KR101491478B1

KR101491478B1 - 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 ksy-0516 변이 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR101491478B1
Application number: KR20140078624A
Authority: KR
Inventors: 김민수; 김중수
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2014-06-26
Filing date: 2014-06-26
Publication date: 2015-02-10
Also published as: WO2015199349A1

Abstract

본 발명은 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KSY-0516 변이 균주, 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 조성물 및 건강기능식품, 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 건강보조식품, 피부 외용제 조성물 및 동물 사료 조성물, 상기 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-1,3/1,6-글루칸의 생산 방법 및 아우레오바시디움 풀루란스 균주에 에틸 메탄설포네이트 처리와 자외선 조사를 동시에 수행하여, 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주의 제조방법에 관한 것이다.

Description

세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주 및 이의 용도{Aureobasidium pullulans KSY-0516 mutant producing exo-type beta-1,3/1,6-glucan and uses thereof}

본 발명은 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주 및 이의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KSY-0516 변이 균주, 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 조성물 및 건강기능식품, 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 건강보조식품, 피부 외용제 조성물 및 동물 사료 조성물, 상기 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-1,3/1,6-글루칸의 생산 방법 및 아우레오바시디움 풀루란스 균주에 에틸 메탄설포네이트 처리와 자외선 조사를 동시에 수행하여, 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주의 제조방법에 관한 것이다.

베타-글루칸(β-glucan)은 최근 그 우수한 생체 조절 기능성, 예를 들면, 지질대사 개선작용, 정장작용, 혈당 상승 억제 또는 항종양 효과나 면역 증강 효과 등이 밝혀짐에 따라 그 용도적 측면에서 주목받고 있는 소재이다. 베타-글루칸은 미생물류, 담자균류 및 식물의 세포벽에 주로 포함되어 있으며, 세포벽을 구성하는 성분으로 존재하고 있다. 베타-글루칸의 구조는 1-2, 1-3, 1-4 또는 1-6-D-글루코피라노스(glucopyranose) 결합이 적어도 2종류 이상을 갖는 글루코스의 중합체를 주성분으로 한다. 동물의 면역계에 대한 활성 증진력을 갖는 베타-글루칸은 여러 가지 종류의 식용버섯, 효모, 보리, 귀리 등에 함유되어 있는 것으로서 알려져 있으며, 특히 담자균(버섯)의 자실체나 균사체에 함유되어 있는 베타-글루칸이 면역 증강 활성이 높고, 표고버섯 자실체로부터 추출되는 렌티난(lentinan)과 같은 중합체는 의약품으로 이용되고 있다. 그러나, 일반적으로 담자균(버섯)의 자실체나 균사체에 함유되어 있는 베타-글루칸은 그 생육재배 조건에 따라 포함되는 베타-글루칸의 함량이나 분자량 등이 크게 차이가 있어, 추출 결과로 얻어지는 베타-글루칸의 경우 고분자체와 저분자체가 혼재하는 등 품질이 일정하지 않아 실용화하기 어려운 단점이 있다. 한편, 미생물 균체의 세포벽은 다량의 베타-글루칸을 포함하고 있으며, 베타-글루칸의 공급원으로서 중요한 의미가 있고, 효모 균체, 유산균 균체, 아우레오바시디움 균체 등은 그 안전성이 우수하여 식품 소재로서 이용가치가 높은 것으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 미생물 균체의 세포벽에 함유되어 있는 베타-글루칸의 경우 역시 다양한 불순물을 포함하고 있어 분리, 정제에 어려움이 따르며, 또한 물에 불용성이기 때문에 효과가 높은 수용성의 베타-글루칸을 제조하기가 쉽지 않다.

이에 비하여, 균체 밖으로 면역 증강 활성이 높은 수용성 베타-글루칸을 분비 생산하는 미생물을 이용하여 베타-글루칸을 생산하는 방법은, 균일하며 수용성의 고활성 베타-글루칸을 얻는 것이 가능하여 매우 유용한 방법이다. 이러한 생각에 기초하여, 고활성의 베타-글루칸을 균체 밖으로 분비·생산하는 것이 알려져 있는 미생물을 사용한 베타-글루칸의 제조방법이 제안되어 왔다. 현재까지 베타-글루칸을 생산하는 미생물로서는 아그로박테리움 속(Agrobacterium sp.)이나 매크로포몹시스 속(Macrophomopsis sp.), 알칼리게네스 속(Alcaligenes sp.) 및 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 등이 밝혀졌다.

미생물 유래 베타-글루칸은 면역증강 활성을 통해 다양한 암에 대한 항암활성(Wagner et al., 1988, In Vitro Cell Dev Biol. 107:511-518), 항세균성 및 항바이러스 활성(Bohn & BeMiller, 1995, Carbohydrate Polymers, 28:3-14)을 보인다. 또한, 상처 치료효과와 피부재생 효과가(Jamas et al., 1994, US Patent 5322841) 탁월해 항염증 및 피부 노화방지 효과가 확인되었으며, 혈당강하작용(Calhoun et al., 1987, Agents Actions, 21:306-309) 등의 다양한 약리학적 효능이 발표되어 의약품 산업 및 건강보조식품, 화장품 산업 등 여러 산업분야에 폭넓은 응용이 기대되고 있다. 또한, 베타-글루칸은 점성, 젤 형성능, 열안정성, pH 안정성 및 유화활성 등이 뛰어나 식품, 화장품 및 다양한 공업 용도로서 주목받고 있다.

일반적으로 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)에 의해 생산되는 글루칸은 풀루란(Pullulan, 알파-글루칸)과 베타-1,3/1,6-글루칸이 동시에 생산된 것이다. 이때 생산된 풀루란은 면역활성 증강효과 등의 생리활성을 나타내지 않는 것으로 알려져 있다. 그러므로 면역활성 증강효과가 있는 베타-1,3/1,6-글루칸만을 사용하기 위해서는 같이 생산된 혼합형 글루칸을 고가의 풀루라나제(pullulanase)를 장시간 동안 처리하여 풀루란을 제거하고 난 후 베타-1,3/1,6-글루칸만을 순수하게 정제해야 하는 단점이 있다. 따라서 순수한 베타-1,3/1,6-글루칸만을 생산하는 미생물을 개발하면 베타-1,3/1,6-글루칸 생산을 위한 비용 절감을 통한 경제적 이익 및 보다 순수한 베타-1,3/1,6-글루칸의 획득에 유리할 것으로 기대된다. 이에 본 발명자들은 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화시켜 풀루란이 생성되지 않고 순수한 베타-글루칸을 생산하는 재조합 균주를 개발하였다(한국등록특허 10-0993577). 그러나 유전자 조작에 의해 개발된 재조합 균주는 식품용으로 사용 불가능하기 때문에 본 발명자들은 물리, 화학적인 방법으로 아우레오바시디움 풀루란스 균주를 돌연변이시켜 순수 베타-1,3/1,6-글루칸만을 생산하는 돌연변이 균주를 개발하였다.

한편, 한국등록특허 제1019012호에는 '아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822 KCTC11179BP, 신균주가 생산하는 세포외 분비형 베타-글루칸 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제0488175호에는 '베타-1,3-1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 SM-2001(KCCM 10307)균을 이용한 항종양기능성 쌀 및 그의 제조방법'이 개시되어 있으나, 본 발명의 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 본 발명자들은 아우레오바시디움 풀루란스 모균주에 돌연변이원인 에틸 메탄설포네이트와 자외선을 처리하여 순수 베타-글루칸만을 생산하는 돌연변이 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주를 개발하고, 상기 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주가 생산수율이 우수하고 정제 용이한 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 효과적으로 생산하는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KSY-0516 변이 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 조성물 및 건강기능식품을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 건강보조식품, 피부 외용제 조성물 및 동물 사료 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-1,3/1,6-글루칸의 생산 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 아우레오바시디움 풀루란스 균주에 에틸 메탄설포네이트 처리와 자외선 조사를 동시에 수행하여, 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주의 제조방법을 제공한다.

본 발명은 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 신규한 아우레오바시디움 풀루란스 변이 균주를 제공함으로써, 정제하기에 용이한 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 방법을 제시하였다. 그리고 베타-1,3/1,6-글루칸은 면역활성 증강효과가 우수하므로, 본 발명의 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 이용하여 면역증강 조성물, 건강기능식품 또는 피부외용제를 비롯하여 동물 사료 조성물 등을 개발할 수 있으므로, 본 발명의 신규한 균주는 산업적으로 유용하게 이용될 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 모균주(좌측)와 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주(우측)를 나타낸 그림이다.
도 2는 자외선 조사 시간에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 사멸율을 나타낸 결과이다.
도 3은 돌연변이원(mutagen) 에틸 메탄설포네이트 처리농도에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 균주의 사멸율을 나타낸 결과이다.
도 4는 분화된 수지상 세포에서 다양한 베타-글루칸에 의한 TNF-α의 활성을 나타낸 결과이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KSY-0516 변이 균주를 제공한다.

본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주는 아루레오바시디움 풀루란스 모균주에 돌연변이원(mutagen)인 에틸 메탄설포네이트(EMS, ethyl methane sulfonate)와 자외선을 동시에 처리하여 돌연변이를 유발하고, 순수 베타-1,3/1,6-글루칸의 생산 능력을 확인하여 선발한 것이다. 상기 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주를 한국생명공학연구원에 2014년 6월 17일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 18296P).

본 발명의 면역활성 증강용 조성물 및 건강기능식품은 유효성분으로 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주, 상기 변이 균주의 배양액, 상기 변이 균주 배양액을 원심분리하여 획득한 상등액 또는 상기 변이 균주, 균주 배양액 및 상등액의 건조물을 포함할 수 있으며, 본 발명에 따른 면역활성 증강용 조성물은 상기 유효성분 내에 베타-글루칸을 포함하고 있어 수지상 세포(dendritic cell)의 분화 유도 및 면역세포를 활성화하는 작용을 함으로써 면역증강 효과를 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명의 면역활성 증강용 건강기능식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있으며 예를 들면, 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마멀레이드 등), 어류, 육류 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지콘비이프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치이즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등) 등에 본 발명의 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 첨가하여 제조할 수 있다.

또한, 본 발명의 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물과 면역 증진 효과가 있다고 알려진 공지의 물질 또는 활성 성분과 함께 혼합하여 조성물의 형태로 제조할 수 있다. 아울러, 본 발명의 면역활성 증강용 건강기능식품은 면역 증진 효과를 더욱 증진하기 위해 이에 한정되지는 않으나, 베타카로틴, 스쿠알렌, 엽록소 제품, 화분, 비타민 A, 비타민 B1, 비타민 B6, 비타민 C, 나이아신, 판토텐산, 아연 등의 첨가물을 추가로 함유할 수도 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 또한 상기 외에 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다.

본 발명의 베타-1,3/1,6-글루칸을 포함하는 면역활성 증강용 조성물 및 건강기능식품은 독성 및 부작용이 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 건강보조식품, 피부 외용제 조성물 및 동물 사료 조성물을 제공한다.

본 발명의 건강보조식품은 영양보조제, 건강식품 및 식품 첨가제 등의 모든 형태를 포함하고, 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다. 예를 들면, 차, 쥬스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한, 본 발명의 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다. 본 발명의 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물의 바람직한 함유량으로는 식품의 전체 중량에 대해 약 1 내지 100중량%를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명의 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물을 포함하고, 본 발명의 피부 외용제 조성물을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 조성물을 함유하고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화할 수 있다.

또한, 본 발명의 동물 사료 조성물은, 상기 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 사료 조성물 기준으로 15~25 중량% 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 동물 사료 조성물은 쥐, 생쥐 또는 가축 등의 포유동물에 적용될 수 있으며, 분말 제형 또는 펠렛 제형일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

또한, 본 발명은 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-1,3/1,6-글루칸의 생산 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주는 세포 외로 순수 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산할 수 있는 균주로, 상기 균주의 배양 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있으며, 일례로 Czapek 액체 배지에 상기 균주를 접종하여 배양하는 방법일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 베타-1,3/1,6-글루칸은 면역활성 증강 조성물, 건강기능식품, 건강식품, 피부 외용제 조성물 및 동물 사료 조성물의 성분으로 사용되는 경우, 수지상 세포의 분화 유도 및 면역세포를 활성화하는 작용을 함으로써 면역증강 효과를 나타낼 수 있다. 이와 같은 면역활성 증강 조성물에 첨가되어 사용되는 경우, 상기 베타-1,3/1,6-글루칸은 다량 함유될수록 효과가 우수하며, 최소 5㎍/㎖의 양으로 함유되는 것이 바람직하다. 만일, 본 발명의 베타-1,3/1,6-글루칸 함량이 5㎍/㎖ 미만으로 함유되는 경우 면역증강 효과를 기대하기 어렵다. 바람직하게는 상기 베타-1,3/1,6-글루칸이 5~1,000㎍/㎖의 양으로 면역활성 증강 조성물에 함유될 수 있으며, 베타-1,3/1,6-글루칸 함량이 1,000㎍/㎖를 초과하면 베타-1,3/1,6-글루칸 중량에 따른 면역증강 효과 증대가 미미하여 비경제적이다.

본 발명의 방법에 따른 상기 에틸 메탄설포네이트는 아우레오바시디움 풀루란스 모균주 배양액에 1~5%(v/v)를 첨가하여 2~4시간 동안 처리할 수 있고, 바람직하게는 2~4%(v/v)의 에틸 메탄설포네이트를 첨가하여 2.5~3.5시간 처리할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 3%(v/v)의 에틸 메탄설포네이트를 첨가하여 3시간 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 본 발명의 상기 자외선 조사는 250nm 파장의 자외선을 500~700㎼/cm²의 광 세기로 1~20분 처리할 수 있고, 바람직하게는 550~650㎼/cm²의 광 세기로 5~15분 처리할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 600㎼/cm²의 광 세기로 10분 처리할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 방법에 따른 상기 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주는 전술한 에틸 메탄설포네이트 처리 및 자외선 조사 처리 조건에서 생존한 변이 균주로, 모균주와 동일한 배양학적 및 생리학적 특성을 가지고 있으며 순수 베타-1,3/1,6-글루칸을 세포외로 생산할 수 있는 능력이 안정화된 신규한 균주이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 자연계로부터 베타글루칸 생산 균주의 확보

자연계로부터 베타-1,3/1,6-글루칸 생산 균주(모균주)를 확보하기 위하여 자연적 부패가 많은 토양 시료를 수집하였다. 수집한 토양 시료 1g을 취하여 멸균 증류수 10㎖에 투입하고 1 분간 볼텍스를 이용하여 현탁하였다. 현탁액을 10⁴~10⁵배 희석하여 Czapek 고체 배지에 도말하고 이를 30℃에서 48시간 배양하였다. 배양접시에 나타난 콜로니 중에서 형태학적으로 검은색을 띄면서 포자를 형상하는 각각의 콜로니만을 확보하여 이를 50㎖ 용량의 Czapek 액체 배지에 접종하고 이를 30℃에서 48시간 배양하였다. 각각의 배양액 10㎖을 취하여 10분동안 4,000rpm으로 원심분리하여 배양액만을 수집한 뒤, 효모 및 버섯류의 베타-1,3/1,6-글루칸 분석 키트인 효모 베타-글루칸 키트 (k-YBGL, Megazyme, 아일랜드)를 이용하여 배양액 내 베타-1,3/1,6-글루칸 생산 여부를 확인하여, 자연계로부터 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 균주를 확보하였다.

실시예 2. 자외선을 이용한 돌연변이의 유발 조건 확립

돌연변이 유발을 위한 첫째 방법으로, 아우레오바시디움 풀루란스 모균주를 Czapek 액체 배지에 접종하고, 30℃에서 20시간 배양하였다. 배양액을 멸균수로 10³배 희석하고, 희석액 100㎕를 고체 배양 접시에 도말하였다. 고체 배양 접시를 평판교반기에서 회전시켜 주면서, 광도 600㎼/cm², 파장 250nm의 자외선 램프로 0~60분간 10분 단위로 조사하면서 돌연변이를 유발시켰다. 돌연변이의 유발은 아우레오바시디움 풀루란스 모균주에 자외선을 조사하지 않은 미생물의 수(CFU/㎖)를 대조구로 하여 균주의 사멸된 정도가 95% 이상인 시간을 확인함으로써 돌연변이 유발 조건을 설정하였다. 도 2에 나타난 바와 같이 아우레오바시디움 풀루란스의 경우 10분 이상 자외선을 조사하여도 사멸율은 크게 증가하지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 아우레오바시디움 풀루란스의 돌연변이 유발 자외선 조사 시간 조건은 10 분으로 확정하였다.

돌연변이 유발을 위한 두 번째 방법으로, 화학적 돌연변이 유도법을 사용하였다. 이를 위해서 아우레오바시디움 풀루란스 모균주를 Czapek 액체 배지에 접종하고, 30℃에서 20시간 배양하고, 상기 배양액 10㎖를 취하여 돌연변이원(mutagen)으로서 99.9% 농도의 에틸 메탄설포네이트(EMS)를 0~500㎕ 첨가하여 3시간 동안 처리하여 돌연변이를 유발하였다. 그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 아우레오바시디움 풀루란스의 경우 에틸 메탄설포네이트의 사용량이 300㎕일 때 사멸율 93%로 확인되었으며, 그 이상의 농도에서는 사멸율에 큰 변화가 없음을 확인하였다.

또한, 상기 돌연변이 유발 조건에서 각각 광도 600㎼/cm², 파장 250nm의 자외선 램프를 이용하여 10분간 자외선만 단독으로 처리한 경우, 300㎕의 에틸 메탄설포네이트만을 단독으로 처리한 경우 그리고 자외선과 에틸 메탄설포네이트를 동시에 처리한 경우의 실험군으로부터 얻어진 콜로니를 무작위적으로 10종씩 선정하여 순수한 베타-1,3/1,6-글루칸만을 생산하는지 확인하였다. 각각의 경우로부터 선정된 콜로니를 각각 50㎖ 용량의 Czapek 액체 배지에 접종하고 이를 30℃에서 48시간 배양하였다. 각각의 배양액으로부터 배양액 10㎖을 취하여 10분 동안 4,000rpm으로 원심분리하여 배양액만을 수집한 뒤, 풀루란(알파글루칸)을 분해하는 효소인 100U/㎖농도의 풀루라나아제 (pullulanase)를 2시간 처리하여 반응산물인 글루코스의 생성 여부를 확인하여 표 1에 나타내었다.

돌연변이 유발 조건별 각 균주에 풀루란 분해효소 풀루라나아제 처리 후 결과

UV 처리	글루코스 (g/ℓ)	에틸 메탄설포네이트 처리	글루코스 (g/ℓ)	UV + 에틸 메탄설포네이트 처리	글루코스 (g/ℓ)
콜로니 1	0.8	콜로니 11	0.6	콜로니 21	-
콜로니 2	1.2	콜로니 12	0.9	콜로니 22	0.4
콜로니 3	2.1	콜로니 13	0.4	콜로니 23	0.6
콜로니 4	1.6	콜로니 14	0.9	콜로니 24	-
콜로니 5	1.5	콜로니 15	1.1	콜로니 25	0.8
콜로니 6	1.8	콜로니 16	1.2	콜로니 26	-
콜로니 7	0.9	콜로니 17	0.6	콜로니 27	1.2
콜로니 8	1.5	콜로니 18	0.8	콜로니 28	-
콜로니 9	1.9	콜로니 19	0.9	콜로니 29	0.6
콜로니 10	2.1	콜로니 20	1.3	콜로니 30	0.5

상기 표 1에서 나타난 바와 같이 자외선 처리한 조건과 300㎕의 에틸 메탄설포네이트를 각각 단독으로 처리한 결과에서는 모든 콜로니에서 풀루라나아제 처리에 의해 풀루란의 분해물인 글루코스가 확인되어, 순수하게 베타-1,3/1,6-글루칸만을 생산하는 콜로니가 없었으며, 또한 상기 모든 콜로니의 경우 모균주처럼 멜라닌을 생산하여 검은색을 띄는 특징을 나타내었다. 반면 자외선과 에틸 메탄설포네이트를 동시에 처리한 경우에서는 콜로니 21, 콜로니 24, 콜로니 26 및 콜로니 28과 같이 알파글루칸을 생산하지 않는 콜로니를 확보할 수 있었다. 그리고 상기 콜로니 21, 콜로니 24, 콜로니 26 및 콜로니 28의 경우에는 모균주와는 다르게 멜라닌을 생산하지 않아 하얀색을 띄는 특징이 확인되었다.

따라서 이상의 결과를 통해 본 발명에서는 순수한 베타-1,3/1,6-글루칸만을 생산하고 모균주와는 다르게 멜라닌을 생산하지 않는 아우레오바시디움 풀루란스 변이균주를 확보하기 위해 돌연변이 유발 조건을 자외선 조사는 10분, 에틸 메탄설포네이트 처리는 균주 배양액 10㎖에 300㎕를 첨가하고 3시간 동안 처리하는 것으로 확정하였다.

실시예 3. 돌연변이 유발

상시 실시예 2의 결과에 따라, 아우레오바시디움 풀루란스 모균주를 Czapek 액체 배지에 접종하고 30℃에서 20시간 배양하였다. 배양액 10㎖을 취하여 돌연변이원 에틸 메탄설포네이트를 300㎕ 첨가하고 3시간 동안 반응시키면서 1차 돌연변이를 유발한 후, 상기 반응액 100㎕를 고체 배양 접시에 도말하였다. 고체 배양 접시를 평판교반기에서 회전시켜 주면서 광도 600㎼/cm², 파장 250nm의 자외선 램프로 10분간 조사하여 2차 돌연변이를 유발시켰다. 본 발명에서 사용한 Czapek 배지 조성표는 하기 표 2와 같다.

Czapek 배지 조성표

성분	첨가량
질산나트륨(NaNO₃)	3g
제2인산칼륨(K₂HPO₄)	1g
황산마그네슘칠수화물(MgSO₄·7H₂O)	0.5g
염화칼륨(KCl)	0.5g
황산철칠수화물(FeSO₄·7H₂O)	0.01g
수크로스	30g
한천(고체 배지 시 첨가)	20g
증류수	1ℓ

실시예 4. 순수 베타- 글루칸 생산 돌연변이 균주의 확보

전술된 실시예 3의 방법으로 돌연변이를 유발한 후, 고체 배양 접시에 나타난 약 700개의 효모 군락(colony)를 Czapek 액체 배지 20㎖가 함유된 100㎖ 삼각플라스크에 접종하여 30℃에서 72시간 배양하였다. 배양된 변이균주 10㎖을 각각 15㎖ 원심분리용 튜브에 취하여 4,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 상등액 5㎖를 15㎖ 원심분리용 튜브에 취하였다. 여기에 5㎖의 에탄올을 첨가하여 1분간 진탕한 후, 상온에서 10분 동안 반응시키고, 반응액을 멤브레인 필터로 여과하여 여과막에 존재하는 폴리머를 취하였다.

상기의 폴리머를 멸균수 10㎖에 현탁한 후, 각각의 시료에 풀루란 분해효소인 풀루라나아제를 1㎍ 첨가하여 30℃에서 5시간 동안 반응시키면서 풀루란을 분해하였다. 순수하게 베타-글루칸만을 생산하는 돌연변이 균주의 확보를 위해, 하기 표 2에 나타난 바와 같이 풀루라나아제 처리 후 풀루란의 분해 생성물인 글루코오스와 말토트리오스가 확인되지 않는 균주를 최종 돌연변이 균주로 확보하였다.

돌연변이 균주에 풀루란 분해효소 풀루라나아제 처리 후 결과

균주번호	생성물 농도(g/ℓ)		균주번호	생성물 농도(g/ℓ)
균주번호	글루코스	말토트리오스	균주번호	글루코스	말토트리오스
KSY-0516	-	-	KSY-1569	-	-
KSY-0678	0.2	0.3	KSY-1759	-	-
KSY-0699	-	-	KSY-1788	-	-
KSY-0848	0.2	0.2	KSY-1801	-	-
KSY-1067	-	-	KSY-1821	-	-
KSY-1124	0.4	0.4	KSY-1834	0.2	0.1
KSY-1354	0.1	0.1	KSY-1845	-	-
KSY-1367	-	-	KSY-1926	-	-
KSY-1398	-	-	KSY-1938	0.2	0.2
KSY-1447	-	-	KSY-1969	-	-

실시예 5. 변이 균주의 유전적 안정성 검사

상기 실시예 4의 표 3에서 풀루라나아제 처리 후 생성물로서 글루코스와 말토트리오스가 생성되지 않는 순수 베타-글루칸 생산 변이균주 14종(KSY-0516, KSY-0699, KSY-1067, KSY-1367, KSY-1398, KSY-1447, KSY-1569, KSY-1759, KSY-1788, KSY-1801, KSY-1821, KSY-1845, KSY-1926, KSY-1969)에 대해 안정성을 확인하기 위해 10 세대에 이를 때까지 계대 배양을 계속하면서 각 3, 6 및 10 세대에서 시료를 취하여 알파 글루칸 생성 여부를 확인하였다. Czapek 액체 배지 30㎖이 함유된 100㎖ 삼각플라스크에 각 변이균주를 접종하여 30℃에서 72시간 배양하였다. 각 변이균주 배양액 10㎖를 15㎖ 원심분리용 튜브에 취하여 4,000rpm으로 10분간 원심분리하여 세포를 침전시킨 후, 상등액 5㎖를 다시 15㎖ 원심분리용 튜브에 취하였다. 여기에 5㎖의 에탄올을 첨가하여 1분간 진탕한 후, 상온에서 10분간 반응시키고, 반응액을 멤브레인 필터로 여과하여 여과막에 존재하는 폴리머를 취하였다. 상기 변이 균주 9종에 대해 3, 6, 10 세대에서 확보된 시료를 풀루란 분해효소인 풀루라나아제에 의해 분해된 생성물로서 글루코오스와 말토트리오스가 생성되지 않은 균주를 확인하여 최종 돌연변이 균주를 확보하였다(표 4). 확보된 결과로 보아 본 발명에 제공된 균주는 유전적으로 순수 베타-글루칸 생산능이 안정된 상태인 것으로 알 수 있었다.

선정된 14종의 돌연변이 균주를 10 세대 동안 계대 배양하여 풀루란 분해효소 풀루라나아제 처리 후 결과

균주번호	3 세대		6 세대		10 세대
	생성물 농도(g/ℓ)		생성물 농도(g/ℓ)		생성물 농도(g/ℓ)
	글루코스	말토트리오스	글루코스	말토트리오스	글루코스	말토트리오스
KSY-0516	-	-	-	-	-	-
KSY-0699	-	-	0.2	0.2	0.2	0.3
KSY-1067	-	-	0.1	0.2	0.2	0.2
KSY-1367	0.3	0.4	0.3	0.3	0.3	0.3
KSY-1398	-	-	-	-	0.2	0.1
KSY-1447	-	-	0.2	0.2	0.2	0.2
KSY-1569	0.2	0.2	0.3	0.2	0.3	0.4
KSY-1759	-	-	-	-	0.1	0.1
KSY-1788	-	-	0.1	0.1	0.4	0.3
KSY-1801	-	-	-	-	0.4	0.2
KSY-1821	0.1	0.2	0.2	0.3	0.2	0.2
KSY-1845	-	-	-	-	0.2	0.2
KSY-1926	-	-	0.4	0.3	0.3	0.4
KSY-1969	0.2	0.2	0.3	0.3	0.2	0.3

실시예 6. 아루레오바시디움 풀루란스 KTS0516 변이 균주의 배양학적 및 생리학적 특성

최종 확보된 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주의 배양학적 및 생리학적 특성을 확인하였다. 표 5와 같이 배양학적 특성의 경우 탄소원으로서는 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose) 및 말토오스((maltose)만을 사용할 수 있었다. 이러한 결과로 보아 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516은 풀루란 합성 능력을 제외하고 모균주와 동일한 배양학적 및 생리학적 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주의 배양학적 특성

분석항목	특성
분석항목	모균주	KSY-0516 변이 균주
D-글루코스(D-Glucose)	+	+
D-갈락토스(D-Galactose)	-	-
L-솔보스(L-Sorbose)	-	-
D-글루코사민(D-Glucosamine)	-	-
D-리보스(D-Ribose)	-	-
D-자일로스(D-Xylose)	-	-
D-아라비노스(D-Arabinose)	-	-
L-람노스(L-Rhamnose)	-	-
수크로스(Sucrose)	+	+
말토스(Maltose)	+	+
셀로비오스(Cellobiose)	-	-
락토스(Lactose)	-	-
리보이톨(Riboitol)	-	-
자이리톨(Xylitol)	-	-
L-아라비니톨(L-Arabinitol)	-	-
D-만니톨(D-Mannitol)	-	-
숙시네이트(Succinate)	-	-
시트레이트(Citrate)	-	-
락테이트(Lactate)	-	-
메탄올(Methanol)	-	-
에탄올(Ethanol)	-	-
니트레이트(Nitrate)	+	+
니트리트(Nitrite)	+	+
에틸아민(Ethylamine)	-	-
리신(Lysine)	+	+
카다베린(Cadaverine)	-	-
바이오틴	-	-
50% D-글루코스	-	-
60% D-글루코스	-	-
1% 아세트산	+	+

(+ : 생장 가능, - : 생장 불가능)

실시예 7. 변이 균주 KSY-0516의 배양공정 최적화에 따른 생산성

변이 균주 KSY-0516을 이용하여 베타-글루칸 생산에 가장 많은 영향을 주는 물리적인 요인들 중 발효조의 교반 (agitation) 속도에 따른 베타-글루칸 생산량 증진에 관한 실험을 수행하였다. 탄소원의 농도가 30g/ℓ로 고정된 Czapek 배지를 2ℓ 발효조에 작업 부피 1.5ℓ하여 교반 속도를 100~500rpm으로 72시간 동안 배양하였다. 교반 속도를 제외한 나머지 조건은 모두 동일한 조건하에 실시하였으며, 실험결과 500rpm에서 모균주의 생산량보다 약 4.7배 높은 10.8g/ℓ의 최대 베타-글루칸을 생산하였음을 확인하였다.

교반 속도에 따른 발효 특성 비교

교반속도 (rpm)	Y _x/suc (gg^-1)	Y _glucan/suc (gg^-1)	P (gℓ^-1)
100	0.183	0.08	2.3
200	0.135	0.14	4.1
300	0.108	0.24	7.2
400	0.810	0.28	8.4
500	0.654	0.36	10.8

(Y _x/suc , 증식수율; Y _glucan/suc , 베타-글루칸 생성수율; P, 최대 베타-글루칸 생산량)

실시예 8. 아우레오바시디움 풀루란스 변이 균주 KSY-0516으로부터 생산된 베타-글루칸의 면역학적 활성 분석

Mutz-3 세포주는 인간 급성 골수성 백혈병(human acute myelo-monocytic leukemia)에서 얻은 세포주로서 분화(differentiation)를 통하여 수지상세포(dendritic cell)의 연구에 보편적으로 사용되고 있다.

Mutz-3 세포는 MEM-alpha 배지에 20%의 소태아혈청(FBS)와 1%의 항생제를 기본 배양액으로 사용하여 부유상태(suspension)로 배양하였으며, 성장인자로 줄기세포인자(SCF)를 10 ng/㎖ 첨가하였다. 세포 배양기(Sanyo, 일본)의 이산화탄소 농도와 배양 온도는 각각 5%와 37℃를 유지하였으며, 세포는 1x10⁶cell/㎖의 개수로 계대 후 약 48시간 배양하였다.

Mutz-3 세포의 분화는 기본 배양액에 과립구 대식세포 콜로니 자극 인자(GM-CSF) 50 ng/㎖, 인터루킨(IL)-4 10 ng/㎖ 및 종양괴사인자(TNF)-α 2.5 ng/㎖을 첨가하여 2일 동안 수지상세포로의 분화를 유도하여 muDC라 명명하였다. 본 실시예에서는 분화 후 24시간 이전의 muDC만을 실험에 이용하였다. 분화가 유도된 muDC를 재부유시켜 48-웰 조직 배양 플레이트에 나누어 분주한 후, 36시간 동안 배양하였다. 36시간 동안 배양된 muDC를 PMA(phorbol 12-myristate 13-acetate) 처리군과 PMA 무처리군으로 분류하여 PMA 처리군에는 100 ng/㎖를 처리하였다. 또한 PMA 처리군과 PMA 무처리군 모두에 베타-글루칸을 종류별로 100 ㎍/㎖을 처리하여 4시간 동안 반응을 유도하여 TNF-α의 변화 정도를 분석하였다. 이때 자이모신(zymosin)은 베타-글루칸의 양성대조군으로서 100 ㎍/㎖ 처리하여 각각의 베타-글루칸에 대한 비교군으로 활용하였다.

그 결과, 도 4의 결과와 같이 본 발명의 변이 균주로부터 생산된 베타-글루칸-5번 (베타-1,3/1,6-글루칸)에 의한 면역활성이 가장 우수함을 알 수 있으며, 베타-1,3/1,6-글루칸 구조를 가지는 다른 종류의 베타-글루칸-2번 (모균주의 베타-글루칸) 및 베타-1,3 글루칸 구조를 가지는 베타-글루칸-6번 (귀리의 베타-글루칸)에 의한 면역활성은 그보다 낮은 수준을, 그리고 베타-1,3 글루칸 구조를 갖지 않는 베타-글루칸-1번, 3번 및 4번은 면역활성이 낮음을 확인할 수 있었다. 이는 수지상 세포의 dectin-1 수용체가 베타-1,3 구조를 갖는 베타-글루칸만을 인식하여 면역 활성을 나타냄을 의미한다. 따라서, 변이균주의 베타-1,3/1,6-글루칸을 처리한 실험군이 다른 실험군에 비해 TNF-α 활성 유도 정도가 우수함을 확인할 수 있었으며, 이는 변이균주로부터 생산되는 베타-1,3/1,6-글루칸이 다른 종류의 베타-글루칸에 비해 면역증강력이 뛰어남을 의미한다.

한국생명공학연구원

KCTC18296P

20140617

Claims

알파-글루칸을 생산하지 않고 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) KSY-0516 변이 균주(KCTC 18296P).
제1항의 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 조성물.
제1항의 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 면역활성 증강용 건강기능식품.
제1항의 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 건강보조식품.
삭제
제1항의 변이 균주, 이의 배양액, 상등액 또는 이의 건조물을 유효성분으로 포함하는 동물 사료 조성물.
제1항의 변이 균주를 배양하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 베타-1,3/1,6-글루칸의 생산 방법.
아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) 균주에 에틸 메탄설포네이트(EMS, ethyl methane sulfonate) 처리와 자외선 조사를 동시에 수행하는 단계를 포함하는, 제1항의 알파-글루칸을 생산하지 않고 세포외 분비형 베타-1,3/1,6-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 에틸 메탄설포네이트는 아우레오바시디움 풀루란스 균주 배양액에 1~5%(v/v)를 첨가하여 2~4시간 동안 처리하는 것을 특징으로 하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주의 제조방법.
제8항에 있어서, 상기 자외선 조사는 250nm 파장의 자외선을 500~700㎼/cm²의 광 세기로 1~20분 처리하는 것을 특징으로 하는 아우레오바시디움 풀루란스 KSY-0516 변이 균주의 제조방법.