CN1662655A - 含有β－葡聚糖的油脂组合物以及生产β－葡聚糖的新型微生物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了含β－葡聚糖的油脂组合物，其含有来自微生物或担子菌的β－葡聚糖。本发明的含β－葡聚糖的油脂组合物可使β－葡聚糖均匀地分散于食品中，而不降低该食品的味道、口感等。另外，使用本发明的新型微生物，可以从蔗糖等廉价糖类中以高生产速度高效率制备高活性高质量的来自上述微生物的β－葡聚糖。

Description

含有β-葡聚糖的油脂组合物以及生产β-葡聚糖 的新型微生物
技术领域
本发明涉及含有来自微生物或来自担子菌的β-葡聚糖的油脂组合物。本发明的油脂组合物可使β-葡聚糖均匀地分散于油脂中，通过用于食品等中，可以使具有生物调节功能的β-葡聚糖均匀地分散于食品等中，而且具有提高该食品等的味道、口感、风味等效果。
另外，本发明还涉及对得到上述β-葡聚糖有用的新型微生物以及使用此微生物制备β-葡聚糖的方法。
背景技术
β-葡聚糖的应用引起了广泛的注目，这是因为近年来的分析发现其具有优良的生物调节功能，例如脂质代谢改善作用、肠调节作用、抑制血糖值上升等或抗肿瘤效果和免疫增强作用。该物质在加工食品中的广泛应用产生极大的益处，不仅有助于增强加工食品的功能性(高附加值化)，而且迎合了广大国民保持健康的期望。β-葡聚糖包含于多种生物体中，例如包含于微生物、担子菌、植物中，主要是构成这些生物体的骨架。β-葡聚糖大部分作为以构成细胞壁的成分而存在。其是以具有β-1-2、1-3、1-4、1-6-D-吡喃葡糖键中的至少2种以上的键的葡萄糖聚合物作为主要成分。
特表2001-501996号公报中，对来自谷类和稻科植物的β-葡聚糖进行了研究，但是，来自谷类和稻科植物的β-葡聚糖有时含有多酚，会发生着色的问题。而且，还存在含量少、价格高的问题，限制了在食品中的应用。
另一方面，微生物或担子菌中，根据培养条件，存在向菌体外分泌与细胞壁成分相同的上述β-葡聚糖的菌株。微生物或担子菌的细胞壁中含有大量β-葡聚糖。
微生物或担子菌的菌体外分泌的β-葡聚糖、从微生物或担子菌中通过分离、提取、纯化等操作提取的β-葡聚糖、微生物和担子菌的细胞壁成分以及菌体自身等来自微生物和担子菌的β-葡聚糖添加到加工食品中的方法如下，例如，1)将微生物或担子菌的培养菌体直接添加到加工食品原料中的方法，2)将培养得到的微生物和担子菌的细胞壁成分进行分离、纯化，添加到加工食品原料中的方法，3)从菌体及分离的细胞壁成分中提取β-葡聚糖，将提取的β-葡聚糖添加到加工食品原料中的方法，4)将培养的微生物和担子菌的培养上清以及从培养上清中分离、纯化的β-葡聚糖添加到加工食品原料中的方法。
但是，上述1)和2)的方法的情况中，β-葡聚糖多为分子量1万以上的高分子量物质，也存在水难溶性的β-葡聚糖，要在加工食品原料中混合均匀非常困难，结果，添加了β-葡聚糖的加工食品中存在以下缺点：口感下降以及焙烤不均匀，由此降低产品价值等。
相反，上述3)和4)的方法有以下优点：β-葡聚糖能够比较均匀地添加到加工食品中，可任意调节β-葡聚糖的含量，所以这两种方法是有用的。但是，存在下列问题：提取、纯化的β-葡聚糖吸水性高，例如，如果直接添加到以小麦粉为主要成分的原料混合物中，加入水揉制，β-葡聚糖容易成团，使得混合物不均匀，导致味道、口感下降、质量降低。另外，虽然通过在原料混合物(主要为粉末)中添加预先溶解在水中的β-葡聚糖可得到含有分散比较均匀的β-葡聚糖的食品，但是由于在水中溶解需要时间，而且所得的水溶液呈粘性，不易制备均匀的水溶液，具有制作现场的作业性差以及不实用的缺陷。
因此，在制造含有来自微生物和担子菌的β-葡聚糖的加工食品时，期望建立在食品中可均匀分散的β-葡聚糖、而且简便地制造该加工食品的方法或者开发这种β-葡聚糖材料。
另一方面，作为使免疫系统活化的β-葡聚糖类，已知有植物细胞壁成分(特公昭62-6692号公报、特开2001-323001号公报)、担子菌(蘑菇)的子实体和菌丝体中含有的成分(K.Sasaki et al.，Carbohydrate Res.，Vol.47，99-104(1976)、特开平05-345725号公报)、微生物菌体的细胞壁成分和菌体外分泌生产的β-葡聚糖等。
微生物菌体的细胞壁成分均含有β-葡聚糖，具有增强免疫活性的作用，这是通常所熟知的。但是，作为安全性特别高、作为食品的利用价值也高的菌体，已知有酵母菌体(特开昭54-138115号公报、特开平09-103266号公报)、乳酸菌菌体(特开平03-229702号公报、特开平10-167972号公报)、短梗霉(Aureobasidium)菌体(特公平06-92441号公报)等。
另外，作为在菌体外分泌生产具有增强免疫活性功能的β-葡聚糖的微生物，如特开平03-2202号公报所记载的，已知有Macrophomopsis属、或生产热凝多糖(curdlan)的产碱菌属(Alcaligenes)(食物繊维の科学、p108、朝倉書店、1997年)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)(Agaric.Biol.Chem.47(6)，1167-1172(1983)、特开平6-340701号公报)。
担子菌(蘑菇)的子实体和菌丝体中含有的β-葡聚糖，免疫增强活性高，如从香菇(lentinus edodes)子实体提取的香菇多糖，也有的作为药物使用。但是通常，担子菌(蘑菇)的子实体和菌丝体中含有的β-葡聚糖，根据其生长、栽培条件，所含的β-葡聚糖量有很大变化，需要通过提取操作分离β-葡聚糖。结果，得到的β-葡聚糖涉及复杂多变的分子种类，高分子物质和低分子物质混合等，使质量变得不稳定。
这样，从担子菌(蘑菇)中稳定制造一定的具有高活性的β-葡聚糖成了当今的课题。另一方面，微生物菌体的细胞壁含有大量的β-葡聚糖，作为β-葡聚糖的供给源令人很感兴趣。但是，微生物菌体的细胞壁本身也含有β-葡聚糖以外的成分，而且由于是水不溶性物质，所以为了得到高效的水溶性β-葡聚糖，需要与担子菌同样进行提取操作，可以说确立稳定提取质量一定的β-葡聚糖的方法是一项课题。
相反，使用在菌体外分泌生产增强免疫活性高的水溶性β-葡聚糖的微生物发酵生产β-葡聚糖是非常有效的方法，采用该方法可以得到均匀且水溶性的高活性β-葡聚糖。基于这种观点，提出了使用已知在菌体外分泌生产高活性β-葡聚糖的短梗霉属微生物制造β-葡聚糖的方法。
然而，已知短梗霉属微生物如果使用蔗糖这种微生物培养通常使用的碳源来培养，则在菌体外分泌生产出芽短梗霉聚糖(pullulan)，α-葡聚糖(特公昭51-36360号公报、特公昭51-42199号公报)，制造高纯度的β-葡聚糖是困难的(特开平06-340701号公报)。另外，短梗霉属微生物俗名为黑酵母，由于菌体生产的黑色素使菌体或培养液着色成黑色，得到的β-葡聚糖也着色，所以制造的β-葡聚糖质量显著下降。为了改良这一点，提出了通过突变处理得到没有着色的突变体，使用该突变体制造出芽短梗霉聚糖等多糖的方法(特公平4-18835号公报)。但是，对于完全不生产黑色素、在菌体外有效分泌生产高纯度的β-葡聚糖(菌体外不分泌生产出芽短梗霉聚糖)的菌株尚不知晓。
另外，在β-葡聚糖制造过程，即培养工序中，对抑制生产的被列为杂质的出芽短梗霉聚糖的培养方法进行了各种研究，特开平06-340701号公报以及特开平07-51080号公报中，提出了调节pH或使用特殊的糖类作为碳源，可以抑制生产出芽短梗霉聚糖而生产高纯度β-葡聚糖的方法。这种情况中，在制造β-葡聚糖时存在的问题是：由于要设定特殊的培养条件，所以操作复杂，由于使用特殊的碳源，培养用的培养基的成本提高等。
如上所述，使用短梗霉属微生物生产β-葡聚糖，需要这样的菌株：即使以通常微生物培养所使用的廉价糖类作为碳源来进行培养，也不会生产出芽短梗霉聚糖等杂质或其生产受到抑制，而且，β-葡聚糖的制造过程中，实际上没有生产黑色素或其生产受到抑制，生产的β-葡聚糖不着色、在菌体外有效分泌生产高活性、高质量的β-葡聚糖的菌株。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以将具有优良的生物调节功能的β-葡聚糖均匀分散到食品中，而且不降低该食品的味道、口感等的β-葡聚糖材料。进一步地，本发明提供了用于从蔗糖等廉价糖类中以高生产速度有效制造高活性、高质量的β-葡聚糖的新型微生物、使用该微生物制造β-葡聚糖的方法、以及该微生物在菌体外分泌生产的β-葡聚糖。
本发明人进行了反复深入的研究，结果发现使用来自微生物和担子菌的β-葡聚糖，通过将其在油脂或油脂组合物中分散、混合，可以得到达成上述目的的β-葡聚糖材料，从而完成了本发明。
另外，本发明人为了达成上述目的，研究了具有在菌体外有效分泌生产高纯度β-葡聚糖能力的微生物。结果发现了在菌体外高效率分泌生产高质量β-葡聚糖的新型微生物。另外，进一步研究结果发现了属于耐抗生素放线菌酮(cycloheximide)的短梗霉属的菌株在菌体外能高效分泌生产高纯度的β-葡聚糖。
即，本发明提供一种含有β-葡聚糖的油脂组合物，其特征是含有来自微生物或担子菌的β-葡聚糖。
另外，本发明提供一种微生物，其中18S rRNA基因的1732碱基序列含有序列表的SEQ ID NO：1所示的碱基序列或以18S rRNA基因的碱基序列为基础的与该碱基序列分子系统学上同等的碱基序列，而且对于抗生素放线菌酮具有抗性，并能在菌体外分泌生产β-葡聚糖。
还有，本发明提供一种微生物，其中ITS-5.8S rRNA基因的563碱基序列含有序列表的SEQ ID NO：2中所示的碱基序列或以ITS-5.8S rRNA基因为基础的与该碱基序列分子系统学上同等的碱基序列，而且能在菌体外分泌生产β-葡聚糖，并优选对于抗生素放线菌酮具有抗性。
还有，本发明提供一种上述微生物，其能在菌体外分泌生产结构中至少具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖键的β-葡聚糖。
还有，本发明提供一种属于短梗霉属的上述微生物。
还有，本发明提供一种上述微生物，其为出芽短梗霉ADK-34(FERM BP-8391)。
还有，本发明提供一种制造β-葡聚糖的方法，包括培养上述微生物(优选用含有糖类作为碳源的培养基来培养)，使其在菌体外分泌生产β-葡聚糖。
还有，本发明提供一种制造β-葡聚糖的方法，包括培养ITS-5.8S rRNA基因的序列与序列表的SEQ ID NO：2中所示的碱基序列显示98％以上相同性的微生物(优选用含有糖类作为碳源的培养基来培养)，使其在菌体外分泌生产β-葡聚糖。
还有，本发明提供一种β-葡聚糖以及含有该β-葡聚糖的油脂组合物，该β-葡聚糖是通过培养出芽短梗霉ADK-34(FERM BP-8391)菌株、使其在菌体外分泌生产的，其结构中至少具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖键。
另外，本发明提供含有上述本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物的食品、以及含有上述本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物的具有预防生活习惯病作用的药物。
本发明最佳实施方式
下面对本发明加以详细说明。
本发明的油脂组合物中使用的β-葡聚糖是从微生物或担子菌得到的，即来自微生物的β-葡聚糖或来自担子菌的β-葡聚糖。
首先，对本发明中使用的上述来自微生物的β-葡聚糖加以说明。
由于微生物细胞自身在其细胞壁上含有大量β-葡聚糖，所以作为上述来自微生物的β-葡聚糖是将微生物接种到各增殖培养基使菌体增殖，得到的培养细胞可以直接使用，或将该培养细胞粉碎，除去内容物，使用得到的培养细胞壁残渣。另外，从上述培养细胞或上述培养细胞壁残渣提取的β-葡聚糖可以直接使用，或将该提取的β-葡聚糖纯化后使用。还有，也可以使用通过培养微生物而在菌体外分泌生产的β-葡聚糖。这种情况下，培养结束后的培养液可以直接使用，或从培养液中分离、纯化β-葡聚糖。
其中，直接使用将微生物接种到各增殖培养基以使菌体增殖而得到的培养细胞的情况中，由于细胞内容物有可能引起作为添加对象物的加工食品的味道、口感下降或物理性质降低，所以优选将该培养细胞粉碎，除去内容物，使用得到的培养细胞壁残渣。更加优选直接使用从上述培养细胞或上述培养细胞壁残渣提取的β-葡聚糖，或纯化后使用。最优选将在菌体外分泌生产的β-葡聚糖与培养液一起使用，或使用培养液的纯化物。
作为得到上述β-葡聚糖而合适的微生物，由于以往供食用的微生物安全性高，所以适合。即包括酵母菌、乳酸菌、纳豆菌、乙酸菌、曲霉菌、如小球藻和螺旋藻等藻类、属于短梗霉属的微生物等。这些微生物可以从环境中(例如食品、土壤、室内等)分离。另外，可以使用单菌分离的保存株或分离株，可进一步使用常用方法将其进行变异操作得到的变异株。变异操作，例如UV照射、或经亚硝基胍、溴化乙锭、甲基磺酸乙酯(ethane methane sulfonate)、亚硝酸钠等进行化学处理等。
上述酵母菌，例如包括啤酒、发泡酒、烧酒、日本酒、葡萄酒、威士忌酒等酒精酿造和制作面包工艺中使用的酵母菌属(Saccharomyces)的酵母类以及压榨酵母、酿造酱油使用的酵母、生产微生物蛋白质使用的念珠菌属(Candida)酵母菌等。
上述乳酸菌，通常使用乳杆菌属(Lactobacillus)和双歧杆菌属(Bifidobacterium)的杆菌、嗜柠檬酸明串球菌属(Leuconostoc)、片球菌属(Pediococcus)、链球菌属(Streptococcus)、乳球菌属(Lactococcus)的球菌等乳酸菌，其他可以使用肠道球菌属(Enterococcus)、漫游球菌属(Vagococcus)、肉杆菌属(Carnobacterium)、气球菌属(Aerococcus)、四联球菌属(Tetragenococcus)等乳酸菌。作为具体的乳酸菌株，可以使用以往使用的下述1种或2种以上的乳酸菌：德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus bulgaricus)、瑞士乳杆菌(L.helveticus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、德氏乳杆菌乳亚种(L.lactis)、干酪乳杆菌(L.casei)、短乳杆菌(L.brevis)、植物乳杆菌(L.plantarum)、清酒乳杆菌(L.sake)、唾液链球菌嗜热亚种(Streptococcus thermophilus)、乳链球菌(S.lactis)、酪链球菌(S.cremoris)、长双岐杆菌(Bifidobacterium Longum)、双岐双岐杆菌(B.bifidum)、短双歧杆菌(B.breve)、婴儿双岐杆菌(B.infantis)、乳脂明串球菌(Leuconostoc cremoris)、肠膜明串球菌(Ln.mesenteroides)、Ln.ocnos、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、啤酒片球菌(P.cerevisiae)、戊糖片球菌(P.pentosaceus)等。这些可以单独使用，也可以组合2种以上共同使用。另外，双歧杆菌属的乳酸菌的培养与其他乳酸菌的培养可以分别进行，也可以将它们混合。
作为上述属于短梗霉属的微生物，只要是通过培养该微生物便可在菌体外生产具有β键的葡萄糖聚合物的菌株均可，作为其例子，例如有出芽短梗霉菌株，具体地可以使用IFO4464、IFO4466、IFO6353、IFO7757、ATCC9348、ATCC3092、ATCC42023、ATCC433023等。其他可以使用从环境中(例如食品、土壤、室内等)分离的微生物。另外，可以使用单菌分离的保存株或分离株、可进一步使用常用方法将其进行变异操作得到的变异株。作为变异操作的例子，例如UV照射、或经亚硝基胍、溴化乙锭、甲基磺酸乙酯、亚硝酸钠等进行化学处理等。
其他可以使用的微生物包括芽孢杆菌属(Bacillus)的纳豆菌菌株、醋杆菌属(Acetobactor)的乙酸菌菌株、曲霉菌属(Aspergillus)的曲霉和青霉属(Penicillium)的菌株、小球藻和螺旋藻等藻类、干燥小球藻粉末、已知在菌体外分泌生产出芽短梗霉聚糖的短梗霉属的菌株、其他已知生产用作食品添加物的增粘多糖类的黄单胞菌属(Xanthomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)、固氮菌属(Azotobactor)、产碱菌属(Alcaligenes)、欧文氏菌属(Erwinia)、肠杆菌属(Enterobacter)、菌核属(Sclerotium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、Macrophomopsis属的菌株。
另外，上述微生物可以优选使用本发明的新型微生物，即“18SrRNA基因的1732碱基序列为序列表的SEQ ID NO：1中所示的碱基序列或以18S rRNA基因的碱基序列为基础的与该碱基序列分子系统学上同等的碱基序列，而且对于抗生素放线菌酮具有抗性，并具有在菌体外分泌生产β-葡聚糖的能力的微生物”，以及“ITS-5.8S rRNA基因的563碱基序列为序列表的SEQ ID NO：2中所示的碱基序列或以ITS-5.8S rRNA基因的碱基序列为基础的与该碱基序列分子系统学上同等的碱基序列，而且具有在菌体外分泌生产β-葡聚糖的能力的微生物”。本发明的这些新型微生物的详细情况在后面描述。
下面对本发明中使用的上述来自担子菌的β-葡聚糖加以说明。
由于担子菌子实体以及菌丝集合成块状的菌核中含有大量的β-葡聚糖，所以子实体以及菌核的微粉碎物、或者从粉碎物中提取的提取物、或者从提取物中纯化的β-葡聚糖等，均可以作为来自担子菌的β-葡聚糖使用。另外，使担子菌的孢子发芽，将菌丝体接种到各增殖培养基，使菌体增殖，得到的培养细胞可以直接使用，或将该培养细胞粉碎，除去内容物，使用得到的培养细胞壁残渣。另外，从上述培养细胞或上述培养细胞壁残渣提取的β-葡聚糖可以直接使用，或将该提取的β-葡聚糖纯化后，均可以作为来自担子菌的β-葡聚糖使用。另外，也可以使用通过培养担子菌而在菌体外分泌生产的β-葡聚糖，这种情况下，可以直接使用培养结束后的培养液，或从培养液中分离、纯化得到β-葡聚糖，均可以作为来自担子菌的β-葡聚糖使用。
其中，直接使用将子实体以及菌核微粉碎成的β-葡聚糖、以及从中提取的β-葡聚糖、将孢子和菌丝体接种到各增殖培养基以使菌体增殖而得到的培养细胞的情况中，由于细胞内容物有可能引起作为添加对象物的加工食品的味道、口感下降或物理性质降低，所以优选将该培养细胞粉碎，除去内容物，使用得到的培养细胞壁残渣。更加优选直接使用从上述培养细胞或上述培养细胞壁残渣提取的β-葡聚糖，或纯化后使用，最优选将在菌体外分泌生产的β-葡聚糖与培养液一起使用，或使用培养液的纯化物。
担子菌最优选栽培品种，本发明也可以使用来自不是商业生产的担子菌的β-葡聚糖。例如，姬松茸(Agaricus blazei)、羊肚菌(Morchella esculenta)(common morel)、乳牛肝菌(Suillus bovinus)、北方肉齿菌(Climacodon septentrionalis)、金针菇(Flammulinavelutipes)、牛舌菌(Fistulina hepatica)、木耳(Auricularia auricula)、竹荪(Dictyophora indusiata)、栗茸(Naematoloma sublateritium)、皱环球盖菇(Stropharia rugosoannulata)、鸡腿菇(Coprinus comatus)、分枝猴头菌(Hericium ramosum)、香菇(Lentinus edodes)、松露(Rhizopogon rubescens)、银耳(Tremella fuciformis)、Lyophyllumulmayium、杉平菌(Pleurocybella porrigens)、白黄侧耳(Pleurotuscornucopiae)、猪苓(Polyporus umbellatus)、栎生侧耳(Pleurotusdryinus)、冬虫夏草(Cordyceps)、滑菇(Pholiota nameko)、蜜环菌(Armillariella mellea)、假蜜环菌(Armillariella tabescens)、大白口蘑(Tricholoma giganteum)、榆耳(Gloeostereum incamatum)、胶齿菌(Pseudohydnum gelatinosum)、黄伞(Pholiota adiposa)、Pholiotaaurivella、红汁乳菇(Lactarius hatsudake)、平菇(Pleurotus ostreatus)、茯苓(Wolfiporia cocos)、草菇(Volvariella volvacea)、真姬菇(Hypsizigus marmoreus)、Myceleptodonoides aitchisonii、玉蕈离褶伞(Lyophyllum shimeji)、粟菇(Grifola frondosa)、硫磺菌(Laetiporussulphureus)、豹皮香菇(Lentinus lepideus)、蘑菇(Agaricus bisporus)、松口蘑(Tricholoma matsutake)、灵芝(Ganoderma lucidum)、剥茸(Panellus serotinus)、紫丁香蘑(Lepista nuda)、白牛肝菌(Boletusedulis)、猴头菌(Hericium erinaceum)、柳松菇(Agrocybe cylindracea)等。
从上述微生物或担子菌的培养细胞壁残渣分离β-葡聚糖的方法，例如有，在培养的微生物和培养的菌丝体或栽培的菌核和子实体中加入适量的溶剂，通过自身消化或通过添加水解酶破坏细胞壁的一部分，流去内容物，回收残渣成分，从培养细胞壁残渣分离出β-葡聚糖的方法。另外还有一种方法是，通过French Press超声波破碎仪等物理性损害微生物和担子菌的细胞，破坏细胞一部分，除去内容物，回收残渣，得到β-葡聚糖的方法。
β-葡聚糖的提取方法没有特别限制，只要在作为提取原料的微生物或担子菌中添加提取溶剂进行提取便可。提取溶剂可以使用水、盐溶液、水性酸溶液、水性碱溶液、有机溶剂等中的一种或二种以上的混合溶剂等。另外，通过组合使用分解细胞壁的酶可以提高提取效率。提取物可以使用用任何制造方法得到的物质、任何形式的物质、任何纯度的物质，例如可以使用固液分离得到的提取液、或将用已知的方法从提取液提取的β-葡聚糖进行浓缩得到的液体和固体状物、或用已知的方法从提取液中纯化得到的纯度更高的液体和固体状物等。当然，即使混合β-葡聚糖以外的提取成分也没有任何问题。本发明中，所有这些物质都称为从微生物或担子菌中提取的β-葡聚糖。
进一步对从微生物或担子菌中提取β-葡聚糖的方法加以说明。本发明中使用的β-葡聚糖，作为水溶性高分子可以在水等溶剂中溶解，例如，将一般市售的担子菌——蘑菇干燥、粉碎，在得到的粉末中用相对于粉末2～100倍量的溶剂如水、温水、热水或盐溶液、酸、碱性水溶液、有机溶剂等，可以在任意的温度下提取任意长的时间。进一步将提取液进行固液分离，可以得到β-葡聚糖。其中，优选用水、温水或热水提取的β-葡聚糖，更加优选用温度4～80℃水提取的β-葡聚糖。提取时也可以加入酶溶液等提取促进剂等。
本发明中使用的β-葡聚糖，优选具有至少2种以上选自下面的键的β-葡聚糖：β-1，2-D-吡喃葡萄糖键、β-1，3-D-吡喃葡萄糖键、β-1，4-D-吡喃葡萄糖键、β-1，6-D-吡喃葡萄糖键，特别优选含有β-1，3-D-吡喃葡萄糖键及β-1，4-D-吡喃葡萄糖键的β-葡聚糖，含有β-1，3-D-吡喃葡萄糖键及β-1，6-D-吡喃葡萄糖键构成的β-葡聚糖，含有β-1，3-D-吡喃葡萄糖键、β-1，4-D-吡喃葡萄糖键及β-1，6-D-吡喃葡萄糖键的β-葡聚糖。但是，由β-1，3-D-吡喃葡萄糖键构成的所谓的热凝多糖不包括在本发明的β-葡聚糖中。
另外，本发明中使用的β-葡聚糖为高分子量物质，虽然可以使用具有任意重量平均分子量(weight average molecular weight)的β-葡聚糖，但是，由于随着分子量降低与油脂的相容性增加，所以分子量小于300万的β-葡聚糖比较理想，优选小于50万，更加优选小于10万。可按照常规的方法降低提取的β-葡聚糖的分子量，以使与油脂具有改良的相容性，也可以直接提取低分子量的β-葡聚糖。
其中混合、分散有来自上述微生物、担子菌或来自本发明的新型微生物的β-葡聚糖的油脂或油脂组合物，只要可供食用，没有特别限制，例如可以使用下述任一种：米油(rice oil)、菜籽油、大豆油、棉籽油、棕榈油、棕榈核油、椰子油、橄榄油、鱼油、牛脂、猪油、可可脂，或者根据需要将上述油脂加工而成的氢化油、微氢化油(slightly hydrogenated oil)、异构化氢化油(hydrogenation isomerizedoil)、互酯化油(interesterified oil)、分馏油(fractionated oil)或者通过2种以上上述油脂加工而成的油脂，以及将2种以上上述油脂混合而成的油脂等。另外，也可以使用将油脂作为分散媒介或分散质的分散系，如这些食用油脂的乳化物(包括W/O乳化物或O/W乳化物、以及双重乳化物O/W/O乳化物及W/O/W乳化物、或更复杂的多重乳化结构的乳化物)和悬浮液等(以下本说明书中该分散系也作为油脂)。
在上述油脂中添加上述β-葡聚糖后混合，可以得到本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物。
将上述β-葡聚糖添加于上述油脂中的方法，对β-葡聚糖的形式没有特别限制，可以直接或将β-葡聚糖溶解在水及其他水溶性溶剂中后添加到油脂中。
当上述油脂为乳化物时，可以在已经乳化的油脂中添加β-葡聚糖，也可以在乳化时添加β-葡聚糖。另外，此时，将β-葡聚糖添加到油相、水相中都可以，但是优选首先将β-葡聚糖添加、分散到油相，然后与水相混合，因为这样可使β-葡聚糖与油脂相容良好，且得到均质的油脂组合物，可在短时间内得到含β-葡聚糖的油脂组合物。
另外，当上述油脂为油包水(water-in-oil)型或可塑化油包水型等时，如上所述，可以在油脂中添加β-葡聚糖后进行乳化，除此之外，也可以在乳化时添加β-葡聚糖，也可以在乳化后添加β-葡聚糖，也可以在塑化(plasticization)后添加β-葡聚糖。还有，当上述油脂为固体脂肪时，可根据需要用合适的方法使其软化或液化，然后混合β-葡聚糖。为了在高度均匀地使β-葡聚糖分散，希望相对于100重量份的粉末状β-葡聚糖添加10～50重量份的油脂，混合后进行滚压(rolling)或滚压与精炼(conching)组合。这时，也可以通过添加其他原料以及追加油脂等来调节最终所得含β-葡聚糖的油脂组合物中的该β-葡聚糖成分的含量。
在上述油脂中添加上述β-葡聚糖后的混合方法没有特别限定，理想的是将β-葡聚糖与油脂混合，于50℃或以上保持一定时间，优选5分钟-6小时，更加优选10分钟-2小时，可以得到β-葡聚糖分散均匀而且与油脂充分相容的含β-葡聚糖的油脂组合物。使用该含β-葡聚糖的油脂组合物制造的食品，与直接添加β-葡聚糖制造的相比，β-葡聚糖更均匀地分散于食品中，结果，产生显著的效果：不会降低味道、口感，出乎意料的是对因使用乳化剂而导致的风味下降具有缓和作用，以及提高食品的风味的效果等。
上述油脂与上述β-葡聚糖的混合手段没有特别限定，可以使用各种混合、捏合(kneading)、搅拌机。例如螺旋桨式搅拌机、往复旋转型搅拌机、筛孔混合机(orifice mixer)、浆叶型搅拌机(paddleagitators)、搅拌型乳化机(均质混合机)、粉碎搅拌机(cutter mixers)、捏合挤压机(cokneaders)、辊式精炼机(conches)、无噪音斩拌机(silentcutters)、喷射混合机(iet mixers)、真空搅拌机(vacuum agitators)、螺杆型混合机(screw mixers)、静态混合机(static mixers)、切削混合机(cutting mixers)、超声波乳化机、捏合机(kneaders)、辊压机(rolls)、Hydrossure、管道混合器(pipeline mixers)、通用混合机(universal mixers)、pin machine、均质器(高压均质器)、球刀、螺条混合器(ribbon mixers)等。优选在产品温度40℃-80℃下使用搅拌型乳化机(均质混合机)及/或均质器(高压均质器)。
将上述β-葡聚糖与上述油脂按上述方法混合搅拌后，本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物可以直接保存，也可以作成乳化物或快速冷却塑化。这时，可以使用Votator、Combinator、Perfector、Complector、Onreitor等，产品温度在10℃以下时优选使用pin machine。另外，也可以将上述油脂乳化，使用Votator、Combinator、Perfector、Complector、Onreitor等快速冷却塑化装置处理后，添加上述β-葡聚糖，用上述任一方法制备含β-葡聚糖的油脂组合物。
在本发明的组合物中，以β-葡聚糖以外的全部组分为100重量份计，上述β-葡聚糖的含量优选为0.01-500重量份，更优选为0.1-150重量份，特别优选为1-100重量份。如果β-葡聚糖的含量低于0.01重量份，则最终产品可能表现不出该β-葡聚糖的功能作用，如果β-葡聚糖的含量超过500重量份，则无论其他成分是什么，该混合物都变成粉末状或者块状，得不到β-葡聚糖均匀混合、分散的食用油脂组合物，加工成最终产品时仍残留块状物，β-葡聚糖分布不均匀的倾向明显。
还有，来自微生物或担子菌的提取液不进行纯化直接使用时，或者只将该提取液进行粉末化、固化处理后直接使用时，该成分中的β-葡聚糖的纯度为1-100％比较理想，优选10-100％，更加优选20-100％，纯度越高越好。
为了进一步抑制组合物中β-葡聚糖变成团状和块状等而分布不均匀，本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物中也可以添加乳化剂、凝胶剂、增稠剂、稳定剂等食品添加剂。这些食品添加剂只要能食用即可，没有特别限制。作为乳化剂，例如有卵磷脂、脂肪酸甘油单酯、失水山梨糖醇脂肪酸酯、丙二醇脂肪酸酯、糖酯等。作为增稠剂、稳定剂，例如有出芽短梗霉聚糖、车前子(Psyllium)、阿拉伯树胶、结冷胶(gellan gum)、葡甘露聚糖、瓜耳树胶、黄原酸胶、酸荚罗望子树胶、角叉菜聚糖、藻酸盐、farceran、刺槐豆胶、果胶、热凝多糖以及它们的低分子化合物，淀粉、加工淀粉、凝胶化淀粉、结晶纤维素、明胶、糊精、琼脂、葡聚糖等。其他食品添加剂包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、酶糖化糖(thick malt syrup)、乳糖、还原淀粉糖化物、异构化液糖、蔗糖结合的麦芽糖浆、寡糖、还原糖聚葡聚糖、山梨糖醇、还原乳糖、海藻糖、木糖、木糖醇、麦芽糖醇、赤藓醇、甘露糖醇、果寡糖、大豆寡糖、半乳寡糖、乳蔗糖寡糖、棉子糖、乳果糖、帕拉金糖寡糖、甜菊糖(stevia)、天冬甜素等糖类；磷酸盐(六偏磷酸盐、二代磷酸盐、一代磷酸盐)、柠檬酸的碱金属盐(钾、钠等)等稳定剂；α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、血清白蛋白等乳清蛋白质，酪蛋白，其他乳蛋白，低密度脂蛋白，高密度脂蛋白，卵黄高磷蛋白、卵黄蛋白、磷糖蛋白、卵白蛋白、伴白蛋白、卵类粘蛋白等卵蛋白，麦醇溶蛋白、麦谷蛋白、谷醇溶蛋白、谷蛋白等小麦蛋白质，其他动物及植物蛋白等蛋白质；氯化钠、岩盐、海盐、氯化钾等无机盐类；醋酸、乳酸、葡糖酸等酸味剂；β-胡萝卜素、焦糖、红曲色素(Monascus color)等着色剂；生育酚、茶叶提取物等抗氧化剂；全蛋、蛋黄、蛋清、酶处理蛋等蛋类；强力粉、中力粉、薄力粉等谷类；大豆粉等豆类；水、香料、乳制品、调味剂、pH调节剂、酶、食品防腐剂、适用期延长剂(shelf life extenders)、水果、果汁、咖啡、坚果仁糊(nut paste)、香辛料、可可块以及可可粉。上述列举的这些添加剂也可以组合2种以上并用。这些添加剂的添加量没有特别限制，可以按通常的量添加，例如，本发明的组合物中，这些添加剂的添加量为0.01-15重量％。
下面对本发明的食品加以详述。本发明的食品含有上述本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物，用该油脂组合物部分或全部替换食品中通常使用的油脂。其不仅包括人造黄油、起酥油等油脂食品，例如还包括焙烤制品、糖食、米加工品、小麦加工品、玉米加工品、大豆加工品、健康食品、药用食品等所有含油脂的食品。另外，本发明的食品，例如色拉油、炸用油(frying oil)、打泡奶油(whipping cream)等液体，液体起酥油等流动状物，或起泡性乳化脂以及调味品、油脂糊(fat spread)、蛋羹、稠糖蜜等糊状或乳状物，或起酥油、人造黄油、糖果、巧克力、掺油面粉糊型咖喱(roux type curry sauce mixes)等固体，都可以用本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物部分或全部替换这些食品中的油脂，按与原来同样的使用方式使用。
下面对本发明的焙烤制品加以具体描述。本发明的焙烤制品含有上述本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物，用该油脂组合物部分或全部替换焙烤制品中通常使用的油脂，制备面团，烤制而成。所述焙烤制品，例如有面包、馅饼、kasutera(日本式海绵蛋糕)、海绵蛋糕(sponge cake)、奶油蛋糕、松饼、华夫饼干、发酵糖食等。制备上述面团(dough)的方法没有特别限制，可以用本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物部分或全部替换现有已知的方法中所使用的油脂来进行制备。例如，当本发明的焙烤制品为面包时，面包面团可用与已知的操作方法相同的操作方法，由小麦粉、水、酵母、糖、食盐等常用的制作面包的原料与本发明的含β-葡聚糖的食用油脂组合物来制备。例如，混合后，包入本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物，按常规方法进行发酵、成形、焙烤等烤制而成。同样地，例如当本发明的焙烤制品为千层酥皮(folded pies)时，可以使用本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物部分或全部替换包入油脂或掺入油脂，当为馅饼皮时，部分或全部替换碎屑、草状等小片油脂，当为海绵蛋糕时，部分或全部替换打泡性乳化油脂或饼用液体油。
在制造焙烤制品伴有烤制工序时，如果直接添加、使用微生物和担子菌作为β-葡聚糖的供给源，或者在制备成面团后直接添加β-葡聚糖，或者在粉末等中直接混合β-葡聚糖后制备成面团，则容易在面团中形成块状物。形成团状和块状物时，使食品产生粗糙感和颗粒状的口感、水分不均匀和硬度不均匀引起的不舒服的口感。而另一方面，通过使用本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物，可使β-葡聚糖均匀地分散在面团中，很少形成团状和块状物，烤制成的最终制品不仅没有不舒服的口感，而且还大大提高了柔软性，得到具有良好口感的焙烤制品。
下面对本发明的糖食类加以具体描述。本发明的糖食类含有上述本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物，用该油脂组合物部分或全部替换糖食类中通常使用的油脂，制备面团，加工而成。其包括，例如将面团炸制而成的休闲零食品和炸面圈类、蒸制的蒸饼和豆沙包等蒸制糖食类。另外，其还包括，例如将上述本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物与糖、香料等混合，根据需要固化成形为糖果、口香糖、巧克力、粉质糖片等，还包括果冻汁露等冰点心。
作为糖食类，不仅需要注意风味，而且还要注意味道、特别是甜味，更重要的是没有块状物，即使非常小的块状物也会立即产生不舒服的口感，使产品价值降低。本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物，由于β-葡聚糖已经以均匀分散的形式存在，即使将其后添加至糖食类中混合时，仍可以使最终的本发明的糖食类含有均匀分散的β-葡聚糖，没有块状物，而且没有不舒服的口感，具有良好的风味。
本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物，可添加至包含对生活习惯病具有预防作用的食品成分的食品或药物中，以增强该作用。例如含有下述物质的食品或药物：使血脂浓度正常化的高级不饱和脂肪酸(EPA、DHA)、调节血清胆固醇的植物甾醇及其酯、二酰基甘油、γ-亚麻酸、α-亚麻酸、甜菜纤维、玉米纤维、车前子种皮、茶多酚、卵磷脂、可有效降低血压的干鲣鱼肽(bonito peptide)、沙丁鱼肽、酪蛋白十二肽、大豆分离蛋白等、可改善肠内环境并具有整肠作用的乳酸菌、葡糖酸、寡糖和各种食物纤维等。另外，通过在已知具有保健功能的物质中添加本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物，可以得到具有增强生物调节功能的食品和药物，所述具有保健功能的物质例如有小球藻、螺旋藻、蜂胶、甲壳质、脱乙酰壳多糖、核酸、灵芝(Ganoderma lucidum)、蘑菇(agaricus)、银杏叶提取物、罗汉果、姜黄(turmeric)、藤黄(garcinia)、苹果纤维、武靴叶(gymnema)、胶原、蓝莓、芦荟(aloe)、锯棕榈(saw palmetto)、植物发酵酶、大豆异黄酮(soybean isoflavon)、叶绿素、蜂王乳(royal jelly)、高丽人参、洋李(prune)，以及春黄菊(chamomile)、百里香(thyme)、鼠尾草(sage)、薄荷(peppermint)、香蜂草(lemon balm)、锦葵(mallow)、牛至(oregano)、猫草茶(cat nip tea)、西洋蓍草(yarrow)、玫瑰茄(hibiscus)等草药类。
另外，本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物添加至米加工品、小麦加工品、玉米加工品、大豆加工品中，可赋予这些产品更强的机能性。例如，米饭类(冷冻米饭、无菌米饭)；米粉、年糕块(rice chip)、脆米饼等米加工品；前面列举的焙烤制品，糖食类，还有意大利面、荞麦面、乌冬面(udon noodles)、酱味乌冬面(Houtou noodles)、中华面等面条类；其他小麦加工品；早餐谷物、玉米片等玉米加工品；豆腐和豆乳、豆乳饮料、豆腐皮、油炸豆腐、油豆腐块、炸豆腐丸、豆馅、豆酱等大豆加工食品。另外，所述油脂组合物可添加至各种食品中，主要包括乳、加工乳、酸奶、乳清饮料、乳酸菌饮料；奶油、奶酪等乳制品；凉粉、豆馅饼、豆馅等日本点心；肉汤、炖汤、咖喱汤等汤类；酱油、辣酱油、调味液、果酱、番茄汁等调味料；香肠等畜肉加工品；蒸鱼酱、烤鱼酱、炸鱼酱等经烤或蒸制成的海产加工品。
适于得到β-葡聚糖的微生物，在上述已有的微生物中例如有短梗霉属微生物，本发明提供一种生产β-葡聚糖的优良的新型微生物。下面对该微生物加以具体描述。
本发明的微生物，18S rRNA基因的1732碱基序列含有序列表的SEQ ID NO：1中所示的碱基序列或以18S rRNA基因的碱基序列为基础的与该碱基序列分子系统学上同等的碱基序列，而且对于由灰色链霉菌(Streptomyces griseus)等产生的抗生素放线菌酮具有抗性，并具有在菌体外分泌生产β-葡聚糖的能力。以及ITS-5.8S rRNA基因的563碱基序列含有序列表的SEQ ID NO：2中所示的碱基序列，或该碱基序列与以ITS-5.8S rRNA基因的碱基序列为基础的分子系统学上同等的碱基序列，而且具有在菌体外分泌生产β-葡聚糖的能力，并对于由灰色链霉菌等产生的抗生素放线菌酮具有抗性。
本发明的这些微生物，只要是具有上述特征的微生物，可以是下述任何菌株：野生株、保存株、保藏在保藏机构的菌株、变异株[UV照射、以及例如经N-甲基-N′-亚硝基胍(NTG)、吖啶、甲基磺酸乙酯(EMS)、亚硝酸等化学物质进行化学处理来诱发突变的变异株]、或者经细胞融合或基因重组菌株等生物工程学、遗传工程学的方法诱导的改良菌株等。
本发明的微生物也可以从环境中得到，例如从下列环境中得到：食品、野菜、水果、室内外的空气中(落下菌)、床、墙壁、天花板、屋顶、灰泥、混凝土、瓷砖的接缝、淋浴帘、塑料布、冰箱、洗衣机、浴缸、室内灰尘、植物体表面、土壤、河川、湖泊、海水等。
如实施例所描述的，本发明人等从环境中分离出了本发明的微生物。在分离出的本发明的微生物中发现有属于短梗霉属的微生物。其中，将能够在菌体外有效分泌生产纯度高、非着色性的β-葡聚糖的1种菌株命名为ADK-34菌株。该菌株保藏在独立行政法人产业技术综合研究所特许生物寄托中心(地址：日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6(邮政编码305-8566)、微生物的表示(保藏者提交的识别用表示)为“出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ADK-34”、保藏编号“FERM BP-8391”、保藏日期2003年6月2日。
另外，关于耐药性，由于根据菌株的情况、培养基的种类、培养时间，显示耐药性的浓度有时不同。本文中，术语“对放线菌酮具有抗性”是指以IFO-4466株、IFO-6353株以及IFO-7757株为基准，与这些菌株相比，对放线菌酮具有抗性。即，在含有放线菌酮的固体培养基(琼脂平板)上接种菌株，于26℃培养10天，这时，在具有没有发现这些IFO菌株生长的放线菌酮浓度的固体培养基上，观察直径0.1mm以上、优选0.3mm以上、更优选0.5mm以上的菌体增殖而形成的菌落。通常，如果固体培养基中的放线菌酮浓度为20μg/ml以上时，则没有发现这些IFO菌株生长。
另外，本发明中，非着色性或着色被抑制的菌株或培养液或β-葡聚糖，是指将培养液适当稀释，于490nm测定通过离心分离(10000g、10分钟)除去了菌体的培养稀释液的吸光度，同样培养得到的IFO-6353株的培养稀释液在490nm的吸光度显示大于0.1的条件下，本发明的微生物的菌株为小于0.099，优选小于0.060，更优选小于0.050。
另外，本发明中，高纯度是指对下述分析例3中所示的生成的多糖相对于出芽短梗霉聚糖(Pullulan)的纯度测定中，进行出芽短梗霉聚糖酶(pullulanase)处理时，酶处理后的苯酚硫酸值与酶处理前的苯酚硫酸值的比为大于75％，优选大于85％，更加优选大于90％。
本发明的微生物对于在菌体外高效率生产高纯度β-葡聚糖是有用的。本发明的微生物生产的该β-葡聚糖优选其结构至少具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖键的β-葡聚糖。
下面对使用本发明的微生物制造β-葡聚糖的方法的最佳实施方式加以说明。
使用本发明的微生物制造β-葡聚糖的方法中，可以使本发明的微生物的菌株作用于该微生物能够生长的培养基，在菌体外的培养基中生产β-葡聚糖。另外，也可以将培养本发明的微生物的菌株得到的培养菌体进行分离，使该培养菌体作用于含有作为β-葡聚糖底物的糖类的溶液或培养基，在菌体外生产β-葡聚糖。但是，由于有时准备分泌到菌体外的分泌型β-葡聚糖包含在菌体内，所以这种为准备分泌而在菌体内蓄积的β-葡聚糖在本发明中也作为菌体外分泌的β-葡聚糖。
使用本发明的微生物制造β-葡聚糖的方法中，作为培养本发明的微生物的菌株的培养基，可以使用下述常用的培养基：含有属于短梗霉属微生物可通常使用的营养源(碳源、氮源、无机盐类)，而且根据需要含有有机营养源。优选含有糖类作为碳源的培养液。这些培养基可以使用各种合成培养基、半合成培养基、天然培养基等任一种。
上述碳源，优选糖类，该糖类例如有葡萄糖、果糖、甘露糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等单糖；蔗糖、麦芽糖、乳糖、海藻糖等二糖；果寡糖、木寡糖等寡糖；糊精、淀粉等多糖。这些糖类可以单独使用或组合使用。其中，主要碳源优选使用葡萄糖、果糖等六碳糖；蔗糖、乳糖等二糖；淀粉、糊精或这些碳水化合物的水解物等多糖。另外，也可以使用以甜菜榨汁、甘蔗榨汁、柑橘类为主的果实榨汁或在这些榨汁中添加糖制成的产品等。其他，可以适当使用甘油、乙二醇等醇类；甘露糖醇、山梨糖醇、赤藓醇等糖醇类；有机酸等碳源。这些碳源可以在培养过程中随时添加，例如，培养基中适当加入蔗糖等糖类，优选使其达到3-500g/l的浓度范围，更优选5-300g/l的浓度范围，最优选10-200g/l的浓度范围，这样可以相对增加β-葡聚糖的生产速度及生成量。
上述氮源可以单独或组合使用下述氮源：胨、肉汁、大豆粉、酪蛋白、氨基酸、麦芽汁、玉米浸渍液、酪蛋白分解物、酵母提取物、尿素等有机氮源；和硝酸钠、硫酸铵、氨气、氨水等无机氮源。
上述无机盐类，例如可以使用氯化钠、氯化钾、碳酸钙、硫酸镁、磷酸钠、磷酸钾、氯化钴等盐类及重金属盐等，根据需要也可以添加维生素。还有，培养过程中发生打泡时，也可以在培养基中适当添加已知的各种消泡剂。
本发明的微生物菌株的培养条件没有特别限制，可以在该菌株能够良好生长的范围内适当选择。通常，在pH5.0～8.5、20℃～35℃下培养2～8天即可，这些培养条件可以根据使用的微生物菌株的种类及特性、外部条件等适当改变，可以选择最佳条件。另外，培养基中菌株的接种量，烧瓶培养时优选为一白金耳量，按比率放大时优选添加种培养液为主培养液的1～10％(v/v)，只要实际上能够培养则不在此限。
本发明的微生物菌株的培养在通气搅拌、振荡等有氧条件下进行。培养时间优选进行至达到作为目的物的β-葡聚糖的生成浓度，通常为2～5天。另外，也可以连续添加作为β-葡聚糖的底物的糖类和培养基成分，连续生产β-葡聚糖。作为β-葡聚糖的底物的蔗糖等糖类，可以直接以粉末的形式或以高浓度溶解在水中的糖浆的形式添加至培养液中，其添加量为每1L培养液优选添加0.1～500g。如果添加量大于500g/L，生产速度显著变慢，所以不理想。添加底物后，优选于25～35℃进行振荡并通气搅拌等操作1～7天，特别优选约2～5天。通过在有氧条件下进行反应，可以由作为底物的蔗糖等糖类制造β-葡聚糖。
另外，将通过培养本发明的微生物菌株得到的培养菌体进行分离，以该培养菌体或该培养菌体的提取液作为催化剂也可以制造β-葡聚糖。这时，在培养菌体、培养菌体制备物或培养菌体处理物的悬浮液中添加作为底物的糖类溶液或培养基即可。上述培养菌体制备物，例如包括将该培养菌体进行均质化处理得到的细胞粉碎液等。另外，上述培养菌体处理物，例如包括将培养菌体或细胞粉碎液固定在藻酸凝胶中、离子交换树脂、陶瓷、脱乙酰壳多糖等中得到的固定化菌体等。制备这些培养菌体、培养菌体制备物或培养菌体处理物的悬浮液可使用的溶液，例如包括上述培养基，或三醋酸、三盐酸、琥珀酸钠、柠檬酸钠、磷酸钠、磷酸钾等缓冲液，它们可以单独使用或混合使用。该缓冲液的pH优选为3.5～9.0，更优选5.0～8.0、最优选5.2～7.8。上述悬浮液中的培养菌体的量没有特别限制，优选按湿容量比为0.1～10％。
可以以任意浓度、任意量往上述悬浮液中添加作为底物的糖类和培养基，每次底物的添加量优选在可以维持菌体活性的范围。例如，每1L悬浮液可以1次或分几次添加0.1～500g底物，也可以按0.5～500g/天连续添加底物。通过将含有菌体和底物的溶液在任意温度下培育任意长的时间，可以生产β-葡聚糖。该培育优选在与上述本发明的微生物菌株培养的同样条件下进行。
进行如上所述的培养后，将菌体外分泌生产的β-葡聚糖按常规方法从培养液中分离、提取。具体地，可以选择、组合各种已知的纯化方法来进行，如通过离心分离、过滤等从培养液中分离除去菌体等固体，或使用活性炭、离子交换树脂等除去杂质以及盐类等。进一步地，可以通过单独或适当组合下述方法来进行分离纯化，根据情况可以反复使用，例如疏水性树脂吸附、洗脱，使用乙醇、甲醇、乙酸乙酯、正丁醇等溶剂沉淀，采用硅胶等的柱体法或薄层色谱法，使用反相柱的制备用高效液相色谱法等。
另外，在用上述方法分离菌体外分泌生产的β-葡聚糖的前后，也可以对菌体进行灭菌。灭菌温度只要是使菌体死亡的温度即可，没有特别限制，优选大于50℃，更优选大于60℃，最优选大于80℃。另外，进一步升高温度，例如，90℃以上，或加压下于121℃，可以热水提取菌体内和准备分泌的β-葡聚糖。灭菌时间和热水提取时间可以设定任意的时间，优选10分钟～8小时，更优选15分钟～6小时，最优选30分钟～2小时，这样可以抑制混入杂质，防止β-葡聚糖劣化，所以比较理想。
另外，使用ITS-5.8S rRNA基因序列与序列表的SEQ ID NO：2中所示的碱基序列显示98％以上相同性的微生物代替本发明的微生物，如上述同样也可以制造β-葡聚糖。
还有，优选使用出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ADK-34(FERM BP-8391)菌株制造β-葡聚糖，可以得到其结构至少具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖键的β-葡聚糖。
使用本发明的微生物制造β-葡聚糖的方法，与使用目前已知的出芽短梗霉菌株或其它属于短梗霉属的微生物进行的培养相比，具有以下优点：显著抑制出芽短梗霉聚糖的生产，所以容易从培养物中分离β-葡聚糖，而且可以使为得到高纯度β-葡聚糖进行的纯化操作简单化。还有，与属于短梗霉属的微生物、酵母、乳酸菌等菌体的细胞壁和担子菌以及植物中提取的β-葡聚糖相比，使用本发明的微生物生产的β-葡聚糖杂质少，分离纯化操作可以简单化的同时，还可显著抑制β-葡聚糖着色，所以易于稳定得到高质量且质量保持一定的β-葡聚糖。
本发明中得到的β-葡聚糖没有着色，质量高，可以直接或添加到其他制品中，用于各种用途。
作为本发明中得到的β-葡聚糖的用途，例如包括食品、食品添加剂、化妆品、卫生用品、化学品、药品等。
下面列举食品的具体例子。
作为油脂食品，例如有人造黄油、起酥油、蛋黄酱、奶油、色拉油、炸用油、打泡奶油、起泡性乳化脂以及调味品、油脂糊、蛋羹、稠糖蜜等。本发明中得到的β-葡聚糖，与油脂相容性良好，如上所述，优选将其添加到油脂中，制成含有β-葡聚糖的油脂组合物(本发明的含β-葡聚糖的油脂组合物)后，与其他原料一起使用。
与谷类相关的制品，例如包括以小麦粉作为主要成分的食品、以米类作为主要成分的食品、米加工品、小麦加工品、玉米加工品、大豆加工品等。例如面包、甜面包、丹麦馅饼等焙烤制品；薄煎饼、炸面圈、比萨饼、拌面油炸鱼虾等，以及它们的预混料(premix)；饼干、甜酥饼、休闲零食品等点心类；生面、干面、方便面、杯装方便面、乌冬面、荞麦面、中华面、米粉、意大利面等面类制品；蒸米饭、米糕、无菌米饭、软罐头蒸米饭、上新粉、饼粉、团子、脆米饼、年糕块等米类制品。
糖食，例如包括巧克力、糖果、水果糖、口香糖、烤制糖果、蛋糕、包子等洋糖食或日本糖食等。
畜肉加工品，例如包括有火腿、香肠、汉堡包等。海产加工品，例如包括有烤鱼酱、蒸鱼酱、炸鱼酱、鱼肉香肠等。
乳制品，例如包括有奶油、奶酪、冰淇淋、酸奶等。
饮料，例如包括有啤酒、酒、日本酒、威士忌酒、白兰地、洋酒、烧酒、蒸馏酒、发泡酒、葡萄酒、果酒等酒精饮料，咖啡、红茶、日本茶、乌龙茶、中国茶、可可、碳酸饮料、营养饮料、运动饮料、咖啡饮料、碳酸饮料、乳酸菌饮料、果汁、果汁饮料等饮料。
调味料和调味品，例如包括有香料、佐料汁、烤肉汁、色拉酱、辣酱油、豆酱、酱油、咖喱(curry sauce mixes)、碎牛肉调味品等。另外，汤，例如包括有玉米汤、土豆汤、南瓜汤等。其他例如有果酱、花生酱、撒在饭上的粉状食品等。
长期保存食品，例如有罐装或者瓶装的水产、畜肉、水果、蔬菜、蘑菇、成牛肉、果酱、番茄等食品及冷冻食品等，另外，例如还有咖喱、焖制品、肉制调味料、麻婆豆腐、肉与蔬菜的混合焖制品、汤、米饭等软罐头食品。另外，粉末状食品，例如有饮料、汤、酱汤等的粉末状方便食品等。
例如还有健康食品、药用食品、离乳食品等婴儿食品、流动食品等病人食品、老人食品、减肥食品、补充食品等。
还包括电灶加热食品、电灶烹调食品等。
食品添加剂，包括有乳化剂、增稠剂、增稠稳定剂、品质改良剂、抗氧剂、稳定剂、保存剂、香料、甜味剂、着色剂、漂白剂、酸味剂、胶基(gum bases)、调味剂、苦味剂、营养强化剂、香辛料、制造用剂等。
化妆品、卫生用品，例如包括有皮肤化妆品、头发用化妆品、药用化妆品、口腔用剂等，具体地例如有化妆水、乳液、润肤霜、软膏、洗剂、炉甘石洗剂、防晒剂、晒黑剂、须后修护液、剃须液、化妆底霜、面膜、洁面剂、洗面剂、痤疮化妆用品、精华液等基础化妆品；粉底、美白粉、眼影、眼线液、眉膏、腮红、口红、指甲油等彩妆用化妆品；洗发水、洗涤剂、护发素、染发剂、焗油膏、定型液、整发剂、生发剂、养发剂、爽身粉、体香剂、脱毛剂、香皂、沐浴露、洗手液、香水、牙膏、口腔保护剂、沐浴剂等。
化学品，例如包括有表面活性剂、乳化剂、增稠剂、粘度调节剂等。
药品，例如包括具有降低胆固醇作用、整肠作用、抑制血糖值升高作用等、对生活习惯病具有预防作用的药品、具有免疫增强作用的药品等。
下面通过实施例对本发明更详细地加以说明，但这些实施例并不是限制本发明的范围。还有，只要没有特别说明，“份”和“％”都是指重量份和重量％。
[分析例1]β-葡聚糖的鉴别方法和含量的测定方法
多糖中的β-葡聚糖的分析，是用苯酚硫酸法测定经乙醇沉淀制得的多糖总量，然后用生化学工业株式会社制造的检测、测定具有β-1，3-D-吡喃葡萄糖键的β-葡聚糖的试剂盒，对沉淀的多糖中的β-葡聚糖进行鉴别、定量。下面说明其步骤。
首先，用苯酚硫酸法测定待测样品中的多糖总量。即，往30μl样品溶液中加入30μl蒸馏水，然后向其中加入120μl含有300mMNaCl的磷酸缓冲液(pH6.9)，再添加540μl(3倍量)乙醇，于-15℃放置10分钟，沉淀多糖。除去上清液后，添加100μl蒸馏水溶解沉淀。向其中加入100μl的5重量％苯酚水溶液和500μl硫酸，反应后，测定该溶液在490nm处的吸光度。另外，不加入样品，往100μl蒸馏水中加入100μl的5重量％苯酚水溶液和500μl硫酸，将该溶液作为空白溶液，测定该空白溶液在490nm处的吸光度。由10mg/ml出芽短梗霉聚糖(Pullulan)作2倍系列稀释，将其作为标准样品，使用该标准样品制成标准曲线，由该标准曲线和上述吸光度对样品中的多糖总量进行定量。
然后，将多糖总量为0.1～1mg/ml左右的溶液先用1.0M NaOH进行10倍稀释，然后用无β-葡聚糖的蒸馏水稀释，稀释至1010倍，制备β-葡聚糖稀释液。将50μl的β-葡聚糖稀释液放入试管中，添加50μl主反应试剂，于37℃保温30分钟。然后，加入50μl亚硝酸钠溶液、50μl氨基磺酸铵、50μl N-甲基-2-吡咯烷酮，反应后，测定溶液在545nm(参考波长630nm)处的吸光度。另外，使用所附β-葡聚糖标准品制备7.5～60pg/ml的β-葡聚糖溶液，制成标准曲线，由该标准曲线和上述吸光度算出各β-葡聚糖稀释液的浓度，求出样品中的β-葡聚糖含量。
[分析例2]β-葡聚糖的分子量的测定方法
β-葡聚糖的分子量的测定方法如下。样品中加入3倍量的乙醇，冷却至-20℃放置10分钟，得到沉淀。将5mg沉淀的β-葡聚糖放入试管中，添加1ml蒸馏水，使其在沸水中溶解。将该溶液通过0.22μm的过滤器，制备用于HPLC的样品。使用HPLC凝胶过滤柱，Shodex填充柱KS-805(昭和电工社制)进行分离，流速为0.6ml/分钟，温度为50℃。使用RI检测器进行检测，使用水作为分离溶剂。使用Shodex Pullulan标准液P-82(昭和电工社制)作为分子量标记进行测定。
[分析例3]培养液中存在的多糖出芽短梗霉聚糖(Pullulan)的纯度的测定方法
使用特异性分解出芽短梗霉聚糖(Pullulan)的酶出芽短梗霉聚糖酶(和光纯药工业社制)对培养液中生产的多糖出芽短梗霉聚糖的纯度进行测定。即，在使用出芽短梗霉聚糖酶进行酶消化反应前后测定多糖量，由酶处理后的多糖量(没有被出芽短梗霉聚糖酶消化的多糖量)和酶处理前的多糖量算出生成的多糖出芽短梗霉聚糖的纯度。下面详细说明多糖量的测定方法。
首先，在50μl出芽短梗霉聚糖酶稀释液中加入2ml柠檬酸缓冲液(10mmol/l柠檬酸-20mmol/l磷酸缓冲液(pH6.0))制备酶溶液。作为阳性对照，将出芽短梗霉聚糖(东京化成工业社制)稀释成10mg/ml的溶液作为标准样品溶液使用。量取培养液或标准样品各30μl，装入2个样品试管(1.5ml容量)，在其中一个试管中加入30μl酶溶液，在另一个试管中加入30μl PBS，于37℃反应1小时。反应结束后，在各样品中加入3倍量的乙醇。充分搅拌，于-15℃保温10分钟后，于4℃、15000rpm下离心分离10分钟，弃去上清液，干燥试管，得到沉淀。在沉淀中加入100μl蒸馏水，搅拌，加入100μl 5重量％苯酚水溶液，立即加入500μl硫酸显色。冷却后，各取100μl分注到96孔微孔板上，蒸馏水中添加5重量％苯酚水溶液和硫酸，作为空白溶液，测定在490nm处的吸光度。另外，使用将出芽短梗霉聚糖稀释成10mg/ml～1μg/ml的溶液制成标准曲线，由该标准曲线和上述吸光度对酶消化反应前后的培养液中的多糖量分别进行定量，算出培养液中存在的多糖出芽短梗霉聚糖的纯度。还有，将作为标准样品的出芽短梗霉聚糖溶液进行酶消化时，10mg/ml溶液中得到90％以上的消化率，1mg/ml浓度的溶液中得到95％以上的消化率，0.1mg/ml或以下的溶液中得到98％以上的消化率。如上所述，当生成出芽短梗霉聚糖时，通过出芽短梗霉聚糖酶的作用，酶处理后的苯酚硫酸值(吸光值)变低，例如，吸光值减少50％时，算出多糖出芽短梗霉聚糖的纯度为50％。
[制造例1]来自蘑菇的β-葡聚糖的制备
1)蘑菇提取液的制备
将姬松茸的子实体破碎、粉碎，在其10kg粉碎物中加入50升热水，煮沸条件下温和搅拌的同时进行热水提取处理3小时。热水提取处理后，离心分离，得到其分离液。
2)蘑菇提取液的纯化物的制备
在上述1)得到的分离液中加入3倍量的99％乙醇，得到沉淀物，冷冻干燥，得到粗纯化物1200g(来自蘑菇的β-葡聚糖粗纯化物：样品A)。算出1g样品A中含β-葡聚糖的量为860mg。另外，最大峰分子量显示为100万。
3)蘑菇酶处理提取物的制备
1kg姬松茸的子实体中加入2升水，用混合机进行破碎。其中添加2g Funcelase(ヤクルト社制)，混合，于55℃进行酶反应3小时。然后，升温至85℃，保持10分钟，使酶失活。加入3升蒸馏水，充分混合后，除去残渣，得到4.5升提取液(来自蘑菇的酶处理β-葡聚糖提取液：样品B)。算出1ml样品B中含β-葡聚糖的量为93mg。另外，分子量分布在1万～80万，最大峰为12万。
4)蘑菇菌丝体培养物的制备
500ml容量的三角烧瓶中，分注120ml葡萄糖马铃薯煮汁培养基(葡萄糖2％、马铃薯200g/l)，于120℃灭菌30分钟，接种另外斜面培养基保存的金针菇IFO-30602的菌丝，于25℃用旋转式培养装置以200rpm培养10天。合并4个三角烧瓶的培养物，用生理盐水洗涤培养基，冷冻干燥，得到8g干燥菌丝体。在1g得到的菌丝体中加入10ml 0.2M氢氧化钠溶液，于15℃搅拌提取1昼夜。提取物用盐酸调pH为3.0，于120℃高压处理30分钟。通过离心分离得到上清液后，用磷酸氢二钠调pH为7.0，加入3倍量的乙醇，得到沉淀。在沉淀中加入10ml蒸馏水，得到样品C。算出1ml样品C中含β-葡聚糖的量为40mg。另外，最大峰的分子量为20万。
[制造例2]来自微生物的β-葡聚糖的制备
1)菌体细胞壁的制备
在溶解了0.5％的溶血卵磷脂的水中，悬浮菌体达到1g/ml的浓度，用超声波破碎仪处理10分钟，通过离心分离除去上清，将沉淀冷冻干燥，制备细胞壁成分。使用市售的森永乳酸菌末(森永乳业社制)作为乳酸菌菌体制备乳酸菌体细胞壁(样品D)，使用市售的压榨酵母(Dia-Yeast：协和发酵社制)作为酵母菌体制备酵母菌体细胞壁(样品E)，使用市售的干燥小球藻(日本クロレラ工业社制)作为小球藻菌体制备小球藻菌体细胞壁(样品F)。在各10mg样品中加入1ml 1M氢氧化钠溶液，于50℃提取1昼夜。将离心分离后的上清液用蒸馏水作10倍～100倍系列稀释，测定β-葡聚糖，算出各10mg样品中含β-葡聚糖的量：样品D为2.8mg、样品E为4.9mg、样品F为3.5mg。然后测定分子量。各10mg样品中加入1ml 1M氢氧化钠溶液，于50℃提取1昼夜，在离心分离得到的上清液中加入3倍量的乙醇，将沉淀物溶解在1ml蒸馏水中。各样品的平均重量分子量为样品D为120万、样品E为200万、样品F为180万。
[制造例3]来自细胞壁的碱提取物的制备
1)来自真菌细胞壁的碱提取物的制备
在100g绣球菌(Sparassis crispa)中加入1升1％氢氧化钠，于65℃搅拌提取2小时。通过离心分离除去提取残渣后，提取液用HCl中和，然后加入等量的乙醇，得到20g沉淀物(真菌细胞壁提取的β-葡聚糖：样品G)。算出1g样品G中含β-葡聚糖的量为500mg。另外，最大峰的分子量为120万。
2)来自微生物细胞壁的碱提取物的制备
在100g由市售压榨酵母制备的细胞壁(酵母菌体细胞壁E)中加入1升2％氢氧化钠，于4℃搅拌提取24小时。将离心分离得到的提取液用HCl中和，用2倍量的乙醇使其沉淀，得到20g提取物(酵母菌体细胞壁提取的β-葡聚糖：样品H)。算出10mg样品H中含β-葡聚糖的量为4.2mg。另外，最大峰的分子量为160万。
[制造例4]微生物培养液的制备
1)乳酸菌培养液的制备
5g聚胨(Polypepton)、5g酵母提取物、5g葡萄糖、1gMgSO4·7H2O、1升蒸馏水，按此比例混合溶解有害片球菌(Pediococcus damnosus)菌株(大阪发酵研究所保存的IFO-3896株)，接种于5升pH调节为5.5的培养基中，于30℃不通风搅拌(50rpm)培养5天。培养进行2次，得到10升培养液。将该培养液离心分离，得到的上清液进行减压浓缩，得到2升培养浓缩液。加入得到的浓缩液的2倍量的乙醇，回收沉淀，冷冻干燥，得到15g粉末(乳酸菌培养物：样品I)。算出1g样品I中含β-葡聚糖的量为600mg。另外，最大峰的分子量为190万。
2)短梗霉(Aureobasidium)培养物的制备
经遗传、形态学鉴定属于短梗霉属的微生物、通过培养在菌体外生产具有β键的葡萄糖聚合物的出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)菌株IFO7757株，用马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基进行培养，将保存菌珠接种于装有100ml YM液体培养基(Difco公司制造)的500ml容量的三角烧瓶中，于28℃预培养3天。在装有FULLZONE搅拌翼的5升容量的发酵罐中，添加3升Czapeak′s培养基(Difco公司制造)和得到的预培养物，于28℃培养5天。还有，培养过程中，调节pH使达到5.0，控制通风量和转速，使通风达到1vvm。将3升培养液于90℃加热灭菌30分钟后，通过离心分离除去菌体，将其中的1升冷冻干燥，得到27g冷冻干燥物(短梗霉培养物：样品J)。算出1g样品J中含β-葡聚糖的量为440mg。另外，在10mg/ml样品J的蒸馏水溶液中添加出芽短梗霉聚糖酶悬浮液(和光顺药社制)使达到0.05％，反应2小时后，加入2倍量的乙醇，在得到的沉淀中再加入1ml蒸馏水溶解，测定分子量。还有，作为对照，10mg/ml出芽短梗霉聚糖的蒸馏水溶液进行同样的操作，也进行分子量测定。结果，样品J的最大峰的分子量为20万，出芽短梗霉聚糖溶液没有发现峰。
剩余的2升培养液中加入2倍量的乙醇，回收沉淀物。将沉淀物冷冻干燥，得到26g粉末(短梗霉培养纯化物：样品K)。算出10mg样品K中含β-葡聚糖的量为6mg。另外，在10mg/ml样品K的蒸馏水溶液中添加出芽短梗霉聚糖酶悬浮液(和光顺药社制)使达到0.05％，反应2小时后，加入2倍量的乙醇，在得到的沉淀中再加入1ml蒸馏水溶解，测定分子量。还有，作为对照，10mg/ml出芽短梗霉聚糖的蒸馏水溶液进行同样的操作，也进行分子量测定。结果，样品K的最大峰的分子量为20万，出芽短梗霉聚糖溶液没有发现峰。
[实施例1]含有β-葡聚糖的油脂组合物
将100份上述样品A与100份豆油用捏和机充分混合，于60℃放置10分钟后，冷却至室温，得到奶油状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-1(β-葡聚糖的含量为43％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例2]含有β-葡聚糖的油脂组合物
将80份上述样品B与120份豆油用捏和机充分混合，于60℃放置10分钟后，冷却至室温，得到奶油状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-2(β-葡聚糖的含量为3.7％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例3]含有β-葡聚糖的油脂组合物
将100份上述样品H与100份豆油用捏和机充分混合，于60℃放置10分钟后，冷却至室温，得到奶油状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-3(β-葡聚糖的含量为21％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例4]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在300份上述样品K中添加100份加热至70℃溶解的棕榈油以及1份卵磷脂，用高速均质器混合，于50℃放置20分钟后，冷却至室温，得到块状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-4(β-葡聚糖的含量为44.9％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例5]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在300份上述样品E中添加100份加热至70℃溶解的棕榈油以及1份卵磷脂，用高速均质器混合，于50℃放置20分钟后，冷却至室温，得到块状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-5(β-葡聚糖的含量为36.6％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例6]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在300份上述样品F中添加100份加热至70℃溶解的棕榈油以及1份卵磷脂，用高速均质器混合，于50℃放置20分钟后，冷却至室温，得到块状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-6(β-葡聚糖的含量为26％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例7]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在50份上述样品G中添加30份棕榈油(palm olein oil)、70份菜籽油、0.2份经过蛋白酶水解处理的蛋黄，用混合器混合，于65℃放置15分钟后，冷却至室温，得到奶油状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-7(β-葡聚糖的含量为16.6％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例8]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在50份上述样品I中添加30份棕榈油、70份菜籽油、0.2份经过蛋白酶水解处理的蛋黄，用混合器混合，于65℃放置15分钟后，冷却至室温，得到奶油状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-8(β-葡聚糖的含量为20％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例9]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在50份上述样品K中添加30份棕榈油、70份菜籽油(rapeseedoil)、0.2份经过蛋白酶水解处理的蛋黄，用混合器混合，于65℃放置15分钟后，冷却至室温，得到变为奶油状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-9(β-葡聚糖的含量为20％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例10]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在5份上述样品A中添加40份米油、20份橄榄油、以及35份红花油，用高速均质器混合，于50℃放置30分钟后，冷却至室温，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-10(β-葡聚糖的含量为4.3％)，其具有与原料油几乎相同的粘度，但略微混浊。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例11]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在5份上述样品I中添加40份米油、20份橄榄油、以及35份红花油，用高速均质器混合，于50℃放置30分钟后，冷却至室温，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-11(β-葡聚糖的含量为3％)，其具有与原料油几乎相同的粘度，但略微混浊。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例12]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在5份上述样品J中添加40份米油、20份橄榄油、以及35份红花油，用高速均质器混合，于50℃放置30分钟后，冷却至室温，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-12(β-葡聚糖的含量为2.2％)，其具有与原料油几乎相同的粘度，但略微混浊。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例13]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在13份上述样品G中加入20份硬化豆油(熔点45℃)、35份棕榈油、30份棉籽油、以及0.2份大豆溶血卵磷脂，于70℃放置10分钟后，用高速混合器乳化，然后快速冷却进行塑化，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-13(β-葡聚糖的含量为6.6％)，其具有类似于人造黄油的物理性质。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例14]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在13份上述样品H中加入20份硬化豆油(熔点45℃)、35份棕榈油、30份棉籽油、以及0.2份大豆溶血卵磷脂，于70℃放置10分钟后，用高速混合器乳化，然后快速冷却进行塑化，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-14(β-葡聚糖的含量为5.6％)，其具有类似于人造黄油的物理性质。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例15]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在13份上述样品K中加入20份硬化豆油(熔点45℃)、35份棕榈油、30份棉籽油、以及0.2份大豆溶血卵磷脂，于70℃放置10分钟后，用高速混合器乳化，然后快速冷却进行塑化，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-15(β-葡聚糖的含量为8％)，其具有类似于人造黄油的物理性质。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例16]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在50份上述样品B中加入27.6份硬化鱼油(熔点36℃)、18份玉米色拉油、以及0.4份酒石酸甘油酯，于50℃搅拌混合30分钟后，用高速混合器乳化，然后快速冷却进行塑化，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-16(β-葡聚糖的含量为4.8％)，其具有类似于油脂糊的物理性质。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例17]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在50份上述样品H中加入27.6份硬化鱼油(熔点36℃)、18份玉米色拉油、以及0.4份酒石酸甘油酯，于50℃搅拌混合30分钟后，用高速混合器乳化，然后快速冷却进行塑化，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-17(β-葡聚糖的含量为22％)，其具有类似于油脂糊的物理性质。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例18]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在50份上述样品I中加入27.6份硬化鱼油(熔点36℃)、18份玉米色拉油、以及0.4份酒石酸甘油酯，于50℃搅拌混合30分钟后，用高速混合器乳化，然后快速冷却进行塑化，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-18(β-葡聚糖的含量为31％)，其具有类似于油脂糊的物理性质。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例19]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在20份上述样品G中加入0.3份橄榄油(熔点36℃)以及0.1份酪蛋白钠，于55℃放置15分钟后，用高速混合器乳化，然后用喷雾干燥机干燥，得到粉末状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-19(β-葡聚糖的含量为49％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例20]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在20份上述样品H中加入0.3份橄榄油(熔点36℃)以及0.1份酪蛋白钠，于55℃放置15分钟后，用高速混合器乳化，然后用喷雾干燥机干燥，得到粉末状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-20(β-葡聚糖的含量为41％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例21]含有β-葡聚糖的油脂组合物
在20份上述样品K中加入0.3份橄榄油(熔点36℃)以及0.1份酪蛋白钠，于55℃放置15分钟后，用高速混合器乳化，然后用喷雾干燥机干燥，得到粉末状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-21(β-葡聚糖的含量为59％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例22]起酥油的制造例
由30份棕榈油、50份硬化棕榈油、20份菜籽油及0.3份卵磷脂构成的油相于70℃熔化，在100份该油相中添加5.0份上述样品G，于70℃将该混合物放置30分钟。然后用均质器高速旋转下搅拌混合2分钟，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-22。肉眼观察发现β-葡聚糖充分分散在油脂中。然后快速冷却进行塑化后，冷却至5℃。这样，得到本发明的起酥油(β-葡聚糖的含量为2.4％)。对得到的起酥油的润滑性、风味进行评估，其结果如下述表1所示。证明所得的起酥油在润滑性和风味上优于下述比较例1得到的起酥油。虽然省略了结晶熟化工序即老化工序，但可以认为所得的起酥油仍具有形成、促进适度结晶生成的作用，具有优异的口感，并具有防止由乳化剂导致的风味劣化的作用。
[实施例23]起酥油的制造例
由30份棕榈油、50份硬化棕榈油、20份菜籽油及0.3份卵磷脂构成的油相于70℃熔化，在100份该油相中添加5.0份上述样品K，于70℃将该混合物放置30分钟。然后用均质器高速旋转下搅拌混合2分钟，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物-23。肉眼观察发现β-葡聚糖充分分散在油脂中。然后快速冷却进行塑化后，冷却至5℃。这样，得到本发明的起酥油(β-葡聚糖的含量为2.9％)。对得到的起酥油的润滑性、风味进行评估，其结果如下述表1所示。证明所得的起酥油在润滑性和风味上优于下述比较例1得到的起酥油。虽然省略了结晶熟化工序即老化工序，但可以认为所得的起酥油仍具有形成、促进适度结晶生成的作用，具有优异的口感，并具有防止由乳化剂导致的风味劣化的作用。
[比较例1]制备起酥油的比较例
由30份棕榈油、50份硬化棕榈油、20份菜籽油及0.3份卵磷脂构成的油相于70℃熔化，用均质器高速旋转下搅拌混合2分钟，然后快速冷却进行塑化后，冷却至5℃，得到起酥油。对得到的起酥油的润滑性、风味进行评估，其结果如下述表2所示。证明所得的起酥油风味上非常差。
[实施例24]人造黄油的制造例
将100份食用油脂于70℃熔化，其由重量比为30∶50∶20∶0.3的棕榈油、硬化棕榈油、菜籽油及山梨聚糖脂肪酸酯组成。在该混合物中添加8份上述样品G，于65℃放置30分钟后，用均质器搅拌下缓慢添加0.5份脱脂奶粉和1份食盐在16份加热至70℃的水中溶解的溶液，混合后，快速冷却进行塑化，于25℃放置过夜后，冷却至5℃。这样，得到本发明的人造黄油(β-葡聚糖的含量为3.2％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的人造黄油的稳定性、润滑性、风味进行评估，其结果如下述表1所示。证明所得的人造黄油口感细腻、润滑。可以认为，与下述比较例2得到的人造黄油相比，风味更佳，具有防止由乳化剂导致的风味劣化的作用。
[实施例25]人造黄油的制造例
将100份食用油脂于70℃熔化，其由重量比为30∶50∶20∶0.3的棕榈油、硬化棕榈油、菜籽油及山梨聚糖脂肪酸酯组成。在该混合物中添加8份上述样品H，于65℃放置30分钟后，用均质器搅拌下缓慢添加0.5份脱脂奶粉和1份食盐在16份加热至70℃的水中溶解的溶液，混合后，快速冷却进行塑化，于25℃放置过夜后，冷却至5℃。这样，得到本发明的人造黄油(β-葡聚糖的含量为2.7％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的人造黄油的稳定性、润滑性、风味进行评估，其结果如下述表1所示。证明所得的人造黄油口感细腻、润滑。可以认为，与下述比较例2得到的人造黄油相比，风味更佳，具有防止由乳化剂导致的风味劣化的作用。
[实施例26]人造黄油的制造例
将100份食用油脂于70℃熔化，其由重量比为30∶50∶20∶0.3的棕榈油、硬化棕榈油、菜籽油及山梨聚糖脂肪酸酯组成。在该混合物中添加8份上述样品K，于65℃放置30分钟后，用均质器搅拌下缓慢添加0.5份脱脂奶粉和1份食盐在16份加热至70℃的水中溶解的溶液，混合后，快速冷却进行塑化，于25℃放置过夜后，冷却至5℃。这样，得到本发明的人造黄油(β-葡聚糖的含量为3.8％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的人造黄油的稳定性、润滑性、风味进行评估，其结果如下述表1所示。证明所得的人造黄油口感细腻、润滑。可以认为，与下述比较例2得到的人造黄油相比，风味更佳，具有防止由乳化剂导致的风味劣化的作用。
[比较例2]制备人造黄油的比较例
将100份食用油脂于70℃熔化，其由重量比为30∶50∶20∶0.3的棕榈油、硬化棕榈油、菜籽油及山梨聚糖脂肪酸酯组成。用均质器搅拌下缓慢添加0.5份脱脂奶粉和1份食盐在16份加热至70℃的水中溶解的溶液，混合后，快速冷却进行塑化，于25℃放置过夜后，冷却至5℃，得到人造黄油。对得到的人造黄油的稳定性、润滑性、风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例27]调味品的制造例
将10份上述样品G、10份蛋黄、1.5份食盐、11份醋、2.5份上等白糖、0.05份芥末粉和0.05份洋葱粉，用混合器高速搅拌混合5分钟，制备水相。用均质器进一步高速搅拌该水相，同时向其中缓慢添加75份加热至70℃的大豆色拉油并混合，于50℃放置10分钟后，乳化，冷却至5℃24小时，得到本发明的调味品(β-葡聚糖的含量为4.5％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的调味品的稳定性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。证明所得的调味品稳定性和风味均优良。
[比较例3]制备调味品的比较例
将10份蛋黄、1.5份食盐、11份醋、2.5份上等白糖、0.05份芥末粉和0.05份洋葱粉，用混合器高速搅拌混合5分钟，制备水相。后面用与实施例27相同的方法制得调味品。对得到的调味品的稳定性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例28]调味品的制造例
将10份蛋黄、1.5份食盐、11份醋、2.5份上等白糖、0.05份芥末粉和0.05份洋葱粉，用混合器高速搅拌混合5分钟，制备水相。用均质器进一步高速搅拌该水相，同时向其中缓慢添加75份实施例12的含有β-葡聚糖的油脂组合物-12并混合，乳化，冷却至5℃24小时，得到本发明的调味品(β-葡聚糖的含量为1.65％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的调味品的稳定性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。证明所得的调味品稳定性和风味均优良。
[比较例4]制备调味品的比较例
将10份蛋黄、1.5份食盐、11份醋、2.5份上等白糖、0.05份芥末粉和0.05份洋葱粉，用混合器高速搅拌混合5分钟，制备水相。用均质器进一步高速搅拌该水相，同时向其中缓慢添加75份油脂(由40份米油、20份橄榄油、35份红花油混合而成)并混合，乳化，冷却至5℃24小时，得到调味品。对得到的调味品的稳定性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例29]蛋黄酱的制造例
在30份上述样品H中添加30份大豆色拉油，搅拌，进行初步乳化后，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物。充分混合由9份蛋黄、5.2份淀粉、8.2份糖、2.8份食盐、8份醋、1份调味香辛料和6份水组成的混合物，并将其添加至油脂组合物中，使用胶体磨进行乳化，得到本发明的蛋黄酱(β-葡聚糖的含量为12.6％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的蛋黄酱的稳定性、润滑性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的蛋黄酱在储存1个月时未发生相分离，并且具有润滑的口感和非常良好的风味。
[比较例5]制备蛋黄酱的比较例
在30份水中添加30份大豆色拉油，搅拌，进行初步乳化后，得到油脂组合物。充分混合由9份蛋黄、5.2份淀粉、8.2份糖、2.8份食盐、8份醋、1份调味香辛料和6份水组成的混合物，并将其添加至油脂组合物中，使用胶体磨进行乳化，得到蛋黄酱。对得到的蛋黄酱的稳定性、润滑性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例30]蛋黄酱的制造例
混合9份蛋黄、8.2份糖、2.8份食盐、8份醋、1份调味香辛料和36份样品B，制备水相。向其中添加25份菜籽油和10份实施例3的含有β-葡聚糖的油脂组合物-3，搅拌，进行初步乳化后，再使用胶体磨进行乳化，得到本发明的蛋黄酱(β-葡聚糖的含量为5.5％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的蛋黄酱的稳定性、润滑性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的蛋黄酱在储存1个月时未发生相分离，并且具有润滑的口感和非常良好的风味。
[比较例6]制备蛋黄酱的比较例
混合9份蛋黄、8.2份糖、2.8份食盐、8份醋、1份调味香辛料和36份水，制备水相。向其中添加25份菜籽油和10份棕榈油，搅拌，进行初步乳化后，再使用胶体磨进行乳化，得到蛋黄酱。对得到的蛋黄酱的稳定性、润滑性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例31]油脂糊的制造例
将27.6份硬化鱼油(熔点36℃)、18.4份棉籽油、40份上述样品K、12.3份水、1份食盐、0.5份脱脂奶粉、0.2份调味料和0.3份卵磷脂进行乳化，然后快速冷却进行塑化，制得本发明的油脂糊(β-葡聚糖的含量为24％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的油脂糊的稳定性、润滑性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的油脂糊在储存1个月时未发生相分离，并且具有润滑的口感和良好的风味。
[比较例7]制备油脂糊的比较例
将27.6份硬化鱼油(熔点36℃)、18.4份棉籽油、52.3份水、1份食盐、0.5份脱脂奶粉、0.2份调味料和0.3份卵磷脂进行乳化，然后快速冷却进行塑化，制得油脂糊。对得到的油脂糊的稳定性、润滑性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例32]咖喱沙司的制造例
将44份小麦粉(薄力粉)和34份在实施例22中得到的起酥油煎炒至浅咖啡色，然后加入8份市售的咖喱粉，得到本发明的咖喱沙司(β-葡聚糖的含量为0.95％)。β-葡聚糖分散均匀。
[实施例33]曲奇饼的制造例
将50份在实施例9中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-9和50份上等白糖用Hobart混合器高速捏合6分钟成乳状液，向其中添加由15份全蛋(净重)、1份食盐、和0.5份碳酸氢铵组成的混合物，在中等速度下混合30秒。再添加100份筛过的小麦粉，在低速下混合30秒，制备面团。将该面团放入直径为6cm的圆筒中，压出各1cm厚，切割，于200℃焙烤13分钟，得到本发明的曲奇饼(β-葡聚糖的含量为4.6％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的曲奇饼的硬度和风味进行评估，其结果如下述表1所示。
[比较例8]制备曲奇饼的比较例
将50份油脂(由30份棕榈油、70份菜籽油、和0.2份经蛋白酶水解的蛋黄混合而成)和50份上等白糖用Hobart混合器高速捏合6分钟成乳状液，向其中添加由15份全蛋(净重)、1份食盐、和0.5份碳酸氢铵组成的混合物，在中等速度下混合30秒。后面与实施例33的操作相同，得到曲奇饼。对得到的曲奇饼的硬度和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例34]曲奇饼的制造例
将50份在实施例14中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-14和40份上等白糖用Hobart混合器高速捏合6分钟成乳状液，向其中添加20份葡萄干酱，在中等速度下混合30秒。再添加筛过的粟粉，在低速下混合30秒，制备面团。将该面团放入直径为6cm的圆筒中，压出各1cm厚，切割，于160℃焙烤15分钟，得到本发明的曲奇饼(β-葡聚糖的含量为2.5％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的曲奇饼的硬度和风味进行评估，其结果如下述表1所示。虽然没有添加鸡蛋、乳制品，但所得的曲奇饼口感良好。
[比较例9]制备曲奇饼的比较例
由20份硬化豆油(熔点45℃)、35份棕榈油、30份棉籽油和0.2份大豆溶血卵磷脂组成的混合物于70℃放置10分钟后，用高速混合器进行乳化，然后快速冷却进行塑化，制得具有类似于人造黄油的物理性质的食用油脂组合物。将50份上述油脂组合物和40份上等白糖用Hobart混合器高速捏合6分钟成乳状液，向其中添加20份葡萄干酱，在中等速度下混合30秒。后面与实施例34的操作相同，得到曲奇饼。对得到的曲奇饼的硬度和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例35]巧克力的制造例
将12份可可块、45份粉糖、20份全奶粉、23份可可脂和2份上述样品G进行混合时，剩下10份可可脂，将其他原料投入Hobart混合器中，用搅打机在中等速度下混合3分钟，再辊压、精炼，得到本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物(β-葡聚糖的含量为1％)。肉眼观察发现β-葡聚糖分散均匀。在该本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物中加入剩余的可可脂，混合，得到巧克力原液。对其进行回火(tempering)处理后，倾注在模具中，冷却，得到本发明的巧克力。对得到的巧克力的润滑性、硬度和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的巧克力可在口中良好地融化并具有良好的风味。
[比较例10]制备巧克力的比较例
将12份可可块、45份粉糖、20份全奶粉、23份可可脂和2份油脂(由30份棕榈油、70份菜籽油、和0.2份经蛋白酶处理的蛋黄混合而成)进行混合时，剩下10份可可脂，将其他原料投入Hobart混合器中，用搅打机在中等速度下混合3分钟，再辊压、精炼，得到油脂组合物。在该油脂组合物中加入剩余的可可脂，混合，后面与实施例35的操作相同，得到巧克力。对得到的巧克力的润滑性、硬度和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例36]巧克力的制造例
将12份可可块、45份粉糖、20份全奶粉、23份可可脂和20份在实施例4中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-4投入Hobart混合器中，用搅打机在中等速度下混合3分钟，再辊压、精炼，对其进行回火处理后，倾注在模具中，冷却，得到本发明的巧克力(β-葡聚糖的含量为15％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的巧克力的润滑性、硬度和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的巧克力可在口中良好地融化并具有良好的风味。
[比较例11]制备巧克力的比较例
将12份可可块、45份粉糖、20份全奶粉、23份可可脂和20份棕榈油投入Hobart混合器中，后面与实施例36的操作相同，得到巧克力。对得到的巧克力的润滑性、硬度和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例37]面包的制造例
使用实施例26中得到的含β-葡聚糖的人造黄油制造面包。加入100份小麦粉、3份酵母、4份糖、2份食盐、6份实施例26中得到的人造黄油以及60份水，在28℃的混合温度下，用Hobart混合器低速混合2分钟，然后高速混合4分钟，制备面包面团。该面团于28℃发酵60分钟，按450g分割成多份，并将每份揉成圆球形，放置(28℃、20分钟)，由压面机中通过三次，成形后，放入单条面包模具中，并最终在38℃和90％相对湿度的条件下，放置至高出模具上边缘2cm，这需要42分钟。然后于220℃焙烤23分钟，得到本发明的面包(β-葡聚糖的含量为0.16％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的面包的硬度和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的面包柔软、具有良好的体积和令人满意的口感。
[比较例12]制备面包的比较例
使用与实施例26相同的方法但不混合β-葡聚糖(样品K)得到的人造黄油，替换实施例26中得到的人造黄油，后面与实施例37的操作相同，制造面包。对得到的面包的硬度和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例38]面包的制造例
加入100份小麦粉、3份酵母、4份糖、2份食盐、2份实施例19中得到的粉末状的含有β-葡聚糖的油脂组合物-19、4份起酥油、30份样品B以及33份水，在28℃的混合温度下，用Hobart混合器低速混合2分钟，然后高速混合4分钟，制备面包面团。该面团于28℃发酵60分钟，按450g分割成多份，并将每份揉成圆球形，放置(28℃、20分钟)，由压面机中通过三次，成形后，放入单条面包模具中，并最终在38℃和90％相对湿度的条件下，放置至高出模具上边缘2cm，这需要46分钟。然后于210℃焙烤30分钟，得到本发明的面包(β-葡聚糖的含量为2.5％)。β-葡聚糖分散地均匀在面包中。对得到的面包的硬度和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的面包柔软、具有良好的体积和令人满意的口感。
[比较例13]制备面包的比较例
加入100份小麦粉、3份酵母、4份糖、2份食盐、2份用与实施例19相同的方法但不混合β-葡聚糖(样品G)得到的粉末状的油脂组合物、4份起酥油以及63份水，在28℃的混合温度下，用Hobart混合器低速混合2分钟，然后高速混合4分钟，制备面包面团。后面与实施例38的操作相同，制造面包。对得到的面包的硬度和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例39]米饭的制造例
用水充分淘洗新泻产越光米(Koshihikari)，在100份经过淘洗的米中，添加60份水和4份实施例3中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-3，在电饭锅中蒸煮，得到本发明的米饭(β-葡聚糖的含量为0.51％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的米饭的硬度进行评估，其结果如下述表1所示。所得的米饭松软、具有良好的口感。
[比较例14]制备米饭的比较例
用水充分淘洗新泻产越光米，在100份经过淘洗的米中，添加60份水和4份豆油，在电饭锅中蒸煮，得到米饭。对得到的米饭的硬度进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例40]爆米花的制造例
在锅中放入100份玉米粒(popcorn kernel)、2份食盐、10份在实施例10中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-10，盖上锅盖并在火上加热，得到本发明的爆米花(β-葡聚糖的含量为0.38％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的爆米花的润滑性进行评估，其结果如下述表1所示。所得的爆玉米花口感润滑、具有良好的品质。
[实施例41]豆腐的制造例
使用实施例22中制得的起酥油制备豆腐。在100份用水浸泡处理过的大豆中加入140份水，进行研磨，在100℃下煮沸5分钟。煮汁放入布袋中，挤压过滤，得到豆乳。在豆乳中添加3份凝固剂(硫酸钙)和10份实施例22中制得的起酥油，轻轻地搅拌后，在75℃下凝固，然后倾倒在铺有棉布的滤筛中，放置30分钟，得到本发明的豆腐(β-葡聚糖的含量为0.095％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的豆腐的润滑性、风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得豆腐具有良好的口感。
[比较例15]制备豆腐的比较例
在100份用水浸泡处理过的大豆中加入140份水，进行研磨，在100℃下煮沸5分钟。煮汁放入布袋中，挤压过滤，得到豆乳。在豆乳中添加3份凝固剂(硫酸钙)和10份按照与实施例22相同的方法制备但不混合β-葡聚糖(样品G)而制得的起酥油，轻轻地搅拌后，在75℃下凝固，然后倾倒在铺有棉布的滤筛中，放置30分钟，得到豆腐。对得到的豆腐的润滑性、风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例42]软巧克力的制造例
由50份糖、5份可可块、15份全脂奶粉、30份在实施例4中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-4、0.3份卵磷脂、和0.04份香兰素组成的混合物按照常规方法进行滚压和精炼，得到本发明的软巧克力(β-葡聚糖的含量为13.5％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的软巧克力的润滑性、硬度和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的软巧克力未发生表面霜斑，并具有良好的风味。
[比较例16]制备软巧克力的比较例
由50份糖、5份可可块、15份全脂奶粉、30份棕榈油、0.3份卵磷脂、和0.04份香兰素组成的混合物按照常规方法进行滚压和精炼，得到软巧克力。对得到的软巧克力的润滑性、硬度和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例43]无水奶油的制造例
混合35份在实施例23中制得的起酥油、45份糖、10份味粉和10份奶粉，得到本发明的无水奶油(β-葡聚糖的含量为1％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的无水奶油的润滑性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的无水奶油可在口中良好融化，并具有非常良好的风味。
[比较例17]制备无水奶油的比较例
混合35份按照与实施例23相同的方法制备但不混合β-葡聚糖(样品K)而制得的起酥油、45份糖、10份味粉和10份奶粉，得到无水奶油。对得到的无水奶油的润滑性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例44]用于奶油三明治的掼奶油的制造例
将由100份在实施例23中制得的起酥油、和0.1份甘油单酯混合，搅打成比重为0.3的掼奶油。然后添加100份糖浆，并进一步搅打，得到比重为0.65的本发明的用于奶油三明治的掼奶油(β-葡聚糖的含量为1.45％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的用于奶油三明治的掼奶油的润滑性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的用于奶油三明治的掼奶油具有非常良好的风味。
[比较例1 8]制备用于奶油三明治的掼奶油的比较例
使用100份按照与实施例23相同的方法制备但不混合β-葡聚糖(样品K)而制得的起酥油，其他与实施例44进行同样的操作，得到用于奶油三明治的掼奶油。对得到的用于奶油三明治的掼奶油的润滑性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例45]硬糖果的制造例
将35份油脂组合物、35份糖、8.5份麦芽糖浆、1.5份脱脂奶粉和40份水混合为水包油乳液，其中所述油脂组合物包括100份实施例1中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-1、100份实施例6中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-6、23份聚甘油脂肪酸酯、14份甘油脂肪酸酯和4份蔗糖脂肪酸酯。蒸煮该乳液直至达到140℃，然后进一步浓缩至水含量达到1.9％，冷却、成形，得到本发明的硬糖果(β-葡聚糖的含量为12.5％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的硬糖果的稳定性、润滑性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的硬糖果在储存期间没有油性成分渗出，并具有良好的风味。
[比较例19]制备硬糖果的比较例
将35份油脂组合物、35份糖、8.5份麦芽糖浆、1.5份脱脂奶粉和40份水混合为水包油乳液，其中所述油脂组合物包括100份豆油、100份棕榈油、23份聚甘油脂肪酸酯、14份甘油脂肪酸酯和4份蔗糖脂肪酸酯。蒸煮该乳液直至达到140℃，然后进一步浓缩至水含量达到1.9％，冷却、成形，得到硬糖果。对得到的硬糖果的稳定性、润滑性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例46]掼奶油的制造例
将50份水加热至60℃，搅拌溶解5份脱脂奶粉和0.1份三聚磷酸钠，制备水相。另外，混合10份实施例3中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-3、20份实施例4中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-4和15份实施例7中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-7，制备油相。在上述水相中混合搅拌该油相，制备初级乳液。将该初级乳液在5Mpa的压力下均质化后，用VTIS灭菌机于142℃灭菌4秒，再在5Mpa的压力下均质化后，冷却至5℃。然后在冰箱中老化24小时，得到本发明的掼奶油(β-葡聚糖的含量为13.6％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的掼奶油的稳定性、润滑性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的掼奶油在膨胀度、乳化稳定性、耐热保形性、风味、口溶性、造花性等方面均良好。
[比较例20]制备掼奶油的比较例
将50份水加热至60℃，搅拌下溶解5份脱脂奶粉和0.1份三聚磷酸钠，制备水相。另外，混合10份豆油、20份棕榈油和15份菜籽油，制备油相。在上述水相中混合搅拌该油相，制备初级乳液。然后与实施例46进行相同的操作，得到掼奶油。对得到的掼奶油的稳定性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例47]乳替代组合物的制造例
将64份水加热至60℃，搅拌下溶解25份脱脂奶粉、0.2份六偏磷酸钠、0.2份柠檬酸钠和0.3份蔗糖脂肪酸酯，制备水相。在该水相中添加10份实施例17中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-17、0.3份甘油脂肪酸酯，混合搅拌，制备初级乳液。将该初级乳液在5Mpa的压力下均质化后，用VTIS灭菌机于142℃灭菌4秒，再在15Mpa的压力下均质化后，冷却至5℃，得到本发明的乳替代组合物(β-葡聚糖的含量为2.2％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的乳替代组合物的稳定性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的乳替代组合物在风味和乳化稳定性等方面均良好。
[比较例21]制备乳替代组合物的比较例
将64份水加热至60℃，搅拌下溶解25份脱脂奶粉、0.2份六偏磷酸钠、0.2份柠檬酸钠和0.3份蔗糖脂肪酸酯，制备水相。在该水相中添加10份按照与实施例17相同的方法制备但不混合β-葡聚糖(样品H)而制得的油脂组合物和0.3份甘油脂肪酸酯，混合搅拌，制备初级乳液。然后与实施例47进行相同的操作，得到乳替代组合物。对得到的乳替代组合物的稳定性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例48]具有预防生活习惯病作用的食品(人造黄油)的制造例
对10份硬化豆油(熔点45℃)、35份棕榈油、10份实施例3中得到的含有β-葡聚糖的油脂组合物-3、30份含有10％以上植物甾醇或植物甾醇脂肪酸酯的酯交换油、13.3份上述样品K、1份食盐、0.5份脱脂奶粉和0.2份调味料进行乳化，然后快速冷却进行塑化，制得本发明的具有降低胆固醇作用的人造黄油(β-葡聚糖的含量为10％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的具有降低胆固醇作用的人造黄油的润滑性和风味进行评估，其结果如下述表1所示。所得的人造黄油具有良好的口溶性和良好的风味。
[比较例22]制备具有预防生活习惯病作用的食品(人造黄油)的比较例
对10份硬化豆油(熔点45℃)、35份棕榈油、10份豆油、30份含有10％以上植物甾醇或植物甾醇脂肪酸酯的酯交换油、13.3份水、1份食盐、0.5份脱脂奶粉和0.2份调味料进行乳化，然后快速冷却进行塑化，制得具有降低胆固醇作用的人造黄油。对得到的具有降低胆固醇作用的人造黄油的润滑性和风味进行评估，其结果如下述表2所示。
[实施例49]具有预防生活习惯病作用的药物的制造例
在氮气氛下，于高速混合器中乳化3份含有4000ppm的α-生育酚的高纯度DHA(纯度：98％、POV小于1.0meq/kg)、20份上述样品K和10份酪蛋白钠，然后用喷雾干燥机干燥，得到本发明的具有预防生活习惯病作用的药物粉末(β-葡聚糖的含量为36.4％)。β-葡聚糖分散均匀。对得到的具有预防生活习惯病作用的药物的稳定性进行评估，其结果如下述表1所示。所得的药物POV为0.8meq/kg，具有优良的抗氧化稳定性。
[比较例23]制备具有预防生活习惯病作用的药物的比较例
在氮气氛下，于高速混合器中乳化3份含有4000ppm的α-生育酚的高纯度DHA(纯度：98％、POV小于1.0meq/kg)、20份水和10份酪蛋白钠，然后用喷雾干燥机干燥，得到具有预防生活习惯病作用的药物粉末。对得到的具有预防生活习惯病作用的药物的稳定性进行评估，其结果如下述表2所示。所得的药物POV为1.4meq/kg，抗氧化稳定性差。
上述实施例和比较例中，对稳定性、口感(润滑性、硬度、风味)进行了如下评估。还有，下述表1和2中的“-”表示未作评估。
·稳定性的评估方法
在5℃下储存1个月后，肉眼观察外观的变化，按照下述3级评估标准对稳定性进行评估。
<评估标准>
○：稳定性优异
△：外观发生变化，如轻微的相分离等
×：观察到相分离
·口感(润滑性、硬度、风味)的评估方法
口感是按照下述3级评估标准，由10位专家分别进行评估，将人数最多的评估作为评估结果。
<评估标准>
(润滑性)
○：非常润滑
△：润滑
×：不润滑
(硬度)
○：非常软
△：软
×：不软
(风味)
○：优异
△：略差
×：差
[表1]
  实施例     稳定性                 口感
    润滑性     硬度     风味
  实施例22     -     ○     -     ○
  实施例23     -     ○     -     ○
  实施例24     ○     ○     -     ○
  实施例25     ○     ○     -     ○
  实施例26     ○     ○     -     ○
  实施例27     ○     -     -     ○
  实施例28     ○     -     -     ○
  实施例29     ○     ○     -     ○
  实施例30     ○     ○     -     ○
  实施例31     ○     ○     -     ○
  实施例33     -     -     ○     ○
  实施例34     -     -     ○     ○
  实施例35     -     ○     ○     ○
  实施例36     -     ○     ○     ○
  实施例37     -     -     ○     ○
  实施例38     -     -     ○     ○
  实施例39     -     -     ○     -
  实施例40     -     ○     -     -
  实施例41     -     ○     -     ○
  实施例42     -     ○     ○     ○
  实施例43     -     ○     -     ○
  实施例44     -     ○     -     ○
  实施例45     ○     ○     -     ○
  实施例46     ○     ○     -     ○
  实施例47     ○     -     -     ○
  实施例48     -     ○ -     ○
  实施例49     ○     - -     -
[表2]
  比较例     稳定性                 口感
    润滑性     硬度     风味
  比较例1     -     △     -     ×
  比较例2     ○     ○     -     △
  比较例3     △     -     -     △
  比较例4     △     -     -     ○
  比较例5     ×     ○     -     △
  比较例6     ×     △     -     △
  比较例7     △     ○     -     △
  比较例8     -     -     △     △
  比较例9     -     -     △     △
  比较例10     -     ○     △     △
  比较例11     -     ○     △     △
  比较例1 2     -     -     △     ○
  比较例13     -     -     △     ○
  比较例14     -     -     △     -
  比较例15     -     ○     -     △
  比较例16     -     ○     △     ×
  比较例17     -     ○     -     ×
  比较例18     -     ○     -     ×
  比较例19     △     ○     -     △
  比较例20     △     -     -     ×
  比较例21     △     -     -     △
  比较例22     -     △ -     ×
  比较例23     ×     - -     -
下面举实施例对本发明的新型微生物作具体说明。试验例1～2中描述了本发明的微生物菌株的筛选方法，试验例3～7中描述了ADK-34菌株的菌学性质。另外，实施例50～52是记载使用ADK-34菌株制备本发明的β-葡聚糖的方法的实施例。关于分析，与上述分析例1～3的方法相同。
[试验例1]菌株的筛选方法1
在日本，以传统的腌制食品为中心，通常可广泛分离不用加热烹调而摄取的市售食品的表面附着、生长的微生物，筛选生产β-葡聚糖的菌株。下面具体描述筛选方法。
首先，将作为对象样品的食品放入灭菌玻璃器皿中，向其中加入10ml灭菌的PBS，使用灭菌过的移液管用PBS重复洗涤样品表面，得到洗涤样品表面的洗涤液。将得到的洗涤液用灭菌的PBS进行10～100倍稀释，将其中的200μl添加到琼脂平板上，用棒(弯曲玻璃棒)铺板，室温下培养2周。平板使用20ml YM培养基(Difco公司制造)，其中加入分别添加100μg/ml氯霉素和1.5重量％琼脂，并使之固化。在生长的约2万菌落中，挑选具有如下特征的菌落：生长初期为乳白色，菌落全体逐渐产生光泽，形成湿润的菌落；菌落全体产生光泽，中心部位略微产生黄褐色或黄褐色的轮廓，形成湿润的菌落；全体形成呈乳白色～粉色的菌落；逐渐变成黑绿色，形成具有菌毛特征的菌落。菌落全体虽然变为粉色，但是都堆积在上部而没有向外周部蔓延的、没有光泽的菌落除外。挑选的菌株进行单菌株分离操作，再培养7天后，保留通过显微镜观察有出芽型分生孢子的菌株以及示出酵母样生长的菌株，观察有分生孢子梗的菌株除外，作为第1次筛选结果。
其次，液体培养由第1次筛选得到的菌株。即，在添加5重量％蔗糖的YM培养基中，使用24孔微孔板，于26℃培养4天，得到培养液。保留生长的菌株均匀分散在培养液中且具有呈粘性培养液的菌株，作为第2次筛选结果。
然后，对由第2次筛选得到的菌株进行单菌株分离，接种在YM培养基上，于26℃培养96小时。在得到的培养液中加入等量的蒸馏水，于121℃灭菌20分钟后，离心分离培养液(8,000rpm)得到培养上清液。在30μl培养上清液中加入2倍量的乙醇，离心分离(1000rpm、10分钟)得到沉淀，加入100μl蒸馏水，用苯酚硫酸法测定多糖总量，对培养基进行同样的操作，得到的沉淀中多糖总量高于培养基中的多糖总量的菌株判定为阳性。将阳性菌株作为第3次筛选结果。
从由对象样品分离培养而生长的约2万菌落中，第1次筛选得到180株菌株，第2次筛选得到50株菌株，第3次筛选得到14株菌株。对第3次筛选得到的菌株以及从大阪发酵研究所购得的3株菌株，即IFO-4466株、IFO-6353株和IFO-7757株，按上述分析例1所述的测定方法测定培养上清液中的β-葡聚糖量，同时，按上述分析例3所述的测定方法测定培养液中生成的多糖出芽短梗霉聚糖的纯度。其结果如表3所示。得出的结论是：ADK-34菌株生成的多糖未被出芽短梗霉聚糖酶消化，其多糖量与β-葡聚糖定量值大体一致，生成纯度良好的β-葡聚糖。
[表3]
  菌株名     苯酚硫酸值(490nm)     纯度(％)   β-葡聚糖量(mg/ml)
    酶处理前     酶处理后
  ADK-1     1.067     0.389     36.5   0.12
  ADK-4     1.183     0.504     42.6   0.23
  ADK-5     1.655     1.042     63   1.34
  ADK-6     1.364     0.764     56   0.649
  ADK-8     1.344     0.914     68   0.674
  ADK-10     1.469     0.646     44   0.357
  ADK-17     1.224     0.759     62   0.411
  ADK-20     1.003     0.552     55   0.264
  ADK-24     1.141     0.776     68   0.888
  ADK-27     1.225     0.882     72   0.954
  ADK-28     1.377     0.565     41   0.5
  ADK-31     1.419     0.426     30   0.311
  ADK-34     1.366     1.369     100   1.89
  ADK-42     1.154     0.427     37   0.44
  IFO-6353     1.455     0.757     52   0.743
  IFO-7757     0.975     0.722     74   0.684
  IFO-4466     0.736     0.521     71   0.701
  出芽短梗霉聚糖1mg/ml     0.755     0.016     3.9   0
  出芽短梗霉聚糖0.5mg/ml     0.411     0.009     2.2   0
[试验例2]菌株的筛选方法2
除使用添加10μg/ml浓度的抗生素放线菌酮的培养基外，其他与试验例1操作相同，进行菌株的筛选。结果，从由对象样品分离培养而生长的4000菌落中，第1次筛选得到30株菌株，第2次筛选得到10株菌株，第3次筛选得到3株菌株(ADK-71菌株、ADK-77菌株、ADK-82菌株)。对第3次筛选得到的菌株与试验例1方法相同，测定β-葡聚糖量以及生成的多糖出芽短梗霉聚糖的纯度。其结果如表4所示。
另外，对第3次筛选得到的3株菌株分别从形态学观察尝试进行菌株鉴定。接种在YM琼脂培养基上后，于26℃培养7天，3株菌株的菌落均全体产生光泽，中心部位产生黄色轮廓，形成湿润的菌落。将这些平板于4℃移管保存7天，中心部位的黄色变成黑绿色。ADK-71菌株和ADK-77菌株除中心部位外没有变化，为白色～粉色。ADK-82菌株的菌落全部变为黑色。另外，将这3株菌株分别在YM液体培养基中于26℃培养3天，显微镜观察培养的菌体时，发现3株菌株均有出芽型分生孢子，为酵母样的生长。另外，将这3株菌株分别在YM琼脂培养基中于26℃培养7天得到菌落的菌体，在3株菌株中均观察到有生长成与分生孢子相关的链状菌体，但是没有发现分生孢子梗。由此判定3株菌株为出芽短梗霉(Aureobasidiumpullulans)。
[表4]
  菌株名      苯酚硫酸值(490nm)     纯度(％)     β-葡聚糖量(mg/ml)
    酶处理前     酶处理后
  ADK-71     0.882     0.893     101     1.22
  ADK-77     0.741     0.842     114     0.936
  ADK-82     0.633     0.655     103     0.854
  出芽短梗霉聚糖1mg/ml     0.768     0.015     2     0
  出芽短梗霉聚糖0.5mg/ml     0.393     0.005     1.3     0
[试验例3]形态学特征和培养特征
试验例1得到的菌株中，ADK-34菌株在YM培养基(1重量％葡萄糖、0.5重量％胨、0.3重量％酵母提取物、0.3重量％麦芽汁、pH6.0)中于26℃培养3天后，用显微镜观察发现，细胞的大小为短径2～2.5μm、长径5～10μm，形状为卵形，表面平滑无色、无运动性。另外，菌丝非常小，宽2.5μm。不均匀且表面平滑无色。形成酵母样的出芽型分生孢子。
[试验例4]琼脂平板培养
试验例1得到的菌株中，ADK-34菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(荣研)中于26℃培养7天。此时观察到的结果如下。培养3天时，生长良好，形状为圆形，边缘粗糙，菌落全部有光泽，表面平滑，白色。另外，培养5天时，菌落表面平滑且变成淡灰白色，示出酵母样，培养7天时，菌落表面变成粉色。将于26℃培养7天的平板于4℃冷藏7天，发现粉色有些变浓，但是菌落全体没有变化。
[试验例5]液体培养
试验例1得到的菌株中，ADK-34菌株在YM培养基中培养。以确定最佳生长温度和pH。最佳生长温度为26℃，最佳生长pH为5.0～7.0，生长开始时的pH为6.2，培养结束后的pH为7.5。优选生长温度为20～30℃，最佳生长温度为26℃，能够生长的温度为5～40℃。该菌株分解葡萄糖、果糖、甘露糖等己糖，蔗糖等二糖以及淀粉，这些碳源任一都可使培养液变粘稠，并具有特有的芳香。
由试验例3～5可得出结果：本发明的微生物中，根据菌学特征鉴定ADK-34菌株为短梗霉属的菌株。
[试验例6]放线菌酮抗性试验
对于试验例1和2筛选得到的菌株以及从大阪发酵研究所购得的保存的IFO-4466株、IFO-6353株和IFO-7757株，进行各菌株对放线菌酮的抗性试验。即，将各菌株在YM琼脂培养基(Difco公司制造)中于26℃生长5天。在YM琼脂培养基(Difco公司制造)中分别添加5、10、20、40、80μg/ml浓度的放线菌酮，制备各培养基。将上述生长的菌株用灭菌的牙签接种到含有放线菌酮的培养基上，于26℃培养10天后，观察有无菌落，有生长的菌落时测定菌落的直径。其结果如表5所示。
[表5]
  (单位：mm)菌株名                            放线菌酮浓度(μg/ml)
    0     5     10     20     40     80
  ADK-1     16.5     0     0     0     0     0
  ADK-4     17.3     8.5     0     0     0     0
  ADK-5     15.6     6.3     0     0     0     0
  ADK-6     14.4     7.1     0     0     0     0
  ADK-8     16.8     7.7     1.1     0     0     0
  ADK-10     14.9     8.5     0     0     0     0
  ADK-17     12.7     6.7     0     0     0     0
  ADK-20     13.3     6.2     0     0     0     0
  ADK-24     15.6     9.1     2.5     0     0     0
  ADK-27     17.4     10.3     0     0     0     0
  ADK-28     15.4     7.1     0     0     0     0
  ADK-31     16.8     6.3     1.7     0     0     0
  ADK-34     15.5     13.6     6.7     5.1     3.7     0.5
  ADK-42     12.7     2.4     0     0     0     0
  ADK-71     13.7     7.6     4.1     1.8     1.2     0
  ADK-77     15.4     9.5     4.1     0.8     0     0
  ADK-82     16.8     10.4     2.9     1.5     1.2     0
  IFO-7757     17.5     0     0     0     0     0
  IFO-6353     15.6     7.3     2.3     0     0     0
  IFO-4466     14.8     4.4     0     0     0     0
由表3和表5可知，IFO-4466株、IFO-6353株以及IFO-7757株对放线菌酮没有抗性，生产的β-葡聚糖相对于出芽短梗霉聚糖的纯度低。另一方面，由表3和表5可知，从食品中分离的菌株中，对放线菌酮产生抗性的菌株(ADK-34菌株、ADK-71菌株、ADK-77菌株、ADK-82菌株)，相对于出芽短梗霉聚糖可高纯度生产β-葡聚糖，对放线菌酮没有产生抗性的菌株，大部分生产的β-葡聚糖相对于出芽短梗霉聚糖的纯度低。
[试验例7]18S rRNA基因的基因分析
筛选得到的ADK-34菌株按下述方法确定18S rRNA基因的1732bp的碱基序列。将ADK-34菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Difco公司制造)中振荡培养，离心分离，用蒸馏水洗涤3次，得到DNA提取用菌体。使用FastPrep FP120(Qbiogene公司制造)和FastDNA试剂盒(Qbiogene公司制造)对该菌体进行细胞破碎，使用Dneasy Plant Mini试剂盒(Qiagen公司制造)分离基因组DNA。以该基因组DNA为模板，使用Ready-To-Go PCR Beads(Amersharm-Pharmasia Biotech)及引物NS1和NS8进行PCR增幅。
引物NS1和NS8的碱基序列为NS1：(5′→3′)GTAGTCATATGCTTGTCTC、NS8：(5′→3′)TCCGCAGGTTCACCTACGGA。热循环仪器使用GeneAmp PCRSystem 9600(Applied Biosystems)。反应结束后，PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。将该DNA片段直接用于测序反应，使用ABI Prism 377型DNA测序仪(Applied Biosystems)进行碱基序列分析。类似的碱基序列利用BLAST从DNA数据库(DDBJ，DNA Data Bank of Japan)中检索。
其结果如序列表的SEQ ID NO：1中所示。另外，根据得到的碱基序列进行数据库检索，研究了该菌株与同源菌的同源性，结果如表6～8所示。根据确定的碱基序列(SEQ ID NO：1)和同源性检索结果(表6～8)，ADK-34与出芽短梗霉的同源性为100％，完全一致。由此结果判定本菌株为出芽短梗霉。
                                               表6
产生显著对比的序列： (bits)Value
AY030322|AY030322.1 Aureobasidium pullulans 18S ribosomal RNA g... 3433 0.0M55639|M55639.1 Aureobasidium pullulans 16S-like ribosomal RNA... 3429 0.0U42474|U42474.1 Dothidea insculpta 18S small subunit ribosomal... 3237 0.0U42475|U42475.1 Dothidea hippophaeos 18S small subunit ribosoma... 3221 0.0U77668|U77668.1 Coccodinium bartschii 18S ribosomal RNA gene，p... 3178 0.0AF258607|AF258607.1 Scytalidium hyalinum strain IP252699 18S ri... 3158 0.0AF258606|AF258606.1 Scytalidium hyalinum strain IP151783 18S ri... 3158 0.0AB041250|AB041250.1 Phyllosticta pyrolae gene for 18S rRNA，par... 3158 0.0AB041249|AB041249.1 Guignardia endophyllicola gene for 18S rRNA... 3150 0.0AB041248|AB041248.1 Guignardia endophyllicola gene for 18S rRNA... 3150 0.0AB041247|AB041247.1 Guignardia endophyllicola gene for 18S rRNA... 3150 0.0Y11716|Y11716.1 P.dematioides 18S rRNA gene.               3148 0.0U42477|U42477.1 Botryosphaeria ribis 18S small subunit ribosoma... 3144 0.0Y18702|Y18702.1 Sarcinomyces petricola 18S rRNA gene，strain CB... 3108 0.0D49656|D49656.1 Lasioderma serricorne yeast-like symbiote DNA f... 3102 0.0AJ224362|AJ224362.1 Bulgaria inquinans 18S rDNA.              3094 0.0AF088239|AF088239.1 Lecidea fuscoatra 18S ribosomal RNA，partia... 3033 0.0Y18693|Y18693.1 Hortaea werneckii 18S rRNA gene，strain CBS 107... 3027 0.0AF088253|AF088253.1 Umbilicaria subglabra 18S ribosomal RNA，pa... 3015 0.0Y11355|Y11355.1 S.crustaceus 18S rRNA gene.              3001 0.0U42478|U42478.1 Sporormia lignicola 18S small subunit ribosomal... 2991 0.0AF184755|AF184755.1 Metus conglomeratus small subunit ribosomal... 2991 0.0AB016175|AB016175.1 Euascomycetes sp.K89 gene for 18S rRNA，pa... 2985 0.0AF184753|AF184753.1 Cladonia rangiferina small subunit ribosoma... 2976 0.0AF140236|AF140236.1 Stereocaulon pasc.hale small subunit ribosom... 2976 0.0AB015778|AB015778.1 Pseudogymnoascus roseus 18S rRNA gene，part... 2972 0.0AF184756|AF184756.1 Pilophorus cereolus small subunit ribosomal... 2968 0.0AF184761|AF184761.1 Stereocaulon vesuvianum small subunit ribos... 2960 0.0AF184754|AF184754.1 Heterodea muelleri small subunit ribosomal... 2960 0.0AF168167|AF168167.1 Dark septate endophyte DS16b 18S ribosomal... 2960 0.0AF184757|AF184757.1 Pilophorus robustus small subunit ribosomal... 2952 0.0AF117984|AF117984.1 Hypogymnia physodes nuclear small subunit r... 2952 0.0AF088246|AF088246.1 Rhizocarpon geographicum 18S ribosomal RNA，... 2946 0.0AF241544|AF241544.1 Cladonia sulphurina small subunit ribosomal... 2944 0.0AB015776|AB015776.1 Byssoascus striatosporus 18S rRNA gene，par... 2940 0.0 1732/1732(100％)1731/1732(99％)1699/1721(98％)1691/1713(98％)1690/1719(98％)1699/1733(98％)，1699/1733(98％)，1699/1733(98％)，1698/1733(97％)，1698/1733(97％)，1698/1733(97％)1697/1732(97％)，1689/1722(98％)，1693/1733(97％)，1692/1733(97％)，1691/1733(97％)，1666/1710(97％)，1679/1731(96％)1648/1689(97％)，1674/1731(96％)，1665/1717(96％)1678/1733(96％)，1680/1733(96％)，1676/1733(96％)，1676/1733(96％)，1640/1687(97％)1675/1733(96％)，1674/1733(96％)，1674/1733(96％)，1661/1713(96％)，1673/1733(96％)，1665/1720(96％)，1643/1693(97％)，1672/1733(96％)，1636/1687(96％)
                                               表7
产生显著对比的序列： (bits)Value
AF140233|AF140233.1 Alectoria sarmentosa small subunit ribosoma... 2938 0.0U70960|U70960.1 Pilophorus acicularis 18S small subunit ribosom... 2936 0.0AF085471|AF085471.1 Baeomyces rufus 18S small subunit ribosomal... 2932 0.0U70961|U70961.1 Stereocaulon ramulosum 18S small subunit riboso... 2928 0.0AF088238|AF088238.1 Lasallia rossica 18S ribosomal RNA，partial... 2926 0.0Y14210|Y14210.1 Monilinia laxa 18S rRNA gene，exon 1，partial.  2916 0.0U42476|U42476.1 Botryosphaeria rhodina 18S small subunit riboso... 29140.0U86692|U86692.1 Stenocybe pullatula 18S SSU ribosomal RNA，part... 2910 0.0AF117992|AF117992.1 Xanthoparmelia conspersa nuclear small subu... 2910 0.0AF085475|AF085475.1 Cladonia subcervicornis 18S small subunit r... 2910 0.0AF085465|AF085465.1 Stereocaulon taeniarum 18S small subunit ri... 2910 0.0AB015787|AB015787.1 Oidiodendron tenuissimum 18S rRNA gene，iso... 2910 0.0AF140235|AF140235.1 Cornicularia normoerica small subunit ribos... 2908 0.0AB015777|AB015777.1 Myxotrichum deflexum 18S rRNA gene，isolate... 2908 0.0AF184759|AF184759.1 Psora decipiens small subunit ribosomal RNA... 2904 0.0AF117981|AF117981.1 Neophyllis melacarpa nuclear small subunit... 2904 0.0AF088251|AF088251.1 Stereocaulon ramulosum 18S ribosomal RNA，p... 2904 0.0AF088245|AF088245.1 Pseudevernia cladoniae 18S ribosomal RNA，p... 2902 0.0AF201452|AF201452.1 Rhytidhysteron rufulum 18S ribosomal RNA ge... 2900 0.0AF274110|AF274110.1 Lepolichen coccophorus 18S ribosomal RNA ge... 2898 0.0AF117991|AF117991.1 Pleurostica acetabulum nuclear small subun... 2898 0.0U43463|U43463.1 Mycosphaerella mycopappi small subunit nuclear... 2894 0.0AF085466|AF085466.1 Stereocaulon vesuvianum 18S small subunit r... 2894 0.0AB033475|AB033475.1 Blumeria graminis f.sp.bromi gene for 18S... 2894 0.0U42485|U42485.1 Lophiostoma crenatum 18S small subunit ribosoma... 2892 0.0AF053726|AF053726.1 Kirschsteiniothelia maritima small subunit... 2890 0.0AF201455|AF201455.1 Tubeufia helicoma 18S ribosomal RNA gene，p... 2886 0.0AF241541|AF241541.1 Xanthoria parietina small subunit ribosomal... 2884 0.0U70959|U70959.1 Leifidium tenerum 18S small subunit ribosomal R... 2880 0.0AF282910|AF282910.1 Lichinella cribellifera 18S small subunit r... 2880 0.0AF117986|AF117986.1 Cetraria islandica nuclear small subunit ri... 2880 0.0L37540|L37540.1 Porpidia crustulata(Ach.)Hertel and Knoph nuc... 2878 0.0AF184751|AF184751.1 Cladia retipora small subunit ribosomal RNA... 2874 0.0 1671/1733(96％)，1671/1733(96％)，1638/1691(96％)1670/1733(96％)，1654/1708(96％)，1636/1691(96％)1619/1671(96％)，1640/1696(96％)，1664/1728(96％)，1637/1692(96％)，1634/1688(96％)，1634/1688(96％)，1663/1727(96％)，1632/1687(96％)1667/1733(96％)，1667/1733(96％)，1652/1713(96％)，1638/16％(96％)1578/1615(97％)，1660/1725(96％)，1664/1730(96％)，1664/1732(96％)1632/1688(96％)，1660/1724(96％)，1655/1719(96％)，1659/1726(96％)1586/1628(97％)，1653/1719(96％)1664/1733(96％)，1667/1733(96％)，1646/1709(96％)，1570/1608(97％)，1636/1697(96％)，
                                               表8
产生显著对比的序列： (bits)Value
AF013229|AF013229.1 Aureobasidium pullulans 18S ribosomal RNA g... 997 0.0AY029406|AY029406.1 Astasia longa internal transcribed spacer 1... 989 0.0AJ276062|AJ276062.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 971 0.0AF121287|AF121287.1 Aureobasidium pullulans var.melanigenum st... 971 0.0AJ244265|AJ244265.1 Trimmatostroma abietina 5.8S rRNA gene and... 965 0.0AJ244231|AJ244231.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 965 0.0AJ244235|AJ244235.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 963 0.0AJ244234|AJ244234.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 963 0.0AF121285|AF121285.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC48433 in... 952 0.0AF121281|AF121281.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC11942 in... 952 0.0AJ244232|AJ244232.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 948 0.0AF182377|AF182377.1 Hormonema sp.F-054,764 internal transcribe... 940 0.0AF121284|AF121284.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC42457 in... 936 0.0AJ244233|AJ244233.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 934 0.0AJ244269|AJ244269.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 932 0.0AJ244236|AJ244236.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 932 0.0AF121286|AF121286.1 Aureobasidium pullulans var.melanigenum st... 920 0.0AJ276061|AJ276061.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 914 0.0AJ244252|AJ244252.1 Kabatiella lini 5.8S rRNA gene and internal... 906 0.0AJ244251|AJ244251.1 Kabatiella caulivora 5.8S rRNA gene and int... 825 0.0AF013225|AF013225.1 Phaeocryptopus gaeumannii 18S ribosomal RNA... 446 e-124AJ244257|AJ244257.1 Pringsheimia smilacis 5.8S rRNA gene and in... 428 e-118AJ244248|AJ244248.1 Hormonema prunorum 5.8S rRNA gene and inter... 420 e-116AJ244245|AJ244245.1 Dothiora rhamni-alpinae 5.8S rRNA gene and... 420 e-116AJ244242|AJ244242.1 Dothichiza pityophila 5.8S rRNA gene and in... 418 e-115AF182376|AF182376.1 Kabatina juniperi internal transcribed spac... 416 e-115AF182375|AF182375.1 Hormonema sp.ATCC74360 internal transcribe... 416 e-115AJ244243|AJ244243.1 Dothiora cannabinae 5.8S rRNA gene and inte... 412 e-113AF027764|AF027764.1 Dothidea insculpta CBS 189.58 18S ribosomal... 412 e-113AF013226|AF013226.1 Kabatina thujae 18S ribosomal RNA gene，par... 412 e-113AF027763|AF027763.1 Dothidea hippophaeos CBS 186.58 18S ribosom... 404 e-111AJ278930|AJ278930.1 Hormonema dematioides 5.8S rRNA gene，26S r... 402 e-110AJ278929|AJ278929.1 Hormonema dematioides 5.8S rRNA gene，26S r... 402 e-110AJ278928|AJ278928.1 Hormonema dematioides 18S rRNA gene(partia... 402 e-110AJ278927|AJ278927.1 Hormonema dematioides 5.8S rRNA gene，26S r... 402 e-110 555/567(97％)，538/546(98％)，517/526(98％)507/510(99％)，503/507(99％)，503/507(99％)，501/506(99％)501/506(99％)501/508(98％)501/508(98％)499/506(98％)501/510(98％)499/508(98％)492/499(98％)497/506(98％)497/506(98％)497/508(97％)，497/505(98％)，496/508(97％)，487/508(95％)，361/398(90％)，255/264(96％)，253/264(95％)，252/264(95％)246/255(96％)，251/262(95％)，251/262(95％)，252/264(95％)，252/264(95％)，251/264(95％)，251/264(95％)，244/255(95％)，244/255(95％)，244/255(95％)，244/255(95％)，
[试验例8]ITS-5.8S rRNA基因
对筛选得到的ADK-34菌株以及IFO-6353株、IFO-7757株，确定ITS-5.8S rRNA基因的563碱基序列或564碱基序列。将各菌株在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Difco公司制造)中振荡培养，离心分离，用蒸馏水洗涤3次，得到DNA提取用菌体。使用FastPrepFP120(Qbiogene)和FastDNA试剂盒(Qbiogene)对该菌体进行细胞破碎，使用DNeasy Plant Mini试剂盒(Qiagen)分离基因组DNA。以该基因组DNA为模板，使用Ready-To-Go PCR Beads(Amersharm-Pharmasia Biotech)及引物ITS5和ITS4进行PCR扩增。
引物ITS4和ITS5的碱基序列为ITS4：(5′→3′)TCCTCCGCTTATTGATATGC、ITS 5：(5′→3′)GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG。热循环仪器使用GeneAmp PCRSystem 9600(Applied Biosystems)。反应结束后，PCR产物使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)进行纯化。将该DNA片段直接用于测序反应，使用ABI Prism 377 DNA测序仪(Applied Biosystems)进行碱基序列分析。利用BLAST程序在DNA数据库(DDBJ，DNA DataBank of Japan)中进行同源序列检索。
ADK-34菌株的结果如序列表的SEQ ID NO：2中所示，IFO-6353株的结果如SEQ ID NO：3中所示、IFO-7757株的结果如SEQID NO：4中所示。另外，根据得到的碱基序列进行数据库检索，研究了该菌株与同源菌株的同源性，结果如表9和表10所示。对确定的碱基序列进行比较发现，ADK-34菌株与IFO-6353株和IFO-7757株不同，不完全一致。ADK-34菌株与IFO-6353株的同源性为98％，ADK-34菌株与IFO-7757株的同源性为98％。另外，根据同源性检索结果(表9和表10)，与ADK-34菌株的ITS-5.8S区域的563碱基对完全一致的菌株尚未报道；IFO-6353株与已报道的出芽短梗霉菌株，Accession No.AJ276062示出100％同源性(表11)，即完全一致；IFO-7757株与已报道的出芽短梗霉菌株，Accession No.AJ276062示出99％的同源性(表12)；ADK-34菌株与Accession No.AJ276062的同源性为98％。
由此可知，ADK-34菌株与目前已报道的出芽短梗霉菌株ITS-5.8S区域的碱基序列有部分不同，判定为新菌株。
                                            表9
产生显著对比的序列： (bits)Value
AF013229|AF013229.1 Aureobasidium pullulans 18S ribosomal RNA g... 997 0.0AY029406|AY029406.1 Astasia longa internal transcribed spacer 1... 989 0.0AJ276062|AJ276062.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 971 0.0AF121287|AF121287.1 Aureobasidium pullulans var.melanigenum st... 971 0.0AJ244265|AJ244265.1 Trimmatostroma abietina 5.8S rRNA gene and... 965 0.0AJ244231|AJ244231.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 965 0.0AJ244235|AJ244235.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 963 0.0AJ244234|AJ244234.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 963 0.0AF121285|AF121285.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC48433 in... 952 0.0AF121281|AF121281.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC11942 in... 952 0.0AJ244232|AJ244232.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 948 0.0AF182377|AF182377.1 Hormonema sp.F-054,764 internal transcribe... 940 0.0AF121284|AF121284.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC42457 in... 936 0.0AJ244233|AJ244233.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 934 0.0AJ244269|AJ244269.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 932 0.0AJ244236|AJ244236.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 932 0.0AF121286|AF121286.1 Aureobasidium pullulans var.melanigenum st... 920 0.0AJ276061|AJ276061.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 914 0.0AJ244252|AJ244252.1 Kabatiella lini 5.8S rRNA gene and internal... 906 0.0AJ244251|AJ24425l-1 Kabatiella caulivora 5.8S rRNA gene and int... 825 0.0AF0l3225|AF013225.1 Phaeocryptopus gaeumannii 18S ribosomal RNA... 446 e-124AJ244257|AJ244257.1 Pringsheimia smilacis 5.8S rRNA gene and in... 428 e-118AJ244248|AJ244248.1 Hormonema prunorum 5.8S rRNA gene and inter... 420 e-116AJ244245|AJ244245.1 Dothiora rhamni-alpinae 5.8S rRNA gene and... 420 e-116AJ244242|AJ244242.1 Dothichiza pityophila 5.8S rRNA gene and in... 418 e-115AF182376|AF182376.1 Kabatina juniperi internal transcribed spac... 416 e-115AF182375|AF182375.1 Hormonema sp.ATCC74360 internal transcribe... 416 e-115AJ244243|AJ244243.1 Dothiora cannabinae 5.8S rRNA gene and inte... 412 e-113AF027764|AF027764.1 Dolhidea insculpta CBS 189.58 18S ribosomal... 412 e-113AF0l3226|AF013226.1 Kabatina thujae l8S ribosomal RNA gene，par... 412 e-113AF027763|AF027763.1 Dothidea hippophaeos CBS 186.58 18S ribosom... 404 c-111AJ278930|AJ278930.1 Hormonema dematioides 5.8S rRNA gene，26S r... 402 e-110AJ278929|AJ278929.1 Hormonema dematioides 5.8S rRNA gene，26S r... 402 e-110AJ278928|AJ278928.1 Hormoncma dematioides 18S rRNA gene(partia... 402 e-110AJ278927|AJ278927.1 Hormonema dcmadoides 5.8S rRNA gene，26S r... 402 e-110 555/567(97％)，538/546(98％)，517/526(98％)507/510(99％)，503/507(99％)，503/507(99％)，501/506(99％)501/506(99％)501/508(98％)501/508(98％)499/506(98％)501/510(98％)499/508(98％)492/499(98％)497/506(98％)497/506(98％)497/508(97％)497/505(98％)，496/508(97％)，487/508(95％)，361/398(90％)，255/264(96％)，253/264(95％)，252/264(95％)246/255(96％)，251/262(95％)，251/262(95％)，252/264(95％)，252/264(95％)，251/264(95％)，251/264(95％)，244/255(95％)，244/255(95％)，244/255(95％)，244/255(95％)，
                                              表10
产生显著对比的序列： (bits)Value
AJ278926|AJ278926.1 Hormonema dematioides 5.8S rRNA gene，26S r... 402 e-110AJ278925|AJ278925.1 Hormonema dematioides 5.8S rRNA gene，26S r... 402 e-110AJ244262|AJ244262.1 Sydowia polyspora 5.8S rRNA gene and intern... 402 e-110AJ244247|AJ244247.1 Hormonema macrosporum 5.8S rRNA gene and in... 402 e-110AJ244244|AJ244244.1 Dothiora europaea 5.8S rRNA gene and intern... 402 e-110AF182378|AF182378.1 Hormonema sp.F-054,258 internal transcribe... 402 e-110AF013232|AF013232.1 Rhizosphaera kalkhoffii 18S ribosomal RNA g... 402 e-110AF013228|AF013228.1 Hormonema dematioides 18S ribosomal RNA gen... 402 e-110AF260224|AF260224.1 Kabatina juniperi 18S ribosomal RNA，partia... 396 e-109AF013231|AF013231.1 Rhizosphaera kalkhoffii 18S ribosomal RNA g... 389 e-106AF121283|AF121283.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC16629 in... 379 e-103AF121282|AF121282.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC16628 in... 379 e-103AF013230|AF013230.1 Rhizosphaera pini 18S ribosomal RNAgene，p... 375 e-102AF246930|AF246930.1 Botryosphaeria mamane isolate 97-59 18S rib... 359 2e-97AF246929|AF246929.1 Botryosphaeria mamane isolate 97-58 18S rib... 359 2e-97AF243410|AF243410.1 Sphaeropsis sapinea isolate 215 18S ribosom... 345 2e-93AF243409|AF243409.1 Sphaeropsis sapinea isolate 411 18S ribosom... 345 2e-93U28059|U28059.1 Sphaceloma fawcettii 18S ribosomal RNA and 26S... 339 1e-91U28058|U28058.1 Elsinoe fawcettii 18S ribosomal RNA and 26S rib... 339 1e-91AF297232|AF297232.1 Cercospora sorghi f.maydis Kenya 1 18S rib... 335 2e-90AF297230|AF297230.1 Cercosporanicotianae 18S ribosomal RNA gen... 335 2e-90AF297229|AF297229.1 Cercospora asparagi 18S ribosomal RNA gene，... 335 2e-90AF243394|AF243394.1 Botryosphaeria ribis isolate 96-8 18S ribos... 335 2e-90AF243393|AF243393.1 Botryosphaeria ribis isolate 94-128 18S rib... 335 2e-90AF079776|AF079776.1 Phomopsisamaranthicola 18S ribosomal RNA g... 335 2e-90AB041245|AB041245.1 Guignardia laricina genes for 18S rRNA，ITS... 333 9e-90AF297667|AF297667.1 Umbilicaria muehlenbergii isolate smll004 1... 331 4e-89AF297666|AF297666.1 Umbilicaria muehlenbergii isolate smll003 1... 331 4e-89AF141190|AF141190.1 Neofabraea alba 18S ribosomal RNA gene，par... 331 4e-89AF141189|AF141189.1 Neofabraea malicorticis 18S ribosomal RNA g... 331 4e-89AF141181|AF141181.1 Pezicula ocellata strain CBS267.39 18S ribo... 331 4e-89AF096204|AF096204.1 Umbilicaria muehlenbergii 18S ribosomal RNA... 331 4e-89AF083199|AF083199.1 Phialophora sp.p3901 18S ribosomal RNA，pa... 331 4e-89AF383949|AF383949.1 Botryosphaeria quercuum 18S ribosomal RNA g... 327 6e-88 244/255(95％)，244/255(95％)，244/255(95％)，244/255(95％)，252/263(95％)，240/251(95％)，244/255(95％)，244/255(95％)，250/264(94％)，244/256(95％)，238/251(94％)，238/251(94％)，244/257(94％)，214/225(95％)214/225(95％)214/226(94％)，214/226(94％)，189/195(96％)189/195(96％)187/193(96％)187/193(96％)187/193(96％)212/225(94％)，212/225(94％)，187/193(96％)189/196(96％)182/187(97％)182/187(97％)182/187(97％)182/187(97％)182/187(97％)182/187(97％)182/187(97％)190/197(96％)，
                                            表11
产生显著对比的序列： (bits)Value
AJ276062|AJ276062.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 1043 0.0AF182377|AF182377.1 Hormonema sp.F-054，764 internal transcribe... 1011 0.0AF121284|AF121284.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC42457 in... 1007 0.0AF013229|AF013229.1 Aureobasidium pullulans 18S ribosomal RNA g... 1005 0.0AJ244269|AJ244269.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 1003 0.0AJ244236|AJ244236.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 1003 0.0AF121286|AF121286.1 Aureobasidium pullulans var.melanigenum st... 991 0.0AF121285|AF121285.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC48433 in... 959 0.0AF121281|AF121281.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC11942 in... 959 0.0AJ244232|AJ244232.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 955 0.0AJ276061|AJ276061.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 954 0.0AJ244265|AJ244265.1 Trimmatostroma abietina 5.8S rRNA gene and... 942 0.0AJ244233|AJ244233.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 942 0.0AJ244231|AJ244231.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 942 0.0AJ244235|AJ244235.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 932 0.0AJ244234|AJ244234.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 932 0.0AF121287|AF121287.1 Aureobasidium pullulans var.melanigenum st... 924 526/526(100％)510/510(100％)508/508(100％)556/567(98％)，506/506(100％)506/506(100％)506/508(99％)502/508(98％)502/508(98％)500/506(98％)502/505(99％)，500/507(98％)，493/499(98％)500/507(98％)，497/506(98％)497/506(98％)501/510(98％)，
                                           表12
产生显著对比的序列： (bits)Value
AJ276062|AJ276062.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 1021 0.0AF013229|AF013229.1 Aureobasidium pullulans 18S ribosomal RNA g... 997 0.0AF182377|AF182377.1 Hormonema sp.F-054，764 internal transcribc... 989 0.0AF121284|AF121284.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC42457 in... 985 0.0AJ244269|AJ244269.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 981 0.0AJ244236|AJ244236.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 981 0.0AF121286|AF121286.1 Aureobasidium pullulans var.melanigenum st... 969 0.0AJ244265|AJ244265.1 Trimmatostroma abietina 5.8S rRNA gene and... 965 0.0AJ244231|AJ244231.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 965 0.0AJ276061|AJ276061.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 940 0.0AF121287|AF121287.1 Aureobasidium pullulans var.melanigenum st... 940 0.0AF121285|AF121285.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC48433 in... 938 0.0AF121281|AF121281.1 Aureobasidium pullulans strain ATCC11942 in... 938 0.0AJ244232|AJ244232.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 934 0.0AY029406|AY029406.1 Astasia longa internal transcribed spacer 1... 932 0.0AJ244235|AJ244235.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 926 0.0AJ244234|AJ244234.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 926 0.0AJ244233|AJ244233.1 Aureobasidium pullulans 5.8S rRNA gene and... 920 0.0AJ244252|AJ244252.1 Kabatiella lini 5.8S rRNA gene and internal... 912 0.0AJ244251|AJ244251.1 Kabatiella caulivora 5.8S rRNA gene and int...872 0.0AF013225|AF013225.1 Phaeocryptopus gaeumannii 18S riibosomal RNA... 454 e-126AJ244257|AJ244257.1 Pringsheimia smilacis 5.8S rRNA gene and in... 436 e-121 525/527(99％)，554/567(97％)，509/511(99％)，507/509(99％)，505/507(99％)，505/507(99％)，505/509(99％)，502/507(99％)502/507(99％)502/506(99％)，502/510(98％)，501/509(98％)，501/509(98％)，499/507(98％)，531/546(97％)，498/507(98％)，498/507(98％)，492/500(98％)，497/508(97％)，492/508(96％)，362/398(90％)，256/264(96％)，
[实施例50]
在30ml容量的试管中加入5.5ml YM培养基(Difco公司制造)，灭菌后(121℃、20分钟)，冷却，然后接种一白金耳量在YPD琼脂培养基(Difco公司制造)的斜面上保存的ADK-34菌株，在300rpm振荡培养器中于26℃培养4天，得到种培养液。在另一试管中加入5.5ml Czapeak′s培养基(Difco公司制造，蔗糖浓度为3重量％)，灭菌后，添加500μl的ADK-34菌株的种培养液(5％接种)，在300rpm振荡培养器中于26℃培养4天。培养液为白色，并具有高粘性。培养后，在培养液中加入等量的蒸馏水，高压蒸气灭菌15分钟，然后，在10000rpm下离心分离15分钟，得到含有多糖的培养上清液。按上述分析例1及上述分析例3的测定方法分别测定培养上清液中的β-葡聚糖量和多糖出芽短梗霉聚糖的纯度。结果，多糖出芽短梗霉聚糖的纯度为100％，由β-葡聚糖量算出的β-葡聚糖对糖产率为44％。还有，培养上清液在490nm处的吸光值为0.030，着色被抑制。另外，按上述分析例2的测定方法测定β-葡聚糖的分子量，分子量为15万～200万。还有，培养上清液的冷冻干燥物作为样品L。
用上述同样的方法培养IFO-6353株，测定β-葡聚糖量和多糖出芽短梗霉聚糖的纯度，结果，多糖出芽短梗霉聚糖的纯度为40％，算出β-葡聚糖对糖产率为11％。还有，培养上清液在490nm处的吸光值为0.190，发现有着色。
[实施例51]
将1.7g酵母氮源基础培养基粉末(Yeast Nitrogen Base w/o AminoAcids and Ammonium Sulfate，Difco)在100ml蒸馏水中溶解，过滤灭菌。将5g硝酸钠在500ml蒸馏水中溶解，制备2倍浓度的硝酸钠溶液。使用蔗糖、葡萄糖、果糖、可溶性淀粉或麦芽糖(和光纯药工业)分别制备12重量％碳源水溶液。将硝酸钠、碳源水溶液以及蒸馏水高压灭菌(121℃、20分钟)，在灭菌过的试管中，加入1ml酵母氮源基础培养基、5ml硝酸钠溶液、2.5ml各碳源的碳源水溶液和1.5ml蒸馏水，使总量达到10ml，制备碳源利用检测培养基(检测培养基)。
在30ml容量的试管中加入5.5ml YM培养基(Difco公司制造)，灭菌后(121℃、20分钟)，冷却，然后接种一白金耳量在YPD琼脂培养基(Difco公司制造)的斜面上保存的ADK-34菌株，在300rpm振荡培养器中于26℃培养4天，得到种培养液。将得到的上述种培养液接种到上述检测培养基上，在300rpm振荡培养器中于26℃培养5天。培养液为白色，并具有高粘性。培养后，在培养液中加入等量的蒸馏水，高压蒸气灭菌15分钟，然后，在10000rpm下离心分离15分钟，得到含有多糖的培养上清液。按上述分析例1及上述分析例3的测定方法分别测定培养上清液中的β-葡聚糖量和多糖出芽短梗霉聚糖的纯度。测定结果如表13所示。由表13可知，任一碳源，多糖出芽短梗霉聚糖的纯度都在90％以上，算出β-葡聚糖对糖产率为20～46％。还有，培养上清液在490nm处的吸光度为0.026～0.041，着色被抑制。另外，按上述分析例2的测定方法测定β-葡聚糖的分子量，分子量为15万～200万。
[表13]
    碳源     纯度(％)    β-葡聚糖对糖产率(％)     培养液的吸光度(490nm)
    蔗糖     100    46     0.031
    葡萄糖     110    44     0.033
    果糖     104    20     0.031
    可溶性淀粉     96    34     0.041
    麦芽糖     94    29     0.026
[实施例52]
将ADK-34菌株接种到YM培养基上，于26℃培养3天，得到300ml种培养液。在装有FULLZONE搅拌翼的5L容量的发酵罐(丸菱株式会社生产)中，添加3L Czapeak′s培养基和300g蔗糖，灭菌冷却后，接种100ml种培养液，于26℃培养72小时，得到3L培养液。将培养液于80℃加热30分钟灭菌后，添加等量的蒸馏水，充分混合后，在8000rpm下离心分离15分钟，得到培养稀释液。将培养稀释液进一步用蒸馏水进行5倍稀释，测定吸光度，在490nm处为0.023。在100ml培养稀释液中添加等量的乙醇，分离得到的沉淀，用乙醇洗涤，直接在50ml蒸馏水中溶解。再次重复该操作，放入透析袋(截留分子量为3000)中，用10倍量的蒸馏水进行透析。最终得100ml多糖溶液。此时的β-葡聚糖的量为25mg/ml，多糖出芽短梗霉聚糖的纯度为95％，β-葡聚糖的分子量为15万～200万。
[实施例53]含有β-葡聚糖的油脂组合物
将100份上述样品L和100份豆油在捏和机中充分混合，于60℃放置10分钟后，冷却至室温，得到奶油状的本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物。β-葡聚糖均匀分散在油脂中。
产业上的可利用性
本发明的含有β-葡聚糖的油脂组合物，可使具有优良生物调节功能的β-葡聚糖均匀地分散于油脂中。通过用于食品等中，β-葡聚糖可以均匀地分散于食品等中，而且可以提高该食品等的味道、口感、稳定性等。而且，通过使用本发明的微生物，可以从蔗糖等廉价糖类中以高生产速度高效制备高活性高质量的β-葡聚糖。
序列表
<110>旭电化工业株式会社
<120>含有β-葡聚糖的油脂组合物以及生产β-葡聚糖的新型微生物
<130>A0301
<160>4
<210>1
<211>1732
<212>DNA
<213>Aureobasidium pullulans ADK-34
<400>1
aaagattaag ccatgcatgt ctaagtataa gcaactatac ggtgaaactg cgaatggctc    60
attaaatcag ttatcgttta tttgatagta ccttactact tggataaccg tggtaattct   120
agagctaata catgctaaaa accccaactt cggaaggggt gtatttatta gataaaaaac   180
caacgccctt cggggctcct tggtgattca taataactaa acgaatcgca tggccttgcg   240
ccggcgatgg ttcattcaaa tttctgccct atcaactttc gatggtagga tagtggccta   300
ccatggtatc aacgggtaac ggggaattag ggttctattc cggagaggga gcctgagaaa   360
cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta cccaatcccg acacggggag   420
gtagtgacaa taaatactga tacagggctc ttttgggtct tgtaattgga atgagtacaa   480
tttaaatccc ttaacgagga acaattggag ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat   540
tccagctcca atagcgtata ttaaagttgt tgcagttaaa aagctcgtag ttgaaccttg   600
ggcctggctg gccggtccgc ctcaccgcgt gtactggtcc ggccgggcct ttccttctgg   660
ggagccgcat gcccttcact gggcgtgtcg gggaaccagg acttttactt tgaaaaaatt   720
agagtgttca aagcaggcct ttgctcgaat acattagcat ggaataatag aataggacgt   780
gcggttctat tttgttggtt tctaggaccg ccgtaatgat taatagggat agtcgggggc   840
atcagtattc aattgtcaga ggtgaaattc ttggatttat tgaagactaa ctactgcgaa   900
agcatttgcc aaggatgttt tcattaatca gtgaacgaaa gttaggggat cgaagacgat   960
cagataccgt cgtagtctta accataaact atgccgacta gggatcgggc gatgttatca  1020
ttttgactcg ctcggcacct tacgagaaat caaagtcttt gggttctggg gggagtatgg  1080
tcgcaaggct gaaacttaaa gaaattgacg gaagggcacc accaggcgtg gagcctgcgg  1140
cttaatttga ctcaacacgg ggaaactcac caggtccaga cacaataagg attgacagat  1200
tgagagctct ttcttgattt tgtgggtggt ggtgcatggc cgttcttagt tggtggagtg  1260
atttgtctgc ttaattgcga taacgaacga gaccttaacc tgctaaatag cccggcccgc  1320
tttggcgggt cgccggcttc ttagagggac tatcggctca agccgatgga agtttgaggc  1380
aataacaggt ctgtgatgcc cttagatgtt ctgggccgca cgcgcgctac actgacagag  1440
ccaacgagtt catttccttg cccggaaggg ttgggtaatc ttgttaaact ctgtcgtgct  1500
ggggatagag cattgcaatt attgctcttc aacgaggaat gcctagtaag cgtacgtcat  1560
cagcgtgcgt tgattacgtc cctgcccttt gtacacaccg cccgtcgcta ctaccgattg  1620
aatggctgag tgaggccttc ggactggccc agggaggtcg gcaacgacca cccagggccg  1680
gaaagttggt caaactccgt catttagagg aagtaaaagt cgtaacaagg tt          1732
<210>2
<211>563
<212>DNA
<213>Aureobasidium pullulans ADK-34
<400>2
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taaagagtaa gggtgctcag cgcccgacct    60
ccaacccttt gttgttaaaa ctaccttgtt gctttggcgg gaccgctcgg ttccgagccg   120
ctggggattc gtcccaggcg agtgcccgcc agagttaaac caaactcttg ttattaaacc   180
ggtcgtctga gttaaaattt tgaataaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct   240
cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa   300
tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cgaggggcat gcctgttcga   360
gcgtcattac accactcaag ctatgcttgg tattgggtgc cgtccttagt tgggcgcgcc   420
ttaaagacct cggcgaggcc actccggctt taggcgtagt agaatttatt cgaacgtctg   480
tcaaaggaga ggaactctgc cgattgaaac ctttattttt ctaggttgac ctcggatcag   540
gtagggatac ccgctgaact taa                                           563
<210>3
<211>563
<212>DNA
<213>Aureobasidium pullulans IFO-6353
<400>3
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taaagagtaa gggtgctcag cgcccgacct   60
ccaacccttt gttgttaaaa ctaccttgtt gctttggcgg gaccgctcgg tctcgagccg  120
ctggggattc gtcccaggcg agcgcccgcc agagttaaac caaactcttg ttatttaacc  180
ggtcgtctga gttaaaattt tgaataaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct  240
cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa  300
tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cgaggggcat gcctgttcga  360
gcgtcattac accactcaag ctatgcttgg tattgggtgc cgtccttagt tgggcgcgcc  420
ttaaagacct cggcgaggcc tcaccggctt taggcgtagt agaatttatt cgaacgtctg  480
tcaaaggaga ggacttctgc cgactgaaac ctttattttt ctaggttgac ctcggatcag  540
gtagggatac ccgctgaact taa                                          563
<210>4
<211>564
<212>DNA
<213>Aureobasidium pullulans IFO-7757
<400>4
tttccgtagg tgaacctgcg gaaggatcat taaagagtaa gggtgctcag cgcccgacct   60
ccaacccttt gttgttaaaa ctaccttgtt gctttggcgg gaccgctcgg tctcgagccg  120
ctggggattc gtcccaggcg agcgcccgcc agagttaaac caaactcttg ttattaaacc  180
ggtcgtctga gttaaaattt tgaataaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct  240
cgcatcgatg aagaacgcag cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa  300
tcatcgaatc tttgaacgca cattgcgccc cttggtattc cgaggggcat gcctgttcga  360
gcgtcattac accactcaag ctatgcttgg tattgggtgc cgtccttagt tgggcgcgcc  420
ttaaagacct cggcgaggcc tcaccggctt taggcgtagt agaatttatt cgaacgtctg  480
tcaaaggaga ggacttctgc cgactgaaac cttttatttt tctaggttga cctcggatca  540
ggtagggata cccgctgaac ttaa                                         564

Claims (23)

1、一种含有β-葡聚糖的油脂组合物，其特征是含有来自微生物或担子菌的β-葡聚糖。
2、权利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂组合物，其中所述β-葡聚糖是通过培养微生物或担子菌而在菌体外分泌的β-葡聚糖。
3、权利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂组合物，其中所述β-葡聚糖是通过培养微生物或担子菌而得到的培养细胞。
4、权利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂组合物，其中所述微生物为酵母、乳酸菌、小球藻、藻类或属于短梗霉属(Aureobasidium)的微生物。
5、权利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂组合物，其中所述微生物为18S rRNA基因的1732碱基序列包括序列表的SEQ ID NO：1中所示的碱基序列或以18S rRNA基因的碱基序列为基础的与该碱基序列分子系统学上同等的碱基序列的微生物，而且对于抗生素放线菌酮具有抗性，并能在菌体外分泌生产β-葡聚糖。
6、权利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂组合物，其中所述微生物为ITS-5.8S rRNA基因的563碱基序列包括序列表的SEQ IDNO：2中所示的碱基序列或以ITS-5.8S rRNA基因的碱基序列为基础的与该碱基序列分子系统学上同等的碱基序列的微生物，而且能在菌体外分泌生产β-葡聚糖。
7、权利要求1所述的含有β-葡聚糖的油脂组合物，其中以该β-葡聚糖以外的全部组分为100重量份计，该β-葡聚糖的含量为0.01-500重量份。
8、一种食品，其含有权利要求1-7任一项所述的含β-葡聚糖的油脂组合物。
9、一种焙烤制品，其含有权利要求1-7任一项所述的含β-葡聚糖的油脂组合物。
10、一种糖食，其含有权利要求1-7任一项所述的含β-葡聚糖的油脂组合物。
11、一种具有预防生活习惯病作用的食品，其含有权利要求1～-任一项所述的含β-葡聚糖的油脂组合物。
12、一种具有预防生活习惯病作用的药物，其含有权利要求1-7任一项所述的含β-葡聚糖的油脂组合物。
13、米、小麦、玉米或大豆加工品，其含有权利要求1-7任一项所述的含β-葡聚糖的油脂组合物。
14、一种微生物，其18S rRNA基因的1732碱基序列包括序列表的SEQ ID NO：1中所示的碱基序列或以18S rRNA基因的碱基序列为基础的与该碱基序列分子系统学上同等的碱基序列，而且对于抗生素放线菌酮具有抗性，并能在菌体外分泌生产β-葡聚糖。
15、一种微生物，其ITS-5.8S rRNA基因的563碱基序列包括序列表的SEQ ID NO：2中所示的碱基序列或以ITS-5.8S rRNA基因的碱基序列为基础的与该碱基序列分子系统学上同等的碱基序列，而且能在菌体外分泌生产β-葡聚糖。
16、权利要求15所述的微生物，其对于抗生素放线菌酮具有抗性。
17、权利要求14-16任一项所述的微生物，其能在菌体外分泌生产结构中具有至少β-1，3-D-吡喃葡萄糖键的β-葡聚糖。
18、权利要求14-16任一项所述的微生物，其属于短梗霉属。
19、权利要求14-16任一项所述的微生物，其为出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)ADK-34(FERM BP-8391)菌株。
20、一种β-葡聚糖的制备方法，其特征是培养权利要求14-16任一项所述的微生物，使其在菌体外分泌生产β-葡聚糖。
21、一种β-葡聚糖的制备方法，其特征是培养ITS-5.8S rRNA基因序列与序列表的SEQ ID NO：2所示的碱基序列显示98％以上相同性的微生物，使其在菌体外分泌生产β-葡聚糖。
22、权利要求20或21所述的β-葡聚糖的制备方法，其中使用含有糖类作为碳源的培养基来培养微生物。
23、通过培养出芽短梗霉ADK-34(FERM BP-8391)菌株而在菌体外分泌生产的结构中具有至少β-1，3-D-吡喃葡萄糖键的β-葡聚糖。
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