CN1045602A - 植物的组织培养方法及其装置以及代谢产物的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及植物的高密度组织培养方法以及用这种培养方法来生产代谢产物的植物组织培养装置。本发明装置中，将纯氧或含氧气体供入通气槽中的液体培养基中，并强制性地将溶解氧液体培养基供入培养槽中，而其流动状态是在培养槽内基本上不对植物组织或组胞带来摇动。按照本发明，可增加细胞增殖速度同时达到高密度培养，并能促进生物碱等代谢产物的生产从而高效生产代谢产物。本发明用于种苗增殖也是极其有效的。

Description

本发明涉及植物的组织培养方法及利用该植物的组织培养法生产代谢产物的生产方法，以及植物的组织培养装置，更详细地说，本发明涉及植物高密度组织培养以及适于用这种培养来生产代谢产物的植物组织培养装置。

作为代谢产物之一的生物碱，例如用作镇痉剂、镇痛剂等的东莨菪碱（スコポラミン），用作副交感神经截断药的莨菪碱（ヒヨスチフミン），以及用作健胃理肠药的小檗碱（ベルベリン），这些化合物都是从天然植物体中提取出来后制成的。然而，由于是以天然植物作为原料，其生产存在受天气影响以及收获期受限制等问题。因而，关于通过植物的组织培养来生产这些化合物方面进行了许多研究（例如，Plant        Cell        Reports        l，101-103（1982）等）。

本发明者们发现，在植物的组织培养中，通过往培养槽内通氧使溶解氧浓度增加，因而提高生物碱的生产性（特开昭62-6674号及特开昭62-6676号）。然而，用此方法进一步提高生物碱的生产性时，如果提高培养组织的密度，则气泡滞留在培养组织的间隙中，这妨碍了氧和养分的顺利供给，因而得不到好的结果。

另外，还提示过将通空气的培养基提供给培养槽的方法（特开昭62-179383号），但是该技术中对供给组织培养的氧浓度，植物组织培养的高密度培养或代谢产物的生产性诸方面都没有充分说明。

如上所述，已有技术的植物组织培养方法，特别是在工业规模的植物高密度组织培养方面存在各种问题，而且，想用组织培养法工业规模生产代谢产物时，代谢产物在产量方面未必能满足要求。

因此，可以工业规模进行高密度培养且能提高代谢产物生产性的植物组织培养方法及其装置的开发成为重要研究课题。

本发明者们发现，在植物的组织培养方法中，由于是在接受溶解氧浓度为10ppm以上的培养基供给的培养槽中培养植物的组织或细胞，因而可以超过以往的高密度进行组织培养，特别是，如果进行上述植物组织培养时是以基本上不会对植物组织或细胞带来摇动的流动状态供给液体培养基，就可能以超过预想的高密度进行组织培养，而且，将这种植物的组织培养方法用于代谢产物生产时，可以显著提高代谢产物的生产。

本发明者们还进一步发现，作为植物组织培养的手段，所采用的植物组织培养装置的构成是将氧或含氧气体通入液体培养基的通气槽中制得氧溶解液体培养基，并将此培养基强制供入植物的组织或细胞培养槽内;如果使用这样的装置、并在规定的培养条件下组织培养植物的组织或细胞，则能顺利地解决上述课题。

本发明申请是基于上述新发现并重复进行研究努力完成的结果，本发明申请之植物组织培养方法的特征是，在接受溶解氧浓度为10ppm以上的培养基供给的培养槽中培养植物的组织或细胞。

本发明申请之植物组织培养装置，同样是基于上述新发现并重复研究努力完成的结果，其特征是该装置具有将氧或含氧气体通入液体培养基通气槽的通气手段，以及将氧或含氧气体通气所得到的氧溶解液体培养基强制性地由前述通气槽供入植物组织或细胞培养槽内的手段。

上述溶解氧浓度最好是在15ppm以上，而上述植物的组织或细胞培养，最好是在培养槽中以基本上不会对植物组织或细胞带来摇动的流动状态连续或间歇地供给液体培养基来进行培养。因此，这种培养方法不会像以前用搅拌型培养槽或空气升液型培养槽时那样对培养的植物组织或细胞造成损伤，而且可以新鲜重为400g/l以上的高密度来培养植物的组织或细胞。

本发明之组织培养装置中，最好是至少在培养槽内氧溶解液体培养基的排出侧，设有防止培养的植物组织或细胞流出的措施，例如过滤器。

由培养槽外向培养槽内强制供给氧溶解液体培养基的手段，最好是以基本上不会对被培养的植物组织或细胞带来摇动的流动状态供给的手段，尤其好的手段是对被培养的植物组织或细胞以均匀的活塞流动形式供给氧溶解液体培养基。

此外，被组织培养的植物组织或细胞具有光合作用能力，要在光照射下进行组织培养，因此上述培养槽最好是用透明材料做成的。

本发明方法及装置中，作为基本上不对上述组织或细胞带来摇动的流动状态，最好是均匀的活塞流动。

此外，以强制性的供给手段来供给液体培养基是高密度进行植物组织培养极其希望的。

本发明申请之代谢产物的生产方法，其特征是从用上述植物组织培养方法所培养得到的培养物中采取代谢产物。

作为可在本发明中使用的植物，只要具有能生产代谢产物的细胞，任何植物都可适用本发明方法。其细胞也可以分化成器官，例如不定根等，还可以同样使用胼胝（カルス）和悬浮细胞。

适合本发明使用的植物可具体例举如下：茄属植物，例如澳洲毒茄属，如Duboisia        myoporoides，Duboisia        leichhardtii等，曼陀罗属植物，如Datrua·tatula，Datura        arborea        Datura        stramonium等;东莨菪属植物，如Scopolia        japonica等;莨菪属植物，如Hyoscyamusmiger等;以及颠茄属植物，如Atropa        belladonna等茄科植物;黄连属植物，如Coptis        japonica        Makino、C.japonika        Makino        Var.dussecta        Nakai，C.japonika        Makino        Var.japonika、C.japonika        Makino        Var.major        Satake，C.quinquefolia        Miq.及C.trifolia        Salisb等黄连属植物;唐松草属植物，如Tralictrum        minus        L.Var        hypoleucum        Miq等;黄根（Xanthoriza）属植物以及白毛莨（Hydrastis）属植物等。

本发明之植物组织培养方法及代谢产物的生产方法中，必需将上述植物组织或细胞放在接受溶解氧浓度为10ppm以上的培养基供给的培养槽中进行组织培养，溶解氧浓度不足10ppm时，则不能使培养基中的溶解氧浓度达到植物的高密度组织培养和增加代谢产物产量所必需的浓度。上述溶解氧浓度最好是在15ppm以上。用于本发明的含氧气体最好是加纯氧的空气或纯氧。

在上述方法中，用作接受溶解氧浓度为10ppm以上培养基供给的培养槽，只要不是直接将上述气体通入培养槽内，而是供给预先通气的培养基，则可不加任何限定地使用。

图1示出本发明之植物组织培养装置的一例，图2示出另一例。

图3示出用作对比的装置，该装置中不设置强制性从通气槽到培养槽内供给氧溶解液体培养基的手段。

图4（1）和（2）的曲线图分别表示本发明实施例及对比例中移植量和东莨菪碱产量以及生长量之比。

图1中，分别设置通气槽4和培养槽3，两者由培养液供给管1连接。在通气槽4中，通过含氧气体通气管2向培养基通入含氧气体，并通过培养液供给管1用泵6，6强制性往培养槽3供给溶解氧浓度为15ppm以上的培养基。5是将通气后的氧气排出的排气管，8是阀门。

图1示例中，培养槽和通气槽是用配管连接，但两槽也可用过滤器、网格等连接。上述含氧气体的通入方法，可以采用过滤器、烧结金属等。

在本发明中，所谓基本上不会对组织或细胞带来摇动的流动状态下供给上述液体培养基，是指没有像已有技术那样由小孔向培养槽内吹出供给液体培养基时由于培养槽内上述液体培养基的搅拌等而造成组织或细胞摇动的操作，通常是用图1所示的泵6等强制供给手段由一个方向以近乎稳定流的状态强制性地向培养槽内供给，其供给时用目视观察几乎看不到不定根等组织或细胞处于摇动的状态。此时往培养槽提供液体培养基的速度为1ml/l/分钟～50l/l/分钟，最好是在500ml/l/分钟～10l/l/分钟的范围内。

由于向上述培养槽中的组织或细胞以这种流动状态供给10ppm以上、最好是15ppm以上氧浓度的液体培养基，因而培养槽中的不定根、胼胝等组织或细胞呈相互紧密连接状态，从整体来看，接近呈一体的中实固形物状态，可以已有技术所不能达到的、新鲜重量为400g/l或干燥重量为20g/l以上的高密度来增殖，从而能大大提高代谢产物的生产性。

而且，如果由固定在培养槽中的过滤器等所限定的容积空间内进行上述组织或细胞培养，在继续培养的同时，因细胞分裂使细胞数增加，但组织培养物整体容积的增加受到上述空间有限容积的抑制，因此，每个细胞的干燥重/新鲜重的比率以及干燥重量大大提高，可以达到超出已有技术常识的高密度组织培养，由此也可大大提高代谢产物的生产性。如果将有限容积的空间内进行上述组织或细胞培养的方法用于澳洲毒茄（Duboisia）的不定限，则可得到干燥重/新鲜重的比率达0.07以上、干燥重量为40g/l以上的高密度。

图2所示装置具有为了能在培养槽内高密度增殖而强制向充满其内部的组织或细胞提供液体培养基的泵6，以及为了防止液体培养基供给时，使组织或细胞产生摇动、并能同时在有限的容积空间内进行上述组织或细胞的培养，因而在培养槽3的内壁面以规定间隔设置了固定的不锈钢制网格7，7，除此而外，图2所示装置的结构与图1的培养装置类似。图2所示装置用于不定根的组织培养及其代谢产物的生产是有利的。

本发明中使用的液体培养基，是以无机成分及碳源作为必需成分，其中添加植物激素类、维生素类，还可根据需要添加氨基酸类后得到的培养基。

无机成分可例举含有氮、磷、钾、钠、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、钼、氯、碘、钴等元素的无机盐，具体说，是硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、氯化钾、氯化钙、磷酸氢钾、磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化镁、硫酸钠、硫酸铁、硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸铜、钼酸钠、三氧化钼、碘化钾、硫酸锌、硼酸、氯化钴等化合物。

上述培养基的碳源，可举例蔗糖等碳水化合物及其衍生物，脂肪酸等有机酸及乙醇等1级醇。

上述培养基的植物激素，可例举萘乙酸（NAA）、吲哚乙酸（IAA）、P-氯苯氧基乙酸、2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）、吲哚丁酸（IBA）及它们衍生物的植物生长激素类和苄基腺嘌呤（BA）、激动素、玉米素等胞质分裂素类。

上述培养基的维生素，可例举生物素、硫胺素（维生素B₁）、吡哆醇（维生素B₆）、吡哆醛、吡哆胺、泛酸钙、抗坏血酸（维生素C）、肌醇、烟酸、烟酰胺及核黄素（维生素B₂）等。

上述培养基的氨基酸类，可例举甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、胱氨酸、苯基丙氨酸及赖氨酸等。

本发明之上述培养基，通常希望使用含有上述无机成分约0.1μM至100mM，上述碳源约1g/l至100g/l，上述植物激素类约0.01μM至100μM，上述维生素类约0.1mg/l至150mg/l以及上述氨基酸类约0至100mg/l的培养基。

用于本发明之植物组织培养的上述培养基的具体例子，可以是以前就已知的ムラシゲ·スム-ゲ（^\62）（Murashige & Skoog）培养基、リンスマイヤ-·スク-グ（RM-1965）（Linsmaier & Skoog）培养基，ホウイト（^\63）（White）培养基，ガンボルグ（Gamborg）B-5培养基、三井的M-9培养基，ニツチ·ニツチ（Nitsch Nitsch）培养基中添加上述碳源及植物激素，还可根据需要添加上述维生素类、氨基酸类后配制得到的培养基。其中对本发明尤其好的是使用ニツチ·ニツチ（Nitsch-Nitcch）、リンスマイヤ-、スク-グ（Linsmaier-Skoog）或ムラシグ·スク-グ（Murashige-Skoog）培养基配制成的培养基。关于上述已经公知培养基的组成，记载在1979年朝仑书店出版、竹内、中岛、古谷著的“新植物组织培养”P386～P391上。

本发明是使用上述培养基在如上所述之培养槽中进行植物的组织培养，并得到含有代谢产物的培养细胞或培养组织的发明。

用于本发明组织培养的上述植物组织的具体例子，可举出该植物的根、叶、茎、种子、花蕾等其它涉及本发明的组织培养或其它已有的组织培养方法所得到的该植物的培养细胞或培养组织。采用澳洲毒茄属植物时，最好是将预先组织培养得到的不定根在上述培养槽中进行组织培养。在这种情况下，原料的不定根是通过本发明方法进行增殖培养，作为代谢产物，得到含有大量东莨菪碱、莨菪碱等莨菪烷类生物碱的不定根。

用本发明方法生产的代谢产物，可例举莨菪烷类生物碱（东莨菪碱、莨菪碱等），异喹啉类生物碱（小檗碱等）等。

本发明中，从含有代谢产物的培养细胞或培养组织中分离出代谢产物时，可采用通常的方法，例如，药局法等中记载的从植物中离析精制代谢产物时所通常用的方法。

以下根据实施例更具体地说明本发明方法。

实施例1

将本公司药草园中栽培的澳洲毒茄属苦槛蓝（Duboisia myoporoides）R.Br的叶洗净，并浸渍在10%的安替佛民（次亚氯酸钠的强碱溶液）液中10分钟，然后用灭菌水清洗3次后，切断成1cm左右，并置于添加萘乙酸和苄基腺嘌呤分别成为10^-5M及10^-6M的リンスマイヤ-·スクグ（Linsmaier & Skoog）的琼脂培养基中，在25℃培养30天。将形成胼胝同时产生的不定根切下，并移植在添加蔗糖3%的吲哚丁酸以致成为10^-5M的ニツチ·ニツチ（Nitsch Nitsch）液体培养液中，继代培养两年。

将如此得到的不定根100mg（干燥重量）移植到如图1所示由通气槽和培养槽构成的培养装置之培养槽中，然后向含50mlニツチ·ニツチ液体培养基（含蔗糖3%，吲哚丁酸10^-5M）的培养槽中以每分钟20ml的流速供入在通气槽通入纯氧的培养基（溶解氧浓度40ppm），用此培养方法进行3周培养。将得到的不定根在干燥后用碱性三氯甲烷-甲醇液50ml萃取。其中添加40ml的1N硫酸后，生物碱移至硫酸层。继而，添加氨水2ml和三氯甲烷40ml，生物碱移至三氯甲烷层，随后减压浓缩，并用气体色谱法分析生物碱量。表1示出这种情况下的东莨菪碱产量。气体色谱法分析是在以下条件下进行。

柱：在红色硅藻土色谱载体（Chromosorb）W（Mesh        80-100）上有

Silicone        OV-17（1%），

3mmφ×1m玻璃柱

载体气体：N₂

柱温度：200℃

实施例2

除通气时使用的气体是在空气中添加氧且氧的分压为50%的气体外，其它操作均与实施例1相同，培养澳洲毒茄不定根，并提取东莨菪碱，测定其含量。其结果示于表1。

实施例3

除用氧分压为30%的气体代替纯氧进行通气外，其它操作均与实施例1相同，结果示于表1。

对比例1

除使用空气代替纯氧进行通气外，其它操作均与实施例1相同，结果示于表1。

对比例2

除将纯氧直接通入培养槽外，其它操作均与实施例1相同，其结果示于表1。

表1

溶解氧浓        生长量（干        东莨菪碱

细胞        气体        度（ppm）        燥重g/l）        含量（%）

实施例1        澳洲毒茄        纯氧        40        20        1.3

不定根

实施例2        澳洲毒茄        氧分压50%        20        20        1.2

不定根

实施例3        澳洲毒茄        氧分压50%        12        16        0.8

不定根

对比例1        澳洲毒茄        空气        8        16        0.7

不定根

对比例2        澳洲毒茄        纯氧        40        16        0.8

不定根        直接通入培养槽

对比例3

实施例1中使用的澳洲毒茄属不定根是经过两年继代培养的，而对比例3中使用的是在实施例1同样条件下经过6个月继代培养的澳洲毒茄不定根。即对比例3是比实施例1早1.5年之前进行的实验，实施例1和对比例3的不定根是具有相同母细胞的相同系列（Cell        line）的不定根。

对比例3中，将这种经过6个月继代培养得到的不定根0.8g（干燥重量），移植到备有溶解氧浓度调节计及底部通气用玻璃过滤板且含有1升上述液体培养基的通气培养槽中，将溶解氧浓度分别保持在表2所示值，培养3周。将所得之不定根干燥之，并用碱性三氯甲烷-甲醇液1升提取它。其中添加1升的1N硫酸，使生物碱移至硫酸层。继而添加氨水100ml及三氯甲烷1升使生物碱移至三氯甲烷层，将其减压浓缩，用气体色谱法分析提取物。求出每单位干燥重量的东莨菪碱、莨菪碱、乙酰莨菪碱、异丁酰莨菪碱（イソブチロイルトロピン）、戊酰莨菪碱（バレロイルトロピン）、惕各酰莨菪碱（チグロイジン）等莨菪烷类生物碱的总量和东莨菪碱的含量。其结果示于表2。

表2

实验        溶解氧浓度        总莨菪烷类生物碱        东莨菪碱含量

号        （ppm）        （%）＊        （%）＊

1        20        2.49        0.71

2        30        2.95        0.82

3        40        3.05        0.85

4        50        2.63        0.75

5        60        2.13        0.61

6        4        1.86        0.49

7        8        2.24        0.57

＊表示按干燥重量的重量%

比较实施例和对比例的结果可看出，用公知的搅拌培养时，即使提高溶解氧浓度，其东莨菪碱含量也很低，而且产量也低，而用本发明之方法，在开始培养时不给组织或细胞带来摇动，则可得到很高的东莨菪碱含量和生长量。

实施例4

除使用的植物组织是黄连细胞，培养基是含激素浓度为萘乙酸100μM，苄基腺嘌呤5μM的リンスマイヤ-·スク-グ（Linsmaier-Skoog）的液体培养基外，其它条件均与实施例1相同，培养黄连细胞，并用90%甲醇提取小檗碱，用HPLC测定含量，其结果示于表3。

对比例4

除通气用的气体是空气外，其它均与实施例4相同，进行黄连细胞的培养、小檗碱的提取，以及含量测定。其结果示于表3。

表3

溶解氧浓        生长量（干        小檗碱

细胞        气体        浓度（ppm）        燥量g/l）        含量（%）

实施例4        黄连细胞        纯氧        40        30        13.5

对比例4        黄连细胞        空气        8        24        8.5

对比例5

将セリバ黄连（Cop Var dissecta Nakai）的叶子用70%乙醇溶液及次氯酸苏打水溶液（有效氯量0.5%）杀菌后，置于将含蔗糖3%，萘乙酸10^-5M，苄基腺嘌呤10^-8M的无菌リンスマイヤ-·スク-グ液体培养基用琼脂固定的固体培养基（琼脂1重量%）上，在25℃的暗处培养，得到セリバ黄连的胼胝。然后在上述同样条件下将这种セリバ黄连胼胝每隔14日继续用リンスマイヤ-·スク-グ的液体培养基培植，用回旋摇动器回旋培养（振幅25mm、100rpm）来加速セリバ黄连培养细胞的生长速度，并得到稳定的セリバ黄连培养细胞。

在设有溶解氧浓度计和含氧气体通气管的通气搅拌培养槽（内容积2升）中，加入将Cu²⁺浓度变更成1μM的无菌上述液体培养基1.5升以及新鲜重量为15g的上述胼胝，调节含氧气体的通气量使溶解氧浓度为表4所示之值，同时在25℃的暗处培养两周。将得到的胼胝干燥之，并用乳钵破碎干燥胼胝后，用90%甲醇提取异喹啉类生物碱。将此提取液用高速液体色谱法分析小檗碱、巴马亭（パルマチン）、黄连碱（コプテシン）、药根碱等异喹啉类生物碱。其结果示于表4。

表4

溶解氧浓度        胼胝产量        总异喹啉类生物碱        小檗碱

实验号        （ppm）        （g干燥重量/l）        （重量%）        （重量%）

1        4        11.0        7.4        6.7

2        8        11.5        10.7        7.2

3        10        11.9        12.7        8.1

4        15        12.3        12.6        8.0

5        20        11.8        11.3        7.6

6        30        6.5        6.3        4.4

7        40        2.3        3.9        2.6

该实验结果也说明用公知的搅拌培养方法不能得到良好的结果。

实施例5

将实施例1同样方法得到的不定根300mg（干燥重量）移植到图2所示由通气槽和培养槽构成的培养装置之培养槽（容积30cm³）中，然后由通气槽通入纯氧，并每分钟供给20ml含蔗糖3%、吲哚丁酸10^-5M的ニツチ·ニツチ（Nitsch-Nitsch）液体培养基（溶解氧浓度40ppm），用此培养方法培养3周。

如果采用本实施例用的图2所示培养槽，则培养槽内的液体培养基的流动状态，如图中箭头所示，从下部向上部呈均匀的活塞流动状态，培养槽内的不定根处于基本上不摇动的稳定状态。用实施例1相同方法对得到的不定根进行生物碱的提取和分析。此种情况下的生物碱产量示于表5。

表5

溶解氧浓度        生长量        东莨菪碱产量        含量

（ppm）        （干燥重g/l）        （mg/l）        （%）

实施例5        40        118        1350        1.2

实施例6

除使用实施例1同样方法得到的不定根150mg（干燥重量）外，其它均与实施例5相同，表6示出经过3周培养时的结果。

对比例6

除用图3所示培养装置之外，其它均与实施例6相同，表6示出不定根经过3周培养的结果。

图3所示之培养装置中，如箭头所示，液体培养基从通气槽的上部流入培养槽上部，再从培养槽下部向通气槽循环，而液体培养基的流动很难形成与实施例6同样状态的流动，容易产生沟流，因而生物碱的生产性差。

表6

溶解氧浓度        生长量        东莨菪碱产量        含量

（ppm）        （干燥重g/l）        （mg/l）        （%）

实施例6        40        57        630        1.1

对比例6        40        37        100        0.27

实施例7

对实施例1同样方法得到的不定根，将供给培养槽的培养基溶解氧浓度规定为40ppm，改变移植量进行3周培养。其结果用

直线示于图4。

对比例7

除供给培养槽的培养基溶解氧浓度为8ppm以外，其它均与实施例7相同，进行3周培养。其结果用0-0直线示于图4。

实施例8

将实施例1中用的相同不定根300mg（干燥重量）移植到由通气槽和培养槽构成的图2所示之培养装置的培养槽（容积30cm³）中，然后将通气槽通入纯氧的ニツチ·ニツチ液体培养基按每分钟20ml供给其中的方法进行培养（第1阶段），培养开始后1周去掉培养基，添加新的含铵离子9mM、硝酸离子36mM、磷酸离子0.25mM、及蔗糖5%，但不含吲哚丁酸的ニツチ·ニツチ液体培养基，作为第2阶段，进行2周培养。与实施例1相同，从得到的不定根中提取东莨菪碱，并测定其含量。其结果示于表7。

对比例8

实施例8中，除培养1周后不舍弃培养基，而且不添加新培养基外，其它均与该实施例相同，结果示于表7。

表7

生长量        东莨菪碱

条件        （干燥重g/l）        含量（%）        产量（mg/l）

实施例8        2段培养        115        2.1        2410

对比例8        1段培养        118        1.2        1350

如果按实施例8的方法，培养产生莨菪烷类生物碱的植物不定根时，由于在培养过程中，将培养基全部换成新的培养基，因而在培养过程中排除了由组织排到培养基中的老废物的影响，则提高了不定根中莨菪烷类生物碱的含量，或促进不定根的生长，从而能提高莨菪烷类生物碱的生产性。此外，由于在培养的第1阶段采用了衍生不定根侧根的培养基，在培养的第2阶段采用了促使侧根伸长并促进莨菪烷类生物碱生产的培养基进行阶段培养，因而可大大提高培养组织中的莨菪烷类生物碱的生产性。

实施例9

将土常山蔓（ァマチヤジル）（Gynostemma pentaphyllum Makino）不定根150mg（干燥重量）移植到由通气槽和培养槽构成的图2所示培养装置之培养槽（容积30cm³）中，然后经通气槽每分钟供给20ml通入纯氧，且含蔗糖3%、吲哚丁酸（IBA）10^-5M的ニツチ·ニツチ的液体培养基（溶解氧浓度40ppm）进行培养。用该方法培养4周。表8示出此时的生长量。此时的代谢产物是人参糖苷（ジンセノサイド）。

对比例9

除通入的气体是用空气（溶解氧浓度8ppm）代替纯氧，且移植到培养槽的量为15mg（干燥重）以外，其它均与实施例9相同，进行培养。结果示于表8。

表8

移植量（干燥重）        生长量（干燥重）

实施例9        5g/l        71g/l

对比例9        0.5g/l        6g/l

实施例10

使用实施例8中所用的相同装置，将毛地黄（ジギタリス，digitalis）幼植物300mg（干燥重量）移植到培养槽中，在通气槽通入纯氧，每分钟供给20ml含蔗糖3%，激动素10^-6M的ニツチ·ニツチ的液体培养基，进行了3周培养。结果示于10。

对比例10

除使用空气且移植量为30mg（干燥重）以外，其它均与实施例10相同，培养结果示于表10。

表9

通入        移植量        生长量        毛地黄毒苷含量

气体        （干燥重）        （干燥重）        （ppm）

实施例10        氧        10g/l        27g/l        40

实施例10        空气        1g/l        4g/l        6

按本发明方法及装置，由于不直接往培养基通含氧气体，因此能够充分供给氧气而又不损伤产生代谢产物的植物细胞，并能在增加细胞增殖速度的同时达到高密度培养，不仅如此，还由于促进生物碱等代谢产物的生产，因而能高效生产代谢产物。特别是当培养植物的不定根等组织或细胞时，是像上述那样以不会给上述组织或细胞带来摇动的状态供给溶解着规定高浓度氧的液体培养基，因而能使胼胝等组织或组胞以极高的密度增殖。本发明用于种苗增殖是极其有效的。如果用于生物碱等代谢产物的生产，则可大大提高其生产性。

图1示出本发明之植组织培养装置之一例。

图2则示出另一例。

图3示出用于对比的装置，该装置中从通气槽到培养槽不设置强制供给氧溶解体液培养基的手段。

图4（1）和（2）分别是表示本发明之实施例和对比例中的移植量和东莨菪碱产量以及生长量之比的曲线图。

Claims (11)

1、植物的组织培养方法，其特征是，在培养槽内以基本上不给上述组织或细胞带来摇动的流动状态连续或间接供给溶解氧浓度超过10ppm的液体培养基的方式培养植物的组织或细胞。

2、权利要求1所述之植物的组织培养方法，其特征是，基本上不给组织或细胞带来摇动的流动状态是均匀的活塞流动。

3、权利要求1所述之植物的组织培养方法，其特征是，用强制性的供给手段进行液体培养基的供给。

4、权利要求1-3的任何一项所述之植物的组织培养方法，其特征是，通过培养使组织或细胞增殖至新鲜重为400g/l以上或干燥重为20g/l以上的高密度。

5、权利要求1-4的任何一项所述之植物的组织培养方法，其特征是，植物的组织或细胞是不定根。

6、代谢产物的生产方法，其特征是，由权利要求1-5任何一项所述之植物的组织培养方法培养得到的培养物中采取代谢产物。

7、植物的组织培养装置，其特征是，该装置具备往液体培养基的通气槽中通氧或含氧气体的通气手段，和将通入氧或含氧气体而得到的氧溶解液体培养基由上述通气槽强制性地供给到植物的细胞或组织培养槽内的手段。

8、权利要求7所述之植物的组织培养装置，其特征是，至少在培养槽内氧溶解液体培养基的排出侧，设置防止被培养的植物组织或细胞流出的手段。

9、权利要求8所述之植物的组织培养装置，其特征是，防止被培养组织流出的手段是过滤器。

10、权利要求7-9的任何一项所述之植物的组织培养装置，其特征是，从培养槽外到培养槽内强制性供给氧溶解液体培养基的手段，是基本上不给被培养植物的组织或细胞带来摇动的流动状态下供给上述氧溶解液体培养基。

11、权利要求10所述之植物的组织培养装置，其特征是，基本上不给被培养植物的组织或细胞带来摇动的状态下供给上述氧溶解液体培养基的手段，是对被培养的植物组织或细胞以均匀的活塞流供给氧溶解液体培养基的手段。

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