CN1375216A - 一种用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及供一种用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺。其工艺流程为:分别将多个产酶菌种和多个益生菌菌种在斜面上培养成熟后,制成孢子悬浮液,再分别将各菌种孢子悬浮液按比例混合,然后分别将种子培养基分别接入产酶和益生菌混合菌种孢子悬浮液,最后种子培养基经过培养长出丰满孢子,将产酶菌种子液和益生菌种子液按比例混合,制成菌酶混合接种剂;混合发酵培养基按一定接种量接入菌酶混合接种剂,接着发酵培养;发酵结束后的产物,经后处理成菌酶制剂。本发明优点是:混合产酶、益生菌发酵,其酶系的产酶量又较混合产酶菌发酵有较大的提高。混合产酶菌与益生菌复合混合发酵,各菌种间这种协同增效作用更大。
Description
技术领域
本发明涉及一种发酵工艺方法，主要是一种用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺。
背景技术
我国饲用酶制剂的研究和开发应用经过十余年的研制开发，取得了很大的进展。特别是近几年来，随着饲料资源短缺问题的日益严重，将麦类及稻谷类谷物用作饲料资源将成为必然趋势，可有效消除这些谷物中抗营养因子的专用酶如木聚糖酶、β-葡聚糖酶等已成为饲料酶制剂的研究热点。益生菌等微生态制剂作为生物饲料添加剂应用于饲料工业，在我国也取得了较大的进展，国内四川、山东等省相继有不同类型的益生菌制剂面市，并在实际应用中显示出较好的效果。但是，迄今为止，饲用酶和益生菌的研究生产尚有许多关键问题急待解决。主要为：1)饲用酶菌种产酶活力不高。目前用于饲用酶生产的各类菌种，基本上采用传统育种手段进行诱变选育，其菌种的产酶水平不可能大幅度提高，酶的抗逆性能如耐高温性能不可能有质的改变。2)发酵方式单一。目前的饲用酶生产大多采用单一菌种，在固体培养条件下，一菌产多种酶系，制成所谓的“复合酶”，造成产品酶系不全或酶系不合理，酶的生产成本较高。3)益生菌的菌系不全面，其产品在运输、使用和保存过程中易失活，从而降低生物活性作用。4)饲用酶和益生菌单独发酵生产，使用时再复合在一起，增加这两种微生物制剂的生产成本，导致应用范围不能扩大。以上这些问题，特别如饲用酶的高效生产和强抗逆性等，虽然从理论上可通过基因重组技术进行改造、克隆并高效表达，构建出优良性能的工程菌。但在实际操作上尚有许多难题不易解决。且构建一个工程菌周期较长，投入也较大。
多菌株混合发酵工艺在益生菌生产上是一种较常规的生产方式。而酶制剂的生产基本上采用单一菌种进行纯培养发酵。饲用酶和益生菌在畜禽养殖上的应用效果均得到了充分的肯定。越来越多的饲料和养殖企业将饲用酶和益生菌作为饲料中基本成分。但由于价格和效益等方面的因素，很少有在饲料中同时加入两种微生物制剂，因而限制了两种制剂的协同增效作用。因此，筛选获得不同酶系高酶活的单一酶产生菌，并采用特殊和有效的手段，进行属内菌种多菌株和不同属间多菌种的混合发酵，获得多种酶系能同时具有高产性状的混合发酵工艺。在此基础上，研究多菌株饲用酶产生菌与多菌株益生菌菌种的复合混合发酵工艺，生产出既含高酶活多酶系复合酶，同时又含有高剂量活菌数益生菌的高效菌酶制剂，是提升饲用酶和益菌生产水平最有效简便的途径。这对提高饲用酶和益生菌在畜禽生产中的应用效果，较大幅度地降低生产成本，促进我国饲用微生物制剂这一无公害饲料添加剂的广泛应用，进而推动养殖业的高效可持续发展具有十分重大的经济意义和深远的社会意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案。这种用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其工艺流程为：1)、将多个产酶菌种单独在PDA斜面上培养成熟后，制成孢子悬浮液，再将各菌种孢子悬浮液按比例混合，然后将产酶种子培养基按一定量接入产酶混合菌种孢子悬浮液，最后接种后的种子培养基经过培养，待培养基中长出丰满孢子后，成熟，待用；2)、将多个益生菌菌种在斜面上单独培养成熟后，制成孢子悬浮液，再将各菌种孢子悬浮液按比例混合，然后将益生菌种子培养基按一定量接入益生菌混合菌孢子悬浮液，最后接种后的种子培养基经过培养成熟，待用；3)、将培养好的产酶混合菌种，注入冷却的无菌水，充分搅拌后的用四层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶菌种种子液；将培养好的益生菌混合菌种，注入冷却的无菌水，充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到益生菌种子液；4)、将产酶菌种子液和益生菌种子液按1∶1比例混合，制成菌酶混合接种剂；混合发酵培养基按一定接种量接入菌酶混合接种剂，接着发酵培养直至发酵结束；5)、发酵结束后的产物，经烘干、粉碎的后处理，即成菌酶制剂。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案还可以进一步完善。
产酶菌种种子准备：1)、将多个产酶菌种单独在PDA斜面上培养，在30℃恒温条件下，经4d长出丰满孢子时，成熟，待用；2)、分别用无菌水将产酶菌种斜面孢子洗下，制成孢子悬浮液，再将各菌种孢子悬浮液按等比例混合；3)、产酶种子培养基，经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％量接入产酶混合菌种孢子悬浮液；4)、接种后的种子培养基在500ml三角瓶中在30℃恒温下，经3d，待培养基中长出丰满孢子后，成熟，作为产酶混合菌种子，待用。
益生菌种子准备：1)、各益生菌种在蛋白胨牛肉膏琼脂斜面上单独培养，在35℃恒温下经3d长出丰满菌落时成熟，待用；2)、分别用无菌水将各益生菌芽孢杆菌孢子洗下，制成孢子悬浮液，再将各菌种孢子悬浮液按比例混合；3)、益生菌种子培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)量接入益生菌混合菌种；4)、接种后的种子培养基在500ml三角瓶中，35℃下经3d培养成熟，作为益生菌混合菌种子，待用。
发酵培养：1)、将培养好的产酶混合菌种子，注入冷却的无菌水，充分搅拌后的用四层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶菌种种子液；2)、将培养好的益生菌混合菌种子，注入冷却的无菌水，充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到益生菌种子液；3)、将产酶菌种种子液和益生菌种子液按1∶1比例混合，制成菌酶混合接种剂；4)、混合发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入菌酶混合接种剂，充分搅拌混匀后，装入500ml三角瓶(每瓶20g)，于30℃培养3d；5)、发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。
所述的后处理是：1)、发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干。2)、烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，按所述酶活性试验方法和活菌数计量法检测后，即成菌酶制剂。
所述的产酶真菌：分别为木聚糖酶产生菌黑曲霉变种No.1、β-葡聚糖酶产生菌黑曲霉变种No.2、酸性蛋白酶产生菌黑曲霉变种No.3及纤维素酶产生菌木霉菌。所述的益生菌：分别为地衣芽胞杆菌、腊状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌及酵母菌。
所述产酶菌种的斜面培养基是马铃薯葡萄糖琼脂斜面，产酶种子培养基配比为麸皮：55％、豆粕：35％、NH4NO3：4％、鱼粉：4％、KH2PO4：2％、水(固∶液)1∶1.15。所述益生菌菌种的斜面培养基配比为葡萄糖：1.0％、蛋白胨：0.5％、牛肉膏0.5％、KH2PO4：0.1％、MgSO4：0.05％、KCL：0.05％、琼脂1.5-2.0％。益生菌种子培养基配比为四号粉：15％、麸皮：40％、豆粕：10％、米糠：20％、玉米粉：15％、蔗糖：0.5～1％、水(固∶液)1∶1.2。所述的混合发酵培养基配比为麸皮70％、豆粕：25％、NH4NO3：2％、鱼粉：2％、KH2PO4：1％、水(固∶液)1∶1.15。
本发明有益的效果是：混合产酶菌较单一产酶菌的产酶活性，木聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶和纤维素酶活性有相应的提高；而混合产酶、益生菌发酵，其酶系的产酶量又较混合产酶菌发酵有较大的提高。混合产酶菌与益生菌复合混合发酵，各菌种间这种协同增效作用更大。
最终的发酵产物为既含高酶活多酶系复合酶，又含有高活菌量的益生菌的菌酶混合制剂。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述。实施例1：
一、菌种培养：
1、产酶真菌培养：取分别为木聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶产生菌的斜面菌种各一支，每支斜面加入20ml无菌水，制成孢子悬浮液。先取每个菌种的孢子悬浮液1ml，分别加入装有产酶发酵培养基的三角瓶中，混匀，作为对比进行单菌株培养。再从每个斜面孢子悬浮液中吸取5ml到一个无菌容器中，混匀，制成产酶多菌株混合种子液。
2、益生菌培养：各取地衣芽胞杆菌、腊状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌和酵母菌斜面一支，每支斜面加入无菌水20ml，制成单一菌种孢子悬浮液。吸取每个斜面孢子悬浮液5ml到一个无菌容器中，混匀，制成益生菌多菌株混合种子液。
3、菌酶混合发酵培养：分别吸取产酶多菌株混合种子液10ml和益生菌多菌种混合发酵液10ml，加入一个无菌容器中，充分混匀，吸取2ml混合种子液，加入装有产酶发酵培养基的三角瓶中，进行产酶菌株与益生菌菌株的多菌种混合发酵培养。
上述单一菌种或多菌种混合发酵培养，均在30℃条件下培养3d。发酵产物经40℃、15h烘干。按酶活性试验方法和益生菌总活菌量计数方法，检测不同产物中的酶活性及总活菌量。
二、结果：见下表
| 处 理 | 酶活力(u/g) 总活菌数 |
| 产木聚糖酶单一菌产β-葡聚糖酶单一菌产酸性蛋白酶单一菌多菌株混合产酶菌混合产酶、益生菌 | 木聚糖酶 β-葡聚糖酶 酸性蛋白酶 (个/g)63850513001820071200 61500 2130073800 63900 22100 1.5-2.5×1010 |
上述结果表明，混合产酶菌较单一产酶菌的产酶活性，木聚糖酶、β-葡聚糖和酸性蛋白酶活性相应分别提高11.5％、20.0％和17％。
而混合产酶、益生菌发酵，其酶系的产酶量又较混合产酶菌发酵相应分别提高3.65％、3.9％和3.75％。
最终的发酵产物为既含高酶活多酶系复合酶，又含有高活菌量的益生菌的菌酶混合制剂。
实施例2：
一、菌种培养：
1、产酶真菌培养：取分别为木聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、纤维素酶产生菌的斜面菌种各一支，每支斜面加入20ml无菌水，制成孢子悬浮液。
先取每个菌种的孢子悬浮液2ml，分别加入经121℃、30min灭菌，装有产酶种子培养基的三角瓶中，混匀，作为对比进行单菌株种子培养。
从每个斜面孢子悬浮液中吸取5ml或者10ml到一个无菌容器中，混匀，制成产酶多菌株混合种子母液。
吸取2ml混合菌种母液，加入经121℃、30min灭菌、装有产酶种子培养基的三角瓶中，充分混匀，进行产酶多菌株混合种子培养。
单一或混合产酶菌种种子在30℃下培养4天，长出丰满孢子，成熟，作为产酶菌种混合菌种子，待用。
2、益生菌培养：
取地衣芽胞杆菌、腊状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、假丝酵母各斜面各一支，每支斜面加入无菌水20ml，制成单一菌种孢子悬浮液。
吸取每个斜面孢子悬浮液5ml或10ml到一个无菌容器中，混匀，制成益生菌多菌株混合种子母液。
吸取益生菌种子母液2ml，加入经121℃、30min灭菌、装有益生菌种子培养基的三角瓶中，充分混匀。
益生菌种子在35℃下培养3天，成熟，作为益生菌混合菌种子，待用。
3、单一产酶菌发酵培养：
1)取已生长成熟的单一产酶菌种子各一瓶，用无菌水制成孢子悬浮液，无菌条件下过滤，过滤液作为各单一产酶菌的接种剂。
2)分别吸取各单一产酶菌接种剂2ml，加入装有产酶发酵培养基的三角瓶中，进行单一产酶菌株的发酵培养。
4、混合产酶菌发酵培养：
1)、取已生长成熟的产酶菌混合菌种子一瓶，用无菌水制成孢子悬浮液，无菌条件下过滤，过滤液作为产酶混合菌的接种剂。
2)吸取2ml产酶混合接种剂，加入装有产酶发酵培养基的三角瓶中，进行产酶菌株的多菌种混合发酵培养。
5、菌酶协同发酵培养：
1)、取已生长成熟的产酶菌混合菌种子一瓶，用无菌水制成孢子悬浮液，无菌条件下过滤，过滤液作为产酶混合菌的接种剂。
2)、取已生长成熟的益生菌混合菌种子一瓶，用无菌水制成孢子悬浮，无菌条件下过滤，过滤液作为益生菌混合菌的接种剂。
3)、分别吸取产酶混合混合菌接种剂10ml和益生菌混合菌接种剂10ml，加入一个无菌容器中，充分混匀，制成菌酶混合接种剂。吸取2ml菌酶混合接种剂，加入装有产酶发酵培养基的三角瓶中，进行产酶菌株与益生菌菌株的多菌种混合发酵培养。
上述单一菌种或多菌种混合发酵培养，均在30℃条件下培养3d。发酵产物经40℃、15h烘干。按酶活性试验方法和益生菌总活菌量计数方法，检测不同产物中的酶活性及总活菌量。
二、结果：见下表
| 处 理 | 酶活力(u/g) 总活菌数木聚糖酶 β-葡聚糖酶 酸性蛋白酶 纤维素酶(个/g) |
| 产木聚糖酶单一菌产β-葡聚糖酶单一菌产酸性蛋白酶单一菌产纤维素酶单一菌多菌株混产酶菌混合产酶、益生菌 | 6830055100191001450074800 63800 22500 1580076900 64700 23800 16200 3.5×1010 |
上述结果表明，混合产酶菌较单一产酶菌的产酶活性，木聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶和纤维素酶活性相应分别提高9.5％、15.8％、17.8％和9.0％。而混合产酶、益生菌发酵，其各酶系的产酶量又较混合产酶菌发酵相应依次提高2.9％、1.4％、5.8和2.5％。
说明，多菌种混合发酵，各菌种间有协同增效作用。混合产酶菌与益生菌混合发酵，这种协同增效作用更大。
最终的发酵产物为既含高酶活多酶系复合酶，又含有高活菌量的益生菌的菌酶混合制剂。
实施例3：
一、菌种培养：
1、产酶真菌培养：取分别为木聚糖酶、β-葡聚糖酶、酸性蛋白酶、纤维素酶产生菌斜面菌种各一支，每支斜面加入20ml无菌水，制成孢子悬浮液。
先取每个菌种的孢子悬浮液2ml，分别加入经121℃、30min灭菌、装有产酶种子培养基的三角瓶中，混匀，作为对比进行单菌株种子培养。
从每个斜面孢子悬浮液中吸取5ml到一个无菌容器中，混匀，制成产酶多菌株混合种子母液。
吸取2ml混合菌种母液，加入经121℃、30min灭菌、装有产酶种子培养基的三角瓶中，充分混匀，进行产酶多菌株混合种子培养。
单一或混合产酶菌种种子在30℃下培养4天，长出丰满孢子，成熟，作为产酶菌种混合菌种子，待用。
2、益生菌培养：
取地衣芽胞杆菌、腊状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌、假丝酵母各斜面一支，每支斜面加入无菌水20ml，制成单一菌种孢子悬浮液。
吸取每个斜面孢子悬浮液5ml到一个无菌容器中，混匀，制成益生菌多菌株混合种子母液。
吸取益生菌混合种子液2ml，加入经121℃、30min灭菌、装有益生菌种子培养基的三角瓶中，充分混匀。
益生菌种子在35℃下培养3天，成熟，作为益生菌混合菌种子，待用。
3、单一产酶菌发酵培养：
1)取已生长成熟的单一产酶菌种子各一瓶，用无菌水制成孢子悬浮液，无菌条件下过滤，过滤液作为各单一产酶菌的接种剂。
2)分别吸取各单一产酶菌接种剂2ml，加入装有产酶发酵培养基的三角瓶中，进行单一产酶菌株的发酵培养。
4、混合产酶菌发酵培养：
1)、取已生长成熟的产酶菌混合菌种子一瓶，用无菌水制成孢子悬浮液，无菌条件下过滤，过滤液作为产酶混合菌的接种剂。
2)吸取2ml产酶混合接种剂，加入装有产酶发酵培养基的三角瓶中，进行产酶菌株的多菌种混合发酵培养。
5、菌酶混合发酵培养：
1)、取已生长成熟的产酶菌混合菌种子一瓶，用无菌水制成孢子悬浮液，无菌条件下过滤，过滤液作为产酶混合菌的接种剂。
2)、取已生长成熟的益生菌混合菌种子一瓶，用无菌水制成孢子悬浮，无菌条件下过滤，过滤液作为益生菌混合菌的接种剂。
3)、分别吸取产酶混合菌接种剂10ml和益生菌混合菌接种剂20ml，加入一个无菌容器中，充分混匀，吸取2ml混合种子液，加入装有产酶发酵培养基的三角瓶中(重复三次)，进行产酶菌株与益生菌菌株的多菌种混合发酵培养。
上述单一菌种或多菌种混合发酵培养，均在28-30℃条件下培养3d。发酵产物经40℃、15h烘干。按酶活性试验方法和益生菌总活菌量计数方法，检测不同产物中的酶活性及总活菌量。
二、结果：见下表
| 处 理 | 酶活力(u/g) 总活菌数木聚糖酶 β-葡聚糖酶 酸性蛋白酶 纤维素酶(个/g) |
| 产木聚糖酶单一菌产β-葡聚糖酶单一菌产酸性蛋白酶单一菌产纤维素酶单一菌多菌株混产酶菌 | 6330051100171001350069800 58800 19500 15800 |
| 混合产酶菌、益生菌 | 72400 62700 20300 16200 3.5×1010 |
上述结果表明，混合产酶菌较单一产酶菌的产酶活性，木聚糖酶、β-葡聚糖、酸性蛋白酶和纤维素酶活性相应分别提高10.3％、15.1％、14％和17％。而混合产酶、益生菌发酵，其酶系的产酶量又较混合产酶菌发酵相应依次提高3.7％、6.6％、4.1和2.5％。
说明，多菌种混合发酵，各菌种间有协同增效作用。混合产酶菌与益生菌混合发酵，这种协同增效作用更大。最终的发酵产物为既含高酶活多酶系复合酶，又含有高活菌量的益生菌的菌酶混合制剂。
木聚糖酶活性的试验方法酶活单位定义：
1单位木聚糖酶活力为在所述条件下，在一分钟内使1微克还原糖(由木糖等同物表示)从底物(木聚糖)中释放出来的酶量。试剂和溶液1. 1％(W/V)木聚糖底物
精确称取木聚糖(Birchwood xylan美国Sigma公司)1.0000g，溶于80蒸馏水中，水浴加热至溶，冷却后转入100ml容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度。此溶液贮存于冰箱内备用(3天内使用有效)。2.磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液：
甲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.2HO2)35.61g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。
乙液：称取柠檬酸(C6H8O7.HO2)21.01g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。
使用溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均匀，用pH计校正至pH为5.0。3.二硝基水杨酸(DNS)试剂：
取酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，2N氢氧化钠262ml，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，混匀，过滤，贮于棕色瓶中，放置1周后使用。
在黑色或棕色瓶中于室温下贮存，该试剂最多稳定6个月。4. 1％木糖标准溶液
称取预先于105℃干燥至恒重的木糖1.0000g，用蒸馏水溶解后定容至100ml，即为1％浓度的木糖标准溶液。
测定步骤
1.标准曲线
用标准木糖溶液制成每ml分别含木糖200、400、600、800、1000、1200μg的稀标准液。用移液管移取不同浓度的稀标准液0.5ml、pH 5.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液1.5ml和DNS试剂3.0ml，搅拌并煮沸，精确至7分钟，取出后立即加入蒸馏水10ml，摇匀。以蒸馏水0.5ml代替木糖稀标准液作为空白对照。冷却后，在波长550nm测吸光度。
绘制木糖浓度对吸光度的函数曲线。对每个新的DNS-试剂制作新的标准曲线。
2.酶样品测定
在50℃下平衡0.5ml酶稀释液和1.0ml pH5.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，加入0.5ml 1％木聚糖底物，搅拌并在50℃下保温，精确至10分钟。加入3.0ml的DNS试剂搅拌并煮沸反应混合物，精确至7分钟。将反应混合物在冷水中冷却至室温，再加入10ml蒸馏水，混匀，并以蒸馏水为对照在550nm测吸光度。
3.酶空白
将0.5ml，1％木聚糖底物在50℃保温10分钟。加入3ml的DNS试剂并搅拌。加入0.5ml酶稀释液和1.0ml pH5.0的缓冲液。煮沸混合物，精确至7分钟。将反应混合物在冷水中冷却至室温，再加入10ml蒸馏水混匀，并以蒸馏水为对照在550nm测吸光度。
酶样品和酶空白之间的吸光度差异应为0.3-0.5。
酶活力计算：按照下式计算样品的木聚糖酶的活力：
其中：
A(X)＝酶样品的吸光度
A(O)＝酶空白的吸光度
K＝标准曲线的斜率
CO＝木糖标准曲线的截距
N-样品的稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g；
0.5-参与反应的酶液量，ml；
10-反应时间，min。
β-葡聚糖酶活性的试验方法
酶活单位定义：1单位β-葡聚糖酶活力是在所述条件下，在1分钟内从底物(β-葡聚糖)中释放1微克还原糖(以葡萄糖对应物表示)的酶量。
试剂和溶液
除特殊规定外，本标准所用试剂均为分析纯，水为蒸馏水或相应纯度的水。
1. 0.5％β-葡聚糖溶液
精确称取β-葡聚糖(从大麦中制取)0.5000g，加入约80ml蒸馏水并加热至沸腾，在用力搅拌下继续煮沸直至葡聚糖溶解，并得到混浊的溶液。连续搅拌将该混浊的溶液冷却至室温，加入蒸馏水将β-葡聚糖浓度调到0.5％(W/V)。通过玻璃纤维滤纸过滤。
该底物可以立即使用，如果贮存于冷冻室中该底物可用2天。
2.磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液
甲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.2HO2)35.61g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。
乙液：称取柠檬酸(C6H8O7.HO2)21.01g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。
使用溶液：取甲液515ml，加乙液485ml混合均匀，用pH计校正至pH为5.0。
3.二硝基水杨酸(DNS)试剂
取酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，2 N氢氧化钠262ml，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，混匀，过滤，贮于棕色瓶中，放置1周后使用。
在黑色或棕色瓶中于室温下贮存，该试剂最多稳定6个月。
4. 1％葡萄糖标准溶液
称取预先于105℃干燥至恒重的无水葡萄糖1.000g，用蒸馏水溶解后定容至100ml，即为1％浓度的葡萄糖标准溶液。
测定步骤
1.标准曲线的制作
用标准葡萄糖溶液制成每ml分别含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200μg的稀标准液。用移液管移取不同浓度的稀标准液0.5ml、pH 5.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液1.5ml和DNS试剂3.0ml，搅拌并煮沸，精确至7分钟，取出后立即加入蒸馏水10ml，摇匀。以蒸馏水0.5ml代替葡萄糖稀标准液作为空白对照。冷却后，在波长550nm测吸光度。
绘制葡萄糖浓度对吸光度的函数曲线。对每个新的DNS-试剂制作新的标准曲线。
2.酶样品测定
在50℃下平衡0.5ml酶稀释液和1.0ml pH5.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液，加入0.5ml 1％葡聚糖底物，搅拌并在50℃下保温，精确至10分钟。加入3.0ml的DNS试剂搅拌并煮沸反应混合物，精确至7分钟。将反应混合物在冷水中冷却至室温，再加入10ml蒸馏水，混匀，并以蒸馏水为对照在550nm测吸光度。
3.酶空白
将0.5ml葡聚糖底物在50℃保温10分钟。加入3ml的DNS试剂并搅拌。加入0.5ml酶稀释液和1.0ml pH5.0的缓冲液。煮沸混合物，精确至7分钟。将反应混合物在冷水中冷却至室温，再加入10ml蒸馏水混匀，并以蒸馏水为对照在550nm测吸光度。
酶样品和酶空白之间的吸光度差异应为0.3-0.5。
酶活力计算：按照下式计算样品的木聚糖酶的活力：
其中：
A(X)＝酶样品的吸光度
A(O)＝酶空白的吸光度
K＝标准曲线的斜率
CO＝葡萄糖标准曲线的截距
N-样品的稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g；
0.5-参与反应的酶液量，ml；
10-反应时间，min。
酸性蛋白酶活性的试验方法
酶活单位定义
一单位酸性蛋白酶活力为在所述条件下，在1分钟内使1微克酚类化合物(由酪氨酸等同物表示)从底物中释放出来的酶量。
试剂和浓液
1. 1.0％(W/W)酪蛋白底物
称取酪素1.0000g，先用少量(3-4ml)浓乳酸湿润后，再加入PH3的乳酸缓冲液约80ml，在沸水浴中边加热边搅拌直至完全溶解。冷却后转入100ml容量瓶中，用乳酸缓冲液PH3定容至刻度。此溶液在4℃冰贮存，有效期为3天。
2. 1mol/L及0.1mol/L盐酸(HCl)溶液
取浓盐酸85ml，加水稀释并定容至1000ml，即为1mol/L盐酸溶液；取100ml1mol/L盐酸溶液，定容至1000ml，即为0.1mol/L盐酸溶液。
3. 100μg/ml L-酪氨酸标准液
精确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g。用1mol/L盐酸60ml溶解后定容至100ml，即为1mg/ml酪氨酸标准溶液。吸取1mg/ml酪氨酸标准溶液10.0ml用0.1mol/L盐酸定容至100ml，即得到100μg/ml L-酪氨酸标准液。
4. 0.4mol/L碳酸钠(Na2CO3)溶液
称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
5.福林(Folin)试剂
于2000磨口回流装置中加入钨酸钠(Na2WO4.2H2O)100g、钼酸钠(Na2MoO4.2H2O)25g、蒸馏水700ml、85％磷酸50ml、浓盐酸100ml。小火沸腾回流10小时，取下回流冷却器，在通风厨中加入硫酸锂(Li2SO4)50g，加蒸馏水50ml和数滴浓(99％)溴水，再微沸15min，以除去多余的溴(冷后仍有绿色需再加溴水，再煮沸除去过量的溴)，冷却后加蒸馏水定容至1000ml。混匀、过滤。试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用时，以1份原Folin溶液与2份蒸馏水混匀。
6.PH3.5乳酸缓冲液
甲液：称取80～90％乳酸10.6g，加水稀释并定容至1000ml。
乙液：称取70％乳酸钠16g，加水稀释并定容至1000ml。
使用液：取甲液2份，加乙液1份，再准确稀释1倍。用pH计校正pH至3.5。
7. 0.4 mol/L三氯乙酸(CCl3-COOH)溶液(沉淀试剂)
称取三氯乙酸65.4g，用蒸馏水溶解并定容至1000ml。
测定步骤
1.标准曲线绘制
用L-酪氨酸标准液制成每ml分别含L-酪氨酸0、10、20、30、40、50、60μg的稀标准液。用移液管取各取稀释液1.0ml，0.4mol/L碳酸钠溶液5.00ml，稀福林试剂1.00ml，搅拌并在40℃水浴中保温20min，冷却至室温并以蒸馏水为对照测其在660nm的吸光度。
绘制酪氨酸浓度对吸光度的函数曲线。
2.样品测定
在40℃下平衡1.0ml酶稀释液，(约5分钟)。加入1.0 ml的平衡过的1％酪蛋白底物搅拌并在40℃保温，精确至10分钟。加入2ml沉淀试剂并搅拌，在40℃保温10分钟，并立即用滤纸(Whatman1号滤纸或新华1号滤纸)过滤。
用移液管移取1ml的滤液、5ml的0.4mol/L Na2CO3溶液和1ml的Folin试剂。搅拌并在40℃保温20分钟。冷却至室温，并以蒸馏水为对照测量在660nm的吸光度。
3.酶空白
在40°下平衡1ml酶稀释液，加入2ml沉淀试剂，搅拌并在40°下保温10分钟，加入1ml酪蛋白底物，搅拌并在40°下保温10分钟，立即用滤纸(Whatman1
号滤纸或新华1号滤纸)过滤。
象处理酶样品一样处理该滤液。
酶样品和酶空白间的吸光度的差异应在0.2-0.5。
酶活力计算：按照下式计算样品的酸性蛋白酶活力：
其中：
A(X)＝样品的吸光度；
A(O)＝空白的吸光度
K＝比色常数；
4＝反应试剂体积(ml)；
N＝样品稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g；
1＝参与反应的酶液量，ml；
10＝反应时间，min
纤维素酶(CMC酶)活性的试验方法酶活单位定义：
1单位纤维素CMC酶活力为在所述条件下，在一分钟内使1微克还原糖(由葡萄糖等同物表示)从底物(CMC羧甲基纤维素钠)中释放出来的酶量。
试剂和溶液1.羧甲基纤维素钠(CMC)溶液
取2g羧甲基纤维素钠(粘度300-600厘泊)溶于200ml蒸馏水中，水浴加热至溶，用四层纱布过滤。取滤液100ml，加入pH 4.8的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液(甲液493ml和乙液507ml混合均匀，并用pH计校正至pH为4.8)20ml，蒸馏水40ml，混匀，贮冰箱备用。1周后应重新配置制。2.磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液：
甲液：称取磷酸氢二钠(Na2HPO4.2HO2)35.61g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。
乙液：称取柠檬酸(C6H8O7.HO2)21.01g，用蒸馏水溶解，并定容至1000ml。
使用溶液：取甲液493ml，加乙液507ml混合均匀，用pH计校正至pH为4.8。3.二硝基水杨酸(DNS)试剂：
取酒石酸钾钠182g，溶于500ml蒸馏水中，加热。于热溶液中依次加入3，5-二硝基水杨酸6.3g，2 N氢氧化钠262ml，苯酚5g，亚硫酸钠5g，搅拌至溶，冷却后用蒸馏水定容至1000ml，混匀，过滤，贮于棕色瓶中，放置1周后使用。
在黑色或棕色瓶中于室温下贮存，该试剂最多稳定6个月。
4. 1％葡萄糖标准溶液
称取预先于105℃干燥至恒重的无水葡萄糖1.000g，精确至0.0001g，用蒸馏水溶解后定容至100ml，即为1％浓度的葡萄糖标准溶液。
测定步骤
1.标准曲线的制作
用标准葡萄糖溶液制成每ml分别含葡萄糖200、400、600、800、1000、1200μg的稀标准液。用移液管移取不同浓度的稀标准液0.5ml、pH 4.8磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液1.5ml和DNS试剂3.0ml，搅拌并煮沸，精确至7分钟，取出后立即加入蒸馏水10ml，摇匀。以蒸馏水0.5ml代替葡萄糖稀标准液作为空白对照。冷却后，在波长550nm测吸光度。
绘制葡萄糖浓度对吸光度的函数曲线。对每个新的DNS-试剂制作新的标准曲线。
2.酶样品测定
在50℃下平衡0.5ml酶稀释液，加入经50℃预热的羧甲基纤维素钠(CMC)溶液1.5ml，搅拌并在50℃下保温，精确至20分钟。加入3.0ml的DNS试剂搅拌并煮沸反应混合物，精确至7分钟。将反应混合物在冷水中冷却至室温，再加入10ml蒸馏水，混匀，并以蒸馏水为对照在550nm测吸光度。
3.酶空白
将羧甲基纤维素钠(CMC)溶液1.5ml在50℃保温10分钟。加入3ml的DNS试剂并搅拌。加入0.5ml酶稀释液。煮沸混合物，精确至7分钟。将反应混合物在冷水中冷却至室温，再加入10ml蒸馏水混匀，并以蒸馏水为对照在550nm测吸光度。
酶样品和酶空白之间的吸光度差异应为0.3-0.5。
酶活力计算：按照下式计算样品的木聚糖酶的活力：
其中：
A(X)＝酶样品的吸光度
A(O)＝酶空白的吸光度
K＝标准曲线的斜率
CO＝木糖标准曲线的截距
N-样品的稀释倍数(制备成的酶液ml数/2g酶粉)，ml/g；
0.5-参与反应的酶液量，ml；
20-反应时间，min。
益生菌总活菌量的计数方法：
1)精确称取菌酶合剂5克，放入带玻璃珠的装有50-100ml无菌水的300ml三角瓶中，充分振荡15min，在无菌条件下过滤。过滤液经65℃，20min水浴，杀灭产酶的真菌孢子和菌丝体。
(2)过滤液经梯度稀释，在10-7～10-10稀释度下，吸0.1ml不同稀释液至蛋白胨牛肉膏琼脂的平板上(平皿)，涂布均匀后，于35℃培养。
(3)计数：经20h培养后，计数不同稀释度下的细菌菌落数，根据各稀释度下菌落数量，计算菌酶制剂中总活菌量。
Claims (10)
1、一种用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：
1)、将多个产酶菌种单独在PDA斜面上培养成熟后，制成孢子悬浮液，再将各菌种孢子悬浮液按比例混合，然后将产酶种子培养基按一定量接入产酶混合菌种孢子悬浮液，最后接种后的种子培养基经过培养，待培养基中长出半满孢子后，成熟，待用；
2)、将多个益生菌菌种在斜面上单独培养成熟后，制成孢子悬浮液，再将各菌种孢子悬浮液按比例混合，然后将益生菌种子培养基按一定量接入益生菌混合菌孢子悬浮液，最后接种后的种子培养基经过培养成熟，待用；
3)、将培养好的产酶混合菌种，注入冷却的无菌水，充分搅拌后用四层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶菌种种子液；将培养好的益生菌混合菌种，注入冷却的无菌水，充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到益生菌种子液；
4)、将产酶菌种子液和益生菌种子液按比例混合，制成菌酶混合接种剂；混合发酵培养基按一定接种量接入菌酶混合接种剂，接着发酵培养直至发酵结束；
5)、发酵结束后的产物，经烘干、粉碎的后处理，即成菌酶制剂。
2、根据权利要求1所述的用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：
1)、将多个产酶菌种单独在PDA斜面上培养，在30℃恒温条件下，经4d长出丰满孢子时，成熟，待用；
2)、分别用无菌水将产酶菌种斜面孢子洗下，制成孢子悬浮液，再将各菌种孢子悬浮液按等比例混合；
3)、产酶种子培养基，经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％量接入产酶混合菌种孢子悬浮液；
4)、接种后的种子培养基在500ml三角瓶中在30℃恒温下，经4d，待培养基中长出丰满孢子后，成熟，作为产酶混合菌种子，待用。
3、根据权利要求1所述的用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：
1)、各益生菌菌种在蛋白胨牛肉膏琼脂斜面上单独培养，在35℃恒温下经3d长出丰富菌落时成熟，待用；
2)、分别用无菌水将各益生菌孢子洗下，制成孢子悬浮液，再将各菌种孢子悬浮液按比例混合；
3)、益生菌种子培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)量接入益生菌混合菌种；
4)、接种后的种子培养基在500ml三角瓶中，35℃下经3d培养成熟，作为益生菌混合菌种子，待用。
4、根据权利要求1所述的用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：
1)、将培养好的产酶混合菌种子，注入冷却的无菌水，充分搅拌后的用四层纱布在无菌条件下过滤，得到产酶混合菌种子液。
2)、将培养好的益生菌混合菌种子，注入冷却的无菌水，充分搅拌，用四层纱布在无菌条件下过滤，得到益生菌混合种子液。
3)、将产酶混合菌种子液和益生菌混合种子液按比例混合，制成菌酶混合接种剂；
4)、混合发酵培养基经121℃，30min灭菌，冷却后，按1-5％(V/W)接种量接入菌酶混合接种剂，充分搅拌混匀后，装入500ml三角瓶(每瓶20g)，于30℃培养3d；
5)、发酵培养过程中，于培养10h起，每隔10h振荡一次，连续3-4次，50h后静止培养，直至发酵结束。
5、根据权利要求1所述的用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：所述的后处理是：
1)、发酵结束后的产物，置40℃，鼓风条件下，经15-24h烘干；
2)、烘干后的发酵产物，粉碎，过80目筛，按所述酶活性试验方法和活菌数计量法检测后，即成菌酶制剂。
6、根据权利要求1所述的用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：所述的产酶真菌：分别为木聚糖酶产生菌黑曲霉变种1、β-葡聚糖酶产生菌黑曲霉变种2、酸性蛋白酶产生菌黑曲霉变种3及纤维素酶产生菌木霉菌；所述的益生菌：分别为地衣芽胞杆菌、腊状芽胞杆菌、枯草芽胞杆菌及假丝酵母菌。
7、根据权利要求1或2所述的用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：所述产酶菌种的斜面培养基是马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)斜面，产酶种子培养基配比为麸皮：55％、豆粕：35％、NH4NO3：4％、鱼粉：4％、KH2PO4：2％、水(固∶液)1∶1.15。
8、根据权利要求1或3所述的用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：所述益生菌菌种的斜面培养基配比为葡萄糖：1.0％、蛋白胨：0.5％、牛肉膏0.5％、KH2PO4：0.1％、MgSO4：0.05％、KCL：0.05％、琼脂1.5-2.0％。
9、根据权利要求1或3所述的用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：益生菌种子培养基配比为四号粉：15％、麸皮：40％、豆粕：10％、米糠：20％、玉米粉：15％、蔗糖：0.5～1％、水(固∶液)1∶1.2。
10、根据权利要求1或3所述的用作饲料添加剂的菌酶制剂协同发酵工艺，其特征是：所述的混合发酵培养基配比为麸皮70％、豆粕：25％、NH4NO3：2％、鱼粉：2％、KH2PO4：1％、水(固∶液)1∶1.15。
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