CN1536069A - 大规模生产虫草菌和灵芝菌的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于生产灵芝菌和/或虫草菌的设备和方法，包含在有效的培养基中培养灵芝菌和/或虫草菌，特别是通过所述设备和方法得到的灵芝菌和/或虫草菌糊状物，以及灵芝菌和/或虫草菌的孢子，包含灵芝菌和/或虫草菌的强化饮料，例如强化牛奶和食品。

Description

大规模生产虫草菌和灵芝菌的方法

技术领域

本发明涉及真菌特别是虫草菌和/或灵芝菌、菌丝体、孢子和糊状物的大规模生产。

本发明进一步涉及用于大规模生产所述真菌的设备和生长参数，也涉及培养基，以及生产真菌的方法。本发明也涉及提取虫草菌和灵芝菌的活性成分的方法。本发明也涉及制备含有依据本发明的真菌和/或真菌糊状物的饮料和食品。特别地，提供了含有牛奶和所述真菌和/或真菌糊状物的乳产品。

背景技术

虫草菌，真菌的一科，例如(冬虫夏草)cordyceps Sinensis(中国称为冬虫夏草)，在传统中药中(TCM)被认为是一种高级的中草药，被认为可用于增强免疫、降痰、补肺、强肾以及增强性能力。虫草菌菌株生长在毛虫或昆虫幼体宿主的体内，虫体由于虫草菌的菌丝在体内纠结而变枯干。最后，一个大的，有时长度为10-15厘米的棒状基质从枯干的宿主长出来，并且在其上面的部分产生一个被侵入的子囊壳。

Ganoderma lucidum(中国称为红灵芝)，是真菌的另一科，在TCM中也被认为是高级草药。被认为能够防癌、降低胆固醇和用于治疗心脏和肺的疾病。灵芝覃的子实体和孢子在TCM处方中是主要的形式。被使用的灵芝的其它菌株包括Ganoderma japonicum(紫灵芝)和Ganoderma tsugae松杉灵芝，两者被认为与红灵芝有不同的治疗效果。

野生的虫草菌和灵芝菌可能有高浓度的重金属，而且也可以带有微生物的污物。因此，难于确保这种野生栽培的质量。工业化生产的虫草菌和灵芝菌，其质量可以通过纯菌株的分离和筛选以及通过加入到菌种生长培养基中的底物的选择和数量来控制，迄今为止，主要局限于不适于大规模生产的琼脂培养或摇瓶培养。虽然摇瓶培养可以使真菌容易生长，但按比例放大生产，例如利用生物反应器，需要严格地控制参数如溶氧、搅拌方式和强度、温度、生长物质的量如碳源和氮源等等，而且这些参数的最佳范围不容易测定。结果显示静止/摇瓶液体培养仅有1％的收率(这里生物量产量是经过45到72小时周期后以每100ml的发酵培养基或液体的干菌丝来定义的)。静止/摇瓶培养的合理的培养周期至少是深层发酵系统的两倍长。一些菌株，例如C.Gracilis、大团囊虫草、蛹虫草甚至不适于在静止/摇瓶中液态培养。此外，灵芝菌细胞在深层发酵系统中倾向于成球，特别是用US5,334,704中介绍的马铃薯-葡萄糖培养基，导致了菌丝的生长受到影响。

除了灵芝菌的子实体外，灵芝菌和虫草菌的孢子在TCM中会非常有价值。不幸的是，虽然灵芝菌和虫草菌在标准环境下在标准生长培养基中能被培养到一定程度，但还从来没有成功地被培养到产生担子孢子。所以迄今为止大规模生产孢子还没有成功。

发明内容

本发明第一方面大体上提供一种用于大规模生产虫草菌和/或灵芝菌的设备，优选包含生物反应器。特别地，如果被用于培养虫草菌，它可以产生至少5％的收率，如果被用于培养灵芝菌，它可以产生至少3％的收率。

另一方面，本发明提供一种用于多阶段的液态发酵的方法，使得虫草菌至少5％的收率或灵芝菌至少3％的收率。

另一方面，本发明提供生产灵芝菌和/或虫草菌孢子的方法。特别地，该方法包括在生长周期中应用压力为2巴和更高来培养灵芝菌和/或虫草菌的步骤。

另一方面，本方面提供一种用于培养灵芝菌和/或虫草菌的新培养基。

另一方面，本方面提供一种用于培养具有硝酸钠和/或核黄素(维生素B2)的灵芝菌和/或虫草菌的培养基。特别地，本发明提供一种用于培养由硝酸钠和/或核黄素(维生素B2)增强的蛹虫草或赤芝的培养基。

另一方面，本发明提供一种包括热水提取灵芝菌和/或虫草菌活性成分在内的方法。

另一方面，本发明提供利用灵芝菌孢子(例如赤芝孢子)、虫草菌孢子、灵芝菌菌丝体和/或虫草菌菌丝体和依据本发明具体实施方式而提供的流程或系统产生的灵芝菌糊状物和/或虫草菌糊状物作为营养补品。

另一方面，本发明提供单细胞灵芝菌和/或虫草菌。本发明进一步提供基本上单细胞形式的灵芝菌和/或虫草菌培养物。本发明进一步提供包含100％的单细胞培养的灵芝菌和/或虫草菌培养物。

另一方面，本发明提供包含依据本发明在培养基中制备的任何灵芝菌和/或虫草菌的菌丝体、孢子或糊状物的饮料和食物。特别地，本发明提供采用在本发明的培养基中生产的至少一种灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和虫草菌糊状物来强化的牛奶。

另一方面，本发明提供了含有至少一种在本发明培养基中生产的灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和虫草菌糊状物的药物组合物。

本发明也提供了由本发明培养基中生产的灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和虫草菌糊状物的用途，其可用于制造有治疗用途的药物组合物、饮料(例如牛奶)和/或食物(例如营养补品)。治疗的用途包括，但不局限于此，治疗肿瘤、巨噬细胞活性的刺激、或免疫系统的刺激、肾和呼吸功能的刺激、增强身体的循环的作用等等。因此，本发明也提供一种用于治疗处理的方法，特别地(但不局限于此)用于治疗肿瘤、巨噬细胞活性的刺激、或免疫系统的刺激、肾和呼吸功能的刺激、增强身体的循环的作用，以及其它给病人用药的方法：至少由本发明培养基中生产的灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和/或虫草菌糊状物，或一种药物组合物、饮料(例如牛奶)和/或(例如，营养补品)包含至少由本发明培养基中生产的灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和/或虫草菌糊状物。

本发明涉及一种用于大规模生产真菌的设备，包含：

一种生物反应器；和

一种液体培养基，包括具有至少一种碳源的水和至少500升的体积且pH至少是pH5；和

用于搅拌液体培养基的工具；和

用于保持液体培养基温度至少在17℃的工具；和

以至少1∶0.5v/v/m的比率向液体培养基通气的工具；和消泡剂。

本发明还涉及一种在液体培养基中培养真菌的多阶段方法：

提供真菌来源；

将真菌接种到第一阶段的液体培养基中；

搅动第一阶段的液体培养基，让真菌生长一段时间；

将第一阶段的培养物接种到第二阶段的液体培养基中；

搅动第二阶段的液体培养基，让培养物生长一段时间；

将第二阶段的培养物接种到容纳在生物反应器中至少500升的液体培养基中；

搅动第三阶段的液体培养基，让培养物生长一段时间；

保持每个阶段液体培养基的pH值至少大约是pH5；

添加至少一种碳源到每个阶段的液体培养基中。

本发明还涉及一种培养蛹虫草的方法，包含使蛹虫草在含有硝酸钠的培养基上生长。

本发明还涉及一种培养蛹虫草的方法，包含使蛹虫草在含有核黄素(维生素B2)的培养基上生长。

本发明还涉及一种用于培养虫草菌或灵芝菌的生长培养基，包含：

葡萄糖；和

麦芽糖；和

水。

本发明还涉及一种生产灵芝菌和/或虫草菌孢子的方法，包含：

使用至少2巴的压力来培养灵芝菌和/或虫草菌。

本发明还涉及一种提取虫草菌成分的方法，包含；

在温度高于90℃的热水中浸泡虫草菌菌丝体至少12小时以获得混合物；

过滤混合物分成滤液部分和残渣部分；

用溶剂混合滤液以获得水溶性榨取物的沉淀；

用溶剂混合残渣并轻轻搅动；

除去溶剂以获得可溶于溶剂的榨取物。

本发明还涉及包含至少下述成分的虫草菌：总蛋白质27-28％、总水溶性多糖至少20％、虫草酸至少5％、虫草菌丝至少0.1％和腺苷至少0.15％。

本发明还涉及包含至少下述成分的灵芝菌，总蛋白质28-30％，和总水溶性多糖至少15％。

一种根据上述方法制备的虫草菌和/或灵芝菌糊状物。

一种单细胞的虫草菌和/或灵芝菌。

一种单细胞培养物包含基本上单细胞菌株的虫草菌和/或灵芝菌。

本发明还涉及一种饮料和/或食品，包含至少下述一种物质：如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如上所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、如上所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌以及如上所述的单细胞培养物。

本发明还涉及一种强化牛奶产品，包含使牛奶与下述至少一种物质混合：如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如上所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、如上所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌以及如上所述的单细胞培养物。

本发明还涉及一种制备强化牛奶产品的方法，包含使牛奶与下述至少一种物质混合：如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如上所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、如上所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌以及如上所述的单细胞培养物。

本发明还涉及一种药用组合物，包含至少下述一种物质：如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如上所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、如上所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌以及如上所述的单细胞培养物。

本发明还涉及下述至少一种物质的用途：如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如上所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物，用于制造药物组合物，这种药物组合物至少可用于治疗肿瘤、巨噬细胞的活性刺激、系统刺激、肾和呼吸功能的刺激和增强身体循环功能。

本发明还涉及一种肿瘤治疗、巨噬细胞活性刺激、和/或免疫反应刺激的方法，包含给予受体所需的下述至少一种物质：如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的虫草菌、如上所述的灵芝菌、如上所述的灵芝菌和/或虫草菌的孢子、灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、以及如上所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌、以及如上所述的单细胞培养物、如上所述的食品或饮料、如上所述的强化牛奶、如上所述的药物组合物。

附图简述

为便于叙述，现参考下列附图描述本发明的优选特征，其中：

图1是显示菌丝体干重的收率对不同成分浓度的图表。试验是用摇瓶发酵进行的。

图2是显示麦芽糖糖浆对虫草菌收率影响的图表。试验是在75升生物反应器中通过深层发酵进行的。添加的无机物是：1.5g/l的KH₂PO₄和0.3g/l的MgSO₄7H₂O。

图3是显示通气率对虫草菌收率影响的图表。试验是在75升生物反应器中深层发酵进行的。

图4是显示搅拌速率对虫草菌收率影响的柱形图。试验是在75升生物反应器中深层发酵进行的。

图5显示通过液体培养生产的灵芝菌孢子的显微镜观测。

图6显示通过SDS-PAGE在赤芝和冬虫夏草活性成分中发现的蛋白、糖蛋白和多糖的剖面图。

图7显示通过蛋白质印迹在赤芝冬虫夏草活性成分中发现的蛋白、糖蛋白和多糖的剖面图。

图8显示根据本发明得到的冬虫夏草的菌丝和孢子的显微镜观测。

图9显示根据本发明得到的冬虫夏草的菌丝和孢子的显微镜观测。

图10涉及随着温度的升高，蛹虫草在含有YM培养基(参见表2)的琼脂斜面/平板上的生长。图片左边的斜面/平板涉及生长温度为20℃，中间的斜面/平板涉及的温度为25℃，以及右边的斜面/平板涉及的温度为29℃。

图11是依据本发明的强化牛奶制备的一般方法的概要。

具体实施方式

在现有技术中，虫草菌或灵芝菌的液体培养基的生长限于采用静止或摇动培养，例如在摇动器上的厄伦美厄烧瓶或其相似物等等。利用摇瓶培养的一般的多阶段液体发酵方法已经被US5,334,704公开。但是，在理论和实践上，本发明大规模生物反应器生产和现有技术静止/摇动液体长操作台面培养基本原理的差异，意味着现有技术不能通过直接放大摇动培养用来成功地大量生产真菌。无论利用多少阶段，利用长操作台面发酵培养方法都不能实现所述真菌的大量生产。由于玻璃仪器的设计和长操作台面装置的搅拌方式比较简单，不能优化诸如通风、搅拌和混合效果等参数，虫草菌的一些株系比如C.Gracilis、大团囊虫草、蛹虫草，不适宜在静止/摇动的液态培养中生长。

在摇瓶培养中，细胞的生长增加了液体培养基的粘度因而妨碍了最佳的通气。这是阻止虫草菌大量生长的一个因素。

本发明提供了用于深层需氧发酵/培养虫草菌和灵芝菌生长的设备、生长培养基和方法。本发明具体实施方式提供的生长培养基和方法可以消除，或至少大体上降低重金属污染物和不需要的微生物的水平(表8和表9与表7相比较)。所选择的纯菌株可用于生产，并且小心控制生物技术参数，从而可确保产物质量的可靠性和一致性。进一步地，本发明提供了一种设备，包括用于大规模生产的生物反应容器，该容器中含有搅拌工具以连续和有规律地搅拌培养基。这样就提高了通气比率和效率以及不断地将氧传递到活细胞中，而且能防止细胞成块或沉到容器的底部。其结果，依据本发明生产的灵芝菌和/或虫草菌大体上是单细胞形式。相反地，现有技术的灵芝菌和虫草菌是多细胞形式。多细胞培养与有性生殖和/或细胞分化有关。就像人类，始于受精卵，并且生长是通过细胞的分化发展成许多不同的细胞系，最终形成包含多器官的个体，换句话说就是“多细胞培养”。

相应地，本发明提供了灵芝菌和/或虫草菌的单细胞。表示灵芝菌和/或虫草菌单细胞特性的定性分析可见图9和图10，它们显示细胞学的形态数据。本发明进一步提供灵芝菌和/或虫草菌大体上单细胞形式的培养物。本发明进一步提供包含100％的灵芝菌和/或虫草菌单细胞培养的培养物。

相应地，本发明提供一种用于大规模生产真菌的设备，包括：

一种生物反应器；和

一种液体培养基，包括至少含有一种碳源的水且体积至少500升以及pH至少是5；和

用于液体培养基的搅拌工具；和

用于使液体培养基温度稳定在至少17℃的工具；和

以至少1∶0.5v/v/m的比率向液体培养基通气的工具；和消泡剂。

举例来说，搅拌工具就是搅拌器。搅拌的速度至少100rpm。包括含有至少一种碳源的水在内的液体培养基可以是依照本发明具体实施方式所描述的任何一种培养基。液体培养基可以进一步包含酵母提取物，特别是酵母提取物的浓度至少为15g/l。液体培养基可进一步含有蛋白胨源，比如含有的浓度至少为15g/l。液体培养可以含有葡萄糖作为一种碳源，例如葡萄糖的浓度至少为30g/l。液体培养基也可以含有麦芽糖作为一种碳源，例如麦芽糖的浓度至少为30g/l。液体培养基可以进一步含有至少一种无机源，例如硫酸镁。特别地，硫酸镁的浓度至少为0.05g/l。液体培养基可以进一步含有一价的磷酸钾盐作为无机源，例如作为无机源的一价磷酸钾盐的浓度至少为0.05g/l。液体培养基可以含有至少0.5g/l的硝酸钠。设备中液体培养基的温度优选保持在至少17℃。

利用本发明的设备大规模生产的真菌可以是虫草菌和/或灵芝菌。但是，任何其它的专业人员已知的和适用于本发明目的的真菌也可以被生产。举例来说，真菌可以是蛹虫草、冬虫夏草、Cordyceps gracilis，Cordyceps memorabilis，大团囊虫草、Cordyceps sphecocephala，Cordyceps hawkesii，Cordyceps martialis，小蝉草、Cordyceps capitata，紫芝、松杉灵芝和/或赤芝、Ganoderma anularis，树舌灵芝、Ganodermaboniense，Ganoderma fornicatus，Ganoderma tenne，Ganodermatropicum。

本发明也提供使用本发明的培养基，通过依据本发明的设备和/或方法得到或可得到的虫草菌和/或灵芝菌。本发明进一步提供使用本发明的培养基，依据本发明的设备和/或方法得到或可得到的虫草菌和/或灵芝菌的糊状物。本发明也提供分别具有如表8和表9所示成分和特性的虫草菌和灵芝菌。

一般真菌生长标准培养基含有葡萄糖和/或马铃薯右旋糖、麦芽提取物和肉蛋白胨。这种标准生长培养基产生的虫草菌或灵芝菌量不足，特别是在摇瓶培养中使用时。使用标准生长培养基且没有调整好参数诸如搅拌、通气、pH、温度和发酵周期，就难以将虫草菌或灵芝菌的生产按比例放大到“大规模”的水平(这里“大规模”水平一般意味着使用400升或更多升的生长培养基)。

本发明提供不同于标准培养基的生长培养基，它可以有效地提高真菌的产量，特别是在物理参数被最优化的生物反应器中。培养基特别适于深层培养，提供至少3％灵芝菌产量和至少5％的虫草菌收率，优选使用已经计划好的生产设备，但不限于此。物理参数包括通气、搅拌速度、压力、消泡剂的量、生长基质的选择和分量等等。已知在生物反应器中合适的通气率和搅拌率可以提高菌丝的生长(见图3和图4)。已发现温度和pH的影响不是很厉害，只要在最佳的范围内，例如pH4.5到7，和优选是pH5.5。发酵容器中可用高于大气压0.5-1.0巴的正压，以防止培养污染。消泡的控制也可以作为抑止泡沫的方法被使用。本发明发酵系统的发酵时间一般是48-72小时，但不是必须的。实际的发酵周期可以从40延续到90小时或更长。相对的，静止/摇动液体培养发酵时间一般是15-30天。

因此，本发明提供一种生物反应器和多步过程用于生产真菌，包括至少一种用于培养真菌例如虫草菌和/或灵芝菌的生长培养基；生长培养基至少包含葡萄糖、麦芽糖和水。生长培养基也可以进一步包含酵母提取物和/或维生素。可以使用含有维生素的酵母提取物。生长培养基可以含有的酵母提取物大体上浓度至少为15g/l，特别是15-30g/l，更特别是20g/l。生长培养基可以进一步含有浓度至少为30g/l，特别是30-50g/l，更特别是40g/l的葡萄糖。生长培养基可以进一步含有浓度至少为30，特别是30-60g/l，更特别是40g/l的麦芽糖。无机物可以是例如硫酸钠、一元磷酸钠、二元磷酸钠、磷酸二氢钾和/或硫酸镁。特别地，生长培养基含有的无机物总浓度至少为0.5，特别是至少为1.0g/l。磷酸镁的浓度可以是至少0.05g/l，特别是0.05-1.0g/l，更特别是0.3g/l。磷酸二氢钾的浓度可以是至少0.5g/l，特别是0.05-2.0g/l，更特别是1.5g/l。硝酸钠的浓度可以是至少0.5g/l，特别是0.5-3g/l，更特别是2g/l。特别地，依据本发明的生长培养基是如表1、表3和/或表6所示的培养基。

使用本发明具体实施方式的系统，虫草菌的收率一般平均值是大约5％，与使用静止/摇动液体培养的平均值1％相比较，收率提高了大约400％。相应地，已经发现在许多其它的成分中，生物活性成分比如水溶的多糖和虫草菌素(3’-脱氧腺苷，其是一种核酸类似物)的收率被提高。

灵芝菌易受生长抑止的影响，因为它在液体生长培养基(例如US5,334,704中介绍的马铃薯-葡萄糖培养基)中易于成球，结果影响了菌丝生长。相比于静止/摇动液体培养的灵芝菌的0.5％的收率，新培养基的收率达到3％的平均数，也就是提高500％。表1显示了利用新培养基虫草菌产量的大体改善。表中所示的新培养基适于培养虫草菌和灵芝菌。

通过本发明具体实施方式提供的方法是生产虫草菌和/灵芝菌的多阶段发酵法。典型地，所需真菌的纯菌株被分离(购买或以某种方式获得的，生长并保存在斜面或平板琼脂上)。随后斜面培养物可被用来接种到第一阶段的使用摇瓶培养的液体培养基上。在适当条件下烧瓶中真菌繁殖，使其浓度高到足以接种到第二阶段发酵，该阶段包括在较大容器中使用液体培养基。第二阶段中，真菌在适当条件下继续生长到浓度高到足以接种到第三阶段发酵。在本发明具体实施方式中，描述了三阶段发酵的方法，但是发酵使用更多阶段也是可能的。

具体实施方式也提供了虫草菌和灵芝菌在大规模生物反应器中生长的特殊条件，而且这些都在下面给出的本发明具体实施方式的实例中被描述。

依据具体实施方式，第一阶段使用的培养基，也就是摇瓶阶段，包含葡萄糖浓度范围从30-50g/l或更多，优选是大约40g/l。已经发现在此葡萄糖浓度下，虫草菌菌丝体的产量最适于摇瓶培养，正如图1所示。

依据具体实施方式，用于中间和生产阶段也就是第二和第三阶段的培养基包含麦芽糖，在无机物存在下，范围大约是30到60g/l，特别是40g/l。已经发现如果在合适的无机物存在下使用，以麦芽糖40g/l的浓度，菌丝体的收率可以达到最佳。不添加无机物，同样的收率只有在麦芽糖至少60g/l才能达到，正如图2所示。所以，发酵系统中无机物的使用，将不含无机物的方法变成了更有生产价值的方法。实例中使用的无机物是KH₂PO₄和MgSO₄。无机物的种类和浓度可以不同，只要它促进菌丝体的生长，例如K₂SO₄可以用来替代MgSO₄。在这个具体实施方式中，KH₂PO₄的浓度范围可以从0.05-2.0g/l，特别是1.5g/l，具体实施方式中MgSO₄.7H₂O的浓度范围可以从0.05-1.0g/l，特别是0.3g/l。还优选的，在用于灵芝菌或虫草菌生产的生长培养基中有足够的维生素，而通常这些维生素在富含维生素的酵母提取物中被发现。必须注意的是市场上有些牌子的可利用的酵母提取物不含有有效量的维生素，而且对于以培养灵芝菌或虫草菌为目的，这些不是优选的。15-30g/l的酵母提取物，特别是20g/l，可被添加到培养基中。用于发酵的第二和第三阶段的培养基可进一步包含浓度在35到50g/l，特别是40g/l的葡萄糖，作为额外的碳源。

依据本发明的培养基的一个实例显示在表1和表6中。在表1中，优选值显示在括号中。

对于蛹虫草和紫芝生长，硝酸钠可被用于替代MgSO₄.7H₂O和KH₂PO₄作为无机源，浓度范围在1到3g/l或更高，优选是2g/l。见表3。

表1.标准培养基和新培养基的比较

	摇瓶		生物反应器
							虫草菌sp	灵芝菌sp	虫草菌sp		灵芝菌sp
	收率g/100ml	收率g/100ml	收率g/100ml	PSmg/g	收率g/100ml	PSg/100g
							标准培养基(g/L)
葡萄糖，20细菌-蛋白胨，5麦芽提取物，20马铃薯-右旋糖液体培养基，24	1.24	0.31		0.2		6.6
							新培养基(g/L)优选值为括号中的
葡萄糖，30-50(40)麦芽糖，30-60(40)KH2PO4，0.05-2.0(1.5)MgSO4，0.05-1.0(0.3)酵母提取物，15-30(20)	3.22	1.66	6.96	1.5	3.0	19

使用不同的试验方法。

因此，本发明提供一种在液体培养基中多阶段培养真菌的方法，包括：

提供真菌来源；

利用真菌接种到第一阶段液体培养基中；

搅拌第一阶段的液体培养基，让真菌生长一段时间；

用第一阶段的培养物接种到第二阶段的液体培养基中；

搅拌第二阶段的液体培养基，  让培养物生长一段时间；

用第二阶段的培养物接种到容纳在生物反应器中的至少500升的第三阶段的液体培养基中；

搅拌第三阶段的液体培养基，使培养物生长一段时间；

保持每个阶段的液体培养基的pH值至少是大约pH5；

添加至少一种碳源到每个阶段的液体培养基中。

方法可进一步地包含添加葡萄糖、麦芽糖、一元磷酸钾、硫酸镁和酵母提取物到第二和第三阶段的液体培养基中的步骤。本方法可以进一步包含将浓度至少是15g/l的酵母提取物添加到第二或第三阶段的液体培养基中。本方法进一步包含添加含有维生素的酵母提取物。本方法进一步包含添加至少一种类型的无机物到第二或第三阶段的液体培养基中的步骤。举例来说，无机物可以包含硫酸镁和/或一元磷酸钾。特别地，方法包含添加硫酸镁到第二或第三阶段的液体培养基中，浓度至少为0.05g/l。本方法进一步包含添加一元磷酸钾到第二或第三阶段的液体培养基中的步骤，以至于浓度至少大约是0.05g/l。

特别地，本发明的方法进一步包含：

在第一阶段液体培养基中培养真菌至少48小时；其中，

液体培养基的体积至少大约是500ml。

第一阶段液体培养基的搅拌步骤可以包含以至少100转/分钟旋转培养基容器的步骤，和/或包含：以至少1∶0.5v/v/m的比率向第二阶段的液体培养基充气；和在体积至少大约50ml的第二阶段的培养基中培养真菌至少40小时。第二阶段液体培养基的搅拌步骤可以包含以至少100转/分钟的速度搅拌第二阶段的液体培养基和/或以至少1∶0.5v/v/m的比率向第三阶段的液体培养基充气；而且在体积至少大约500升的第三阶段培养基中培养真菌至少48小时。

本发明任何具体实施方式的方法可以进一步包含保持液体培养基温度至少17℃的步骤。特别地，本发明的方法中如果真菌是蛹虫草；方法进一步包含保持液体培养基温度至少是17℃的步骤。实际上，已经发现蛹虫草不会在高于25℃的温度下生长(见图10)。图10显示在YM培养基(见表2)存在的斜面/平板上蛹虫草在25℃下生长减慢。在29℃发现不生长。

本发明的方法中，蛹虫草的培养包含使蛹虫草在含有硝酸钠的培养基中生长的步骤。特别地，培养基中硝酸钠的浓度至少是0.5％。

本发明的方法中，培养基可以包含浓度至少0.01％的核黄素。

依据更多的方面，本发明提供由依照本发明的正在生长的灵芝菌和/或虫草菌菌丝体制备的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物并进一步包含了收集菌丝体并将其过滤的步骤。任何已知的适于本发明糊状物制备的过滤器和过滤系统都可以被使用。例如，利用重力穿过滤布或利用可调节的或被控制的真空过滤器，比如转桶真空过滤器。获得的湿菌丝体被收集(它大致含有10-15％的总固形物，也就是说85-90％的水分)，然后洗涤(优选两次)，以去除发酵培养基的残渣。灵芝菌和/或虫草菌糊状物也可以由如实例中描述的虫草菌和/或灵芝菌的孢子来制备。依据本发明任何具体实施方式制备的灵芝菌和/或虫草菌糊状物可以被用于制备“强化”饮料和/或食品。例如，用于制备强化饮品和奶产品。特别地，虫草菌糊状物包含成分(在干重的基础上)：总蛋白质：27-28％；总水溶性多糖：至少20％；虫草酸(甘露糖醇)：至少5％；虫草菌素(3’-脱氧腺苷)：至少0.1％；腺苷：至少0.15％。糊状物形式的虫草菌的产品规格被显示在表13中。糊状物形式的灵芝菌的产品规格被显示在表14中。

虫草菌和灵芝菌种的孢子被分别归做子囊孢子和担子孢子的起源。子囊孢子被游离细胞结构界限在子囊中，也就是孢子的边界在细胞质的物质中被分开而且脱离了与ascal质膜的接触，而担子孢子基本上是非常均匀的，也就是说，大体上椭圆形的细胞在尖端的担子柄的顶部产生。

大体上，药用真菌的孢子具有特殊的或独特的治疗性能，有别于它的子实体或菌丝体，尽管虫草菌孢子的药用性能不被完全了解。孢子区别于子实体是因为孢子的活性成分在孢子中比在子实体中更浓缩。因此，孢子的功效比子实体的要高。实际上，就赤芝的孢子而论，孢子的效果高于或强于子实体的75倍。

对于灵芝菌，孢子的商业产品是以农业技术为基础的。例如，灵芝(俗名：灵芝)孢子的商业产品中，“产”在子实体伞状形态上的孢子在成熟时用农业技术收集。

至于虫草菌种，现有技术中没有可利用的技术方法来生产孢子。例如，对于野生的或农田培养的冬虫夏草(俗名：冬虫夏草或毛虫真菌)形成的是一种特殊的子实体，一种基质。但是，没有科学的研究或著作曾经介绍冬虫夏草的孢子被“种植”而且可以由此被收集。

本发明发展了一种利用液体和深层培养系统商业生产灵芝菌和/或虫草菌种的孢子的方法。

正如上面所提到的，灵芝菌孢子的生产依赖于农业过程产生的子实体。对于虫草菌来说，现有技术中没有孢子生产的描述。本发明第一次提供一种商业制备虫草菌孢子的方法。根据现有技术的方法，大约1000kg的赤芝干子实体仅能产出1kg的干孢子，也就是说收率大约是0.1％。通过利用本发明的方法，30kg的干菌丝可以生产2-3kg的灵芝菌干孢子，虫草菌也是如此，有大约6-10％的收率。

因此，发明提供灵芝菌孢子和/或虫草菌孢子和它们的制备过程。灵芝菌和/或虫草菌孢子的药用特性在后面提及。除了被用作健康补品或药物之外，孢子也可以被用于食品强化和化妆品的应用。例如，依据本发明，这样的孢子用于制备灵芝菌和/或虫草菌糊状物和也可以制备强化饮料或食品。

本发明进一步提供一种含有虫草菌和/或灵芝菌菌丝体和孢子的食品和饮料，以及依据本发明任何具体实施方式制备的虫草菌和/或灵芝菌糊状物。上述的饮料可以是：酸乳酪、液体酸乳酪、果汁、牛奶、豆奶、酒精(酒精饮品)、咖啡、红茶、绿茶、乌龙茶、运动饮品等等。上述食品可以是：烘烤的甜品如饼干、面包、蛋糕、米饼等等；冷甜品如布丁、果冻、冰淇淋等等；糖果如口香糖、糖块等等；点心如饼干、薄饼等等；面条等等；由鱼或肉(鱼饼)制成的酱肉食品、火腿和鱼肠等等；调味品比如味噌、酱油、敷料、蛋黄酱和甜味剂等等；和各种菜肴如豆腐、魔芋、中国饺子、花卷、沙拉、汤、炖菜等等。饮料和食品可以依照已知的和标准的技术将至少一种虫草菌和/或灵芝菌菌丝体和孢子，或依据本发明任何具体实施方式法制备的虫草菌和/或灵芝菌糊状物与合适的食物和/或饮料的配料混合一起制备而得。

特别地，本发明提供一种“强化”牛奶，包括将奶，例如任何一种液态牛奶，比如全奶、脱脂奶、配方奶等等，与至少一种在本发明培养基中生产的灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和虫草菌糊状物混合。更特别地，这种由奶和本发明的灵芝菌糊状物和/或虫草菌糊状物混合制成的强化奶保持了灵芝菌和/或虫草菌成分的完整性，灵芝菌和/或虫草菌糊状物的物理特性，特别是在溶解度和分散性上，牛奶成分的完整性以及牛奶的味道和天然颜色的完整性方面。虫草菌强化牛奶的分析在表16中给出。

另一方面，本发明提供一种药用组合物，包含至少一种在本发明培养基中生产的灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和/或虫草菌糊状物。任选地，药用组合物至少含有一种制药学上可接受的赋形剂和/或稀释液。

本发明也提供了一种在本发明培养基中生产的灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和虫草菌糊状物的用途，用于制造优治疗用途的药物组合物，饮料(如牛奶)和/或食品(例如营养补品)。

药典上已经允许虫草菌和灵芝菌用作以下用途：

●免疫系统、肾和呼吸功能的支持；

●在维持健康的血液葡萄糖和胆固醇水平中的支持；

●提高生命力；

●增强身体的循环功能

下述的灵芝菌和虫草菌的药用效果已经通过动物模型和/或人类(临床)试验被进行研究：

●免疫调节：冬虫夏草(CS)能明显增强身体的免疫力。

●抗癌和抗微生物引起的影响：与免疫调节相结合，CS显示一种抗癌功效，并被报导可以抑止病毒、细菌和真菌的感染。

●抗糖尿病活性：CS中的多糖被报导明显降低血糖水平。

●能量代谢及其效能的增强：CS刺激肝的能量代谢已被报导。

●呼吸和肺部的功能：CS被报导可松弛支气管壁以及具有镇静，止咳和抗炎特性，因此它有效防止咳嗽、粘痰、哮喘和其它呼吸疾病。

●胆固醇和脂肪的代谢：报告显示血浆甘油三酸酯、“不良胆固醇”比如LDL-c和vLDL-c和总胆固醇水平可以被CS降低。

●对肾功能紊乱的影响：有显示CS可以被用于治疗Berger’s疾病(IgA肾病)。

●对性功能障碍和生殖紊乱有影响：已报导通过摄取CS临床改善阳痿。

●其它：报告暗示CS可以刺激小鼠骨髓细胞红血球生成，和抑止血小板的聚合。

下面特别记述了关于赤芝和冬虫夏草菌株的医用效果：

1)赤芝子实体或孢子的医用效果：

●抗癌剂：动物中的癌症研究显示用赤芝(俗名：灵芝)治疗有50％的肿瘤衰退率(举例来说老鼠中连接的组织癌症模型)。

●免疫系统的增强(支气管炎、哮喘、敏感症、疱疹病和HIV感染)在中国包括2000例的老年慢性支气管炎用浓缩的灵芝菇治疗已经显示了好的反应。该研究证明了好于60％的成功率。

●抗病毒活性：灵芝提取物的一种特殊的蛋白抑止多糖成分，称作GLhw-02，已经显示在试验条件下拥有抵抗疱疹单纯病毒1型和2型有效的抗病毒特性。在试验条件下，灵芝菇提取物中的各种灵芝酸已经显示是积极的抗HIV剂，显示了在保守剂量上减少50％的病毒复制的能力。

●心血管的健康(高血压和减少血小板凝聚)：两例人对照研究显示灵芝提取物可以降低高血压到有意义的水平(心脏收缩和心脏舒张)，甚至在以前对已有的抗高血压的药物没有反应的病人中也是如此。

●肝脏保护效果(肝保护特性)：在中国灵芝是用于治疗慢性和急性肝炎的处方。灵芝菇中的各种灵芝酸有很强的抗肝毒素的特性，这种特性在试验条件下显示保护肝细胞不受化学方法导致的伤害，包括保护不受高毒和致命物质四氯化碳的伤害。

2)虫草菌子实体、菌丝或孢子的医用效果：

●免疫调节：冬虫夏草(CS)可以明显增强身体的免疫力。

●抗癌和抗微生物的效果：与免疫调节功能相连，CS显示一种抗癌效果和被报导可抑止病毒、细菌和真菌的感染。

●抗糖尿病的活性：CS中的多糖被报导明显降低血糖水平。

●能量代谢和性能的增强：CS刺激肝的能量代谢已被报导。

●呼吸和肺部的功能：CS被报导可松弛支气管壁以及具有镇静，止咳和抗炎特性，因此它有效防止咳嗽、粘痰、哮喘和其它呼吸疾病。

●胆固醇和脂肪的代谢：报告显示血浆甘油三酸酯，“不良胆固醇”比如LDL-c和vLDL-c和总胆固醇水平可以被CS降低。

●对肾功能紊乱的影响：有显示CS可以被用于治疗Berger’s疾病(IgA肾病)。

●对性功能障碍和生殖紊乱有影响：已报导通过摄取CS临床改善阳痿。

●其它：报告暗示CS可以刺激小鼠骨髓细胞红血球生成，和抑止血小板的聚合。

(Wang and Shiao，食品和药物分析杂志，Vol.8，No.4，248-257，2000；天然产品研究协会，http：//www.naturalproducts.org/inpr/monographs pdf/index.html；中国药物大药典(中国)。1997，上海科学与技术出版社，上海，中国；Ming-Shang MIAO，食物疗法：中国药物药典(中国)。2001，科学出版社，北京，中国)

因此，本发明也提供一种用于治疗处理的方法，特别地(但不局限于此)用于治疗肿瘤、巨噬细胞的活性刺激、或免疫系统的刺激，肾和呼吸功能的刺激、增强身体循环功能和其它上述提到的用途，包含给予至少一种在本发明培养基中生产的灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和/或虫草菌糊状物、或含有至少一种在本发明培养基中生产的灵芝菌菌丝体、虫草菌菌丝体、灵芝菌孢子、虫草菌孢子、灵芝菌糊状物和/或虫草菌糊状物的药物组合物、饮料(如牛奶)和/或食品(例如营养补品)。

下面给出生产不同种的虫草菌和灵芝菌的实例。应该指出的是给出的生长条件的参数比如发酵周期，温度，搅拌速度，通气率，pH范围等，不必局限于已给出的数值，可以在合理的范围内改变，因为这是本领域的技术人员的常识。

实施例

实施例1：在发酵装置中培养紫芝

本实例使用一种含有至少一种碳源、酵母提取物、维生素(尽管不总是，酵母提取物通常含有足够的活性维生素而不需要补充添加维生素)、无机物和其它生长元素如蔗糖、葡萄糖、蛋白胨和食物级化学物质。已发现酵母提取物富含维生素，特别利于灵芝菌的生长。

为了生产紫芝APN3-1(FIRDI-36445)合适菌株的孢子，比如在平滑的斜面或平板琼脂培养基(表2)上，25-30℃下(优选29℃)培养和保存赤芝APN3-1(FIRDI-37177)3-5天。然后收获合适量的真菌，并用于接种到摇瓶中的液体生长培养基中以制备一级种子培养物。

摇动培养的一个典型制备实例包含，在Erlenmeyer摇瓶中的液体生长培养基，5升圆锥形摇瓶中的1升肉汤培养基(表3)，121℃下高压灭菌20分钟，并接种入6个赤芝APN3-1的斜面培养基，并置于下述生长条件：

●pH5.5(在接种前调整)

●29℃

●摇瓶在摇动器上以大约160转/分钟速度旋转

●培养周期72小时

当生长速率达到稳定阶段，终止一级种子培养。然后来自一级培养的适量细胞用于在小搅拌罐中液体培养基中二级种子的培养。

二级种子的培养使用在75升生物反应器中50升或更多的发酵培养基(表1)，例如BioLafitte牌的或更大的生物反应器(比如800升或更大)。系统在121℃灭菌30分钟并接入2升一级种子培养物(或大约4％接种量，也就是2升到50升)。保持下述生长条件：

●pH5.5(在接种前调整)

●25℃

●通气率1∶0.5v/v/m到1∶0.9v/v/m(也就是对于600升的液体培养基来说，1500-2700升/小时)，这里“v/v/m”是指培养基体积/通气流量。

●涡轮搅拌速度200转/分钟

●培养周期48小时

对于赤芝菌丝体的大规模生产，大约50升或更多的二级种子培养物，或8％的接种量，被用来接种到800升或更大的搅拌罐反应器(BioLafitte)中，一般装有600升或更多的合适的发酵培养基。培养基的体积范围实际地可以从至少400升和更多。装有培养基的罐首先在121℃灭菌30分钟，并保持下述条件：

●pH5.5(在接种前调整)

●25℃

●搅拌速度200转/分钟

●通气率1∶1v/v/m(600升大约36.0m³/小时)

●培养周期72小时

对于紫芝可以得到至少3％的收率。

通过从反应器中排除培养物，并用真空过滤器、压滤机或液压机将其过滤而收集菌丝体。每个反应器获得高达60-100公斤的含有30％干物质的菌丝饼。然后菌丝饼在双椭圆旋转真空干燥器上被干燥或通过冷冻干燥，得到含有28-30％蛋白质的丝状粉末。丝状粉末用碾磨机磨成100-200目大小的颗粒。得到的粉末随后包装到铝袋中。

实施例2：在发酵装置中的赤芝和松杉灵芝的培养

赤芝APN3-2(FIRDI-37177)或松杉灵芝APN3-3(FIRDI-36090)首先生长并保存在斜面或平板琼脂培养基(表2)上，在24℃下3-5天然后赤芝或松杉灵芝的斜面培养物被用来接种到250毫升Erlenmeyer摇瓶中的50毫升的液体生长培养基(表3)中。菌丝体在旋转摇动器上以160转/分钟，在25-29℃(优选27℃)摇动培养72小时。

对于赤芝和松杉灵芝的商业生产来说，使用实施例1提到的多阶段发酵。赤芝和松杉灵芝的菌丝产量与紫芝的收率接近。

表2：YM斜面/平板琼脂培养基

成分	含量
		酵母提取物	3g
麦芽提取物	3g
		蛋白胨	5g
右旋糖	10g
		琼脂	20g
蒸馏水	高达1升

表3：蛹虫草和紫芝肉汤培养基

成分	含量，g/l
		葡萄糖	40g
麦芽糖粉	40g
		NaNO3	2g
酵母提取物/蛋白胨	20g
		水	高达1升

但是用于培养所有其它灵芝菌种的培养基(表1)与特殊用于培养紫芝的培养基稍有不同(表3)。对于所有其它的灵芝菌种来说，KH₂PO₄和MgSO₄.7H₂O被用作无机源，但是对于赤芝来说，具有如表3所示组分的培养基是优选使用的(其中无机物是NaNO₃)。

实施例3：发酵装置中冬虫夏草的培养

使用一种液体培养基，其含有一种碳源、一种氮源、维生素、无机物和其它来自葡萄糖原始材料、麦芽糖或粉末、酵母提取物和食品级化合物的生长因子。为了生产虫草菌，例如冬虫夏草，分离的菌株首先接到固体培养基上培养。冬虫夏草的APN4-1(FIRDI-36421)菌株在YM斜面或平板琼脂培养基(表2)或PDA(表4)试管或琼脂平板上的培养基上25℃生长和/或保持3天。

对于一级种子培养物，使用实施例1描述的Erlenmeyer烧瓶摇动培养。每5升的圆锥烧瓶含有1升的肉汤培养基(表5或表6)在121℃灭菌20分钟，并接种入3-6个冬虫夏草APN4-1的斜面或平板培养物，随后在下述条件下生长：

●pH5.5(在接种前调整)

●25℃

●烧瓶以大约150转/分钟的速度在振荡器上旋转

●培养周期48小时。

冬虫夏草二级种子的培养，每个含有50升或更多的发酵培养基的75升(或更大的)搅拌生物反应器(BioLafitte)在(表1)121℃灭菌30分钟后用2升来自一级种子培养物的细胞接种(4％的接种量)。保持下述生长条件：

●pH5.5

●25℃

●1∶0.2-1∶0.9v/v/m的通气率(对于50升的培养基来说，1500-2700升/小时)

●搅拌速度200转/分钟

●培养周期48小时

对于冬虫夏草的培养，800升(或更大)的搅拌罐反应器(例如，BioLafitte)，每个含有600升或更多体积的发酵培养基(表1)被接入50升或更多的二级种子培养物(8％的接种量)。罐和发酵培养基在接种前121℃灭菌30分钟。

●pH5.5

●25-29℃

●搅拌速度200转/分钟

●一般1∶0.5-1∶1v/v/m的通气率(对于600升的培养基来说，18-36.0m³/小时)

●培养周期48-72小时

当菌丝体到了指数生长期末期时或达到生产目的繁殖足够的量时，800升生物反应器底部的阀门被打开，收集冬虫夏草的菌丝体并在真空过滤器或压滤机过滤；每个生物反应器得到高达100公斤的含有30％干物质的菌丝饼。然后菌丝饼在双椭圆旋转真空干燥器上被干燥或通过冷冻干燥，得到含有27-28％蛋白质的丝状粉末。丝状粉末用碾磨机磨成100-200目大小的颗粒。得到的粉末随后包装到铝袋中。

表4.马铃薯右旋糖琼脂培养基

成分	含量
		马铃薯提取物	4.0g
葡萄糖	20.0g
		琼脂	15.0g
PH	5.6g
		蒸馏水	高达1升

表5.烧瓶培养基-1

成分	含量g/l
		葡萄糖	40.0
麦芽糖粉	20.0g
		马铃薯右旋糖肉汤	24.0g
酵母提取物	10.0
		水	高达1升

表6.烧瓶培养基-2

成分	含量g/l
		葡萄糖	40.0
麦芽糖粉	40.0
		KH2PO4	1.5
MgSO4.7H2O	0.3
		酵母提取物/蛋白胨	20.0
水	高达1升

实施例4：发酵装置中gracilis虫草，memorabilis虫草和大团囊虫草的 培养

gracilis虫草APN4-2(FIRDI 32217)，memorabillis虫草APN4-3(FIRDI 32218)和大团囊虫草的菌株在YM斜面或平板琼脂培养基(表2)上25℃生长和保持3-5天。gracilis虫草，memorabillis虫草或大团囊虫草的斜面培养物被接种到250-ml Erlenmeyer烧瓶中的50ml生长培养基(表5，6记述的)中。菌丝体在旋转摇动器上以150转/分钟，25℃摇动培养72小时。

对于gracilis虫草，memorabillis虫草和大团囊虫草的商业生产来说，采用实例3记述的多阶段发酵。

实施例5：蛹虫草

发现在温度高于25℃时，菌株生长不好，而且在琼脂斜面/平板上也不能很好地生长。通过将0.6％的NaNO₃或0.01％的核黄素(维生素B2)添加到YM琼脂培养基(对照，表2)中，培养时间从7天缩短到3天(在强化培养基上生长)。蛹虫草APN4-5(FIRDI32219)在用其接种到实例3的多阶段发酵中之前，在强化YM培养基上17-23℃，优选20℃生长和保存3天。

因此，用来培养其它所有虫草菌菌株的培养基(表1)稍不同于特定用于蛹虫草的培养基(表3)。对于其它所有的虫草菌，KH₂PO₄和MgSO₄.7H₂O被用作无机源，而对于蛹虫草来说，则使用NaNO₃(表3)来替代。

虫草菌或灵芝菌中活性成分的提取方法目前在现有技术中被使用，不包含任何热水提取步骤。本发明提供一种包括热水提取步骤在内的方法，这种方法提高了来自药用真菌的可重获的活性成分量。使用的水也可以与pH缓冲液混合，调整到大约pH10。

实施例6：虫草菌生物活性成分的提取过程

根据本领域已知的传统方法，虫草菌或灵芝菌的活性成分被提取成为溶于水和溶于乙醇的混合物。但是，这些传统的提取方法不包括具体实施方式中提供的和下面记述的热水提取。传统方法中没有热水提取步骤，这样不能有效提取水溶的多糖。为了更有效，热水也可以缓冲到pH10。

大约1700g的湿虫草菌用大约6升的热水(大约90℃)浸湿过夜，也就是大约24小时或更长，伴随轻轻地搅动。随后过滤虫草菌，然后滤渣与2体积的99％的乙醇混合(每体积6升)。接着，添加乙醇到滤渣后得到的沉淀物被收集并在50％的乙醇中洗涤，随后冻干，得到2.9克的虫草菌多糖。

然后残渣被用来提取活性成分，用4倍的大约4升的80％乙醇溶解，并伴随轻轻的搅动。随后乙醇被蒸发掉，冷冻干燥所得浓缩物，得到101克的固体。除了乙醇之外可以使用其它溶剂，在本领域明显可以使用丙酮。

水提取物和乙醇提取物两者都可以被用于治疗。

实施例7：灵芝菌的孢子形成

根据实施例1-5，灵芝菌在生物反应器中培养48-72小时后，其中压力被升到至少2巴，并且通气率调整1∶0.4到1∶0.6v/v/m(大约1350-1500升/小时)，每升肉汤产生0.1克灵芝菌孢子。在这种压力下，发现灵芝菌产生如图5所示的担子孢子。

通过从反应器中汲取培养物，菌丝体被收集，并用真空过滤器或压滤机过滤以得到含有30％干物质的菌丝体饼。可以利用重力或控制真空压力，两者任选其一，通过聚酯针毡过滤介质来过滤培养基，制得总固体占10-20％的湿菌丝。

灵芝菌孢子穿过过滤器并保留在被过滤过的发酵液中(液体残渣)。对于不同种类的灵芝菌来说，每毫升过滤的发酵液中可获得的孢子数量的范围是10⁶-10⁷个。过滤的发酵液通过喷射式离心机离心浓缩液体以得到含30-40％的总固体，或洗涤两次直到发酵残渣被除去。孢子的浓缩溶液随后通过喷雾干燥或冷冻干燥而被干燥。每升发酵液获得产量高达3.0克。

在本发明之前，这种灵芝菌的孢子仅可以在固体生长培养基上生产，液体生长培养基主要用于生产菌丝体。灵芝菌的孢子与子实体相比，在TCM中被认为有更高的疗效和更高的价值。

实施例8：虫草菌的孢子形成

虫草菌孢子以与实例7中记述的灵芝菌同样方式生产。

实施例9：实施例1-8可改变的条件

上述给出的实施例中的参数对本领域技术人员来说可以明显进行调整。例如，灵芝菌和虫草菌的真菌在温度25到30℃的范围，pH4.5到7.0的范围下生长，而且依据参数培养周期范围从40小时到90小时。这些参数用于发酵的任何阶段，尽管在每个阶段它们可以优选不同的值。

但是，一些虫草菌的菌株，例如蛹虫草菌在17℃到23℃的温度范围内生长旺盛，优选25℃。因此这种真菌的生产系统最低温度优选17℃。

最大的生物反应罐中通常至少是1∶0.5v/v/m的通气比率，能明显维持已给出的培养基的体积。同样地，搅拌速度或摇动培养烧瓶的旋转速度可以从至少100转/分钟到任何容器能维持已给出的培养基体积的速度。

发酵第一阶段的体积在5升的圆锥烧瓶中通常是1升，但可以低到500毫升。发酵第二阶段一般在75升的容器中通常生长培养基的体积是50升。但是，为了生产，至少30升的体积可能足够。第三阶段，或生产阶段，发酵体积可能至少400升，尽管一般是600升或更多。

表1给出的新培养基的成分显示了培养基中成分可优选的浓度。但是至少葡萄糖30g/l、麦芽糖30g/l、酵母提取物15g/l、KH₂PO₄0.05g/l和MgSO₄.7H₂O0.05g/l也可用于培养真菌。

对于冬虫夏草和紫芝的生长培养基来说，无机源用NaNO₃替代KH₂PO₄和MgSO₄。浓度1g/l可能维持一个合理的生长率，尽管可优选的浓度是2g/l。

下面表7、表8和表9显示了野生虫草菌和灵芝菌粉末与建议的具体实施方式所生长的虫草菌和灵芝菌质量上的不同。

市场上的虫草菌和灵芝菌粉末的化学和卫生测定

表7.分析

项目	虫草菌	灵芝菌
			10％pH	5.5-6.0	5.5-6.5
湿度％	4	4
			蛋白(Kieldhal，Nx6.25)	28.9	27.7
灰分(套炉，550℃)	6.60	4.73
			铜，Cu(ppm)砷，As(ppm)铅，Pb(ppm)汞，Hg(ppm)	21＜1＜1＜0.1	7.8＜1＜1＜0.1
总需氧平板数，cfu/g总霉菌和酵母，cfu/gE.coli，Salmonella spp，和Staphylococcusaureus	500200没有	260100没有

表8.利用具体实施方式中提供的方法得到的虫草菌粉末的产品规格

产品说明	深层培养的虫草菌菌丝体粉，然后经过干燥，粉碎和灭菌
		产品图谱：蛋白质/糖蛋白：全部：	SDS-PAGE和western blotting傅立叶转换红外线光谱(FTIR)
物理外观：颜色：气味：颗粒大小：流动性：	粉末具有很好的流动性棕或浅棕轻微的发酵物味道100到200目自由流动
		PH(在10％的溶液中)	4.5-5.5
湿度％	低于5％
		活性成分：总蛋白：总水溶性多糖：虫草酸(甘露醇)：虫草菌素(3’-脱氧腺苷)：腺苷：	27-28％20％或更多5％或更多0.1％或更多0.15％或更多
灰分：	低于5％
		重金属：砷铜铅汞	＜0.01ppm＜15ppm＜0.2ppm＜0.01ppm
微生物限度：总细菌数，CFU/g总酵母和霉菌，CFU/g总E.coli，每克Staphylococcus aureus，每克Salmonella spp.，每克	依据新加坡药品规定＜102＜102无无无

表9：利用具体实施方式中提供的方法得到的灵芝菌粉末的产品规格

产品说明	深层培养的灵芝菌菌丝体粉，随后菌丝体干燥，并碾成粉末
		产品图谱蛋白质/糖蛋白：全部：	SDS-PAGE和蛋白质印迹傅立叶转换红外线光谱(FTIR)
物理外观：颜色：气味：颗粒大小：流动性：	粉末具有很好的流动性棕或浅棕轻微的发酵物味道100到200目自由流动
		PH(在10％的溶液中)	5.5-6.5
湿度％	低于5％
		总蛋白：	28-30％
总水溶性多糖(PS)：(克/100克粉末)	超过15％
		灰分：	低于7％
重金属：砷铜铅汞	依据新加坡药品规定＜0.01ppm＜15ppm＜0.2ppm＜0.01ppm
		微生物限度：总细菌数，CFU/g总酵母和霉菌，CFU/g总E.coli，每克Staphylococcus aureus，每克Salmonella spp.，每克	依据新加坡药品规定＜102＜102无无无

本发明具体实施方式生产的真菌可以用于组合物中，它包含几种虫草菌和灵芝菌的混合物。下面的表10-12给出了3个实例(配方1-3)：

表10.配方1(两种虫草菌)

	剂量，每个胶囊
		冬虫夏草菌丝体蛹草菌菌丝体	175毫克或350毫克75毫克或150毫克

表11.配方2(灵芝加上变色栓菌)

	剂量，每个胶囊
		紫芝菌丝体变色栓菌菌丝体赤芝孢子	100毫克或200毫克100毫克或200毫克50毫克或100毫克

表12.配方3(超级激发剂)

	剂量，每个胶囊
		冬虫夏草菌丝体蛹虫草菌菌丝体gracilis虫草菌丝体memorabillis虫草菌丝体大团囊虫草菌丝体赤芝孢子紫芝菌丝体	100毫克50毫克50毫克100毫克50毫克100毫克50毫克

实施例10：制备虫草菌糊状物

在实施例1-5记述的大规模培养方法完成后，菌丝体收集是利用重力将培养基通过针毡聚酯过滤器过滤或利用控制的真空压力制得含有10-20％总固体的湿菌丝，而不是收集并干燥。然后湿菌丝用水洗涤两次以除去培养基残留物。

获得的虫草菌糊状物的产量，每立方米发酵液250-500公斤。

含有10-20％总固体的湿菌丝置于匀化过程，用胶质磨粉机或用匀化器，或者任何合适的研磨设备。通过匀化得到0.5-3.0μm大小的湿菌丝颗粒。颗粒的大小可使湿菌丝在溶液中很好地扩散。获得的虫草菌制备物被称为“糊状虫草菌”。

表13显示了获得的“糊状冬虫夏草”特殊性质。图8和9显示的是冬虫夏草的菌丝和孢子图片。

表13：以糊状物形式的冬虫夏草的产品规格

产品说明	深层培养的冬虫夏草菌丝体，然后过滤，包装和在110-121℃干馏
		包装形式	产品糊状物形式，数量3公斤或定制大小，装入叠成薄片的干馏袋中
产品图谱蛋白质/糖蛋白：全部：	SDS-PAGE和蛋白质印迹傅立叶转换红外线光谱(FTIR)
		物理外观：颜色：气味：性质：	棕或浅棕轻微的发酵物味道糊状
PH(在10％的溶液中)	4.5-5.5
		总固体％	10-20％
成分(干成分)总蛋白：总水溶性多糖：虫草酸(甘露醇)：虫草菌素(3’-脱氧腺苷)：腺苷：	27-28％20％或更多5％或更多0.1％或更多0.15％或更多
		灰分：	低于5％
重金属：砷铜铅汞	依据新加坡药品规定＜0.01ppm＜15ppm＜0.2ppm＜0.01ppm
		微生物限度：总细菌数，CFU/g总酵母和霉菌，CFU/g总E.coli，每克Staphylococcus aureus，每克Salmonella spp.，每克	依据新加坡药品规定＜102＜102无无无

还评述了不同于冬虫夏草(C，sinensis)的其它的种或系的不同性质。

表14显示了这些性质。

表14：其它虫草菌菌株的性质

产物和细胞说明	1)蛹虫草视觉上是最苍白最细小的细菌丝，而冬虫夏草是最粗糙的2)蛹虫草糊状物更有牛奶香味3)粉状的蛹虫草尝起来是最甜的，大团囊虫草有点酸，冬虫夏草是比较苦的4)过滤的蛹虫草生物团比冬虫夏草和大团囊虫草更紧实5)在显微镜下，蛹虫草的子囊种有两个孢子，而相对照冬虫夏草中只有一个孢子(见照片)
		FTIR图谱	五种虫草菌在傅立叶转换红外线光谱(FTIR)中的图谱是非常不同的，如果需要可以被提供
活性成分：虫草酸	蛹虫草和大团囊虫草的含量高于9％，而冬虫夏草只有5-7％
		活性成分：虫草菌素	蛹虫草的含量是冬虫夏草的两到三倍。但是大团囊虫草中的虫草菌素的存在还没有被确定
活性成分：腺苷	在蛹虫草和大团囊虫草中，比冬虫夏草更高
		活性成分：抗真菌生素(balanol)	一种蛋白激酶抑止剂，仅在大团囊虫草中得到

实施例11：灵芝菌糊状形式的制备

使用上述实例中同样的方法，不同的是用灵芝菌替代虫草菌。

表15显示了灵芝菌糊状物的产品规格。

表15：以糊状物形式的灵芝菌的产品规格

产品说明	深层培养的灵芝菌菌丝体，然后过滤，包装和在110-121℃干馏
		包装形式	产品糊状物形式，数量3公斤或定制大小，装入叠成薄片的干馏袋中
产品图谱：蛋白质/糖蛋白：全部：	SDS-PAGE和蛋白质印迹傅立叶转换红外线光谱(FTIR)
		物理外观：颜色：气味：性质：	棕或浅棕轻微的发酵物味道糊状
PH(在10％的溶液中)	4.5-5.5
		总固体％	10-15％
成分(干成分)总蛋白：总水溶性多糖：	28-30％15％或更多
		灰分：	低于7％
重金属：砷铜铅汞	依据新加坡药品规定＜0.01ppm＜15ppm＜0.2ppm＜0.01ppm
		微生物限度：总细菌数，CFU/g总酵母和霉菌，CFU/g总E.coli，每克Staphylococcus aureus，每克Salmonella spp.，每克	依据新加坡药品规定＜102＜102无无无

实施例12：虫草菌“强化”牛奶的牛产

虫草菌强化的UHT牛奶的生产试验是在标准的Tetra PakUHT(超高温)车间进行的。

300升的新鲜牛奶倒入混合罐-Tetra Almix，其中加入固体含量12％的虫草菌糊状物1875克，使得每升牛奶含有750毫克的虫草菌。混合充分后，在泵入高压匀化器之前牛奶预热到75℃，在200-250巴的压力下牛奶被匀化。预热的、匀化的牛奶被泵入到UHT设备的加热部分，在其中在4秒钟内将该牛奶加热到140℃，然后冷却到25℃。冷却的牛奶被泵入到一个无菌的缓冲罐中，从此无菌的包装线连续生产出250毫升一袋的最终的虫草菌牛奶。

在Tetra Almix的混合过程中，虫草菌糊状物被很好地分散到新鲜牛奶中。在UHT流程中没有发现污染物(“污染物”在奶厂中涉及一个在管线或超滤中流动的问题，其中有机的特殊物质在管线中成团并引起流程或卫生的问题)。正如表18所示，pH记录和“UHT前”和“UHT后”白利糖度的量(“白利糖度”，与总固体的百分比有关，是基于折射率的)没有明显的不同。沉淀的量低于0.5％v/v。粘度的升高也不明显(也就是说从2到3厘泊)。

在感觉上，产品味道新鲜、滑爽而且有奶油口感。

产品的保温试验，在35℃和55℃下进行7天，显示出正常和满意的结果。产品在室温下9个月的储存期试验没有发现微生物数量的增长并表现出可接受的与普通UHT牛奶相反的感观结果。获得的产品的分析显示在表16中。

表16：产品分析记录单

未加工的牛奶	PH	°白利糖度	沉淀％v/v
				6.53	13.1	＜0.5
	UHT流程的虫草菌牛奶	试验	UHT之前				UHT之后
PH				6.59	6.50
		°白利糖度	14.0			14.9
沉淀％v/v				＜0.5	＜0.5
		浓度周/秒	2			3
最终产品的评价				试验			感观
	PH	6.48	新鲜牛奶的味道，滑爽而且奶油口感
				°白利糖度	15.0
	沉淀％v/v	0.5

实施例13：生产“强化”牛奶的一般方法的要点

根据本发明强化牛奶制备的一般方法的要点显示在图11中。步骤如下所述：

I)步骤(1)

新鲜奶指的是任何类型的液态牛奶，比如全脂牛奶、脱脂牛奶、复合牛奶等等。

II)步骤(2)

糊状物成分是指根据本发明制得的任何类型的活性糊状物成分。

III)步骤(3)和(4)

混合罐是任何类型的用于很好地混合液态牛奶和本发明的糊状物的搅拌设备。该流程确保使糊状物很好地分散到液态牛奶中。

IV)步骤(5)

混合牛奶+糊状物的混合物，并在UHT处理之前加热到75℃。

V)步骤(6)

另外要分解牛奶中的脂肪小珠以减少乳状物。作为标准的工业过程，匀化也被用来碎裂或很好地分散糊状物的颗粒或片段。

IV)步骤(7)、(8)和(9)

UHT处理是指在任何UHT厂的流程，其中混合物被泵入通过一个封闭的系统并在被冷却到75℃和随后被冷却到25℃前，在135-150℃被处理几秒钟，非直接加热或直接充入或灌入蒸气。

VII)步骤(10)

任何带有无菌储罐的无菌包装设备被用来将获得的强化牛奶包装成具有长保存期的任何形式的UHT牛奶产品。

VIII)步骤(11)

与UHT处理不同，标准的巴斯德灭菌过程可以被用来生产具有短保持期的巴斯德灭菌的强化牛奶。

实施例14：用虫草菌/灵芝菌提取物制备“强化”牛奶

实施例6提到的虫草菌和/或灵芝菌的提取物被用来强化奶产品和饮品。采用与实施例12和13记述的同样的方法将牛奶添加到虫草菌或灵芝菌提取物中。

实施例15：利用由虫草菌/灵芝菌孢子制得的粉末制备“强化”牛奶

根据实施例7或8得到的灵芝菌或虫草菌的孢子分别被收集，过滤和干燥，例如用双圆锥旋转干燥器或冷冻干燥。然后根据实施例12和13，将获得的粉末混合到牛奶中，用以制备依据本发明的牛奶组合物。

实施例16：利用由虫草菌/灵芝菌孢子制得的糊状物制备“强化”牛 奶

根据实施例7或8得到的灵芝菌或虫草菌的孢子分别被收集，过滤和依据实施例10或11操作。然后依据实例12和13，将制备的糊状物混合到牛奶中。

实验室试验的详述：通过SDS-PAGE和蛋白质印迹得到的赤芝和冬虫夏草中蛋白多糖和糖蛋白的图谱

目前，许多研究已经记述了来自灵芝菌和虫草菌的一组生理或药物活性成分是结合了多糖和/多聚糖的蛋白质[Y.Xu，Intl.J.FoodSci.Tech.，36，229-242(2001)]。在赤芝中具有分子量(MW)为12-18千道尔顿(kDa)的糖蛋白被发现有免疫抑止的活性[H.Tsunoo等人，美国专利5,334,704(1994)]或抗癌的功效[J.Zhang等人，Bio.Biotech.Biochem.，58，1202-1205(1994)]。冬虫夏草的多聚糖的片段被发现具有抗癌活性，能够在体内抑止小鼠恶性肿瘤180的生长[YJ.Chen，Life Sciences，60，2349-2359(1997)]。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)被用来分离通过已描述的方法得到的提取物中的蛋白，主要是基于它们的分子量。含有12％的丙烯酰胺的SDS-聚丙烯酰胺凝胶依据标准程序被制备(如Bio-Rad记述的)。电泳是在Mini-Protean3 Cell上进行，Bio-Rad的缓冲体系(更低和更高)：0.025M Tris，0.192M的氨基乙酸和0.1％SDS，pH8.3。提取物(0.5ml)与0.5ml的含有0.125M的Tris-Cl，4％的SDS和20％v/v的氨基乙酸，0.2M的DTT和0.02％的溴酚蓝的处理缓冲液混合，pH6.8。混合物(20μl)被装到凝胶上，在恒压300V、15mA下电泳2小时。然后凝胶在50％甲醇、10％乙酸和40％的水(v/v)组成的混合溶液中摇动至少2小时，随后在含有50％的甲醇、0.05％考马斯亮蓝、10％乙酸和40％水(v/v)的染液中，伴随慢慢的摇动染色4小时。凝胶在7％的乙酸、5％甲醇和88％水(v/v)的溶液中脱染，并保持在7％的乙酸，5％甲醇和2％的氨基乙酸溶液中。凝胶用纤维素膜覆盖并空气干燥。

蛋白质印迹的操作是将SDS-PAGE凝胶上的条带转移到硝化纤维素膜上，用Mini Trans-BlotElectrophoretic Transfer Cell，Bio-Rad，在含有25mMTris，192mM氨基乙酸缓冲液，在pH8.3，30V中央电压和90mA的限制电流下，至少18小时。转化的膜用Bio-Rad的免疫印记试剂盒染色来探测糖蛋白。

图6和7显示在赤芝和冬虫夏草的活性成分中发现的蛋白、糖蛋白和多聚糖的图谱。

老鼠的急性口服毒性试验

1)10只雄性和10只雌性的Sprague Dawly(SD)老鼠，6-8周大，由新加坡国立大学(NUS)的试验动物中心获得并在新加坡Kent Ridge动物保藏单位使之适应环境5天。根据它们的性别2或3只笼养在一起。室温保持在22-26℃，湿度在40-70％m，房间处于12小时照明和12小时黑暗的循环中。动物被喂以通常的实验室生物，不限制给予饮用水。在试验前，材料是口喂，饲料被停留一晚上。体重仅在定量给料前记录。

2)随后5只公鼠和5只雌鼠被随意选择并被分配，组成试验组。用“2g虫草菌和灵芝菌的粉末/20ml悬浮液”用填喂法喂给它们一个剂量，相当于2g/Kg老鼠体重。

3)其它的10只老鼠作为对照组并被喂以水，20ml/Kg老鼠体重。

4)服药后2小时观察所有的动物，在下一个2小时每小时观察。此后，每天至少观察一次，一直到15天。体重、饲料的量和水消耗程度都被监测。

5)15天后，记录体重，并处死老鼠。实施尸体解剖并进行大体的病理学观察。

用“固定服药方法”测定的灵芝菌和虫草菌粉末的LD50被认为大于2g/Kg体重。用本发明的物质口服给老鼠没有发现有毒性。采用的程序是OECD急性口服毒性-固定服药方法TG420的一个修正程序。

采用2g/Kg体重的剂量用于给药。

对老鼠进行虫草菌物质的免疫调节试验

1)方法

i)冬虫夏草乙醇提取物的制备

mycelia虫草的乙醇提取物，与实施例6中记述的相同，被用于研究老鼠的免疫调节。

方法：

200克被磨成粉的mycelia虫草浸到800ml的80％乙醇溶液中。混合物被摇动一个晚上，并重复几次直到菌丝体失去颜色。

以500转/分钟的速度离心5分钟除去残渣。在40-50℃的水浴温度下用旋转真空蒸发仪除去乙醇。

提取物被冷冻干燥一个晚上以制备用于动物研究的虫草菌菌丝体乙醇提取物的粉末。

ii)在老鼠身上免疫调节的评价草案

草案1：体内研究：

为了研究样品是否在老鼠体内刺激了巨噬细胞的活性，每个样品2个剂量溶解在水中，每个样品每天一次口服给5只老鼠，进行14天。5只对照鼠仅喂以水(对照组)。处理期结束时，所有的老鼠被处死，并用PBS从腹腔中取出巨噬细胞。

来自对照和处理组巨噬细胞被预备好，并以不同的效应物：目标物的比率(10∶1，5∶1，2∶1和1∶1)，与癌症细胞一起培养24小时。

培养期后，细胞混合物用MTT处理并用微板记录器测定。分析获得的结果以确定是否发现有明显的不同。

草案II：体外研究

未处理的老鼠的脾被取出，并准备脾细胞的单细胞悬浮液。脾细胞被置于96-孔的微平板中，并如下所述被分组：

i)阴性对照：细胞用盐处理

ii)阳性对照：细胞用免疫刺激物，LPS和Con-A处理

iii)处理1：细胞用不同剂量的样品处理

iv)处理2：细胞用不同剂量的样品和次佳剂量的Con A或LPS处理

v)处理3：细胞用不同剂量的样品和最佳剂量的Con A或LPS处理

细胞被培养48小时。培养期后，用MTT处理细胞以评价被样品处理的脾细胞的活性。

从不同组得到的数值被分析用以确定不同组的统计学的重要性。

缩写：

PBS：磷酸盐缓冲盐水

MTT：3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑溴化物

Con A：伴刀豆球蛋白A

LPS：脂多糖

2)结果

i)草案I：老鼠体内免疫调节试验

用mycelia虫草的80％乙醇提取物处理(以10mg/(Kg体重)和100mg/(Kg体重)剂量)的老鼠，当体外以1∶1和2∶1的低巨噬细胞：毒瘤比率试验时，结果是刺激了巨噬细胞的活性。当以10∶1的最高比率试验时，用提取物10mg/(Kg体重)处理的老鼠的巨噬细胞的活性也提高了。

ii)草案II：老鼠的体外免疫调节试验：

在分裂素、ConA和LPS不存在时，体外mycelia虫草的80％乙醇提取物浓度依赖性地和明显地提高了淋巴细胞的增殖。当有次佳量和最佳量的ConA存在时，仅在最高浓度试验(10μg/ml)中，T-淋巴细胞的活性明显升高。在此浓度，仅在LPS分裂素达到最佳量时，提取物明显地提高了B-淋巴细胞的增殖。

Claims (91)

1.一种用于大规模生产真菌的设备，包含：

一种生物反应器；和

一种液体培养基，包括具有至少一种碳源的水和至少500升的体积且pH至少是pH5；和

用于搅拌液体培养基的工具；和

用于保持液体培养基温度至少在17℃的工具；和

以至少1∶0.5v/v/m的比率向液体培养基通气的工具；和

消泡剂。

2.如权利要求1所述的设备，其中搅拌工具是搅拌器，其搅拌速率至少是100转/分钟。

3.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含酵母提取物。

4.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含的酵母提取物的浓度至少是15g/l。

5.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含蛋白胨源。

6.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含的蛋白胨源浓度至少为15g/l。

7.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含葡萄糖作为碳源之一。

8.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含浓度至少为30g/l的葡萄糖作为碳源之一。

9.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含麦芽糖作为碳源之一。

10.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含浓度至少为30g/l的麦芽糖作为碳源之一。

11.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含至少一种无机源。

12.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含硫酸镁作为无机源。

13.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含浓度至少为0.05g/l的硫酸镁作为无机源。

14.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含一元磷酸钾作为无机源。

15.如权利要求1所述的设备，其中液体培养基进一步包含浓度至少为0.05g/l的一元磷酸钾作为无机源。

16.如上述权利要求任一所述的设备，其中大规模生产的真菌是虫草菌。

17.如上述权利要求任一所述的设备，其中大规模生产的真菌是灵芝菌。

18.如权利要求16或17所述的设备，其中液体培养基的温度至少是17℃。

19.如权利要求1到11任一所述的设备，其中真菌是蛹虫草。

20.如权利要求1到11任一所述的设备，其中真菌是紫芝。

21.如权利要求19或20所述的设备，其中无机物包括硝酸钠。

22.如权利要求21所述的设备，其中硝酸钠的浓度至少是0.05g/l。

23.通过权利要求1所述设备得到的虫草菌。

24.通过权利要求1所述设备得到的灵芝菌。

25.一种在液体培养基中培养真菌的多阶段方法：

提供真菌来源；

将真菌接种到第一阶段的液体培养基中；

搅动第一阶段的液体培养基，让真菌生长一段时间；

将第一阶段的培养物接种到第二阶段的液体培养基中；

搅动第二阶段的液体培养基，让培养物生长一段时间；

将第二阶段的培养物接种到容纳在生物反应器中至少500升的液体培养基中；

搅动第三阶段的液体培养基，让培养物生长一段时间；

保持每个阶段液体培养基的pH值至少大约是pH5；

添加至少一种碳源到每个阶段的液体培养基中。

26.如权利要求25所述的方法进一步包含将葡萄糖、麦芽糖、一元磷酸钾、硫酸镁和酵母提取物添加到第二或第三阶段液体培养基中的步骤。

27.如权利要求25所述的方法进一步包含将浓度至少为15g/l的酵母提取物添加到第二或第三阶段液体培养基中。

28.如上述权利要求任一所述的方法，其中酵母提取物含有维生素。

29.如权利要求25所述的方法进一步包含将至少一种类型的无机物添加到第二或第三阶段液体培养基中的步骤。

30.如权利要求29所述的方法，其中无机物包含硫酸镁。

31.如权利要求29所述的方法，其中无机物包含一元磷酸钾。

32.如权利要求29所述的方法进一步包含将浓度至少为0.05g/l的硫酸镁添加到第二或第三阶段液体培养基中。

33.如权利要求29所述的方法进一步包含将浓度至少为0.05g/l的一元磷酸钾添加到第二或第三阶段液体培养基中的步骤。

34.如权利要求25所述的方法进一步包含：

在第一阶段液体培养基中培养真菌至少48小时；其中

液体培养基具有至少大约500ml的体积。

35.如权利要求25所述的方法，其中搅拌第一阶段液体培养基的步骤中包含以至少100转/分钟的速率旋转培养基的容器的步骤。

36.如权利要求25所述的方法进一步包含：

以至少1∶0.5v/v/m的比率向第二阶段的液体培养基充气；和

在体积至少大约50ml的第二阶段培养基中培养真菌至少40小时。

37.如权利要求25所述的方法，其中第二阶段液体培养基的搅动步骤包含以至少100转/分钟的速度搅拌第二阶段的液体培养基。

38.如权利要求25所述的方法进一步包含的步骤：

以至少1∶0.5v/v/m的比率向第三阶段分液体培养基充气；和

在体积至少大约500升的第三阶段培养基中培养真菌至少48小时。

39.如上述任何权利要求所述的方法，其中真菌包含虫草菌。

40.如上述任何权利要求所述的方法，其中真菌包含灵芝菌。

41.如权利要求39到40任一所述的方法进一步包含使液体培养基中的温度至少保持在17℃的步骤。

42.如权利要求25到38所述的方法，其中真菌包含蛹虫草；和

进一步包含使液体培养基的温度至少保持在17℃的步骤。

43.一种培养蛹虫草的方法，包含使蛹虫草在含有硝酸钠的培养基上生长。

44.如权利要求43所述方法，其中培养基中硝酸钠浓度至少为0.5％。

45.一种培养蛹虫草的方法，包含使蛹虫草在含有核黄素(维生素B2)的培养基上生长。

46.如权利要求45所述的方法，其中培养基中核黄素的浓度至少为0.01％。

47.通过如权利要求25-39或41-46所述的方法得到的虫草菌。

48.通过如权利要求25-38和40-41所述的方法得到的灵芝菌。

49.一种用于培养虫草菌或灵芝菌的生长培养基，包含：

葡萄糖；和

麦芽糖；和

水。

50.如权利要求49所要求的一种生长培养基进一步包含酵母提取物。

51.如权利要求50所要求的一种生长培养基，其中酵母提取物含有维生素。

52.如权利要求50或51所要求的一种生长培养基，其中酵母提取物浓度至少为15g/l。

53.如权利要求49所要求的一种生长培养基，其中葡萄糖浓度至少为30g/l。

54.如权利要求49所要求的一种生长培养基，其中麦芽糖浓度至少为30g/l。

55.如权利要求49所要求的一种生长培养基进一步包含无机物。

56.如权利要求55所要求的一种生长培养基，其中无机物包括磷酸钠。

57.如权利要求55所要求的一种生长培养基，其中无机物包括一元磷酸钠。

58.如权利要求55所要求的一种生长培养基，其中无机物包括二元磷酸钠。

59.如权利要求56、57或58所要求的一种生长培养基，其中无机物的浓度至少有1g/l。

60.如权利要求55所要求的一种生长培养基，其中无机物包括硫酸镁。

61.如权利要求60所要求的一种生长培养基，其中硫酸镁的浓度至少为0.05g/l。

62.如权利要求55所要求的一种生长培养基，其中无机物包括硝酸钠。

63.如权利要求62所要求的一种生长培养基，其中硝酸钠浓度至少为0.5g/l。

64.一种生产灵芝菌和/或虫草菌孢子的方法，包含：

使用至少2巴的压力来培养灵芝菌和/或虫草菌。

65.如权利要求64所述的方法进一步包含在生物反应器系统中培养灵芝菌和/或虫草菌。

66.如权利要求65所述的方法进一步包含在含有生物反应器系统中培养灵芝菌和/或虫草菌；和

一种液体培养基，包含具有至少一种碳源的水和至少500升的体积且pH值至少是pH5；和

用于搅动液体培养基的工具；和

用于使液体培养基的温度至少保持在17℃的工具；和

以至少1∶0.5v/v/m的比率向液体培养基通气的工具；和

消泡剂。

67.通过如权利要求64到66所述的方法得到的灵芝菌和/或虫草菌的孢子。

68.一种提取虫草菌成分的方法，包含；

在温度高于90℃的热水中浸泡虫草菌菌丝体至少12小时以获得混合物；

过滤混合物分成滤液部分和残渣部分；

用溶剂混合滤液以获得水溶性榨取物的沉淀；

用溶剂混合残渣并轻轻搅动；

除去溶剂以获得可溶于溶剂的榨取物。

69.根据权利要求68所述的方法，其中溶剂是有机溶剂。

70.根据权利要求69所述的方法，其中有机溶剂是乙醇。

71.根据权利要求68所述的方法，其中水与碱性缓冲液混合。

72.根据权利要求71所述的方法，其中水包含了pH10的碱性缓冲液。

73.根据权利要求68所述的方法进一步包含的步骤：

实行多于3个循环的用溶剂混合残渣的步骤，并在除去溶剂之前轻轻搅动以获得溶于溶剂的提取物。

74.根据权利要求25-46任一所述的方法，进一步包含收集、过滤菌丝体和洗涤菌丝体以除去存在于培养物中的培养基残渣的步骤。

75.根据权利要求74所述的方法制备的虫草菌和/或灵芝菌的糊状物。

76.包含至少下述成分的虫草菌：总蛋白质27-28％、总水溶性多糖至少20％、虫草酸至少5％、虫草菌丝至少0.1％和腺苷至少0.15％。

77.一种含有如权利要求76所述虫草菌特征的虫草菌糊状物。

78.包含至少下述成分的灵芝菌，总蛋白质28-30％，和总水溶性多糖至少15％。

79.一种制备被纯化的虫草菌和/或灵芝菌糊状物的方法，包含在权利要求49-63的生长培养基存在下培养虫草菌和/灵芝菌。

80.如权利要求79所述的方法，进一步包含收集、过滤菌丝体、和洗涤菌丝体以除去存在于培养物中的培养基残渣的步骤。

81.一种根据权利要求79-80任一所述的方法制备的虫草菌和/或灵芝菌糊状物。

82.一种单细胞的虫草菌和/或灵芝菌。

83.一种单细胞培养物包含基本上单细胞菌株的虫草菌和/或灵芝菌。

84.如权利要求83所述的单细胞培养物，包含基本上100％的灵芝菌和/或虫草菌的单细胞种。

85.一种饮料和/或食品，包含至少下述一种物质：如权利要求23所述的虫草菌、如权利要求24所述的灵芝菌、如权利要求47所述的虫草菌、如权利要求48所述的灵芝菌、如权利要求67所述的灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如权利要求78所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、如权利要求82所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌以及如权利要求83-84所述的单细胞培养物。

86.一种强化牛奶产品，包含使牛奶与下述至少一种物质混合：如权利要求23所述的虫草菌、如权利要求24所述的灵芝菌、如权利要求47所述的虫草菌、如权利要求48所述的灵芝菌、如权利要求67所述的灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如权利要求77-78所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、如权利要求82所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌以及如权利要求83-84所述的单细胞培养物。

87.一种制备强化牛奶产品的方法，包含使牛奶与下述至少一种物质混合：如权利要求23所述的虫草菌、如权利要求24所述的灵芝菌、如权利要求47所述的虫草菌、如权利要求48所述的灵芝菌、如权利要求67所述灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如权利要求77-78所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、如权利要求82所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌以及如权利要求83-84所述的单细胞培养物。

88.一种药用组合物，包含至少下述一种物质：如权利要求23所述的虫草菌、如权利要求24所述的灵芝菌、如权利要求47所述的虫草菌、如权利要求48所述的灵芝菌、如权利要求67所述灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如权利要求77-78所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、如权利要求82所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌以及如权利要求83-84所述的单细胞培养物。

89.权利要求88的药用组合物，进一步与制药学上可接受的赋形剂和/或稀释液结合。

90.下述至少一种物质的用途：如权利要求23所述的虫草菌、如权利要求24所述的灵芝菌、如权利要求47所述的虫草菌、如权利要求48所述的灵芝菌、如权利要求67所述的灵芝菌和/或虫草菌的孢子、如权利要求77-78所述的灵芝菌和/或虫草菌的糊状物，用于制造药物组合物，这种药物组合物至少可用于治疗肿瘤、巨噬细胞的活性刺激、系统刺激、肾和呼吸功能的刺激和增强身体循环功能。

91.一种肿瘤治疗、巨噬细胞活性刺激、和/或免疫反应刺激的方法，包含给予受体所需的下述至少一种物质：如权利要求23所述的虫草菌、如权利要求24所述的灵芝菌、如权利要求47所述的虫草菌、如权利要求48所述的灵芝菌、如权利要求67所述的灵芝菌和/或虫草菌的孢子、灵芝菌和/或虫草菌的糊状物、以及如权利要求82所述的单细胞灵芝菌和/或虫草菌、以及如权利要求83-84所述的单细胞培养物、如权利要求85所述的食品或饮料、如权利要求86所述的强化牛奶、如权利要求88-89所述的药物组合物。

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