CN1019507B - 培养方法和培养装置 - Google Patents

培养方法和培养装置

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Abstract

一种培养方法，包括在培养罐中的培养基中培养一种被培养的物质，以生产一种有用物质，其特征在于至少采用二只彼此连通的培养罐，其中第一培养罐调整在适合被培养物质生长的培养条件下以及第二培养罐调整在给定条件下适合有用物质的生产；一种适合所述被培养物质生长的培养溶液构成的培养基连续地或间歇地馈入至第一培养罐；贮于第一培养罐的部分培养溶液作为液体介质以及连同含有在所述培养溶液中的被培养物质连续地或间歇地一起传输至第二培养罐；以及贮于第二培养罐中作为培养介质的部分培养溶液连续地或间歇地从罐内排出；同时，揭示了实施所述方法的一种培养装置。

Description

本发明涉及对需培养的物质诸如植物细胞等进行组织培养的方法和实现所述方法所用的培养装置。更具体地说，本发明涉及在较常规方法浓度高的情况下能有效地对物质进行组织培养的方法，它也涉及一种实现根据本发明的方法的培养装置。
作为对植物细胞进行组织培养的常规方法，已知的有分批培养和连续培养。
（1）分批培养
在分批培养中，得到的经培养的组织（例如经培养的细胞等）的产量取决于在培养基中的营养物（在培养基中的配料）的浓度而变化，因此，当使用通常用在分批培养中的Linemaier-Skoog培养基、White培养基和Nitch&Nitch培养基时，营养物在培养期间被消耗掉，因此，由上述方法以获得高浓度的经培养的组织是不可能的。作为一种增加经培养组织浓度的方法，已提出了一种方法，其中营养物浓度较常规方法增加。然而，当营养物的浓度太高时，产生了一些问题，即如此高的浓度干扰了培养，例如所培养的物质被破坏，因此通过增加营养物的浓度来增加培养物质的生产率的方法有一个限制，并且每单位容量培养罐的经培养物质的收得率低，效率低。
（2）连续培养
例如在文献“发酵工程（Fermentation    Engineering）（Hogaku）”卷61，第117-128页（1983）（日文）中描述了用于连续培养的常规方法。
在连续培养中，在培养期间将罐中的细胞保持在几乎相同的条件下，因此，根据工业上的目的，可通过例如由培养条件的改变增加细胞的生长或增殖速率或通过增加所希望物质的含量而进行培养。另外，由于在连续培养中培养阶段是连续的，因此实际的培养时期长，而且能在给定的高浓度中对细胞进行培养，而在分批培养中，必须在重复由装料-灭菌-培养-回收-洗涤-装料组成的循环，因此，与分批培养相比较，连续培养的效率高。
然而，根据我们的研究，已发现在某些情况下存在着连续培养中生产率低于分批培养生产率的缺点。
我们已在涉及常规方法的问题上作了研究，发现问题是由这样的事实引起的，即在几乎所有情况下，要同时加速细胞的生长和加速所希望物质的生产是很困难的。
完成本发明的目的在于消除上述缺点。
本发明的目的在于提供一种用于连续培养的新方法，其中改进了常规方法，与常规方法相比，能有效地进行有用物质的生产。
本发明的另一个目的是提供一种实现本发明所述方法的装置。
我们已研究了有关常规方法的问题，发现当使用以下描述的方法和以下描述的装置时，可达到本发明的目的，本发明是以下列发现为基础的。
本发明提供了一种培养方法，它包括在培养罐中的液体培养基中对所需培养的物质进行培养，以产生一种有用的物质或产生一种包含有用物质的经培养物质，其特征在于使用至少两个相互连通的培养罐，将其第一个培养罐保持在适合于所需培养物质生长的培养条件下，将其第二个培养罐保持在适合于从所述需培养的物质产生出有用的物质的培养条件下;组成适合于所述需培养物质生长的培养基的培养溶液被连续地或间断地送入所述第一个培养罐;将储存在第一个培养罐中的作为液体培养基的培养溶液的一部分和包含在所述培养溶液中的所需培养物质一起连续地或间断地转移到所述第二个培养罐中;将储存在第二个培养罐中的作为培养基的部分培养溶液连续地或间断地从罐中引至外面。
本发明也提供了一种用于在培养罐内的液体培养基中培养一种物质以产生一种有用物质或产生一种含有有用物质的培养基的培养装置，其特征在于所述装置由至少两个培养罐组成，其第一个培养罐配备有第一培养基条件设定装置，用以保持液体培养基在适合于需培养物质生长的条件下储存在所述第一个培养罐中;其第二个培养罐被提供有一种第二培养基的条件调节装置，其目的是为了保持液体培养基在适合于由所述需培养物质产生有用物质的条件下储存在所述第二个培养罐中;在所述第一个培养罐和第二个培养罐之间设有一个主连通管，通过这个管子，储存在所述第一个培养罐中的作为液体培养基的部分培养溶液和包含在所述培养溶液中的所述需培养物质一起被连续地或间断地转移到所述第二个培养罐中。
我们已发现，当对物质进行培养时，要达到所述物质生长或增殖的速率的高峰值所需的时间与要达到有用物质产生的速率高峰值所需的时间有所不同，如图2所示。即我们已发现，细胞在液体培养基中的生长条件与有用物质的产生条件是不同的。
完成本发明是以此发现为依据的，根据本发明的方法和装置，将在第一个培养罐中的培养基与在第二个培养罐中的培养基保持在的不同条件下，即将在第一个培养罐中的培养基调整在一定的状态下以使它适合于细胞的生长或增殖，而将在第二个培养罐中的培养基调节一定的状态下以使它适合所希望的有用物质的产生。因此，可消除常规连续培养方法的生产率低的不足。
根据本发明，通过由至少两个阶段构成的连续培养方法，可大大提高生产率，此两个阶段为：
以连续的方式分别在第一个培养罐和第二个培养罐中，分别培养置于有力生长条件下的细胞和置于快速生产条件下的细胞的阶段，另一个阶段是将在第一个培养罐中处理的在生长步骤中生长的超过预定量的过量组织或细胞连续地或间断地转移到在第二个培养罐中处理的生产步骤中，并将包含增加浓度的所希望有用物质的组织或细胞从第二个培养罐中排出和回收。
图1图示了本发明的培养装置的一个实施例。
图2为表明生长速率（增殖）和生产速率之间关系的曲线图。
10：第一个培养罐
11，21：培养基送入管
20：第二个培养罐
15，25：排出口
30：主连通管
32：辅助连通管
[培养方法]
在本发明中，使用至少两个培养罐。
调节送入第一个培养罐中的培养基的成分，以加速需培养的组织或细胞的生长或增殖。希望在主要营养素源中的如糖、磷酸盐和氮源（它们加速植物细胞的生长）配料的浓度较其他配料的浓度增加，控制它们的进料速率以使它们在培养溶液中的浓度保持在最佳范围内。如同在此后描述的那样，应分别是确定较佳的成分、送入速率、培养基的温度、氧含量、搅拌条件等，这取决于培养的植物细胞的类型或浓度。
将适合于增加所希望有用物质浓度的培养基送至第二个培养罐是所希望的，通常，能阻止细胞生长的培养基成分会得到有利的结果，阻止生长的培养基组成物是包含较低浓度的诸如糖、磷酸盐和氮 源的主要培养基。然而，在减小或增加所希望有用物质浓度方面起作用的配料组分随植物的种类和所希望物质而变化，因此这些配料组分的浓度系由植物种类和所希望有用物质所决定。确定在第二个培养罐中的培养基温度、氧含量、搅拌条件等，而不考虑在第一个培养罐中的那样参考。
第一个培养罐和第二个培养罐可通过例如一个主连通管相互连通，将储存在第一个培养罐中的作为部分培养基的培养溶液与包含在其中的需培养物质一起连续地或间断地转移至第二个培养罐中。
在本发明中，将新鲜的培养基送入第二个培养罐中是可能的，在某些情况下，这种方法较佳的是包括将新鲜培养基送入第二个培养罐，这取决于作为需培养物质的植物种类，在这种情况下，认为第二个培养罐起成熟培养罐的作用，因为如此使用由第一个培养罐转移来的培养溶液，是当τml/v值（通过由培养基更新比计算得培养基送入第一个培养罐中的进料速率ml而获得的值）大于特定生长速度μ时，将含有细胞的培养溶液以速率μ转移至第二个罐中，以τml-μ的速率将细胞被除去的培养溶液从罐中向外排出，如果希望，可将排出的溶液送入第二个罐中以更新第二个培养罐中的培养溶液。
培养基更新比和特定生长（增殖）速度的定义将在此后作更详细的描述。
如果希望，在主连通管道上还可提供有一个或更多个中间培养罐，可将中间罐置于第一个和第二个培养罐状态之间的条件下。
可将本发明的培养方法应用于任何作为需培养物质的植物上而无特殊限制，只要它们是能应用上常规组织培养的植物。
这些植物的例子包括诸如日本黄连属和莎鳞鱼属落叶松属的毛茛科植物;诸如罂粟的催眠罂粟属植物;诸如甘草的豆科植物;诸如胡萝卜和mishimasaiko的爪哇属植物;诸如大黄属的蓼属植物;诸如萝芙木和马达加斯加蔓长春花的夹竹桃植物;诸如烟碱烟草的茄科植物;诸如L.erythrorhizon的紫草科植物;诸如Perilla    frutesoens    Brittvar、Crispa    Decne和薄荷的beefsteak植物;诸如茜草和咖啡的茜草科植物以及诸如毛地黄的gigili    tare植物。
本发明中，将这些植物的组织（包括细胞和器官）在液体培养基中培养，液体培养基含有作为基本组分的无机物质、碳源和植物激素，除此之外，所述液体培养基还包含维生素和选择性的氨基酸。无机物质的例子包括氮、磷、钾、钠、钙、镁、硫、铁、锰、锌、硼、钼、氯、碘和钴这些元素的无机盐。包含所述元素的无机盐的典型例子包括硝酸钾、硝酸钠、硝酸铵、氯化铵、氯化钾、氯化钙、磷酸氢二钾、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸钠、硫酸亚铁、硫酸铁、硫酸锰、硫酸铜、钼酸钠、氧化钼、磺化钾、硫酸锌、硼酸、氯化钴等。
碳源的例子包括诸如蔗糖的糖类、其衍生物、诸如脂肪酸的有机酸类、诸如乙醇的伯醇类等。
植物激素的例子包括诸如吲哚基乙酸（IAA）、萘乙酸（NAA）、对氯苯氧基异丁酸和2，4-二氯苯氧基乙酸（2，4-D）的植物生长素和诸如激幼素、玉米素和苄基腺嘌呤的细胞分裂素类。
能用于液体培养基的维生素的例子包括生物素、硫胺素（维生素B1）、吡哆素（维生素B6）、吡哆醛、吡哆胺、泛酸钙、抗坏血酸（维生素C）、肌醇、烟酸、烟酰胺、核黄素（维生素B2）等。
能用于液体培养基的氨基酸的例子包括甘氨酸、丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、酷氨酸、赖氨酸等。
本发明的液体培养基较佳包含从约0.1μM至约1000mM的无机物质、每立升从约1克至约100克的碳源、从0.01μM至1000μM（较佳为1μM至100μM）的植物激素、每立升从约0.1毫克至约150毫克的维生物和每立升0至1000毫克的氨基酸。
液体培养基的例子包括由下列步骤制备的培养基，该步骤为：在常规用于植物组织培养的诸如Murashige    &    Skoog（′62）培养基、Linsmaier-Skoog（RM-1965）培养基、White（′63）培养基、（Gamborg的B-5培养基和Mitsui    M-9培养基的常规液体培养基中加入碳源、植物激素和可供选择性的所述维生素和所述氨基酸。
在Takeuchi、Nakajima和Furuya著作的 “New    Plant    Tissue    Culture（Shin    Shokubutsu    Soshiki    Baiyo）”第386-391页（1979）由Asakura    Shoten出版（日文）的这篇文章中，描述了上述常规培养基组成物。
植物组织培养最好在下列条件下通过采用上述液体培养基来进行。
在本发明的组织培养方法中，在组织培养期间，培养是在如此的条件下进行，以至于经培养的组织浓度（以液体培养基的量为基准）处在10至500（g/l）范围内，其中较佳为20至400（g/l）范围内。由于在培养期间，组织生长或增殖，并且其量增加，因此在培养期间可选择性地从培养罐中取出适量的组织培养物质使在培养罐中的经培养组织浓度保持在上述范围内。取出的经培养组织的重量为在湿态时测量的鲜重，鲜重为通过下列方式测量的经培养组织的重量，即将经培养的组织送至其上放置有一过滤布的上下真空漏斗（Nutsche）上，借助于水喷射泵进行过滤五分钟，测量培养溶液被去除后的经培养组织的重量，所获得的鲜重可变动，这取决于植物的种类，但它通常具有80-95重量%的含水量。
这里用到的术语“经培养的组织”意指通过对植物的组织片块或细胞进行培养所获得的物质，组织片块的例子包括茎顶、茎、叶、花、种子和根以及由组织片块和经培养细胞衍生而来的胼胝。经培养的组织可被用作组织培养的原材料，当在培养期间所述经培养的组织的浓度低于10g/l时，每单位容量培养罐的经培养组织的收得率是低的。因此，同常规方法一样，其培养的效率低，所以不选择如此低的浓度。当经培养组织的浓度高于500g/l时，增加了淤浆的浓度，培养溶液的搅拌和混和很难进行，不能有效地提供氧，结果产生了经培养组织的死亡，并且经培养组织的正常生长和增殖会变得困难。当强力进行搅拌以提供足够量的氧时，经培养的组织经受了断裂和破坏使继续培养变得困难，因此，选用高于500g/l的浓度是不可取的，据此，在经培养组织浓度为10至500g/l范围内进行所述培养。
如上所述，进行培养，同时将经培养组织的浓度保持在上面限定的范围内，为了满足上述需要，可选择性地取出适量的经培养组织，以便在第一个和第二个培养罐中的经培养组织的浓度不超出上面限定的范围，即使当在培养期间由于培养组织的生长而增加了其浓度时，从培养罐取出部分经培养组织是不必要的，除非其浓度超出了上述范围。
在本发明中，从组织培养的开始时就将在第一个和第二个培养罐中的经培养组织的浓度保持在10至500g/l范围内并不总是必要的，例如，装入两个培养罐中的组织片块或经培养细胞的浓度可小于10g/l（以液体培养基的量为基准）并且可开始组织培养，然后在培养期间，细胞增殖，经培养组织的浓度会增至10至500g/l，从而使本发明的组织培养圆满地进行。
（2）将含有控制浓度营养素的各个液体培养基连续地或间断地送至各个培养罐，同时从各个培养罐的另一边连续地或间断地取出培养溶液，以满足上述（1）的需，即是：使经培养组织的浓度保持在10至500g/l范围内，如果希望，将细胞滤出或沉淀，在通过取出不包含细胞的所得培养溶液而更新在培养罐中的培养溶液的同时，进行组织培养，培养溶液的更新可连续地或间断地进行。
上述营养素为用于本发明液体培养基的配料，它包括无机物质、碳源、植物激素、维生素和氨基酸。
这里所用的术语“含有控制浓度营养素的液体培养基”意指包含下列成份的液体培养基：从约1至约0.1μM至约100μM的无机物质，从约1至约100g/l的碳源，从约0.01至100μM的植物激素（较佳为1至100μM），约0.1至150mg/l的维生素，从0至约1000mg/l的氨基酸。当将液体培养基送至培养罐时，最好使用一种新鲜液体培养基。然而，在调整营养素的浓度后，可再循环使用由各个培养罐移出的液体培养基，当欲将液体培养基循环使用时，希望能将在培养溶液中的由细胞代谢形成的废物去除。
当在更新培养溶液的同时进行组织培养时，希望植物的组织培养在一定的条件下进行，使得培养基更新比率（定义为每天τml/v或每天τtl/v）和特定生长速度μ[天]之间的关系保持在μ＜τml/v或τtl/v＜20μ范围内，其中V代表在各个培养罐中的培养溶液立升（1）量，Uml代表送入第一个培养罐中的液体培养基量，Vtl代表送入第二个培养罐的液体培养基的量（1/天），特定生长速度μ（天）为由下列方法定义的量，总之 Vml和Vtl在此后都被称作τ。
当不从罐中向外排出经培养组织时，特定生长速度μ由下列式子定义：
μ= ln Xt Xo t
其中X0代表培养t0时的经培养组织的量，Xt代表过了t小时（天）后经培养组织的量。
当由罐中向外排出增殖的培养组织，其时保持经培养组织的量X时，特定生长速度μ由下式定义：
μ＝ (Tt)/(Xo·T)
其中Yt代表t小时（天）后由罐中排出的经培养组织的量。
根据物理学，速度μ具有量纲为[时间-1]，较大的μ值意味着培养组织的生长速度较高。
特定生长速度μ的值可变，这取决于植物培养组织的种类，但通常在0.02至1.0（天-1）范围内。
当培养基更新比（τ/v）小于特定生长速度μ时（当τ/v＜μ时的情况），经培养组织的浓度逐步增高，并变得很难保持浓度不变。
当培养基更新比（τ/v）远远大于特定生速度μ时（20μ≤τ/v时），经培养组织具有相反的效果，例如，它容易产生变黑和死亡，因此，希望通过将培养基更新比（τ/v）调整至μ≤τ/v＜20μ范围内的某一值。
上面，已描述了当植物细胞为需培养的物质的情况，然而，本发明并不局限于此，本发明也可应用于其他物质，例如在本发明中，除了植物细胞外，诸如酶的动物细胞也能用作待培养物质，可用本发明的方法对其培养。
如上所述，将第一个培养罐调节在一定的条件下以适应待培养物质的生长，通常，根据植物的种类确定温度、pH值、溶解氧的浓度、液体培养基的组成、培养基更新比、细胞密度等参数，例如，当使用紫草属enythrorizon时，最佳状态为：温度为24至26℃，pH为4至6，溶解氧的浓度为4至8ppm，使用基组成物A和B见表1，另外，细胞密度为10至400克/立升，较佳为50至300g/l，培养基更新比为每天0至30%（体积比）。
当使用日本黄连的细胞时，最佳状态为：温度为23至26℃pH为4至6，溶解氧浓度为4至10ppm，使用的培养基组成物A、C和D见表1。另外，细胞密度为50至500g/l，较佳为100至400g/l，培养基更新比为每天5至50%（体积比）。
当使用Rubiaakane茜草植物的细胞时，最佳状态为：温度为23至26℃，pH为4至6，溶解氧浓度为2至10ppm，采用的培养基组成物A、E和F见表1，另外，细胞密度为50至500g/l，较佳为100至400克/升，培养基更新比为每天0至35%（体积比）。
如上所述，将第二个培养罐调整在一定的条件下以适合所希有用物质的生产或适合包含所希望的有用物质的细胞或组织的生产，根据植物类型和需生产的所希望的有用物质的种类来确定其最佳状态。
例如，当采用紫草属enythrorizon的细胞来生产（紫草宁二羟基羟甲戊烯基蔡二酮）时，温度为22至25℃，使用具有表1给出组成物G和H的培养基，其他条件基本上与那些适合生长的条件相同。
当采用日本黄连的细胞来生产小檗碱时，溶解氧浓度为4至15ppm，采用具有表1所给组成物Ⅰ的培养基。
当采用Rubiaakane（茜草）植物的细胞来生产蒽醌染料时，采用具有表1给出的组成物J的培养基。
作为例子，实施本发明的培养方法采用下述的培养装置是较佳的。
参见图1，本发明的培养装置至少由第一培养罐10和第二培养罐20组成。培养罐10和20通过主连通管30连续地或间歇地彼此连结。贮于第一培养罐10的培养溶液是培养基的部分，并和包含在所述的培养溶液中的培养物质一起，通过所述的管30，从第一培养罐传输至第二培养罐。在本发明的具体例子中，培养溶液的输送，通过主输送管道30上阀门进行。
用作液体培养基的培养溶液贮于第一和第二培养罐中的每一个。每一培养溶液的条件由第一和第二培养基的给定装置所控制，以适合细胞生长和所需的有用物质的生产。
在图1表示的实例中，采用培养介质供应管11和21作为培养介质条件给定装置，通过它，培养溶液所构成的含有营养的培养基，如上面所描述的，连续或间歇地馈入相应的第一和第二培养罐10和20。
该培养基条件调节装置包括一个用于调节培养介质溶液组分的装置;控制培养基温度的装置（图中未表明）;空气供应管13和23以调节在培养介质中所含的氧气含量;搅拌装置14和24用于搅拌培养溶液等。在本发明中，通过培养条件调节装置，在第一培养罐和第二培养罐之间给定不同的培养基条件。具体地说，在罐之间该培养溶液组成上只是不同地调节的。在第一个培养罐10中，该培养介质是适合于细胞生长或增殖的条件，而在第二个培养容器20中，该培养介质是适合于所需有用物质生产的条件。
培养罐10和20相应地配备有培养溶液放料门15和25。过滤器16和26相应地固定在放料门15和25上。来自培养混合物的不包含培养组织的培养溶液可以通过放料门从罐内排放到罐外。作为过滤器16和26可用具有孔的金属网或合成树脂或布料制成的网，也可以采用天然或合成纤维。眼网尺寸或孔径尺寸可以使培养组织在其中不能通过，但能让培养溶液在其中通过为度。在采用组合的网的过滤器的情况下，如果需要，可以采用二层或多层彼此叠合的过滤器。具有过滤器的放料门15可以固定配置在培养容器10和20中的任何位置，通过其中的提供的开口和培养溶液接触。然而，由于培养溶液的更新应有效地进行，因此位于此点的每一放料门15和25需远离每一进料门（管11和21的开口端）用于导入培养基。如果需要，可以采用插入管作为细胞沉降管代替该过滤器，所述的管具有给定溶液的流速的直径，即：这样的直径可使排放速度低于细胞沉积的速度。
在图1表示的具体例子中，在第一培养罐10提供的放料门15通过辅助连结管32与第二培养罐20连结。该传输通过在管子32上的阀门33控制。
用在本发明培养方法中的培养装置的第二培养罐20具有在完成培养后排放培养混合物（培养溶液和培养组织）的放料管40。
如上述提及的搅拌装置，可以采用回转式旋转培养罐，它几乎没有通过诸如剪切力的外力的作用而损害细胞，如在我们的-Copending日本专利申请号103938/1984或如在日本专利Laid-Open公开号134989/1983所揭示的滚动回转筒型培养装置。
在本发明中在主要连结管30上可提供一个或多个中间培养罐和有条件在中间容器中贮存培养介质，其中的培养条件调节在第一和第二培养罐的培养条件之间。
根据本发明的培养方法和培养装置，比用传统的方法可以提高单位容器容量的培养组织的得率。这样，以工业规模进行组织培养时，可以比传统方法以高的效率经济上有利的方式生产培养的组织。
以下实施例将更详细地说明本发明。
实施例1
采用一台具有空容积为4.5立方米的，配置具有1平方米过滤面积的100目不锈钢过滤器和具有孔尺寸为2微米的表面积为0.5平方米的分布管的第一培养罐，以及一台空容积为5.5立方米的并配置过滤器的第二培养罐。具有这二台设备的一套装置用水蒸汽于125℃消毒30分钟。将含有3%蔗糖的3立方米的Linamaier-skoog液体培养基（以下简单称为LS介质），它用热交换器型式的连续消毒器消毒后，放入第一培养罐中，然后保持在25。
（日本黄连属）（Coptia    japonica）（在LS介质中培养14天得到的）细胞作为种子细胞，馈入第一培养罐以得到4克/立升的浓度数量。在其中导入0.5vvm空气，培养进行10天以得到含有细胞浓度15克/立升培养溶液。从第7天开始每隔二天将表1所示的培养基D馈入第一培养罐以保持在培养溶液中的蔗糖在0.5至1%的浓度。培养溶液通过过滤器得到等量的不含细胞的培养溶液。该溶液传输至第二培养罐使该培养溶液在第一培养罐中保持3立方米。从第12天开始，每隔大约1小时，该培养混合物（含有培养细胞物质的培养溶液）以相应增殖细胞的数量传输至第二培养罐，保持在第一培养容器中在培养溶液的细胞为14至16 克/立升的浓度。除此之外的操作为：在第一培养罐中过量的培养溶液（相当于超过了3立方米的量通过过滤器传输到第二培养容器。在第二罐中，通过过滤器得到的无细胞的培养溶液可从罐排放以保持培养溶液的数量在4立方米水平。以这种方式，在第19天细胞浓度达到15克/立升。
然后停止从第一罐向第二罐传输无细胞的培养溶液并放出含有细胞的培养溶液，开始保持第二罐中的细胞浓度在13至17克/立升。在这种状况下，培养继续大约二个月。在培养周期期间，从第一和第二罐各取培养混合物的小样。分析试样以测定细胞生长率和小檗碱的含量。从它们的平均值计算产率。在该实施例中，该产率是以7立方米培养溶液为基础计算的，它是第一和第二罐中的总的数量。
其结果示于表2。
实施例2
除了细胞浓度定为30克/立升以及连续从第一罐放出至第二罐馈入无细胞培养溶液，直到培养被终止外，重复实施例1的生产过程，在种子细胞放入后（接种）后的第18天以后，细胞浓度从28至32克/立升自第26天始，开始从第二容器排放细胞。
其结果示于表2
实施例3
除了细胞浓度定为70克/立升和含有1%蔗糖的LS培养基以及既无磷酸又无植物激素外，馈入第二罐以得到在第二罐中含有蔗糖浓度为从0至0.2%的培养溶液外，重复实施例1的流程。
在种子细胞放入（接种）后的第26天，细胞浓度达到66至73克/立升，并从自第34天始，从第二罐开始排放细胞。
其结果示于表2。
对比实施例1
采和实施例1中的第一培养罐以及进行培养并以实施例1描述的相同方法开始。在第十二天，细胞浓度达到15克/立升。然后每隔约一小时，以相应于增长细胞的数量放出培养混合物回收细胞，保持细胞在14至16克/立升的浓度。该细胞/无细胞培养溶液通过过滤器排放而控制排放率保持在培养溶液的数量在3立方米的水平。
其结果示于表2
对比实施例2和3
除了细胞浓度相应地为30克/立升和70克/立升外，重复实施例1的流程。
其结果示于表2。
表1
单位    A    B    C    D    E    F    G    H    I    J
NH4HO3mM 21 6 21 12 21 9 - - 12 9
KHO3mM 19 19 19 10 19 9 3.3 7 10 9
NaNO3mM - 19 - - - - - - - -
CaCl2·2H2O mM 3 1.0 3 2.9 3 1.5 1.3 2.9 2.9 1.5
MgSO4·7H2O mM 3 1.5 3 2.5 1.5 0.8 2.9 3 2.5 0.8
KH2PO4mM 1.3 1.2 1.3 2.5 1.4 5 0.1 0.1 - 0.5
Kl    μM    5    -    5    5    5    -    5    -    5    -
H3BO3μM 100 30 100 100 100 160 24 72 100 160
MnSO4·4H2O μM 100 98 100 100 100 112 30 - 100 112
ZnSO4·7H2O μM 30 30 30 30 30 35 10 10 30 35
Na2MoO4·2H2O μM 1 1 1 1 1 1 0.1 - 1 1
CuSO4·5H2O μM 0.1 0.1 1 1 0.1 0.1 1 1.2 1 0.1
CoCl2·6H2O μM 0.1 - 0.1 0.1 0.1 - - - 0.1 -
Na3EOTA μM 100 - 100 90 100 100 - - 90 100
FeSO4·7H2O μM 100 100 100 90 100 100 6 4.3 90 100
KCl    mM    -    -    -    -    -    -    0.9    -    -    -
肌醇    ppm    100    100    100    100    100    100    -    -    100    100
硫胺素    ppm    0.4    0.4    0.4    0.4    1    0.5    0.1    -    0.4    0.5
甘氨酸    ppm    -    -    -    -    2    2    3    -    -    2
L-谷氨酰胺    pmm    -    -    -    -    -    -    -    -    -    -
尼克酸    ppm    -    -    -    -    0.5    5    0.5    -    -    5
吡哆素    pmm    -    -    -    -    0.5    0.5    0.1    -    -    0.5
IAA（吲哚乙酸）    μM    1    -    1    -    -    -    -    10    -    -
激动素    μM    10    -    10    -    -    -    -    -    -    -
NAA（萘乙酸）    μM    -    -    -    10    -    -    -    -    -    -
HA（苄腺嘌啉）    μM    -    -    -    0.01    10    10    -    -    -    -
2，4D（2，4-二    μM    -    -    -    -    1    1    -    -    -    -
氯苯氧乙酸）
蔗糖    %    3    3    3    2    3    2    3    3    1    1
表2
实施例1    实施例2    实施例3
第一罐
细胞浓度（公斤/立方米）    15    30    70
比增殖速度μ（1/日）    0.23    0.24    0.24
第二容器
细胞浓度（公斤/立方米）    15    30    70
比增殖速度μ（1/日）    0.05    0.05    0.07
小檗碱比例（%）    10    9    8
细胞得率（公斤/日）    13.4    27.6    70
小檗碱得率（公斤/日）    7.3    2.5    5.6
每单位容积小檗碱得率    0.19    0.36    0.8
（公斤/立方米·日）
对比实施例1    对比实施例2    对比实施例3
细胞浓度（公斤/立方米）    15    30    70
比增殖速度μ（1/日）    0.16    0.21    0.17
小檗碱比例（%）    4.6    3.9    4.8
细胞收率（公斤/日）    8.1    18.9    35.7
小檗碱收率（公斤/日）    0.37    0.74    1.71
每单位容积小檗碱的收率
（公斤/立方米·日）    0.12    0.25    0.57

Claims (4)

1、一种在培养液中培养细胞或植物组织以生产小檗碱的方法，其特征在于：
(a)在第一和第二个包含培养溶液的彼此连通的培养罐中，供给毛艮科植物的细胞或组织，
(b)使第一培养罐的培养基溶液中选自包括糖、磷酸盐离子和氮源中的至少一种营养组分较高于第二培养罐中的培养液组分的浓度，以保持第一培养罐适于所述细胞或组织的生长的培养条件，
(c)使在第二培养罐中的培养溶液的相同的营养成分浓度较低于第一培养罐中的培养溶液的营养成分的浓度，以保持第二培养罐，适于从所述的细胞或组织生产小檗碱，
(d)补充替换液体培养基以及由此保持在第一培养罐的培养液中的所述营养组分的浓度，并且同时将在第一培养罐中的部分培养溶液与所述的细胞一起馈入第二培养罐，
(e)调节馈入到所述第一培养罐的培养溶液的馈入速率为(Vml)[1/日]、在第一培养罐的细胞或组织的比增殖速度(μ)在0.1-0.5/日的范围和在第一培养罐的培养溶液的数量(v)需满足μ＞τ毫升/v＜20μ的关系，以及
(f)将部分细胞和组织与含小檗碱的培养液从第二培养罐排出，并从中回收小檗碱。
2、如权利要求1所述的培养方法，其特征在于含有至少一种选自所述营养成份的液体介质被馈入至第二培养罐以保持所述的营养成分的浓度。
3、如权利要求1所述的培养方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）从第一培养罐排出部分培养溶液，
（2）从其中基本上除去所有的细胞或组织，
（3）将基本上没有细胞或组织的步骤（2）的溶液输至第二培养罐。
4、如权利要求3所述的培养方法，其特征在于通过过滤第一培养罐的培养溶液除去步骤（2）的细胞和组织，并且该细胞或组织基本上留在过滤器上。
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