CN1058288C

CN1058288C - 一种隐孔菌菌粉的生产方法

Info

Publication number: CN1058288C
Application number: CN 94117227
Authority: CN
Inventors: 华启洪; 金国梁; 孙静
Original assignee: 华启洪; 金国梁; 孙静
Current assignee: Zhejiang Cifu Pharmaceutical Co., Ltd.
Priority date: 1994-10-15
Filing date: 1994-10-15
Publication date: 2000-11-08
Anticipated expiration: 2014-10-15
Also published as: CN1121111A

Abstract

本发明提供了一种隐孔菌菌粉的生产方法。隐孔菌菌丝在23-30℃、pH为4-7的培养基中培养6-7天；移入带培养液的烧瓶中振荡培养5天(频率150-220rpm、温度23-30℃)；用压差法将菌丝液移入带培养液的种子罐中培养48h[通风量1∶0.2-1.0(v/v分钟)，叶轮搅拌速度100-200rpm，罐压0.5-1.0kg/cm²，温度23-30℃]；将种子罐培养的菌丝液装入带培养液的发酵罐发酵4天(通风量1∶0.2-0.6(v/v分钟)，叶轮搅拌速度100-200rpm，罐压0.5-1.0kg/cm²，温度23-30℃)，经烘干、粉碎、过筛得到隐孔菌菌粉。

Description

一种隐孔菌菌粉的生产方法

本发明涉及微生物的生产方法，特别是一种隐孔菌菌粉的生产方法。

隐孔菌【Cryptoporus volvatus(peck)Hubbard】属于非褶菌目，多孔菌科，隐孔菌属，只有单一的一个隐孔菌种。具有平喘、止咳、祛痰、抗过敏、抗感染等药用功效，是一种高效、低毒、无副作用的药物。其植物形态、生长环境、生物学特性、药用功效等已在国内外文献杂志中作过多次报道，如：《药用真菌隐孔菌的生物学特性研究》(作者：华启洪、孙静、沈礼，“中国中药杂志”1991年第16卷第12期)；《中药隐孔菌挥发油成分研究》(作者：华启洪、金国梁、沈礼，“中国药学杂志”1993年第28卷第2期)；《中药隐孔菌的化学成分》作者：华启洪、金国梁，“植物资源与环境”1933.2(1)60-61页)。《隐孔菌生产的抗肿瘤多糖》(Antitumor polysaccharigdesproduced by Cryptoporus)[作者：Usno，Saburo等，japen，kekai 78 94，021，1978；C.A.Vol，89，19540gh)。《隐孔菌生长所需要的营养素》(Nulrilional reguirents forgrowth of Cryptoporus volvalus)【作者：Peffey，ThomasM.Can.J.Bot.1989.67(8)，2532-4，1989；C.A.Vol.III.211745v】。《云南本草》(作者：兰茂，云南人民出版社出版，)【见附件】。野生隐孔菌在黑龙江、河北、湖北、福建、广东、广西、海南岛、四川、云南、西藏、陕西、吉林、浙江、江西等省均有分布，但比较分散，采集加工困难，而且药源数量稀少。隐孔菌菌种可由野生隐孔菌经组织分离、驯化培养获得，也可以直接向中国科学院昆明植物研究所购买(见附件证明)，因此隐孔菌已经多次在国内外期刊文献中使用，为本领域的专业人员所熟知，菌种也可以任意购得，可以认为隐孔菌菌种是公众能够得到的，所以该菌种的生产方法申请专利时，不需要提交中国专利局指定的单位保藏。我国支气管哮喘的患病率占总人口的5.29％左右，达四、五千万人之多，且尚有日益增多的趋势，目前临床上使用的药物有一定的副作用和毒性，尤其对心血管的副作用更大，虽然隐孔菌具有很好的平喘、止咳功效，且低毒无副作用，可以成为一种优良的平喘、止咳药物。但尚未有工业化规模生产隐孔菌药物的报导。

本发明的目的就是要提供一种隐孔菌菌粉的规模化生产方法。

本发明的任务是以如下方式完成的：

一种隐孔菌菌粉的生产方法，其特点在于：

(a)将保存在4±1℃条件下的已知隐孔菌菌种【Cryptoporusvolvalus(peck)Hubbard】通过无菌操作移植到下述培养基中，在23-30℃条件下活化培养6-7天，

培养基的组分和含量为：

葡萄糖 10-50g

玉米粉 5-20g

酵母粉 0.5-2g

KH₂PO₄ 0.5-2g

MgSO₄ 0.2-1g

VB₁ 3.0-5.0mg

琼脂 20g

水 1000ml

上述培养基的PH值为4-7，消毒灭菌，然后

(b)将上述活化后的隐孔菌菌丝移入内装200-250ml下述培养基的1000ml三角烧瓶中，在振荡频率为150-220rmp、温度为23-30℃条件下在旋转式摇瓶机中振荡培养5天，

培养基的组分及含量为：

葡萄糖 20-50g

玉米粉 10-20g

酵母粉 1-3g

KH₂PO₄ 0.1-1g

MgSO₄ 0.05-0.5g

VB₁ 3.0-5.0mg

水 1000ml

上述培养液的PH值为4-7，消毒灭菌，然后

(c)在100l³的种子罐中装入等于或小于70％罐容量的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量5-10％摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.2-1.0(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为100-200rpm，罐压0.5-1.0kg/cm²，温度23-30℃条件下培养48h，

培养液的组分及含量为：

葡萄糖 50-400g

玉米浆 4-15g

蛋白胨 1-8g

酵母膏 1-3g

KH₂PO₄ 0.5-2g

MgSO₄ 0.25-1.0g

(NH₄)₂SO₄ 2-8g

水 1000ml

上述培养液的PH值为4-7，消毒灭菌，然后

(d)在1000l³-5000l³的发酵罐中装入等于或小于70％罐容量的下述培养液，再装入5-10％罐容量的种子罐培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.2-0.5(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为100-200rpm，罐压0.5-1.0kg/cm²，温度为23-30℃条件下培养发酵4天，

培养液的组分及含量为：

葡萄糖 50-400g

玉米浆 4-15g

蛋白胨 1-8g

酵母膏 1-3g

KH₂PO₄ 0.5-2g

MgSO₄ 0.25-1.0g

(NH₄)₂SO₄ 2-8g

水 1000ml

上述培养液的PH值为4-7，消毒灭菌，然后

(e)将上述发酵罐内的隐孔菌菌丝液体压滤，所得隐孔菌菌丝体滤饼在70-100℃条件下烘干、粉碎、过筛得到颗粒小于60目的隐孔菌菌粉。

本发明方法和已知技术相比，所采用的隐孔菌菌种易得，由于它通过三级通气发酵进行自我繁殖而被大量获得，其得率达到0.4-1.2％。本发明方法所采用的培养基，培养液中的碳源和氮源组分价格很便宜、含量也不高，因此生产成本很低。将用本发明方法生产的隐孔菌菌粉装入胶囊即可构成《平喘胶囊》药物，按年产隐孔菌菌粉4T计，可生产57万盒平喘胶囊(0.299×24/盒＝6.96g/盒)，每盒成本约3元，出厂价为21元/盒，税后利润为14.94元/盒，总利润为850万元。按我国4-5千万病人中有1％，服平喘胶囊一个疗程(9粒×15天)计，每年预计销售量为240万盒，总年利润约3600万元，因此具有很好的经济效益。本发明方法无污染，因此也有很好的环境效益。

用本发明方法生产的隐孔菌菌粉所作的药理试验如下：试验单位：(浙江医科大学杭州分校)

1、镇咳试验：

实验方法：小白鼠氨水引咳法

组别	动物数只	剂量克/公斤	咳嗽次数次/分X±SD	P值	镇咳百分率(％)
组别	动物数只	剂量克/公斤	咳嗽次数次/分X±SD	P值	镇咳百分率(％)	对照组可待因组小剂量组大剂量组	891010	1^※50^※※1.182.38	11.12±10.380.66±1.411.6±2.061.1±1.72	＜0.05＜0.05＜0.05	94.0685.6190.10

※5％阿拉伯树胶1毫升/公斤。

※※可待因50毫克/公斤

实验结果表明，小白鼠服本发明方法生产的隐孔菌菌粉后，其在统计学上的P值小于0.05，表明镇咳效果显著，以大剂量试验的效果为最佳。

2、祛痰作用

实验方法：采用小白鼠酚红法。

组别	动物数	剂量(克/公斤)	洗出液酚红浓度(微克/毫升)X±SD	P值
组别	动物数	剂量(克/公斤)	洗出液酚红浓度(微克/毫升)X±SD	P值	对照组	9	1^※	2.23±0.81
小剂量组	8	1.19	3.94±0.76	＜0.01	对照组	9	1^※	2.23±0.81
小剂量组	8	1.19	3.94±0.76	＜0.01	中剂量组	9	2.38	4.11±2.73	＜0.01
高剂量组	9	4.76	6.31±3.25	＜0.01	中剂量组	9	2.38	4.11±2.73	＜0.01

※5％阿拉伯树胶1毫升/公斤。

实验结果表明，用本发明方法生产的隐孔菌菌粉其祛痰效果很好，小、中、大剂量组在统计学上的P值均小于0.01，具有非常显著的效果。

3、平喘作用

实验方法采用药物性豚鼠哮喘模型，药物引喘法

组别	动物数	剂量(克/公斤)	III级反应潜伏期T2-T1(S)X±SD	P值
组别	动物数	剂量(克/公斤)	III级反应潜伏期T2-T1(S)X±SD	P值	菌粉水煎液I	7	0.156	7.4±44.1	＞0.05

菌粉水煎液II	9	0.208	35.55±43.11	＜0.01
菌粉水煎液II	9	0.208	35.55±43.11	＜0.01	菌粉水煎液III	6	2.38	246.25±71.2	＜0.01

实验表明，剂量在208毫克/公斤和2380毫克/公斤时，在统计学上的P值均小于0.01，表明本发明方法生产的隐孔菌菌粉的平喘效果非常显著。

4、对豚鼠卵蛋白过敏性哮喘的拮抗作用

实验立法采用豚鼠过敏性支气管痉挛试验法。

组别	动物数	剂量毫升	反应级数X土SD	P值
组别	动物数	剂量毫升	反应级数X土SD	P值	对照组	10	2^※	1.9±0.87
实验组	10	2^※※	0.9±0.56	＜0.01	对照组	10	2^※	1.9±0.87

※生理盐水

※※含(生药)39.21毫克/毫升

实验表明，本发明方法生产的隐孔菌菌粉对抗过敏的作用非常显著，其在统计学上的P值小于0.01。

5、隐孔菌菌粉毒性试验

(1)急性毒性试验(LD_5.0)

口服(粉剂)

LD₅₀＞66克/公斤，最大耐授量39克/公斤～50.7克/公斤腹腔注射(水煎剂)

30.98毫克/公斤，22.77毫克/公斤

(2)长期毒性试验(三个月)

实验结果：服药三个月后血液学检查和血清生化测定的各项指标都正常，病理切片观察，无异常发现，证明菌粉对心、肝、肾、脾、脑、睾丸或卵巢和造血系统等25个器官组织均无毒性反应。

6、临床资料

病例采自杭州市一院内科门诊成年及13岁以下支气管哮喘的患者。11例均为反复发作性或长期持性呼吸困难伴有肺部哮鸣音者。服用本发明方法生产的隐孔菌菌粉胶囊，成人每日三次，每次服三颗(每颗含隐孔菌菌粉0.29g)，儿童减半，服2-3周为一个疗程，随后评定效果。

试验结果，本组11例治后止咳、祛痰、平喘显效高达81.8％，好转者9.2％，其中显效者经随访二个月临床症状无发作，且两肺哮鸣音消失。11例患者治疗前后测得CAMP及其比值(CAMP/CGMP)相比较有明显差异(P＜0.05)，治疗后显见CAMP增高。临床试验结果表明，其疗效与药理试验的结果完全一致。表明本发明方法生产的隐孔菌菌粉作为药物具有很好的社会效益。

以下提供用本发明方法生产隐孔菌菌粉的三个实施例。

实施例一

(a)将保存在5℃条件下的已知隐孔菌菌种【Cryptoporusvolvatus(peck)Hubbard】通过无菌操作移植到下述培养基中，在23℃条件下培养6天，菌丝已长满整个斜面。

培养基配方

葡萄糖 10g

玉米粉 5g

酵母粉 0.5g

KH₂PO₄ 0.5g

MgSO₄ 0.2g

VB₁ 3.0mg

琼脂 20g

水 1000ml

上述培养基配方PH值为4

菌丝生长情况：菌丝灰白色，纤细、稀疏、生长缓慢，生长势较差，

(b)将上述活化隐孔菌菌种的菌丝移入内装200ml下述液体培养基的1000ml三角烧瓶中，用旋转式摇瓶机振荡培养，振荡频率为100rpm，在23℃条件下振荡培养5天。菌丝生长缓慢，培养基中形成一定数量的菌球，

液体培养基配方

葡萄糖 20g

玉米粉 10g

酵母粉 1g

KH₂PO₄ 1g

MgSO₄ 0.5g

VB₁ 3.0mg

水 1000ml

上述培养基的PH值为4

(c)在100l³的种子罐中装入60％罐容量的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量5％摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.2(v/v分钟)叶轮搅拌速度为100rpm，罐压为0.5公斤/cm²，温度为23℃条件下培养48h，

培养液的配方为：

葡萄糖 50g

玉米浆 4g

蛋白胨 1g

酵母膏 1g

KH₂PO₄ 0.5g

MgSO₄ 0.25g

(NH₄)₂SO₄ 2g

水 1000ml

上述培养液的PH值为4，消毒灭菌，然后

(d)在1000ml的发酵罐中装入60％罐容量的下述培养液，再装入5％罐容量的种子罐培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.2(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为100rpm，罐压为0.5公斤/cm²，培养温度为22℃，发酵培养4天，

培养液配方为

葡萄糖 50g

玉米浆 4g

蛋白胨 1g

酵母膏 1g

KH₂PO₄ 0.5g

MgSO₄ 0.25g

(NH₄)₂SO₄ 2g

水 1000ml

上述培养液的PH值为4，消毒灭菌，然后

(e)将上述发酵罐内的隐孔菌菌丝液用板框压滤，得到隐孔菌菌丝体的滤饼，在80℃的烘房内烘干，经过粉碎，用60目筛子过筛得到隐孔菌菌粉，其得率为0.4-0.5％。

实施例二

(a)将保存在4℃条件下的已知隐孔菌菌种【Cryptorusvolvatus(peck)Hubbard】通过无菌操作移植到下述培养基中，在26℃条件下培养6天，菌丝已长满整个斜面培养基，

培养基配方

葡萄糖 35g

玉米粉 10g

酵母粉 1g

KH₂PO₄ 1g

MgSO₄ 0.5g

VB₁ 4.6mg

琼脂 20g

水 1000ml

上述培养基的PH值为6

菌丝生长情况：菌丝生长十分旺盛，菌丝粗壮，纯白色，气生菌丝浓密，生长势好，

(b)将活化的隐孔菌菌种的菌丝移入内装250毫升下述培养基的1000ml的三角烧瓶中，用旋转式摇瓶机振荡培养。振荡频率为150rpm，在26℃条件下振荡培养5天、菌丝生长快，培养基中菌丝浓，菌球大小均匀，直径约0.3-0.4mm，培养液清、淡黄色，

培养基配方

葡萄糖 35g

玉米粉 15g

酵母粉 2g

KH₂PO₄ 0.5g

MgSO₄ 0.1g

VB₁ 4.6mg

水 1000ml

上述培养基的PH值为6，消毒灭菌，然后

(c)在100l³种子罐中装入70％罐容量的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量10％摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.3(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为150rpm，罐压为1kg/cm²，温度为26℃条件下培养48h，

培养液的配方为

葡萄糖 350g

玉米浆 10g

蛋白胨 5g

酵母膏 2g

KH₂PO₄ 1g

MgSO₄ 0.5g

(NH₄)₂SO₄ 5g

水 1000ml

上述培养液的PH值为6，消毒灭菌，然后

(d)在5000l³的发酵罐中装入70％罐容量的下述培养液，再装入10％罐容量的种子罐培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.3(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为150rpm，罐压为1kg/cm²，培养温度为26℃，发酵培养4天，发酵产物有浓郁芳香扑鼻的挥发性气味，颜色棕色，

培养液配方

葡萄糖 350g

玉米浆 10g

蛋白胨 5g

酵母膏 2g

KH₂PO₄ 1g

MgSO₄ 0.5g

(NH₄)₂SO₄ 5g

水 1000ml

上述培养液的PH值为6，消毒灭菌，然后

(e)将上述发酵罐内的隐孔菌菌丝液体用板框压滤，得到隐孔菌菌丝体滤饼，在90℃的烘房内烘干，经粉碎并用60目筛子过筛，得到隐孔菌菌粉，本实施例隐孔菌菌粉的得率高达1.2％，所用培养液组分的含量居中，生产成本也最低。

实施例三

(a)将保存在3℃条件下的已知隐孔菌菌种【Cryptoporusvolvatus(peck)Hubbard】通过无菌操作移植到下述培养基中，在30℃条件下培养7天，

培养基配方

葡萄糖 50g

玉米粉 20g

酵母粉 2g

KH₂PO₄ 2g

MgSO₄ 1g

VB₁ 5.0mg

琼脂 20g

水 1000ml

上述培养基的PH值为7

菌丝生长情况：菌丝生长较快，菌丝纤细，稀疏，灰白色，生长势较差。

(b)将上述活化隐孔菌菌种的菌丝移入内装250毫升已灭菌的下述培养液的1000ml三角烧瓶中，用旋转式摇瓶机振荡培养，振荡频率为200rpm，在30℃条件下振荡培养5天，菌丝生长情况比实施例二差，

培养基配方

葡萄糖 50g

玉米粉 20g

酵母粉 3g

KH₂PO₄ 0.1g

MgSO₄ 0.05g

VB₁ 5.0mg

水 1000ml

上述培养基的PH值为7，消毒灭菌，然后

(c)在100l³的种子罐中装入65％罐容量的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量7％摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.6(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为200rpm，罐压为1kg/cm²，温度为30℃的条件下培养48h，

培养液配方

葡萄糖 400g

玉米浆 15g

蛋白胨 8g

酵母膏 3g

KH₂PO₄ 2g

MgSO₄ 1g

(NH₄)₂SO₄ 8g

水 1000ml

上述培养液PH值为7，消毒灭菌，然后

(d)在1000l³发酵罐中装入65％罐容量的下述培养液，再装入7％罐容量的种子罐培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.6(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为200rpm，罐压为1kg/cm²，培养温度为30℃条件下发酵培养4天，

培养液配方

葡萄糖 400g

玉米浆 15g

蛋白胨 8g

酵母膏 3g

KH₂PO₄ 2g

MgSO₄ 1g

(NH₄)₂SO₄ 8g

水 1000ml

上述培养液PH值为7

(e)将所得发酵液经板框压滤得隐孔菌菌丝体滤饼，在100℃烘房烘干，经粉碎，用60目筛子过筛，得到隐孔菌菌粉。

本实施例的碳源和氮源的用量均较高，培养基PH值偏高，培养温度取上限，生产得率不高，只有0.4-0.5％。

Claims

1、一种隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于：

(a)将保存在4±1℃条件下已知的隐孔菌菌种【Cryptoporusvolvatus(peck)Hubbard】通过无菌操作移植到下述培养基中，在23-30℃条件下活化培养6-7天，

培养基的组分和含量为：

葡萄糖 10-50g

玉米粉 5-20g

酵母粉 0.5-2g

KH₂·PO₄ 0.5-2g

MgSO₄ 0.2-1g

VB₁ 3.0-5.0mg

琼脂 20g

H₂O 1000ml

上述培养基的PH值为4-7、消毒灭菌，然后，

(b)将上述活化后的隐孔菌菌丝移入内装200-250ml下述培养液的1000ml三角烧瓶中、在振荡频率为150-220rmp、温度为23-30℃条件下在旋转式摇瓶机中振荡培养5天，

培养液的组分和含量为：

葡萄糖 20-50g

玉米粉 10-20g

酵母粉 1-3g

KH₂PO₄ 0.1-1g

MgSO₄ 0.05-0.5g

VB₁ 3.0-5.0mg

水 1000ml

上述培养液的PH值为4-7、消毒灭菌，然后

(c)在100l³的种子罐中装入等于或小于70％罐容量的下述培养液，用压差法移接相当于罐容量5-10％摇瓶培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.2-1.0(v/v分钟)、叶轮搅拌速度为100-200rpm、罐压0.5-1.0kg/cm²，温度23-30℃条件下培养48h，

培养液的组分及含量为：

葡萄糖 50-400g

玉米粉 4-15g

蛋白胨 1-8g

酵母膏 1-3g

KH₂PO₄ 0.5-2g

MgSO₄ 0.25-1g

(NH₄)₂SO₄ 2-8g

水 1000ml

上述培养液的PH值为4-7，消毒灭菌，然后

(d)在1000-5000l³的发酵罐中装入等于或小于70％罐容量的下述培养液，再装入5-10％罐容量的种子罐培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.2-0.6(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为100-200rpm，罐压0.5-1.0kg/cm²，温度为23-30℃条件下培养发酵4天，

培养液的组分及含量为：

葡萄糖 50-400g

玉米浆 4-15g

蛋白胨 1-8g

酵母膏 1-3g

KH₂PO₄ 0.5-2g

MgSO₄ 0.25-1g

(NH₄)₂SO₄ 2-8g

水 1000ml

上述培养液的PH值为4-7，消毒灭菌，然后

2、根据权利要求1所述的隐孔菌菌粉的生产方法，其特征在于：

(a)将保存在4℃条件下的已知隐孔菌菌种通过无菌操作移植到下述培养基中，在26℃条件下培养6天，

培养基配方

葡萄糖 35g

玉米粉 10g

酵母粉 1g

KH₂PO₄ 1g

MgSO₄ 0.5g

VB₁ 4.6mg

琼脂 20g

水 1000ml

上述培养基的PH值为6

(b)将活化的隐孔菌菌种的菌丝移入内装250ml下述培养基的1000ml的三角烧瓶中，用旋转式摇瓶机振荡培养，振荡频率为150rmp，在26℃条件下振荡培养5天

培养基配方

葡萄糖 35g

玉米粉 15g

酵母膏 2g

KH₂PO₄ 0.5g

MgSO₄ 0.1g

VB₁ 4.6mg

水 1000ml

上述培养基的PH值为6，消毒灭菌，然后

培养液的配方为：

葡萄糖 350g

玉米浆 10g

蛋白胨 5g

酵母膏 2g

KH₂PO₄ 1g

MgSO₄ 0.5g

(NH₄)₂SO₄ 5g

水 1000ml

上述培养液的PH值为6，消毒灭菌，然后

(d)在5000l³的发酵罐中装入70％罐容量的下述培养液，再装入10％罐容量种子罐培养的隐孔菌菌丝液，在通风量为1∶0.3(v/v分钟)，叶轮搅拌速度为150rpm，罐压为1kg/cm²，培养温度为26℃，发酵培养4天，

培养液配方为

葡萄糖 350g

玉米浆 10g

蛋白胨 5g

酵母膏 2g

KH₂PO₄ 1g

MgSO₄ 0.5g

(NH₄)₂SO₄ 5g

水 1000ml

上述培养液的PH值为6，消毒灭菌，然后

(e)将上述发酵罐内的隐孔菌菌丝液体用板框压滤，得到隐孔菌菌丝体滤饼，在90℃的烘房内烘干，经粉碎并用60目筛子过筛，得到隐孔菌菌粉。