KR101400010B1 - 베타글루칸 하이드롤레이즈 스크리닝 방법 - Google Patents

베타글루칸 하이드롤레이즈 스크리닝 방법 Download PDF

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Abstract

아우레오바시디움 플룰란스 유래 순수 β-글루칸을 이용하여 자이모그래피와 LB-한천 플레이트로 β-1,3-1,6 글루칸 하이드롤레이즈를 스크린하는 방법을 발명하였다. 트리판 블루와 결합된 β-글루칸이 함유된 한천 플레이트 상에서 β-글루칸 하이드롤레이즈 생산균주인 패니바실러스 속 균주를 스크린하였고, 이 효소의 활성은 SDS-β-글루칸 자이모그래피로 분석하였다. β-글루칸은 CMC 자이모그래피 상에서 셀룰로스 분해활성을 나타내는 바실러스 속 균주에 의해서는 가수분해되지 않았다.

Description

베타글루칸 하이드롤레이즈 스크리닝 방법 {A screening method for b-glucan hydrolase employing Trypan Blue-coupled b-glucan agar plate and b-glucan zymography}
본 발명은 베타글루칸 하이드롤레이즈 또는 이 효소를 함유하는 균주의 스크리닝 방법에 관한 것으로서, 트리판 블루와 결합된 β-글루칸이 함유된 한천 플레이트 및 β-글루칸 자이모그래피를 이용하여 β-1,3-1,6 글라이코시딕 결합을 가수분해하는 효소 또는 이 효소를 생산하는 균주만을 선택적으로 스크린할 수 있다.
통상 "검은 이스트"라고 불리는 아우레오바시디움 플룰란스 (Aureobaisidum pullulans)는 널리 퍼진 다형성 곰팡이이다 (Cooke, 1959). 이 미생물은 플룰란 (α-글루칸) 및 의학 및 산업 분야에서 많이 이용되는 β-(1,3-1,6)-글루칸 (β-글루칸)을 포함하는 엑소다당류의 혼합물을 생산한다 (Morris 1990; Sakaria et al. 1997). 또한, β-글루칸은 면역체계를 자극하고 혈중 콜레스테롤 농도를 낮추는데 이용될 수 있다 (Shin et al. 2007). 나아가, β-글루칸은 양성 및 악성 종양 모두에 강력한 적대자이다 (Akramiene et al. 2007). 본 발명자들은 플룰란 합성효소 유전자를 붕괴시켜 순수한 β-글루칸 엑소다당류만을 생산하는 아우레오바시디움 플룰란스 NP1221이라는 돌연변이 종을 구축하였다 (Kang et al. 2010).
저분자량 β-글루칸은 점도가 낮고 수용성인 용액을 형성한다 (Kimura et al. 2007a, b). 이것은 마우스에서 장내 면역기능을 강화하고 (Kimura et al. 2007b) 음식에 대한 알러지 반응을 방지한다 (Kimura et al. 2007a). 따라서, 저분자량 β-글루칸의 효과적인 생산은 중요한 목표이다.
β-글루칸의 용해도를 높이기 위해, 다당류의 분자량 저하방법으로는 초음파 처리, 산 또는 염기 처리, 또는 효소에 의한 가수분해 방법이 이용되어 왔다. 초음파 처리는 분자량을 50 kDa 정도로 낮추었지만, 삼중 나선구조가 파괴되었다. 산 처리는 일반적으로 다당류 분해에 효과적이지만 글루칸 분자의 β-(1,6) 가지도 가수분해되었다. 하지만, β-글루칸 하이드롤레이즈는 저분자량 β-글루칸을 제조하면서도 초음파 처리, 산 또는 염기처리에 따르는 단점들을 피할 수 있다. 그러므로, β-글루칸 하이드롤레이즈 스크리닝은 저분자량 β-글루칸의 효과적인 생산에 필수적이다.
β-글루칸은 β-글라이코시딕 결합 (β-1,3 및 β-1,6 또는 β-1,4 및 β-1,6)에 의해 연결된 D-글루코스 단량체로 이루어져 있다. β-1,3과 β-1,6 글라이코시딕 결합을 갖는 β-글루칸은 β-1,4와 β-1,3 결합을 갖는 β-글루칸에 비해 생물학적 활성이 더 크다 (Ooi and Liu 2000).
본 발명은 저분자량 β-글루칸을 효과적으로 생산하는데 필요한 β-글루칸 하이드롤레이즈 또는 이 효소를 생산하는 균주를 간단히 스크린하는 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명자들은 β-글루칸에 활성을 나타내는 β-글루칸 하이드롤레이즈의 새로운 스크리닝 방법을 개발하게 되었다. 트리판 블루로 염색된 β-글루칸을 포함하는 한천 플레이즈와 β-글루칸 존재 하에서 수행하는 자이모그래피 방법이 β-글루칸에 작용하는 가수분해 효소를 생산하는 균주를 스크린하기 위해 적용되었다. 본 발명자들은 이외에도 숏건 클로닝으로 패니바실러스 속 WEL301 유래 β-글루칸 하이드롤레이즈를 암호화하는 유전자 서열을 밝혔다.
본 발명은
a) 트리판 블루와 결합된 β-글루칸이 함유된 한천 플레이트 상에 시료를 도말하여 투명 존을 형성하는 시료를 선택하는 단계; 및
b) 상기 단계에서 선택한 시료에 대하여 β-글루칸 자이모그래피를 실시하여 β-글루칸을 분해시키는 시료를 선택하는 단계;를 포함하는 β-1,3-1,6 글라이코시딕 결합을 가수분해하는 효소 또는 이 효소를 생산하는 균주를 스크린하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 b) 단계의 β-글루칸 자이모그래피가 β-글루칸을 함유한 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 시료를 로딩하고 전기영동하는 방법임을 특징으로 하는, β-1,3-1,6 글라이코시딕 결합을 가수분해하는 효소 또는 이 효소를 생산하는 균주를 스크린하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 a) 및 b) 단계의 β-글루칸이 플룰란 합성효소 유전자를 붕괴시켜 순수한 β-글루칸 엑소다당류만을 생산하는 아우레오바시디움 플룰란스 NP1221로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는, β-1,3-1,6 글라이코시딕 결합을 가수분해하는 효소 또는 이 효소를 생산하는 균주를 스크린하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법에 의하면, 간단한 공정으로 β-1,3-1,6 글루칸에만 특이적으로 활성을 갖는 β-1,3-1,6 글루칸 하이드롤레이즈 또는 이 효소를 생산하는 균주를 스크린할 수 있다.
이 방법으로 스크린된 β-1,3-1,6 글루칸 하이드롤레이즈 또는 이를 생산하는 균주는 저분자량 β-글루칸 제조에 이용할 수 있다.
도 1은 바실러스 속 균주 (DJ-2와 DJ-3) 및 패니바실러스 속 (Paenibacillus sp.) WRL301의 배양 상층액을 β-글루칸 (a) 또는 CMS (b) 존재 하에 자이모그래피한 것이다. 전기영동 후, 두 개의 자이모그램은 37 ℃로 16시간 동안 효소반응 완충액에서 배양하였다. 젤은 0.1 w/v% 콩고레드로 30분간 염색한 다음 1 M NaCl로 탈색하였다.
레인 1: DJ-2, 레인 2: DJ-3, 레인 3: WRL301.
도 2는 패니바실러스 속 (Paenibacillus sp.) WRL301 유래 β-글루칸 하이드롤레이즈 활성에 대한 pH와 온도의 효과를 나타내는 그래프이다. A는 pH 변화에 따른 효과를 나타낸다. 반응은 1% β-글루칸과 0.5 U/㎖의 효소용액이 함유된 50 mM 구연산 완충액 (검은 원), 50 mM 인산 완충액 (흰색 원), 그리고 50 mM 트리스-HCl 완충액 (검은 네모)에서 수행되었다. B는 온도 변화에 따른 효과를 나타낸다. 반응은 1% β-글루칸과 0.5 U/㎖의 효소가 함유된 50 mM 구연산 완충액 (pH 5.0)에서 10분간 수행하였다. 데이타는 세 번의 실험에서 얻은 평균값으로 나타내었고, 막대는 표준편차를 나타낸다.
도 3은 β-글루카네이즈의 아미노산 서열을 나타낸다. 패니바실러스 속 WRL301 유래 β-글루카네이즈 ("Ps Glu"), 바실러스 푸밀루스 (Bacillus pumilus) (YP_001486800) 유래 β-글루카네이즈 ("Bp Glu") 및 헤르페토시폰 아우란티아쿠스 (Herpetosiphon aurantiacus) (YP_001543076) 유래 β-글루카네이즈 ("Ha Glu")의 아미노산 서열 배열을 ClustalW 프로그램을 이용하여 수행하였다. 모든 서열에서 보존되는 아미노산은 별표로 표시하였다.
도 4는 트리판 블루와 결합된 β-글루칸이 함유된 한천 플레이트에 시료를 도말하여 투명존 형성을 본 결과이다.
도 5는 16S rRNA 유전자 서열에 기반하여 선택된 시료 균주 패니바실러스 속 WRL301의 계통발생 위치를 나타내는 계통도이다.
이하, 좀더 구체적인 실시예를 들어 본 발명의 구성을 좀더 자세히 설명한다. 그러나, 본 발명의 범위가 실시예의 기재에 의하여 한정되는 것이 아님은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명하다.
실시예 1: β-글루칸 하이드롤레이즈 생산 미생물 분리
전북 정읍시 내장산에서 채취한 토양 (1 g)을 증류수에 10-3 ~10-4 농도가 되도록 희석한 후 0.1% (w/v) β-글루칸과 0.01% (w/v) 트리판 블루를 포함하는 LB (Luria-Bertani) 한천배지에 뿌렸다.배지의 최초 pH는 7.0으로 조절하였고, 37 ℃로 3~5일간 배양하였다.
실시예 2: 자이모그래피
β-글루칸/CMC 자이모그램은 종래 방법에 따라 제조하였다 (Kim et al. 1998; Kim and Choi 1999). 간단히 설명하면, 분리용 젤 용액 [12% (w/v) 폴리아크릴아마이드]은 β-글루칸 또는 CMC (carboxymethyl cellulose) (양자 모두 0.12% w/v)이 함유되도록 제조하였다. 4 ℃에서 10 mA로 전기영동 한 후 젤은 실온에서 2.5% (v/v) 트리톤 X-100을 함유한 50 mM Tris/HCl (pH 7.4)에 넣고 교반하며 30분간 배양하였다. 각 젤은 30분간 증류수로 세척한 후 자이모그램 반응 완충액 [30 mM Tris/HCl 및 0.02% (w/v) NaN3; pH 7.4]에 넣고 37 ℃에서 12시간 동안 배양하였다. 최종적으로 β-글루칸 또는 CMC 를 분해하는 활성이 있는 효소를 함유한 젤 부분은 0.1% (w/v) 콩고 레드로 30분간 염색하고 1 M NaCl로 탈색하였다 (Han et al. 2005).
실시예 3: pH와 온도의 효과
다른 언급이 없으면, 반응은 1% β-글루칸과 0.5 U 효소/㎖가 함유된 50 mM 구연산 완충액 (pH 5.0)에서 40 ℃로 10분간 수행되었다. 50 mM 구연산 나트륨/구연산 완충액 (pH 3~6), 50 mM Na2HPO4/KH2PO4 (pH 6~8) 그리고 Tris/HCl 완충액 (pH 8~10)을 이용하여 40 ℃에서 pH를 3~10으로 변화시켰다.
또한, pH 5.0에서 온도를 20~60 ℃로 변화시켰다.
효소 1단위의 활성은 40 ℃, pH 5.0에서 분당 1 mol의 D-글루코스를 유리시키는 효소의 양으로 정의하였다.
실시예 4: 숏건 클로닝
패니바실러스 속 WRL301의 β-글루칸 하이드롤레이즈 유전자의 완전한 DNA 서열은 숏건 클로닝으로 얻었다. 패니바실러스 속 염색체 DNA는 "Current Protocols in Molecular Biology"에 기재된 대로 제조하였다. 분리된 유전자 DNA는 1~3 단위의 Sau3AI으로 37 ℃에서 30분간 부분 분해하였다. 반응은 65 ℃로 20분간 가열하여 정지시켰고, 약 2.5 kb의 DNA 조각은 젤 추출 킷트 (Qiagen Inc., Valencia, CA, USA)를 이용하여 정제하였다. 정제된 띠는 BamHI으로 자른 탈인산화 pHSG298 (Takara, Tokyo, Japan)로 연결하였다. E. coli DH5α는 재조합 플라스미드로 형질전환된 후 카나마이신 10 ㎍/㎖와 0.02% (w/v) 트리판 블루를 포함하는 LB 한천배지에서 배양하였다. β-글루칸 하이드롤레이즈 양성 클론은 콜리니 주위로 투명한 존을 형성하였다. 이러한 클론의 재조합 플라스미드는 Plasmid Midi-kit (Qiagen)을 이용하여 분리 및 정제되고, 재조합 DNA는 SolGent Co.에 의뢰하여 DNA 서열을 분석하였다.
결과 1: β-글루칸 하이드롤레이즈-생산 미생물 분리
콜로니 주위의 투명 존 형성으로 특징지어지는 생물체는 트리판 블루와 결합된 β-글루칸이 β-글루칸 하이드롤레이즈에 의해 분해됨으로 인해 얻어졌다 (도 4). 16S rRNA 유전자 서열에 기반하여 선택된 계통발생 위치는 도 5에 나타내었다. 이 균주는 패니바실러스 속과 가장 가까운 일치성을 나타내었고, 따라서 패니바실러스 속 WRL301 (GenBank accession number, AB685737)로 명명하였다. 패니바실러스 속에 의한 β-글루칸 하이드롤레이즈 발현은 β-글루칸 또는 CMC 존재 하에 자이모그래피로 확인하였다.
결과 2: 패니바실러스 속 WRL301 유래 β-글루칸 하이드롤레이즈 자이모그래피
패니바실러스 속은 CMC는 분해하지 않고, β-글루칸만 가수분해하였고 (도 1, 레인 3), 따라서, 이 효소는 β-1,3 및 β-1,6 결합을 포함하는 다당류에만 작용한다 (도 1B, 레인 3). 반면, A. pullulans NP1221 유래 β-글루칸은 CMC 존재 하에서 자이모그래피에서 셀룰로스 분해활성을 나타내는 바실러스 속 균주에 의해서는 가수분해되지 않았다 (도 1). 이것은 트리판 블루와 결합된 β-글루칸이 함유된 한천 플레이트에서의 배양 및 β-글루칸 또는 CMC 존재 하에서의 자이모그래피를 포함하는 본 발명의 스크린 방법이 β-1,3 및 β-1,6 글라이코시딕 결합에만 특이적으로 작용하는 β-글루칸 하이드롤레이즈 확인에 유용함을 말해준다.
결과 3: 패니바실러스 속 WRL301 유래 β-글루칸 하이드롤레이즈 활성에 미치는 pH와 온도의 영향
최대 효소 활성은 pH 5.0 및 40 ℃에서 나타났다 (도 2). 이 효소는 기질로서 β-1,3 및 β-1,6 글루칸에만 자이모그래피에서 활성을 나타내었다. 그러므로, 본 발명자들은 패니바실러스 속 WRL301 유래 효소가 β-1,3 및 β-1,6 결합을 포함하는 다당류에 높은 기질 특이성을 갖는 β-글루칸 하이드롤레이즈라고 결론지었다.
결과 4: 숏건 클로닝
β-글루칸 하이드롤레이즈 유전자는 ATG로 시작해서 TAA로 끝나는 2,994 bp의 오픈 리딩 프레임을 갖는다. 이 오픈 리딩 프레임은 997 aa의 단백질을 코딩하는데, 여기서 첫 32개의 aa는 신호 펩타이드 (SignalP 4.0 Server; http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)로 추정되며; 계산된 분자량은 106,910 Da (GenBank accession number, AB695292)였다. 아미노산 서열은 패밀리 9 글라이코사이드 하이드롤레이즈 (GH 9)와 유사하였다. 바실러스 푸밀러스 {Bacillus pumilus (YP_001486800)} 유래 셀룰레이즈, 헤르페토시폰 아우란티아쿠스 {Herpetosiphon aurantiacus (YP_001543076)} 유래 글라이코사이드 하이드롤레이즈, 써모비피다 푸스카 {Thermobifida fusca (YP_290232)} 유래 엔도글루카네이즈 및 셀룰로모나스 피미 {Cellulomonas fimi (YP_004451558)} 유래 글라이코사이드 하이드롤레이즈 와는 각각 60, 47, 44 및 39%의 상동성을 나타내었다. 이는 패니바실러스 속 WRL301의 β-글루칸 하이드롤레이즈가 GH 9 패밀리에 속함을 제시한다. 패니바실러스 속 WRL301, B. pumilus (YP_001486800) 및 H. aurantiacus의 β-글루칸 하이드롤레이즈의 아미노산 서열은 도 3에 나타내었다.
결론
본 발명자들은 트리판 블루와 결합된 β-글루칸이 함유된 한천 플레이트 및 β-글루칸 자이모그래피로 β-1,3-1,6 글루칸 하이드롤레이즈 또는 이를 생산하는 균주를 탐지하는 새로운 방법을 개발하였다. β-글루칸 하이드롤레이즈는 장내 면역기능을 강화하고 알러지 반응을 방지하는 저분자량 β-글루칸의 효과적인 생산에 필수적이다. 이 방법을 이용하여 본 발명자들은 β-글루칸 하이드롤레이즈를 생산하는 균주인 패니바실러스 속 WRL301을 스크린하였으며, β-글루칸 하이드롤레이즈를 코딩하는 유전자 서열을 분석하였다. 따라서, 본 발명의 방법은 환경원으로부터 배양배지에 관계 없이 β-1,3-1,6 글루칸 하이드롤레이즈를 탐지하는데 유용하다.

Claims (3)

  1. a) 트리판 블루와 결합된 β-글루칸이 함유된 한천 플레이트 상에 시료를 도말하여 투명 존을 형성하는 시료를 선택하는 단계; 및
    b) 상기 단계에서 선택한 시료에 대하여 β-글루칸 자이모그래피를 실시하여 β-글루칸을 분해시키는 시료를 선택하는 단계;를 포함하는 β-1,3-1,6 글라이코시딕 결합을 가수분해하는 효소 또는 이 효소를 생산하는 균주를 스크린하는 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 b) 단계의 β-글루칸 자이모그래피는 β-글루칸을 함유한 SDS-폴리아크릴아마이드 젤에 시료를 로딩하고 전기영동하는 방법임을 특징으로 하는, β-1,3-1,6 글라이코시딕 결합을 가수분해하는 효소 또는 이 효소를 생산하는 균주를 스크린하는 방법.
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 a) 및 b) 단계의 β-글루칸은 플룰란 합성효소 유전자를 붕괴시켜 순수한 β-글루칸 엑소다당류만을 생산하는 아우레오바시디움 플룰란스 NP1221로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는, β-1,3-1,6 글라이코시딕 결합을 가수분해하는 효소 또는 이 효소를 생산하는 균주를 스크린하는 방법.

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