国际会议(1992))。

在这种情况下，已尝试了多种方法以改善紫杉醇的生产力，例如，可列举使用了具有高紫杉醇含量的经培养的红豆杉(Taxus chinensis)细胞的方法(美国专利5,407,816)；使用了连续传代培养法的方法(日本待审查的专利特许公开7-255495)；和在培养基中加入了信息传递物质甲基茉莉酸酯的方法(日本待审查的专利特许公开8-33490，EP 683232)，然而，上述方法中没有一个已被实际应用，还需要对生产力作进一步地改善。

甚至当在液体培养基中搅拌培养时，经培养的植物细胞不是形成单个细胞，而是产生了大小为几十微米至几毫米的细胞群体，这是因为一般情况下，靠细胞壁粘附的各个细胞是牢固和紧密的。在本发明所用的乔木植物，如红豆杉植物中，由于次生细胞壁，如木质素生长的结果，细胞间的粘附特别有力。

涉及经培养的植物细胞中次生代谢物的产生的最新研究表明：随着上述这些细胞群体大小的变化，次生代谢物会有所变化(Y.Yamada和Y.Fujita，植物细胞培养手册，第1卷，D.A.Evans等人编辑，Macmillan出版公司，纽约，pp.717-728(1983)；Y.Hara等人，Planta Med.，55，pp.151-154(1989))。然而，没有报道显示这些细胞群体的颗粒大小与紫杉烷型二萜的生产力之间的关系。

另一方面，美国专利5,344,775公开了得到由1-10个细胞组成的红豆杉植物小细胞群体的方法，该方法步骤如下：

(i)提供得自红豆杉外植体的愈伤组织片段，该片段含有被支持物培养基物理支持的分生组织，所述培养基含有如植物生长素的α-萘乙酸和如细胞激动素的6-苄基氨基嘌呤；

(ii)在含有植物生长素和细胞激动素的液体培养基中培养愈伤组织以产生具有受限的细胞间粘附的大量1-10个细胞的细胞群体的悬浮液；

(iii)在含有植物生长素和细胞激动素的支持物培养基表面平铺从细胞悬浮液中得到的细胞。

(iv)在支持物培养基上培养得自步骤(iii)的被平铺的细胞以形成假愈伤组织细胞，假愈伤组织细胞是缺少分化的维管或器官组织的细胞和缺少被清楚地确定的分生带的细胞的疏松的，无定形的聚集，细胞聚集具有差的细胞间粘附，极端的脆性，当受到机械干扰时会分散成大量单个细胞和小细胞群体，假愈伤组织细胞表明在细胞生长培养基中质量加倍的最初速度比步骤(i)中愈伤组织的质量加倍速度要快，并显示出生产紫杉烷的水平比步骤(i)中的愈伤组织所生产的要高的特性。

然而，得到由1-10个细胞组成的小的细胞聚集体，从而能生长或产生次生代谢物是十分困难的(红豆杉植物经培养的细胞的直径通常为20-30μm，因此由10个细胞组成的细胞聚集体的直径估计为100μm以下)。除非如上述美国专利中所述将培养基和培养条件精心联合，否则不可能得到上述这种聚集。

在包括本发明人所用的那些细胞的大量红豆杉植物的经培养细胞中，仅仅加强液体培养中所用的搅拌条件不能得到由1-10个健康细胞组成的小群体。通过使用孔径为100μm的筛分级分离能得到的只是不具有生长或产生次生代谢物之能力的老化细胞克隆的碎片。

因此，上述美国专利中公开的分离小细胞群体的要点在于制备这种能容易地释放小细胞群体的愈伤组织。在基本思路和方法上，该专利与限定了振荡和搅拌条件以释放小细胞群体的本发明有所不同。换句话说，根据上述美国专利的说明书，专利中用于释放由1-10个健康细胞组成的小细胞群体的振荡和搅拌条件属于常规方法之列。与本发明的条件不同的是，美国专利中所用的条件不超出常规细胞培养所用条件的范围。

另外，考虑到实际的，工业化的培养方法，我们希望在任何上述方法中，通过利用所谓的两步培养法来增加最终得到的紫杉烷型二萜的生产力，在两步培养法中，预培养和主培养在不同的条件下进行。进行预培养是为了培养细胞，进行主培养是为了生产感兴趣的紫杉烷型二萜，如紫杉醇。通过常规的细胞培养方法生产紫杉烷型二萜时，从上述3个涉及改善紫杉醇生产力的专利中可以看出它们强调了主培养条件的改善。例如，加入诱导剂(elicitor)或信息传递物质；或改善培养方法。至于预培养，还不知道改善感兴趣的化合物的最终生产力所优选的具体条件。

至于预培养的作用，首先是增加细胞的生长速率以为主培养提供尽可能多的细胞，同时，需要预培养以增加细胞生产紫杉烷型二萜的潜伏能力，使得当细胞被转移时会在主培养中有效地生产二萜。然而，如上所述，从增加细胞潜伏能力的角度看，一点也未认识到预培养条件的重要性。

一般情况下，有关控制或调节悬浮培养中的植物细胞的氧供给等的参数，可列举例如质量传递体积系数(k_La)和溶解氧的浓度(DO)。尽管振荡速率和气体供应的速率易于测定，并在此意义上是有利的，但它们得不到普遍使用，这是因为它们受培养容器的形状和所用培养基量的影响，因此，在培养工程方面它们统统是没有意义的参数。已知在满刻度培养中，感兴趣产物的生产力(积累的量/细胞)受k_La和DO的影响(Y.Fujita & Y.Hara，农业生物化学，49，pp.2071-2075(1985))。然而，至今仍未检查出这些参数对预培养的影响。

本发明的目的是在通过培养植物细胞生产紫杉烷型二萜的方法中改善紫杉烷型二萜的生产力。

作为针对解决上述任务的深而广的研究结果，本发明人发现(i)在培养生产紫杉烷型二萜的植物细胞时，使用小细胞群体可增加紫杉烷型二萜的生产力；和(ii)在加强氧供给的条件下预培养生产紫杉烷型二萜的植物细胞可增强所得细胞生产紫杉烷型二萜的潜伏能力，依次会改善主培养中二萜的生产力，从而达到本发明的目的。

本发明涉及通过培养生产紫杉烷型二萜的植物的细胞以生产紫杉烷型二萜的方法，所述方法包括下列步骤(a)和(b)中的一个或两个以增加其大小适于生产二萜的那些细胞群体的比率：

(a)在预培养用以提供给主培养以生产紫杉烷型二萜的细胞的过程中，或在细胞从一次预培养转移到下一次预培养时，用筛和/或滤器进行至少一次操作以除去大细胞群体；

(b)在剧烈搅拌条件下培养细胞。

其大小适于生产二萜的细胞群体的平均直径范围为0.12mm-1.6mm，优选为0.12mm-1.0mm，平均直径以细胞群体的长轴和短轴之间的中间值表示。

相对于细胞的总湿重而言，优选其大小适于生产二萜的细胞群体的比率增加到65％或更高，尤其是80％或更高。

本发明还涉及通过培养生产紫杉烷型二萜的植物的细胞以生产紫杉烷型二萜的方法，所述方法包括：

在氧供给条件下，在液体培养基中预培养细胞，其中氧对液体培养基的质量传递体积系数(k_La)为10h^-1或更高；

为主培养提供所得的细胞以生产紫杉烷型二萜；和

从所得培养物中回收紫杉烷型二萜。

另外，本发明涉及通过培养生产紫杉烷型二萜的植物的细胞以生产紫杉烷型二萜的方法，所述方法包括：

在将液体培养基的溶解氧浓度(DO)维持在培养所用温度下的饱和氧浓度的30％或更高的条件下，在液体培养基中预培养细胞；

为满刻度培养提供所得的细胞以生产紫杉烷型二萜；和

从所得培养物中回收紫杉烷型二萜。

图1是表示底部具有用作挡板的折叠结构的烧瓶的图。

以下将详细地描述本发明。

用于本发明的生产方法中的能生产紫杉烷型二萜的植物的例子包括红豆杉植物，如欧洲红豆杉(Taxus Baccata LINN)，东北红豆杉(T.cuspidataSIEB.et ZUCC)，Kyaraboku(T.cuspidata SIEB.et ZUCC var.nanaREHDER)，Pacific yew(T.brevifolia NUTT)，加拿大红豆杉(T.canadensisMARSH)，红豆杉(T.chinensis)，西藏红豆杉(T.wallichiana ZUCC)和杂种紫杉(T.media)，其中特别优选欧洲红豆杉和T.media。

首先，将取自红豆杉植物部分，如根，生长点，叶，茎，种子或等等的外植体灭菌，置于用gelan树胶固化的木本植物培养基(下文称之为“WP培养基”)上，在10-35℃下放置14-60天，以使组织块的部分变成愈伤组织。次生培养所得的愈伤组织逐渐加快了生长速率以产生稳定化的愈伤组织。术语“稳定化的愈伤组织”是指在培养过程中能保持愈伤组织状态而不会分化成茎干或根的愈伤组织，而且所述愈伤组织的细胞具有一致的生长速率。

将这种稳定化的愈伤组织转移到适于生长的液体培养基(如液体WP培养基)中，然后生长速率被进一步地加快(此阶段的预培养被特别地称为“生长培养”)。

在本发明的一个实施方案中，进行下列步骤中的一个或两个以增加这些稳定化的细胞中那些适于生产紫杉烷型二萜的细胞群体。

第一步，通过筛分经培养的细胞除去大细胞群体。可以用滤器代替筛或者联合使用筛和滤器进行此除去操作。不特别地限制筛的孔径，只要筛能除去大细胞群体即可。考虑到改善感兴趣产物的生产力的效率，优选孔径为1410μm或更小，更优选840μm或更小。

由于红豆杉植物经培养细胞的群体不呈球形，那些短轴比上述孔径小细胞群体可穿过每个上述筛。当孔径为1410μm时，能穿过每个筛的细胞群体的平均直径(以细胞群体长轴和短轴的中间值表示)为1.6mm或更小，当孔径为840μm时，上述平均直径为1.0mm或更小。那些能穿过孔径为100μm的筛的，平均直径为0.12或更小的细胞群体既可以从细胞群中除去，也可以保留，因为它们生长的能力和它们生产紫杉烷型二萜的能力都显著地降低。

筛分经培养细胞的时间可以在预培养的过程中，也可以在将细胞从一次预培养转移到下一次预培养时。考虑到操作的效率和经济，优选在转移细胞时筛分。优选在生产紫杉烷型二萜的主培养之前的第2代至第10代培养物的培养过程中，和/或在第2代至第10代每次培养开始时进行的细胞转移时，至少进行一次除去大细胞群体的操作。尽管可以在将细胞从预培养转移到主培养时进行筛分操作，但考虑到培养的花费和废物处理的花费，在此时筛分是不利的，因为紧接主培养之前的预培养中细胞量大；在筛分操作过程中微生物污染的可能性也高；需弃去的大细胞群体的量也大。

WO 95/14103(EP 683232)公开了一种方法，其中在细胞从预培养转移到主培养时通过颗粒大小来分级分离细胞。然而，进行分级分离是为了增加实验的准确性，此文献中的方法与本发明中所用方法在思路和操作上完全不同，即由于通过筛分以增加适于生产紫杉烷型二萜的那些细胞群体的比率的发明效果通常可以从约第2代延续到约第10代，而无需在筛分操作后转移细胞时进行类似的操作，因此不需要在将细胞由预培养转移到主培养时再进行此操作。

当在培养过程中进行经培养细胞的筛分时，需从培养容器中将细胞取出一次以筛分。或者可将筛或滤器掺入培养装置中以使大细胞群体能被自动地除去。也可以当细胞被转移到新鲜培养基中时有规律地进行上述筛分操作，从而得到一组稳定的小细胞群体。

本文所用的术语“预培养”是指主要为了培养提供给主培养的种子细胞而进行的培养，预培养的目的是根据细胞量的增加分阶段地增加培养规模。为了生产紫杉烷型二萜，通常需进行2-10次预培养。本文所用的术语“主培养”是指为了最终生产出感兴趣的产物紫杉烷型二萜而进行的培养。

第二步，在实现强搅拌的条件(下文称之为“强搅拌条件”)下培养细胞，所述强搅拌条件不会伤害单个细胞，其目的是破碎大细胞群体，从而产生小细胞群体。本文所用的术语“强搅拌条件”中所指的那些条件能破碎细胞群体，以使平均直径通常范围为0.12mm-1.6mm，优选为0.12mm-1.0mm的小细胞群体的比率相对于细胞的总湿重而言变成通常为65％或更高，优选为80％或更高。

通过增加叶轮的旋转速度或改变叶轮的形状，或者通过在培养容器中安装挡板可达到这种搅拌条件。在用于生产紫杉烷型二萜的主培养中，或者预培养中，可在这种搅拌条件下进行培养。在培养周期中，可在特殊时期或整个培养周期中增加搅拌的强度。

当细胞具有正常的细胞间粘附强度时，为了通过增加叶轮的旋转速度以达到上述搅拌条件，可在30-180rpm的速度，优选为40-120rpm的速度下，使用例如直径为培养容器内径的1/2，高度为培养液体深度的1/4的桨式叶轮。

为了通过改变叶轮的形状以达到上述振荡条件，可使用例如空心桨式，螺旋式或涡轮式叶轮。

为了通过在培养容器中安装挡板以达到上述搅拌条件，可增加从培养容器内壁表面至挡板末端的直线距离，和/或增加所安装的挡板的数目。

将所得的细胞群体提供给为了生产紫杉烷型二萜而进行的主培养。

在本发明的另一个实施方案中，进行预培养以从上述稳定化的细胞中得到具有有所增加的生产紫杉烷型二萜的潜伏能力的种子细胞。将所得种子细胞提供给主培养以生产紫杉烷型二萜。

在本发明中，术语“生产的潜伏能力”是指当细胞被转移到新的培养基中时，生产大量紫杉烷型二萜的能力。换句话说，此术语是指种子细胞的生产能力(接种)。

在提供加富的氧的条件下进行培养以得到具有有所增加的生产紫杉烷型二萜的潜伏能力的种子细胞。

具体地说，通过将氧对液体培养基的质量传递体积系数(下文称之为“k_La”)设置为10h^-1或更高，优选为15-50h^-1可达到加富的氧供给。

甚至在k_La大于50h^-1的条件下也可改善种子细胞的生产能力，然而，实践中不优选通过增加通气速度和/或搅拌速度来增加k_La，因为会出现问题，如通气使细胞上升到培养液的表面，并对细胞造成损害。为了测定k_La值，可使用例如下列的方法。简单地说，在与本发明培养方法中所用条件相同的条件(如温度，搅拌等)下，在液体培养基中加入CuSO₄，所述液体培养基与本发明所用的培养基相同，不同之处在于培养基中不含细胞。然后，在其中通入具有特异性氧浓度的含氧气体以测定饱和的溶解氧浓度(C_s)。随后，加入适量的Na₂SO₃水溶液，或在其中通入非氧气体如氮气以将溶解氧浓度调节至0-1ppm。(在使用非氧气体的情况下，无需在液体培养基中加入CuSO₄)随后再次以特异性的通气速度通入上述含氧气体以增加溶解氧浓度。再通入含氧气体后，分别在时间点t₁和t₂测定溶解氧浓度C₁和C₂。然后通过下式测定某些条件下的k_La(使用其中C₁和C₂的范围都是3-5ppm的那些数据)： $\ln \frac{\mathrm{Cs}-C_1}{\mathrm{Cs}-C_2}=k_{L}a(t_2-t_1)$ 一般情况下，k_La的值取决于通气速度，搅拌速度等等。

控制k_La的方法包括：对瓶培养而言，增加或减少培养液，改变振荡方法(旋转类型或活塞类型)，增加或降低振荡速度等等；对罐培养而言，改变罐的形状，增加或减少通气量，改变搅拌器的位置或气体喷嘴的直径，安装挡板，改变叶轮的形状和旋转速度等等。对罐培养而言，在这些方法中，优选增加或减少通气量和改变叶轮的旋转速度作为控制k_La的方法。

在瓶培养和罐培养中，常规使用的k_La值低于10h^-1。尽管特别地使用了超过10h^-1的值，但它们被用于主培养中。通过将预培养的k_La设置在显得比主培养中的后的上述范围中而达到的效果是未知的。

另外，优选将预培养中的k_La设置得比主培养中的高。

通过将用于培养细胞的液体培养基中的饱和氧浓度(下文称之为“DO”)维持在30-90％，优选50-75％可达到加富的氧供给的第二条件。由于DO受细胞的呼吸速率以及k_La的影响，所以不可能仅仅简单地通过通气速度和搅拌速度来控制DO。然而，通过自动地增加或降低通气速度或者增加或降低通入气体中氧气的浓度，同时用氧电极等监测培养溶液中的DO，即可控制DO。

在本发明中，通过将k_La和/或DO设置在上述范围中，以改善种子细胞的生产能力的预培养如果在主培养前通常进行直至10次传代，即可在主培养中显示出效果。当进行的预培养在时间上与主培养越接近时，这种预培养的效果越强烈。紧接主培养之前进行这种预培养最适合。

紫杉烷型二萜并不受特别地限制，只需具有紫杉烷骨架即可。具体的例子包括紫杉醇，10-脱乙酰紫杉醇，7-表紫杉醇，浆果赤霉素III，10-脱乙酰浆果赤霉素III，7-表浆果赤霉素III，三尖杉宁碱(cephalomannine)，10-脱乙酰三尖杉宁碱，7-表三尖杉宁碱，浆果赤霉素VI，紫杉烷1a，木糖基(xylosyl)三尖杉宁碱，木糖基紫杉醇，紫杉醇C，10-脱乙酰紫杉醇C，taxicine I，taxicine II，紫杉碱I，紫杉碱II和taxagifine。

本发明中用于培养细胞的培养基的例子包括那些常规用于植物细胞培养的已知培养基，如Murashige & Skoog培养基(1962)，Linsmaier Skoog培养基(1965)，木本植物培养基(1981)，Gamborg氏B-5培养基，Fujita等人的M-9培养基。

可在这些培养基中加入植物激素，如果必要，还可加入碳源，无机成分，维生素，氨基酸等等。至于碳源，可使用如蔗糖，麦芽糖和乳糖的二糖；如葡萄糖，果糖和半乳糖的单糖；淀粉；或适当比例的两种或多种这些糖源的混合物。

至于无机成分，具体的例子包括：磷，氮，钾，钙，镁，硫，铁，锰，锌，硼，铜，钼，氯，钠，碘和钴。这些成分可以以下列化合物的形式被加入，如硝酸钾，硝酸钠，硝酸钙，氯化钾，磷酸氢二钾，磷酸二氢钾，氯化钙，硫酸镁，硫酸钠，硫酸亚铁，硫酸铁，硫酸锰，硫酸锌，硼酸，硫酸铜，钼酸钠，三氧化钼，碘化钾，氯化钴等等。

至于植物激素，可使用如吲哚乙酸(IAA)，萘乙酸(NAA)和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)的生长素；和如细胞分裂素，玉米素和二氢玉米素的细胞激动素。

至于维生素，可使用生物素，硫胺素(维生素B1)，吡哆醇(维生素B6)，泛酸，肌醇，烟酸等等。

至于氨基酸，可加入甘氨酸，苯丙氨酸，亮氨酸，谷氨酰胺，半胱氨酸等等。

一般情况下，所用无机成分的浓度约为0.1M-100mM；碳源浓度约为1-30g/l；植物激素浓度约为0.01-10M；维生素和氨基酸的浓度约为0.1-100mg/l。

在本发明的细胞培养中，可使用得自上述植物的根，生长点，叶，茎，种子，花粉，花药，花萼等的组织块或细胞，或通过在上述培养基或常规培养基中培养所述组织块或细胞得到的经培养细胞。

通过用如甲醇的有机溶剂提取可从所得的经培养的组织，经培养的细胞和/或培养基中分离出紫杉烷型二萜。或者，通过使适当的吸附剂和有机溶剂共存于培养基中也可以不断地回收紫杉烷型二萜。

在本发明中，通过在培养基中加入生产促进剂即可进一步地改善紫杉烷型二萜的生产力，所述生产促进剂如EP 683232中公开的茉莉酸或茉莉酸衍生物，如甲基茉莉酸酯；EP 727492中公开的茉莉酸的亚氨基或氨基衍生物；EP 727492中公开的晕斑素(coronatine)或晕斑素衍生物，如coronafacic acid；EP 683232中公开的含有重金属和/或重金属离子的化合物；EP 683232中公开的胺；或EP 727492中公开的环多糖，如环糊精。

至于本发明细胞培养所用的培养温度，通常使用约10-35℃，特别优选23-28℃，因为在这些温度下可达到最大的生长速率。至于培养周期，优选7-42天。

当本发明培养方法中使用液体培养基时，在完成培养后通过倾析或过滤从培养基中分离经培养的细胞，然后，通过例如用有机溶剂提取从细胞和/或培养基中分离感兴趣的紫杉烷型二萜。

至于进一步增加本发明效果的方法，可将本发明的方法与EP 683232中公开的方法一起使用。在后一方法中，细胞根据它们特殊的重力被分级分离成很多层，培养至少一层中所含的细胞。

通过在本发明中使用EP 683232中公开的主培养条件也可进一步地改善生产力，即通过从培养的最初阶段起即将培养容器中气体相的氧气浓度控制在低于空气中的氧气浓度以进行培养，或者通过从培养的最初阶段起即将接触组织和/或细胞的液体培养基中的溶解氧浓度控制在低于培养细胞的温度下的饱和溶解氧浓度以进行培养。

根据本发明，通过培养能生产紫杉烷型二萜之植物的细胞即可容易地得到大量紫杉烷型二萜。

下文中，将参照以下的实施例和比较实施例更具体地描述本发明，然而，本发明的范围并不局限于这些实施例。

实施例1预培养中的振荡速度对用筛分级分离细胞群体的影响(1)预培养

从经2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液灭菌的杂种紫杉种子中无菌分离胚。将胚的一部分置于经高压灭菌器灭菌的固体WP培养基上(按重量计含有0.25％的gelan树胶)，所述培养基中添加有浓度为10-5的α-萘乙酸。在25℃下，于黑暗中进行静止培养以得到愈伤组织。随后，将4g(湿重)此愈伤组织转移到含有100ml经高压灭菌器灭菌的液体WP培养基的300ml烧瓶中，所述培养基中添加有与上述浓度相同的α-萘乙酸(下文中将所述培养基称之为“标准培养基”)。在旋转振荡器上进行回转振荡培养(放大率：25mm；100rpm)。每15天将愈伤组织次生培养总共5次以加快生长速率，如此得到的细胞被称之为“标准细胞”。

在与上相同的条件下，将标准细胞转移到烧瓶中，在相同类型的旋转振荡器上，以170rpm的振荡速度培养14天。(2)筛分

使用孔径为1410μm，840μm和500μm的不锈钢筛，根据细胞群体的大小相继地分级分离所得的细胞，然后，测定各个级分湿重的比率。

另一方面，为了比较，使标准细胞经受相同的筛分过程而不以170rpm进行振荡培养以通过细胞群体的大小分级分离，然后，测定各个级分湿重的比率。两次筛分过程的结果示于表1。

                        表1以170rpm和以100rpm进行培养的细胞中颗粒大小的分布(％)级分         以170rpm的振荡    以100rpm的振荡

         速度培养的细胞    速度培养的细胞＞1410μm        6.1                38.0840-1410μm      15.1               22.7500-840μm       31.0               28.3＜500μm         47.8               11.0

实施例2得自每个颗粒大小级分之细胞的紫杉醇生产力

将2g(湿重)实施例1中所得的4个级分中的每一种转移到含有20ml标准培养基的100 ml锥瓶中，所述标准培养基中含有100μM可用作紫杉烷型二萜生产的促进剂的甲基茉莉酸酯。然后，在25℃下，于黑暗中，在与上述类型相同的旋转振荡器上，以100rpm的振荡速度进行14天振荡培养(主培养)。

完成培养之后，通过过滤和冻干收获细胞，测量细胞的干重以测定每升液体培养基中经培养细胞的重量。用甲醇或类似物从干燥的愈伤组织中提取紫杉烷型二萜，通过使用高效液相层析与标准产品比较，定量地测定紫杉烷型二萜，从而测出紫杉醇的产量。也可以用二氯甲烷从培养物滤液中提取紫杉烷型二萜，随后如上所述进行相同的定量测定，结果示于表2。

                    表2得自各个颗粒大小级分的细胞的紫杉醇生产力级分           干细胞产量(g/l)    紫杉醇产量(mg/l)＞1410μm         18.5                  20840-1410μm       17.4                  24500-840μm        21.7                  49＜500μm          18.0                  82由总产量(即从细胞中收获的紫杉醇+从培养基中收获的紫杉醇)计算出紫杉醇的产量。

表2表明不锈钢筛的筛孔越小，用筛分级分离出的那些细胞中紫杉醇的产量越高。

实施例3预培养中的振荡速度对紫杉醇生产的影响(1)预培养

将4g(湿重)实施例中所述的标准细胞转移到含有100ml标准培养基的300ml锥瓶中，在25℃下，于黑暗处，在与上述类型相同的旋转振荡器上，以170rpm的振荡速度进行14天振荡培养。(2)主培养

通过过滤从液体培养基中分离所得的细胞，然后将2g(湿重)细胞转移到含有20ml标准培养基的100ml锥瓶中，所述标准培养基含有100μM甲基茉莉酸酯。在25℃下，于黑暗处，在与上述类型相同的旋转振荡器上，以100rpm的振荡速度进行14天振荡培养。按与实施例2中相同的方式处理所得的细胞和培养基，接着测定干细胞产量和紫杉醇的产量。

另一方面，进行相同的操作，不同之处在于预培养中旋转振荡器的振荡速度被设置在100rpm和80rpm，接着测定干细胞产量和紫杉醇的产量。

另外，进行相同的操作，不同之处在于预培养中所用的烧瓶具有用作挡板的折叠结构以增加搅拌的强度(见图1)。接着测定干细胞产量和紫杉醇的产量，结果概括于表3。

                         表3

               预培养中的振荡速度(rpm)

               80    100    170    具有折叠的烧瓶干细胞产量(g/l)  20    19     23     20紫杉醇(mg/l)     21    72     116    140

表3表示紫杉醇的产量随着预培养中振荡速度的增加而增加。

实施例4主培养中的振荡速度对紫杉醇生产的影响及其对细胞群体颗粒大小的影响

将1升含有100μM甲基茉莉酸酯和100g(湿重)标准细胞的标准培养基转移到小型发酵罐中，所述发酵罐具有经改动的桨式叶轮，该叶轮的搅拌速度被设置成40rpm，60rpm或80rpm。在25℃下，于黑暗中将细胞培养14天，培养的同时以0.1vvm的速度通入含1％CO₂的空气。按与上述实施例2相同的方式处理所得细胞的一部分和培养基以测定干细胞产量和紫杉醇的产量。用孔径为840μm的筛筛分剩下的细胞，测定穿过此筛的小颗粒大小细胞的比率，结果示于表4。

                   表4

                                    搅拌速度(rpm)

                                   40    60    80小细胞群体^*的重量占细胞总湿重的比率 51    68    81

(％)

干细胞的产量(g/l)                  19    20    19

紫杉醇(mg/l)                       46    61    75^*穿过孔径为840μm的筛的细胞

表4表明当主培养中搅拌速度增加时，紫杉醇的产量也有所增加。另外，在那些以较高的搅拌速度培养的细胞中，小细胞群体占细胞总湿重的比率也增加了。

实施例5用筛分级分离细胞群体对紫杉醇生产的影响

从实施例1中所述的标准细胞中除去能穿过孔径为1410μm或840μm的不锈钢筛的细胞群体，然后通过过滤从液体培养基中分离出剩下的细胞。将4g(湿重)所得细胞转移到含有100ml标准培养基的300ml锥瓶中，在25℃下，于黑暗处，在与上述类型相同的旋转振荡器上，以100rpm的振荡速度进行14天振荡培养。通过过滤从液体培养基中分离出所得的整个细胞。将2g所得的细胞转移到含有20ml标准培养基的100ml锥瓶中，所述标准培养基含有100μM甲基茉莉酸酯。在25℃下，于黑暗处，在与上述类型相同的旋转振荡器上，以100rpm的振荡速度进行14天振荡培养。按与实施例2中相同的方式处理所得的细胞和培养基，接着测定干细胞产量和紫杉醇的产量，结果示于表5。

另一方面，按与上述相同的方式处理标准细胞，不同之处在于无需用筛除去大细胞群体，然后测定干细胞产量和紫杉醇的产量，结果示于表5。

                        表5每个细胞群体组的紫杉醇产量

细胞群体组    干细胞产量(g/l)  紫杉醇(mg/l)

未经分级分离      19               60

＜1410μm         20               97

＜840μm          21               122^*由总产量(即从细胞中收获的紫杉醇+从培养基中收获的紫杉醇)计算出紫杉醇的产量。

表5表明在预培养中转移细胞时，用较小孔径的筛分级分离的细胞能生产更多的紫杉醇。

实施例6用500μm或更小孔径的筛分级分离出的细胞中的颗粒大小分布，和所得级分中的紫杉醇生产力

按与实施例1中相同的方式筛分实施例1中所得的标准细胞，不同之处在于使用了孔径为500μm，250μm和100μm的筛。测定每个所得级分中细胞湿重的比率，结果示于表6。

                      表6以170rpm和以100rpm进行培养的细胞中颗粒大小的分布(％)级分                 以170rpm的振荡    以100rpm的振荡

                 速度培养的细胞    速度培养的细胞＞500μm                 56.1              87.1250-500μm               29.2              10.5100-250μm               13.0              2.1＜100μm                 1.7               0.3

用显微镜检查能穿过100μm筛的那些细胞，结果发现不论振荡速度如何，这些细胞都是变成褐色或其碎片的老化细胞群，尽管也可观察到很少的由1-10个细胞组成的细胞簇。按与实施例2中相同的方式重新培养这些细胞，但一点也未观察到新的细胞生长或紫杉烷型二萜的产生。

因此，尽管实施例2中证实了用500μm筛分级分离的级分具有改善的紫杉醇生产力，但其中所含的能穿过100μm筛的那些细胞被认为是不适于生产本发明的紫杉烷型二萜。

实施例7预培养中k_La的影响(1)预培养

从经2％安替佛民溶液或70％乙醇溶液灭菌的杂种紫杉种子中无菌分离胚。将胚的一部分置于经高压灭菌器灭菌的固体WP培养基上(按重量计含有0.25％的gelan树胶)，所述培养基中添加有浓度为10^-5的α-萘乙酸。在25℃下，于黑暗中进行静止培养以得到愈伤组织。随后，将4g(湿重)此愈伤组织转移到含有100ml经高压灭菌器灭菌的液体WP培养基的300ml烧瓶中，所述培养基中添加有与上述浓度相同的α-萘乙酸，在旋转振荡器上进行回转振荡培养(放大率：25mm；100rpm)。每14天对愈伤组织进行一次次生培养以加快生长速率(如此得到的细胞被称之为“标准细胞”)。除非另有说明，下文中的振荡培养条件与上述相同。

将所得标准细胞转移到含有15ml或20ml液体WP培养基的100ml锥瓶中，以使细胞密度为40mg(湿重)/ml，并培养14天(预培养)。

通过上述方法计算上述每个体积培养基的k_La值，结果，当培养基为15ml时，k_La值为21h^-1，当培养基为20ml时，k_La值为16h^-1。

通过真空过滤从每个烧瓶中回收细胞，将其中的一部分提供给主培养作为种子细胞，将剩下的细胞冻干。测量细胞的干重以测定每升液体培养基中经培养细胞的重量，接着计算细胞的产量。

另一方面，将一部分所得细胞冻干，然后用甲醇或类似物从中提取紫杉烷型二萜，通过使用高效液相层析与标准产品比较，定量地测定二萜，从而测出紫杉醇和浆果赤霉素III的产量。也可以用二氯甲烷从培养基中提取紫杉烷型二萜，随后如上所述进行相同的定量测定，将所得的量与提取自细胞的紫杉烷型二萜的量相加，结果示于表7。(2)主培养

通过下列步骤进行主培养，首先，在Nunc Multidish(Nunc公司)的每个孔中加入4ml含有100μM甲基茉莉酸酯(JA-Me)的液体WP培养基和500mg(湿重)上述种子细胞，按与上述相同的方式振荡培养14天(主培养)。作为对照，在无JA-Me的液体WP培养基中按与上述相同的方式培养细胞。

完成培养之后，用吸管回收培养基，冻干孔中剩下的细胞，测量细胞的干重以测定每升液体培养基中经培养细胞的重量，接着计算细胞的产量。按与上述相同的方式提取紫杉烷型二萜，随后进行定量测定，结果示于表8，主培养中的k_La为5h^-1。比较实施例1

按与实施例7相同的方式进行操作，不同之处在于当预培养中第一次转移标准细胞时，100ml烧瓶中的培养基体积为30ml或40ml，结果示于表7和8。当培养基为30ml时，通过与上述相同的方法测定的k_La值为9h^-1，当培养基为40ml时，测定的k_La值为6h^-1。

                     表7(预培养后)培养基体积            k_La 细胞产量紫杉醇   浆果赤霉素(ml/烧瓶)            (h^-1) (g/l)  (mg/l)   III

                                          (mg/l)15(实施例7)            21    11      9        320(实施例7)            16    11      7        230(比较实施例1)        9     12      11       340(比较实施例1)        6     11      3        1

                        表8(满刻度培养之后)培养基体积(ml/烧  细胞产量  紫杉醇    浆果赤霉素III瓶)                (g/l)    (mg/l)       (mg/l)

                   +    -   +    -    +    -15(实施例7)          25   27  280  93   148  3120(实施例7)          24   26  251  88   138  2730(比较实施例1)      24   26  146  36   43   940(比较实施例1)      26   28  47   25   40   4“+”表示加JA-Me，“-”表示不加JA-Me。

如表7所示，我们清楚地认识到预培养中的k_La对预培养结束时得到的细胞量(细胞产量)或紫杉烷型二萜的生产力(紫杉醇和浆果赤霉素III的产量)没有影响。

另一方面，如表8所示，我们认识到尽管预培养中的k_La对预培养结束时得到的细胞量(细胞产量)没有影响，但对紫杉烷型二萜的生产力(紫杉醇和浆果赤霉素III的产量)有显著的影响，即实施例7中紫杉烷型二萜的生产力(紫杉醇和浆果赤霉素III的产量)显著增加。另外，在含有JA-Me的培养基中生产力得以进一步地提高。

实施例8预培养中k_La的影响(1)预培养

将1.6升液体WP培养基和64g(湿重)标准细胞转移到小型发酵罐中，所述发酵罐具有经改动的桨式叶轮，该叶轮的搅拌速度被设置成70rpm，在25℃下，于黑暗中将细胞培养14天，培养的同时以0.05vvm或0.1vvm的速度通入含1％CO₂的空气。

通过真空过滤从所得的培养物中回收细胞，将全部的量用于随后的主培养中作为种子细胞。(2)主培养

在与上述类型相同的小型发酵罐中加入种子细胞和1.5升含有100μM甲基茉莉酸酯的液体WP培养基。进行主培养的同时以0.05vvm的速度通入与预培养中所用的相同的气体，其它培养条件和培养周期与预培养中相同。

按与实施例7中相同的方式定量地测定所得细胞和培养基中所含的紫杉烷型二萜。通过上述方法测定每个通气条件下的k_La值，这里需注意甚至在相同的通气速度下，预培养中的k_La也比主培养中的高，原因是预培养中每个小型发酵罐中的培养基的量较大，给出较高的液体深度(通气速度：0.05vvm；预培养中的k_La：22h^-1；主培养中的k_La：19h^-1)，结果示于表9。比较实施例2

按与实施例8相同的方式进行操作，不同之处在于预培养中对小型发酵罐的通气速度为0.02vvm，结果示于表9。

                      表9(主培养后)预培养时的通气    k_La    细胞产量紫杉醇  浆果赤霉素III

速度(vvm)      (h^-1)   (g/l)  (mg/l)      (mg/l)0.02(比较实施例      8        21     10           22)0.05(实施例8)        22       29     51           80.1(实施例8)         36       38     184          19

如表9所示，我们认识到预培养中的k_La对主培养结束时紫杉烷型二萜的生产力(紫杉醇和浆果赤霉素III的产量)有显著的影响，即实施例8中紫杉烷型二萜的生产力显著提高。

出乎意料地是，k_La或DO在预培养结束时不会影响所得细胞的量(细胞产量)或紫杉烷型二萜的生产力(紫杉醇和浆果赤霉素III的产量)，而是特异性地影响细胞生产这些二萜的潜伏能力。

Claims (11)

1.通过培养能生产紫杉烷型二萜的植物的细胞以生产紫杉烷型二萜的方法，所述方法包括下列步骤(a)和(b)中的一个或两个以增加其大小适于生产二萜的那些细胞群体的比率：

(a)在预培养用以提供给主培养以生产紫杉烷型二萜的细胞的过程中，或在细胞从一次预培养转移到下一次预培养时，用筛和/或滤器进行至少一次操作以除去大细胞群体；

(b)在剧烈搅拌条件下培养细胞；

其中：

适于生产二萜的细胞群体的平均直径范围为0.12mm-1.6mm，所述平均直径以所述细胞群体的长轴和短轴之间的中间值表示；

相对于细胞的总湿重而言，其大小适于生产二萜的细胞群体的比率增加到65％或更高；

所述预培养是在供给氧的条件下进行的，其中氧对液体培养基的质量传递体积系数(k_La)为10h^-1或更高；

能生产紫杉烷型二萜的植物是属于红豆杉属的植物。

2.权利要求1的方法，其中适于生产二萜的细胞群体的平均直径范围为0.12mm-1.0mm，所述平均直径以所述细胞群体的长轴和短轴之间的中间值表示。

3.权利要求1的方法，其中相对于细胞的总湿重而言，其大小适于生产二萜的细胞群体的比率增加到80％或更高。

4.权利要求1的方法，其中在生产紫杉烷型二萜的主培养之前的第2代至第10代培养物的培养过程中，和/或在所述第2代至第10代每次培养开始时进行的细胞转移时，至少进行一次步骤(a)的操作。

5.权利要求1的方法，其中k_La的范围为15h^-1-50h^-1。

6.权利要求1的方法，其中预培养中的k_La比主培养中的k_La高。

7.权利要求1的方法，其中紫杉烷型二萜选自下列物质中的至少一个：紫杉醇，10-脱乙酰紫杉醇，7-表紫杉醇，浆果赤霉素III，10-脱乙酰浆果赤霉素III，7-表浆果赤霉素III，三尖杉宁碱，10-脱乙酰三尖杉宁碱，7-表三尖杉宁碱，浆果赤霉素VI，紫杉烷1a，木糖基三尖杉宁碱，木糖基紫杉醇，紫杉醇C，10-脱乙酰紫杉醇C，taxicine I，taxicineII，紫杉碱I，紫杉碱II和taxagifine。

8.权利要求1的方法，其中属于红豆杉属的植物是杂种紫杉或欧洲红豆杉。

9.权利要求1的方法，其中在主培养中使用了茉莉酸衍生物或晕斑素衍生物作为紫杉烷型二萜生产的促进剂。

10.权利要求9的方法，其中茉莉酸衍生物选自下列物质中的至少一种：茉莉酸，茉莉酸的烷基酯，和茉莉酸的亚氨基或氨基衍生物。

11.权利要求9的方法，其中晕斑素衍生物是晕斑素和/或coronafacicacid。