KR100993577B1 - 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 ｎｐ-1221 ｋｃｔｃ11265ｂｐ 및 이를 이용하여 세포외 분비형 베타-글루칸을생산하는 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 순수한 베타-글루칸 (β-glucan)만을 생산하는 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) NP-1221 KCTC 11265BP 및 본 균주를 이용하여 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법에 관한 것으로서, 본 발명에 의해 생산되는 베타-글루칸은 세포 외로 분비되는 형태의 베타-글루칸으로서 물에 대한 용해성이 우수하고 정제하기에 편리하여 대량생산이 용이하므로, 의약품, 건강보조식품 및 사료첨가제 등을 포함하는 다양한 용도로 이용 가능하다.

아우레오바시디움 풀루란스, 베타-글루칸, 면역활성 증진제

Description

신균주 아우레오바시디움 풀루란스 ＮＰ-1221 ＫＣＴＣ 11265ＢＰ 및 이를 이용하여 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법{Aureobasidium pullulans NP-1221 KCTC 11265BP and a producing method for exo-type β-glucan using the same}

본 발명은 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 아우레오바시디움 플루란스 신균주 및 이 신균주를 이용하여 베타-글루칸을 생산하는 방법에 관한 것이다.

베타-글루칸(β-glucan)은 최근 그 우수한 생체 조절 기능성, 예를 들면, 지질대사 개선작용, 정장작용, 혈당치 상승 억제 또는 항종양 효과나 면역 증강 효과 등이 밝혀짐에 따라 그 용도 측면에서 주목받고 있는 소재이다. 베타-글루칸은 미생물류, 담자균류, 식물의 세포벽에 주로 포함되어 있으며, 이러한 생물체의 골격인 세포벽을 구성하는 성분으로서 존재하고 있다. 베타-글루칸의 구조는 β－1－2, 1－3, 1－4, 1－6－D－글루코피라노스(glucopyranose) 결합을 적어도 2종류 이상 갖는 글루코오스의 중합체를 주성분으로 한다. 동물의 면역계에 대한 활성 증진력을 갖는 베타-글루칸은 여러 가지 종류의 식용버섯, 효모, 보리, 귀리 등에 함유되어 있는 것으로 알려져 있다. 특히 담자균(버섯)의 자실체나 균사체에 함유되어 있 는 베타-글루칸은 면역 증강 활성이 높고, 표고버섯 자실체로부터 추출되는 렌티난(lentinan)과 같은 폴리머는 의약품으로 이용되고 있는 것도 있다. 그러나, 일반적으로 담자균(버섯)의 자실체나 균사체에 함유되어 있는 베타-글루칸은 그 생육·재배 조건에 따라 포함되는 베타-글루칸의 함량이나 분자량 등이 크게 차이가 있어 추출 결과로서 얻어지는 베타-글루칸의 경우 고분자체와 저분자체가 혼재하는 등 품질이 일정하지 않아 실용화하기 어려운 단점이 있다. 한편, 미생물 균체의 세포벽은 다량의 베타-글루칸을 포함하고 있고, 베타-글루칸의 공급원으로서 중요한 의미가 있으며, 효모 균체, 유산균 균체, 아우레오바시디움 균체 등은 안전성이 우수하여 식품 소재로서 이용가치가 높은 것으로 알려져 있다. 그러나, 이러한 미생물 균체의 세포벽에 함유되어 있는 베타-글루칸의 경우 다양한 불순물도 포함하고 있어 분리, 정제에 어려움이 따르며, 또한 물에 불용성이기 때문에 효과가 높은 수용성 베타-글루칸을 제조하기가 쉽지 않다.

현재까지 베타-글루칸을 생산하는 미생물로서는 애그로박테리움 속 (Agrobacterium sp.)이나 매크로포모프시스 속 (Macrophomopsis sp.), 알칼리게네스 속 (Alcaligenes sp.)이 생산하는 커드란 (curdlan)(식물섬유의 과학, p108, 아사쿠라 쇼텐 (Asakura Shoten), 1997년), 아우레오바시디움 풀루란스 (Agaric. Biol. Chem. 47(6), 1167-1172(1983) 등이 밝혀졌다.

미생물이 생산하는 고분자 물질은 이제까지 다양한 구조와 성질을 갖는 것이 밝혀져 왔고, 그 중에는 식물성 고분자에서 볼 수 없는 독특한 성질의 생리활성과 비교할만한 물성적 특성을 갖는 것들이 있다. 미생물 유래 베타-글루칸은 면역증강 을 통한 다양한 암에 대한 항암활성 (Wagner 등, 1988), 항세균성 및 항바이러스 활성(Bohn & BeMiller, 1995)이 우수하다. 또한, 상처 치료효과와 피부재생 효과(Jamas 등, 1991)가 탁월해 항염증 및 피부의 노화방지 효과가 확인되었으며, 이밖에 혈압강하작용 (Chang & Miles, 1991), 혈당강하작용 (Chang & Miles, 1987) 등의 다양한 약리학적 효능이 여러 학회에 발표되어 의약품 산업 및 건강보조식품, 화장품 산업 등에의 응용이 기대되고 있다. 또한, 이들 베타-글루칸은 점성, 젤 형성능, 열안정성, pH 안정성 및 유화활성 (Hamada, 1987) 등이 뛰어나 식품, 화장품 및 다양한 공업 용도로서 주목받고 있다.

그러나 일반적으로 미생물에 의해 생산되는 글루칸은 알파-글루칸(Pullulan, 풀루란)과 베타-글루칸이 동시에 생산된다. 이때 생산되는 풀루란은 면역활성 증강효과 등의 생리활성을 나타내지 않는 것으로 알려져 있다. 그러므로 면역활성 증강효과가 있는 베타-글루칸만을 사용하기 위해서는 이와 같이 생산된 혼합형 글루칸을 고가의 풀루라나제(pullulanase)로 장시간 동안 처리하여 풀루란을 제거하고 난 후 베타-글루칸만을 순수하게 정제해야 하는 단점이 있다. 따라서 순수한 베타-글루칸만을 생산하는 미생물을 개발하면 베타-글루칸 생산 비용 절감을 통한 경제적 이익을 거둘 수 있고, 좀더 순수한 베타-글루칸 이용에 유리할 것으로 기대된다.

이에 본 발명의 목적은 자연계로부터 베타-글루칸의 생산수율이 우수하고, 정제하기에 간편한 세포외 분비형의 베타-글루칸을 생산하는 새로운 균주를 제공하려는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 알파-글루칸 즉 풀루란을 합성하는 효소를 불활성화하여 생체 활성 기능이 있는 베타-글루칸만을 생산하는 새로운 균주를 제공하려는 것이다.

또한 본 발명의 다른 목적은 상기 신균주로부터 면역증강 활성이 우수한 세포외 분비형 베타-글루칸을 효과적으로 생산하는 방법을 제공하려는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 얻어진 세포외 분비형 베타-글루칸을 포함하는 면역증강 조성물, 건강보조식품 및 화장료 조성물을 제공하는 것이다.

이에 본 발명자들은 다년간의 연구를 통하여 아우레오바시디움 풀루란스로부터 풀루란의 생합성에 관여하는 풀루란 합성효소 유전자(pullulan synthetase)를 확보하고 이를 유전자 파쇄 방법(Gene disruption method)을 이용하여 불활성화함으로써 순수한 베타-글루칸만을 생산하는 재조합미생물인 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221을 발명하였다. 이를 위해 본 발명에서는 풀루란 합성 유전자 제거를 위한 벡터를 제작하고 이를 아우레오바시디움 풀루란스에 삽입시켜 풀루란 합성 유전자가 제거된 새로운 재조합미생물인 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221을 개발하 고 이를 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 2008년 1월 18일자로 기탁하여 기탁번호:KCTC 11265BP를 부여받음으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 새로운 균주 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 KCTC 11265BP가 생산하는 베타-글루칸은 세포 외로 분비되는 형태의 순수한 베타-글루칸으로서, 물에 대한 용해성이 우수하여 대량생산이 용이하다. 따라서, 상기 신균주에 의해 생산된 세포외 분비형 베타-글루칸은 의약품, 건강보조식품 및 화장료 조성물 등 다양한 용도로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 풀루란 합성 유전자를 불활성화한 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 풀루란 합성 유전자가 불활성화된 벡터로 형질전환된 균주를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 풀루란 합성 유전자가 불활성화된 벡터로 형질전환하여 제조된, 순수한 베타-글루칸을 생산하는 새로운 균주 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 KCTC 11265BP를 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 상기 풀루란 합성 유전자가 불활성화된 균주를 이용하여 베타-글루칸을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 풀루란 합성 유전자가 불활성화된 균주는 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 KCTC 11265BP를 포함한다.

본 발명은 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 것을 특징으로 하는 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 제공한다.

또한, 본 발명에서 상기 균주는 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 KCTC 11265BP인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 상기 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주 제조용 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 PulS 유전자 불활성화를 유전자 파쇄방법(gene disruption method)으로 수행하는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 PulS 유전자 불활성화에 있어서 PulS 유전자의 두 개 엑손 중 1 이상의 엑손을 파쇄하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 PulS 유전자 불활성화가 TEF 프로모터 및 상기 TEF 프로모터와 결합된 항생제 내성 유전자로 이루어진 카셋을 상기 PulS 유전자의 1 이상의 엑손에 끼워넣어 수행되는 것을 특징으로 하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명은 상기 재조합 벡터로 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 형질전환하여 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 제조하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주가 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 KCTC 11265BP인 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기 풀루란 생합성 관여 유전자가 불활성화된 세포외 분비형 베 타-글루칸 생산 균주를 배양하여 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 배양하여 얻어진 배양액, 균체를 제거한 상등액 또는 그 건조물을 포함하며, 면역 세포를 활성화시켜 면역활성 증강효과를 나타내는 면역증강용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 배양하여 얻어진 배양액, 균체를 제거한 상등액 또는 그 건조물을 포함하는 것을 특징으로 하는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 배양하여 얻어진 배양액, 균체를 제거한 상등액 또는 그 건조물을 포함하는 것을 특징으로 하는, 화장료 조성물을 비롯한 피부 외용제 조성물을 제공한다.

뿐만 아니라, 본 발명은 동물 사료 조성물에 있어서, 상기 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 배양하여 얻어진 배양액, 균체를 제거한 상등액 또는 그 건조물을 포함하는 것을 특징으로 하는 사료 조성물을 제공한다.

상기 방법으로 얻어진 베타-글루칸은 특별한 정제 과정 없이 배양액 자체 또 는 배양액을 건조한 건조물을 이용하여 면역증강용 약학 조성물, 건강기능식품 조성물 및 화장료 조성물을 포함하는 피부 외용제 조성물과 동물 사료 조성물로 매우 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명은 상기와 같이 얻어진 베타-글루칸을 유효성분으로 함유하고, 면역증강에 효과적인 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 베타-글루칸을 0.01 ~ 99.9% 함유하는 것이 바람직하고, 0.1 ~ 90% 함유하는 것이 더욱 바람직하다. 그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태, 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 베타-글루칸을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 베타-글루칸을 포함하는 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 베타-글루칸을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면 활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제한다. 경구투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제한다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 베타-글루칸을 포함한 약학 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 베타-글루칸은 1일 0.01㎎/㎏ ~ 10g/㎏, 바람직하게는 1㎎/㎏ ~ 1g/㎏으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 따라서, 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 면역 증강 효과를 나타내는 베타-글루칸을 포함하는 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명의 베타-글루칸을 포함하는 조성물은 면역 증강을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 베타-글루칸물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있고, 분말, 과립, 정제, 캡슐 또는 음료 형태로 사용할 수 있다.

본 발명의 베타-글루칸 자체는 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

본 발명의 상기 베타-글루칸은 면역 증강을 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 베타-글루칸의 양은 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물인 경우 전체 식품 중량의 0.01 ~ 15중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물인 경우 100㎖를 기준으로 0.02 ~ 10g, 바람직하게는 0.3 ~ 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 베타-글루칸을 함유하는 것 외에 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 탄수화물은 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등의 이당, 예를 들어 말토 스, 슈크로스 등의 및 다당, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜을 포함한다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물(예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파탐 등)를 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100㎖당 일반적으로 약 1 ~ 20g, 바람직하게는 약 5 ~ 12g이다.

상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 또는 천연 풍미제와 같은 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 기타 본 발명의 조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위하여 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 각각 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하지는 않으나, 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0~20 중량부 범위에서 선택하는 것이 일반적이다.

본 발명은 또한, 상기 베타-글루칸을 함유하는 화장료 조성물을 비롯한 피부 외용제 조성물을 제공한다. 본 발명의 피부 외용제 조성물을 유효성분으로 하는 도포제는 통상적인 제조방법에 따라 어떤 형태로든 용이하게 제조할 수 있다. 일례로서 크림형 도포제를 제조함에 있어서는 일반적인 수중유형(O/W) 또는 유중수형(W/O)의 크림 베이스에 본 발명의 베타-글루칸을 함유하고 여기에 향료, 킬레이트제, 색소, 산화방지제, 방부제 등을 필요에 따라 사용하는 한편, 물성개선을 목 적으로 단백질, 미네랄, 비타민 등 합성 또는 천연소재를 병용할 수 있다.

뿐만 아니라, 본 발명의 베타-글루칸은 화장료로서 이용할 수 있는데, pH 조절제, 향료, 유화제, 방부제 등을 필요에 따라 부가하여 통상의 화장료 제조 방법으로 화장수, 젤, 수용성 파우더, 지용성 파우더, 수용성 리퀴드, 크림 또는 에센스 등으로 제형화할 수 있다.

본 발명의 베타-글루칸은 면역증강 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 등의 피부 외용제 및 사료 조성물의 성분으로 사용되는 경우, 수지상 세포의 분화 유도 및 면역세포를 활성화하는 작용을 함으로써 면역증강 효과를 나타낼 수 있다. 이와 같은 면역증강 조성물에 첨가되어 사용되는 경우, 상기 베타-글루칸은 다량 함유될수록 효과가 우수하며, 최소 5㎍/㎖의 양으로 함유되는 것이 바람직하다. 만일, 본 발명의 베타-글루칸 함량이 5㎍/㎖ 미만으로 함유되는 경우 면역증강 효과를 기대하기 어렵다. 좀더 바람직하게는 상기 베타-글루칸은 5 ~ 1,000㎍/㎖의 양으로 면역증강 조성물에 함유된다. 베타-글루칸 함량이 1,000㎍/㎖를 초과하면 베타-글루칸 증량에 따른 면역증강 효과 증대가 미미하여 비경제적이다.

또한, 상기 베타-글루칸이 건강기능식품 또는 화장료 조성물에 사용되는 경우 상기한 바와 같은 면역활성증강 효과를 나타내어 매우 유용하게 이용될 수 있으며, 그 첨가량은 대상에 따라 달라질 수 있으며 이에 한정하지 않는다.

상기 베타-글루칸이 건강기능식품에 포함되어 사용되는 경우, 총 중량에 대하여 0.005 ~ 2중량%로 첨가되며, 화장료 조성물에 포함되어 사용되는 경우에는 총 중량에 대하여 0.001 ~ 2중량%로 첨가되는 것이 바람직하다. 또한, 동물사료 조성물에 포함되어 사용되는 경우에는 총 중량에 대하여 0.005 ~2중량%로 첨가되는 것이 바람직하다. 하한선 미만이면 면역증대 기능 등이 미미하며, 상한선을 넘으면 첨가량이 증가되어도 효능 증가가 크지 않아 비경제적이다.

이하, 본 발명을 자세히 설명한다.

본 발명자들은 생산수율이 우수하고 정제하기에 간편한 세포외 분비형의 순수한 베타-글루칸을 생산하는 균주를 개발하였다. 본 발명의 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 KCTC 1265BP는 풀루란 합성효소를 불활성화함으로써 베타-글루칸만을 순수하게 생산한다. 본 발명의 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 KCTC 1265BP으로부터 생산되는 베타-글루칸은 면역활성 증강효과가 우수하여 이를 면역증강 조성물, 건강보조식품 또는 사료첨가제 등에 매우 유용하게 사용할 수 있다.

본 발명자들은 상기의 조건들을 만족시키는 균주를 개발하고 이 균주를 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans) NP-1221로 명명하고 한국생명공학연구원 유전자은행(KCTC, Korean Collection for Type Cultures)에 2008년 1월 18일자로 기탁하였다(기탁번호:KCTC 11265BP).

이러한 본 발명의 균주는 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하며, 그 배양 조건은 서당 1.0~5.0중량%, 질산나트륨 0.01~0.05중량%, 제이인산칼륨 0.1~1.0중량%, 염화칼륨 0.05~0.50중량%, 황산마그네슘 0.02~0.2중량%, 황산제일철 0.001~0.01중량%을 포함하여 제조된 액체 배지에서 잘 자라는 것으로 확인되었다.

본 발명의 균주 배양의 일례로서, 상기 액체 배지를 발효조에 넣고 121℃이상에서 30~60분간 가압 습윤 살균한 다음, 살균된 상기 액체 배지를 30℃로 냉각하고 상기 균주를 접종한 후, 30℃의 배양온도, 0.5~1.0 vvm의 에어 공급 및 150~300 rpm 교반 속도로 발효조에서 배양된다.

상기 균주 배양 후 그 배양물로부터 베타-글루칸의 정제는 일반적인 원심분리법 및 동결건조를 통하여 수행할 수 있다. 예를 들어, 상기 베타-글루칸의 정제는 상기 균주 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후 그대로 또는 건조하여 사용할 수 있다. 본 발명의 균주에 의한 베타-글루칸은 분자량 8.9 x 10⁵ 달톤으로서, 모균주와 동일하였다.

또한, 본 발명의 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221이 생산하는 베타-글루칸이 생체 내에 존재하는 면역세포들 가운데 면역조절기능의 중추적인 역할을 담당하고 있는 수지상 세포의 분화와 활성에 미치는 영향을 분석하였다. 수지상 세포는 적혈구 농축액을 혈액은행으로부터 공급받아 적혈구 용해완충액을 처리하여 적혈구를 제거하고 단핵구 분리 키트(monocyte isolation kits)를 사용하여 단핵구(monocyte)를 분리하여 실험을 수행하였다. 수지상 세포를 GM-CSF(1,000 U/㎖)와 IL-4(1,000 U/㎖)가 포함된 배지(10% FBS, RPM1640)로 6웰 마이크로플레이트에서 배양하였다. 배양 4일 후에 1㎖의 배지와 동량의 GM-CSF(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)와 IL-4를 첨가하고, 배양 6일째 베타-글루칸을 처리한 다음, 37℃ CO₂ 인큐베이터에서 24시간 동안 배양하여 수지상 세포의 분화능을 분석한 결과 베타-글루칸이 존재하는 상태에서 면역 기능을 담당하는 수지상 세포의 분화가 활발히 진행됨을 알 수 있었고, 이러한 결과를 토대로 베타-글루칸이 수지상 세포의 분화를 유도하여 생체 내에서 면역 기능을 강화시킴을 확인하였다(데이터 기재하지 않음). 이 결과는 모균주인 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221에서 얻어진 베타-글루칸의 면역증강 효능과 동일한 것이다(특허출원 제10-2008-57124호 참조).

상기 균주의 배양하여 그 배양물로부터 순수한 베타-글루칸은 일반적인 원심분리법 및 동결건조를 통하여 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 베타-글루칸 정제는 상기 균주의 배양액을 원심분리하여 균체를 제거한 후, 균체가 제거된 상등액에서 베타-글루칸을 회수한 다음 동결건조함으로써 분말 상태의 순수한 베타-글루칸을 획득할 수 있다. 상기 방법으로 얻어진 베타-글루칸은 면역증강 조성물, 건강보조식품 및 사료첨가제로 매우 유용하게 사용될 수 있다.

이하, 실시예를 들어 본 발명을 상세히 기술할 것이나 본 발명의 범위는 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 풀루란 생합성에 관여하는 유전자 분석 및 확보

본 발명자들은 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pulluans) 균주가 생산하는 풀루란(Pullulan) 생합성에 관여하는 PulS 유전자 부분을 미국의 국가 생명공학 정보센터(National Center for Biotechnology Information, USA)에서 확인하였으며 인증번호는 AF470615이었다.

PulS 유전자의 총 크기는 1,816bp의 염기로 이루어져 있으며, 실제로 발현하는 부분인 엑손(exon)은 2개의 부분으로 나뉘어 있다. 첫 번째 엑손은 209번째 염기부터 488번째 염기까지이고 두 번째 엑손은 1,070번째 염기부터 1,242번째 염기까지로 구성되어 있다. 본 발명자들은 209번째부터 488번째의 첫 번째 엑손 부분을 PCR(Polymerase chain reaction)로 증폭하여 확보하였다.

PCR 증폭을 위한 올리고머(Oligomer)는 PulS1F 5`- TCTAGAGGCACGCGTTTTTTCG -3`과 PulS1R 5`- CGGGTGACGAAGAGGAGAAG -3`, 그리고 PulS2F 5`- GTAGATGCCGACCATCATCAACAG -3`과 PulS2R 5`- AAGCTTCTTCCATTTACACCAAGCAG -3`을 이용하였다. 모든 PCR 수행에서 주형은 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pulluans)의 게놈 DNA를 이용하였다. 확보한 PCR 생산물은 첫 번째 엑손 부분의 정 중앙에서 좌측방향과 우측방향을 각각 확보하였으며 이는 각각 "엑손 1"과 "엑손 2"로 명명하였다. 그리고 차후에 항생제 내성 유전자 카셋(cassette)을 삽입하였다.

< 실시예 2> 표적 유전자의 파쇄를 위한 카셋 제작

본 발명에서 표적 유전자의 파쇄는 동일한 유전자 염기서열이 인식되었을 경우 서로의 인력에 의해 교차되는 상동 재조합(Homologous recombination)의 원리를 이용하였다. 그래서 앞선 표적 유전자의 엑손(Exon) 부분을 좌·우 양방향으로 증폭하여 확보한 후 그 가운데는 항생제 내성 유전자를 갖는 카셋을 부착시켜 주었다. 부착하는 방법으로는 오버랩 PCR을 사용하여 좌측 엑손 부분의 PCR 생산물 3` 부분에 카셋을 먼저 부착시키고 다시 카셋의 3` 부분에 오른쪽 엑손 부분을 부착하였다. 카셋 제작에는 항생제 내성 유전자의 PCR 증폭과 아우레오바시디움 풀루란스 (Aureobasidium pullulans) 균주에서 작용하는 프로모터(Promotor)가 필요하다. 그래서 우리는 이미 아우레오바시디움 속에서 강하게 작용하는 것이 확인된 프로모터 TEF를 PCR로 증폭하여 확보하였다. 또한 항생제 내성 유전자는 아우레오바시디움 속(Aureobasidium Sp .)에 작용하는 하이그로마이신(Hygromycin) 합성을 억제하는 하이그로마이신 포스포트랜스퍼라제(Hygromycin phospho-transferase) 유전자를 증폭하여 확보하였다.

PCR 수행은 프로모터의 경우 pFA6a-mRFP-KanMX6 플라스미드 DNA를 주형으로 이용하고 올리고머는 TEFF 5`- TCTTCGTCACCCGGACATGGAG -3`과 TEFR 5`- GGTTGTTTATGTTC GGATGTGATGT -3`을 이용하였다. 그리고 항생제 내성 유전자의 증폭에는 대장균(E. coli)의 게놈 DNA를 주형으로 이용하였으며 올리고머는 HygF 5`- CGAACATAA ACAACCATGAAAAAGCCTGAA -3`과 HygR 5`- GGTCGGCATCTACTCTATTCCTT -3`을 이용하였다. 그리고 TEF 프로모터와 프로모터의 3` 부분에 PCR 증폭된 항생제 내성유전자 Hyg를 부착하기 위하여 오버랩 PCR을 수행하였다. 오버랩 PCR 수행을 위해서는 각각의 증폭된 산물을 주형으로 모두 사용한다. 왜냐하면 HygF 올리고머의 5`쪽 15개의 염기가 TEFR 올리고머와 상보적인 서열을 지니고 있기 때문이다. 즉, 프 로모터와 항생제 내성 유전자 모두 주형으로 하여 반응시키게 되면 두 개의 상보적인 부분이 서로 결합하게 된다. 그리고 다시 PCR 증폭을 위한 올리고머는 TEFF, HygR을 이용하여 결합된 생산물을 하나로 증폭시키게 된다. 그 결과, TEF-Hyg가 결합된 TH PCR 생산물을 카셋으로 확보하였다.

< 실시예 3> 표적유전자 엑손 부분과 항생제 카셋의 접합을 위한 PCR

앞에서 언급한 바와 같이 본 발명자들은 표적유전자의 두 개의 엑손 부분 중 첫 번째 엑손을 파쇄하기 위해 PCR 증폭을 통하여 엑손 부분의 정 가운데를 중심으로 좌측과 우측으로 나누어 각각 증폭하였다. 이미 PCR에 의해 생산된 각각의 산물은 항생제 카셋과 결합 가능한 상태이며, 좌측부분 증폭산물(엑손 1)은 3` 말단에 상보적 염기서열을 가지며, 우측 증폭산물(엑손 2)은 5` 말단에 상보적 염기서열을 포함한다. 그래서 우리는 좌측부분과 TH 항생제 카셋의 접합을 위하여 오버랩 PCR을 먼저 수행하였다. 주형으로는 좌측 증폭산물(엑손 1)과 카셋을 이용하였으며 증폭을 위한 올리고머는 PulS1F와 HygR을 이용하였다. 그리고 엑손 1과 카셋이 결합된 증폭산물과 우측 증폭산물(엑손 2)을 주형으로 하여 오버랩 PCR을 수행하였다. 증폭을 위한 올리고머로는 PulS1F와 PulS2R을 이용하였고 최종적으로 표적 부분을 파쇄할 수 있는 PCR 산물로서 엑손 1+TH 카셋+엑손 2 산물을 확보하였으며 이를 편의상 "ETHE"로 명명하였다. 그리고 이 증폭 산물을 이용하여 T 벡터에 클로닝하였다.

< 실시예 4> T 벡터를 이용한 재조합 유전자 클로닝

PCR 증폭된 산물은 3` 말단과 5` 말단에 A(아데닌) 염기 꼬리를 생성하게 된다. 이것은 T(티민)과 결합하는 성질이 있다. 그래서 본 연구자들은 티민 염기를 포함하며 증폭 산물의 아데닌 꼬리를 클로닝 하는 벡터(vector)인 pBT1.1(Bio-solution Co.) T-벡터를 이용하여 클로닝을 실시하였다. 먼저 증폭 산물 "ETHE"(엑손1+카셋+엑손2)와 T-벡터, 라이게이션(ligation) 완충용액, 라이게이즈(ligase) 그리고 삼차증류수를 혼합하여 증폭산물과 벡터를 접합하는 과정을 거쳤다. 2시간 이상 충분한 접합이 종료된 후에 준비된 대장균 숙주에 접합된 DNA를 이용하여 형질전환을 시도하였다. T-벡터에는 암피실린(Ampicillin)에 내성을 지니는 유전자가 포함되어있기 때문에 항생제를 이용한 형질전환 균주 선별이 가능하다. 또한 X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D- galactopyranoside) 과 IPTG(Isopropyl b-D-thiogalactopyranoside)를 이용한 변색 선별도 가능하다. 형질전환 방법은 높은 온도를 이용한 DNA 삽입 방법(Heat shock)을 이용하였다. 배지에는 암피실린과 X-gal, IPTG를 각각 포함하였고, 37℃에서 16시간 배양하였다. 그리고 푸른색 콜로니를 제외한 정상적인 색깔의 콜로니를 선별하여 재조합 DNA를 확보하였다.

< 실시예 5> 클로닝된 재조합 플라스미드 DNA 확인 및 확보

이미 플레이트에서 관찰된 정상적인 색깔의 콜로니를 확보하여 액상 배지 5㎖에 암피실린을 첨가한 후 콜로니를 접종하였다. 12시간 동안 37℃에서 200rpm으로 충분히 배양한 후에 균체를 확보하여 DNA를 추출하였다. 추출 방법은 DNA 추출 킷트(kit)를 사용하였으며 확보된 DNA를 이용하여 ETHE의 존재 유무를 확인하기 위한 PCR과 제한효소를 이용하여 총 크기확인 및 벡터와 ETHE 부분의 크기를 확인하였다. 총 크기 확인을 위해서는 XbaI으로 처리하였고, 벡터와 ETHE 부분의 확인을 위해서는 XbaI과 HindⅢ를 이용하여 DNA 절편의 성향을 관찰하였다. 그 결과 모두 정상적인 것으로 확인되었으며 재조합 플라스미드 DNA는 pKBR103으로 명명하였다.

< 실시예 6> 재조합 플라스미드 DNA 를 이용한 아우레오바시디움 풀루란스의 형질전환

본 발명에서 제작한 재조합 플라스미드 pKBR103을 이용하여 아우레오바시디움 풀루란스 균주 형질전환을 시도하였다. 방법으로는 아우레오바시디움 균체의 구상 원형질세포(spheroplast)를 만들어서 PEG(Polyethylene glyco)를 매개로한 DNA의 삽입방법을 실시하였으며 형질전환된 균체를 선별하는 선별마커로써 하이그로마이신(Hygromycin) 항생제를 사용하였다. 형질전환으로 추정되는 콜로니들을 플레이트에서 확인하였으며, 상보적 염기들의 상동적 재조합 특성으로 인한 유전자 파쇄 및 하이그로마이신 카셋의 삽입을 유도하기 위하여 레플리카 플레이팅을 10세대 실시하였다. 최종적인 균주의 확인은 PCR을 이용하여 카셋의 삽입에 의한 유전자 크기가 증가된 것을 확인하였다.

그 결과 도 1a와 같이 기존의 모균주와 형태적, 유전자적으로 비교되는 형상을 나타내는 것을 확인하였다.

< 실시예 7> 형질전환된 아우레오바시디움 풀루란스의 배양학적 및 생리학적 특성

형질전환된 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221의 배양학적 및 생리학적 특성을 확인하였다. 표 1과 같이 배양학적 특성의 경우 탄소원으로서는 글루코오스(glucose), 수크로오스(sucrose) 및 말토오스((maltose)만을 사용할 수 있었다. 이러한 결과로 보아 NP-1221은 풀루란 합성 능력을 제외하고 모균주와 동일한 배양학적 및 생리학적 특성을 나타냄을 확인할 수 있었다.

D-Glucose	+	Melezitose D	-	DL-Lactate	-	w/o biotin	-
D-Galactose	-	Inulin	-	Succinate	-	w/o Thiamin	-
L-Sorbose	-	Starch D	-	Citrate	-	w/o Biotin & Thiamin	-
D-Glucosamine	-	Glycerol	+	Methanol	-	w/o pyridoxine	-
D-Ribose	-	Erythritol	-	Ethanol	-	w/o pyridoxine & Thiamin	-
D-Xylose	-	Riboitol	-	Propane 1,2 diol	-	w/o Niacin	-
L-Arabinose	-	Xylitol	-	Butane 2,3 diol	-	w/o PABA	-
D-Arabinose	-	L-Arabinitol	-	Nitrate	+	at 25℃	+
L-Rhamnose	-	D-Glucitol	-	Nitrite	+	at 30℃	+
Sucrose	+	D-Mannitol	-	Ethylamine	-	at 35℃	-
Maltose	+	galactitol	-	L-Lysine	+	at 37℃	-
α,α-Trehalose D	-	myo-Inositol	-	Cadaverine	-	at 40℃	-
Me α-D-glucoside	-	D-Glucono-1,5-lactone	-	Creatine	-	0.01% Cycloheximide	-
Cellobiose	-	2-Keto-D-gluconate	-	Creatinine	-	0.1% Cycloheximide	-
Salicin	-	5-Keto-D-gluconate	-	Glucosamine	+	1% Acetic acid	+
Arbutin	-	5-Keto-D-gluconate	-	Imidazole	-	50% D-Glucose	-
Melibiose	-	D-Gluconate	-	w/o vitamins	+	60% D-Glucose	-
Lactose	-	D-Glucuronate	-	w/o myo-Inositol	+
Raffinose	-	D-Galacturonate	-	w/o Pantothenate	+

<실시예 8> 형질전환된 아우레오바시디움 풀루란스의 순수 베타 글루칸 생산 여부 확인

모균주 아우레오바시디움 풀루란스 IMS-822와 형질전환된 신균주 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221을 자펙 배지(Cazpeck medium)에 접종하여 30℃에서 3일간 배양한 후, 4,000rpm으로 원심분리하여 세포를 제거한 후 배양 상등액 1㎖를 취하였다. 여기에 풀루란(pullulan) 분해효소인 풀루라네이즈(pullulanse)와 라미나리네이즈(laminarinase)를 처리하여 24시간 반응시킨 후 유리된 당성분을 고압액체크로마토그래피(HPLC)로 분석한 결과, 모균주로부터 생산된 다당의 경우에는 풀루라네이즈에 의한 반응 산물로서 말토트리오스(maltotriose)가 검출되었으나, 형질전환된 균주의 경우에는 풀루라네이즈에 의한 반응 산물이 없는 것으로 보아 풀루란이 생산되지 않음을 확인하였다. 또한, 베타-1,3 결합을 특이적으로 자르는 라미나리네이즈(laminarinase)를 이용하여 유리된 당성분을 분석한 결과 글루코즈(glucose)와 젠티오바이오즈(gentiobiose)가 유리되는 것을 확인하였다. 이것은 변이주로부터 나온 다당이 베타 결합으로만 이루어진 것을 확인한 것이었다.

도 1a는 본 발명의 아우레오바시디움 풀루란스(Aureobasidium pullulans)의 모균주와(좌) 형질전환된 신균주 NP-1221(우)을 나타낸 사진이고,

도 1b의 아가로즈 젤 사진은 PCR을 이용하여 형질전환된 유전자의 변형을 확인한 것이다.

M : 1kb + 래더 마커(ladder marker)

1 : 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 게놈에서 하이그로마이신 카셋 삽입에 의하여 pulS 유전자 엑손 1 크기가 증가한 것을 나타내는 PCR 증폭산물

2 : 모균주 게놈에서 순수한 pulS 유전자 엑손 1의 PCR 증폭산물.

도 2는 모균주 아우레오바시디움 풀루란스에서 풀루란 합성에 관여하는 PulS 유전자의 엑손부분 PCR 증폭과 TH 카셋의 아가로즈(agarose) 젤 DNA 사진이다.

도 3은 TH 카셋의 구성인 TEF 프로모터와 하이그로마이신 내성유전자 Hyg의 PCR 증폭과 결합된 모식도 및 아가로즈(agarose) 젤 DNA 사진이고,

도 4는 엑손1과 카셋과 엑손2의 결합을 나타내는 아가로즈(agarose) 젤 DNA 사진과 모식도를 나타낸 그림이고,

도 5는 본 발명에서 제작한 재조합 플라스미드 DNA pKBR103의 모식도와 클로닝확인의 아가로즈(agarose) 젤 DNA 사진이고,

도 6의 맨 위는 신균주 아우레오바시디움 플루란스 NP-1221로부터 생산된 다당류를 라미나리네이즈(laminarinase)로 반응시킨 후 HPLC 분석한 크로마토그램이고,

가운데는 신균주 아우레오바시디움 플루란스 NP-1221로부터 생산된 다당류를 풀루라네이즈(pullulanse)로 반응시킨 후 HPLC 분석한 크로마토그램이고,

아래는 아우레오바시디움 플루란스 IMS-822 KCTC BP11179(모균주)로부터 생산된 다당류를 풀루라네이즈(pullulanse)로 반응시킨 후 HPLC로 분석한 크로마토그램이다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> Aureobasidium pullulans NP-1221 KCTC 11265BP and a producing method for exo-type b-glucan using the same <130> MSKIM-NP1221 <160> 8 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 1 tctagaggca cgcgtttttt cg 22 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 cgggtgacga agaggagaag 20 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 gtagatgccg accatcatca acag 24 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 aagcttcttc catttacacc aagcag 26 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 tcttcgtcac ccggacatgg ag 22 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 ggttgtttat gttcggatgt gatgt 25 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 cgaacataaa caaccatgaa aaagcctgaa 30 <210> 8 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ggtcggcatc tactctattc ctt 23

Claims (13)

1. 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 것을 특징으로 하는 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주.
2. 제1항에 있어서,

   상기 균주는 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 KCTC 11265BP인 것을 특징으로 하는 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주.
3. 상기 제1항 또는 제2항의 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 배양하여 세포외 분비형 베타-글루칸을 생산하는 방법.
4. 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 상기 제1항의 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주 제조용 재조합 벡터.
5. 제4항에 있어서,

   상기 PulS 유전자 불활성화는 유전자 파쇄방법(gene disruption method)으로 수행하는 것을 특징으로 하는 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주 제조용 재조합 벡터.
6. 제5항에 있어서,

   상기 PulS 유전자 불활성화는 PulS 유전자의 두 개 엑손 중 1 이상의 엑손을 파쇄하는 것을 특징으로 하는 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주 제조용 재조합 벡터.
7. 제6항에 있어서,

   상기 PulS 유전자 불활성화는 TEF 프로모터 및 상기 TEF 프로모터와 결합된 항생제 내성 유전자로 이루어진 카셋을 상기 PulS 유전자의 1 이상의 엑손에 끼워넣어 수행되는 것을 특징으로 하는 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주 제조용 재조합 벡터.
8. 상기 제4항 내지 제7항 중 어느 한 항의 재조합 벡터로 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 형질전환하여 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성 화한 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 제조하는 방법.
9. 제8항에 있어서,

   상기 풀루란 생합성에 관여하는 PulS 유전자를 불활성화한 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주는 아우레오바시디움 풀루란스 NP-1221 KCTC 11265BP인 것을 특징으로 하는, 세포외 분비형 베타-글루칸 생산 균주를 제조하는 방법.
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