KR101699018B1

KR101699018B1 - 셀룰로시마이크로비움 속 유래의 신규한 엔도-베타-1,4-글루카나제 및 그의 용도

Info

Publication number: KR101699018B1
Application number: KR1020150160133A
Authority: KR
Inventors: 손광희; 박호용; 김도영; 조한영; 신동하
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2015-11-16
Filing date: 2015-11-16
Publication date: 2017-01-23
Also published as: WO2017086612A1

Abstract

본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 셀룰로시마이크로비움 속 (Cellulosimicrobium sp.) 유래의 엔도-베타-1,4-글루카나제, 상기 엔도-베타-1,4-글루카나제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용하여 엔도-베타-1,4-글루카나제를 생산하는 방법 및 상기 재조합 미생물을 이용하여 비전분성 다당체를 생물학적으로 분해하는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따른 엔도-베타-1,4-글루카나제 효소는 우수한 셀룰로스 분해 활성을 보이므로, 제지, 펄프, 세제, 바이오 소재 및 바이오 에너지 등 다양한 산업분야에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

Description

셀룰로시마이크로비움 속 유래의 신규한 엔도-베타-1,4-글루카나제 및 그의 용도{Novel endo-beta-1,4-glucanase derived from Cellulosimicrobium sp. and uses thereof}

본 발명은 셀룰로시마이크로비움 속 유래의 신규한 엔도-베타-1,4-글루카나제 및 그의 용도에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 셀룰로시마이크로비움 속 (Cellulosimicrobium sp.) 유래의 엔도-베타-1,4-글루카나제, 상기 엔도-베타-1,4-글루카나제를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물, 상기 재조합 미생물을 이용하여 엔도-베타-1,4-글루카나제를 생산하는 방법, 상기 방법에 의해 생산된 엔도-베타-1,4-글루카나제 및 상기 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액에 비전분성 다당체를 첨가하여 비전분성 다당체를 생물학적으로 분해하는 방법에 관한 것이다.

식물 세포벽을 구성하는 기본물질인 셀룰로스는 D-포도당으로 구성된 비전분성 다당류로 베타-1,4 결합을 골격으로 하고 있으며 난분해성의 특성을 가진다. 자연상태에서 이 구조의 다당류는 베타-1,4-자일란(xylan)과 베타-1,4-만난(mannan)과 같은 헤미셀룰로스 및 리그닌 구조물 안에 매우 고도로 구성된 베타-1,4-글루칸(glucan) 사슬로 구성되어 있으므로, 효과적인 분해를 위해서 식물성 바이오매스 분해 미생물은 다양한 종류의 엑소- 및 엔도-형태의 글리코사이드 가수분해효소(glycoside hydrolase, 이하 GH) 효소군을 생성하여 당복합체 구조에 상호보완적으로 작용하여 효소 분해를 수행한다.

섬유소 분해효소 중에서 엔도-베타-1,4-글루카나제(endo-beta-1,4-glucanase)는 셀룰로스 섬유구조 분해에 관여하는 주된 GH 효소이다. 이 효소군은 1차 구조의 유사성을 기반으로(http://www.cazy.org/Glycoside-Hydrolases.html) 현재 7개의 인버팅(inverting) GH 패밀리와 5개의 리테이닝(retaining) GH 패밀리로 나뉜다. 이에 따라, 다양한 세균 및 진균 유래의 엔도-베타-1,4-글루카나제가 분자 수준에서 규명되었고 그 생화적 특성이 밝혀졌다. 그럼에도 불구하고, 미생물 유래 엔도-베타-1,4-글루카나제 중에 GH6 패밀리에 속하는 것은 분자구조적 특성에 관한 연구에 비해 상대적으로 효소학적 특성에 대한 연구는 상당히 미흡한 상태이다. 유전체 분석을 통해서 다수의 GH6 엔도-베타-1,4-글루카나제 유전자가 규명되었음에도 불구하고, 단지 3개의 효소, 포도스포라 안세리나 (Podospora anserina), 셀룰로모나스 파츠노대 (Cellulomonas pachnodae) 및 휴미콜라 인소렌스 (Humicola insolens) 유래의 GH6 엔도-베타-1,4-글루카나제만이 클로닝되어 재조합 균을 통해 발현되고 일부 특성이 규명되었다.

반추위 동물처럼, 초식곤충을 포함한 무척추동물과 지렁이는 소화관 내에 섬유소 및 헤미셀룰로스를 분해하는 공생 미생물군을 가지고 있어서 식물성 먹이를 소화하는데 도움을 받고 있다. 이전의 연구를 통해 본 발명자들은 지렁이 (Eisenia fetida)의 장으로부터 헤미셀룰로스 분해 미생물인 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 (Cellulosimicrobium funkei HY-13, KCTC 11302BP) 균주의 분리에 관해 보고했었다. 이 공생 미생물은 적어도 5개의 새로운 헤미셀룰로스 분해효소를 가졌고, 이들은 각각 독특한 분자를 구조를 가지며, 기질인 베타-1,4-자일란과 베타-1,4-만난에 대한 효과적인 분해기능을 가지고 있다. 이러한 발견에 근거하여 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주의 식물 바이오매스 분해 시스템을 유전체 수준에서 규명하고 세부특성을 분석하기 위해서, 본 발명자들은 이 균주의 전장 유전자 서열을 해석하였다. 그 유전체 크기는 4.67Mb 였고, 74.2%의 높은 GC 함량을 가지는 특성을 로슈/454 파이로시퀀싱, 게놈 시퀀서 FLX 및 PacBio RS 플랫폼의 단분자실시간 서열(SMRT, single-molecule real-time sequencing thchnology) 분석을 통해 확인하였다. 본 발명에서는 이 서열을 기반으로 새로이 발굴된 유전자 중 GH6에 속하는 신규한 엔도-베타-1,4-글루카나제의 분자생물학적 및 생화학적 특성을 보고하고자 한다.

한편, 한국등록특허 제1132296호에는 '잔토모나스 유래의 신규 엔도글루카나제'에 대해 개시되어 있고, 한국등록특허 제1481755호에는 '신규 엔도클루카나제 및 그의 용도'에 대해 개시되어 있으나, 본 발명의 셀룰로시마이크로비움 속 유래의 신규한 엔도-베타-1,4-글루카나제 및 그의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 (Cellulosimicrobium funkei HY-13, KCTC 11302BP) 균주로부터 유래한 엔도-베타-1,4-글루카나제가 기존의 엔도-베타 글루카나제와 서열 유사성이 최대 71%로 매우 높은 수준이 아닌 신규한 효소이며, 효소의 활성이 pH 4.0과 pH 10.0 사이의 넓은 범위에서 1시간 동안 반응시킨 후에도 90% 이상의 높은 잔존 활성을 나타내는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 셀룰로시마이크로비움 속 (Cellulosimicrobium sp.) 유래의 엔도-베타-1,4-글루카나제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엔도-베타-1,4-글루카나제를 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 이용하여 엔도-베타-1,4-글루카나제를 생산하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 생산된 엔도-베타-1,4-글루카나제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액에 비전분성 다당체를 첨가하여 비전분성 다당체를 생물학적으로 분해하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 셀룰로시마이크로비움 속 유래의 신규한 엔도-베타-1,4-글루카나제 효소는 우수한 셀룰로스 분해 활성을 보이므로, 제지, 펄프, 세제, 바이오 소재 및 바이오 에너지 등 다양한 산업분야에 유용하게 이용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주로부터 유래한 엔도-베타-1,4-글루카나제와 그것의 구조적 상동체들간의 아미노산 서열 유사성을 비교한 결과이다. Cfu, 본 발명의 엔도-베타-1,4-글루카나제 (KR154730); Csp1, 셀룰로모나스 속 (Cellulomonas sp.) KRMCY2 GH6 단백질 (WP_034662937); Csp2, 셀룰로모나스 속 HZM 가설 단백질 (WP_029289470); Cfi, 셀룰로모나스 피미 (Cellulomonas fimi) GH5 단백질 (WP_013770391); Xce, 자일라니모나스 셀룰로실리티카 (Xylanimonas cellulosilytica) GH6 단백질 (WP_012877020).
도 2는 정제된 엔도-베타-1,4-글루카나제의 SDS-PAGE 결과이다. S는 크기 마커이고, 1는 봉입체(inclusion body)로부터 얻은 단백질, 2는 정제된 엔도-베타-1,4-글루카나제 단백질을 로딩한 결과이다.
도 3은 pH(A) 및 온도(B)에 따른 엔도-베타-1,4-글루카나제의 활성을 확인한 결과이다. (C)와 (D)는 각각 pH 및 온도에 대한 본 발명의 엔도-베타-1,4-글루카나제의 효소 안정성을 확인한 결과이다. ●, 시트르산나트륨 완충용액;○, 인산나트륨 완충용액;▲, 트리스염산 완충용액;▽, 글리신수산화나트륨 완충용액.
도 4는 엔도-베타-1,4-글루카나제의 다양한 불용성 물질에 대한 결합 특성을 확인해 본 결과이다. CelL, 엔도-베타-1,4-글루카나제.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 셀룰로시마이크로비움 속 (Cellulosimicrobium sp.) 유래의 엔도-베타-1,4-글루카나제(endo-β-1,4-glucanase)를 제공한다.

본 발명에서 용어, "엔도-베타-1,4-글루카나제(endo-β-1,4-glucanase)"는 셀룰로오스를 분해하는 효소인 셀룰라제 중 하나로서, 셀룰로오스 사슬의 중간에 작용하여 짧은 사슬의 글루코오스 폴리머 또는 글루코오스 이량체(glucose dimer)인 셀로바이오스(cellobiose)를 만드는 효소로서, 불용성의 섬유소를 효과적으로 분해하기 위하여 매우 중요한 효소이다.

본 발명에 따른 엔도-베타-1,4-글루카나제의 범위는 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 1로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리 활성을 나타내는 단백질을 말한다.

바람직하게, 본 발명의 엔도-베타-1,4-글루카나제는 셀룰로시마이크로비움 속 (Cellulosimicrobium sp.)의 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 (Cellulosimicrobium funkei HY-13, KCTC 11302BP) 균주 유래의 엔도-베타-1,4-글루카나제일 수 있다.

본 발명의 엔도-베타-1,4-글루카나제는 최적의 활성을 나타내는 온도로서, 바람직하게는 45~55℃, 보다 바람직하게는 50℃ 일 수 있다. 또한, 최적의 활성을 나타내는 pH로서, 바람직하게는 pH 4.0~6.0의 pH, 보다 바람직하게는 pH 5.0일 수 있다. 본 발명의 엔도-베타-1,4-글루카나제 효소의 활성은 pH 4.0과 pH 10.0 사이의 넓은 범위에서 1시간 동안 반응시킨 후에도 90% 이상의 높은 잔존 활성을 나타내었다.

또한, 본 발명은 엔도-베타-1,4-글루카나제를 코딩하는 유전자를 제공한다.

본 발명에 따른 엔도-베타-1,4-글루카나제를 코딩하는 유전자는 서열번호 2로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열과 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 엔도-베타-1,4-글루카나제를 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

본 발명에서 용어, "벡터"란 연결되어 있는 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 벡터의 하나의 유형인 "플라스미드"는 그 안에 추가적으로 DNA 조각을 연결시킬 수 있는 환형의 이중 가닥 DNA 루프를 의미한다.

본 발명의 벡터는 작동 가능하도록 연결된 목적 단백질을 코딩하는 유전자의 발현을 지시할 수 있는데, 이러한 벡터를 "발현벡터"라고 한다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술의 사용에 있어서 발현 벡터는 플라스미드 형태이다.

상기 발현벡터는 숙주세포에 따라, 사용가능한 발현벡터의 종류가 결정될 수 있는데, 대장균을 숙주로서 사용하는 경우는 발현벡터로 pET28a 벡터를 예로 들수 있으며, 효모를 숙주로서 사용하는 경우는, YEp13, YCp50, pRS계, pYEX계 벡터 등을 예로 들 수 있다. 프로모터로서는, 예를 들면 GAL 프로모터, AOD 프로모터 등을 사용할 수 있다.

아울러, 상기 발현벡터에는, 목적 유전자의 발현의 억제 또는 증폭, 또는 유도를 위한 각종의 기능을 가진 발현 억제용의 단편이나, 형질전환체의 선택을 위한 마커나 항생물질에 대한 내성유전자, 균체밖으로의 분비를 목적으로 한 시그널을 코딩하는 유전자, 난발현성 단백질에 적합한 맞춤형 융합인자 등을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명에서 용어, "형질전환"이란 DNA를 숙주세포로 도입하여 DNA가 염색체 외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다.

본 발명에서 형질전환 방법은 본 발명의 발현벡터를 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적인 형질감염(transient transfection), 미세 주사, 형질 도입(transduction), 세포 융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질 감염(DEAE Dextran-mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질 감염(polybrene-mediated transfection), 전기천공법(electroporation), 스페로플라스트법, 아세트산리튬법 등의 공지 방법으로 숙주세포에 도입하여 형질전환시킬 수 있다.

본 발명에 따른 형질전환에 사용되는 숙주 세포는 당업계에 널리 알려져 있는 숙주세포는 어떤 것이나 사용할 수 있으나, 본 발명의 엔도-베타-1,4-글루카나제를 코딩하는 유전자의 도입효율이 우수하고, 도입된 유전자의 발현효율이 높은 숙주를 사용할 수 있는데, 예를 들면 박테리아, 곰팡이, 효모, 식물 또는 동물(예컨대, 포유동물 또는 곤충) 세포를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 미생물을 배양하고, 이의 배양물 또는 배양상등액으로부터 엔도-베타-1,4-글루카나제를 회수하는 단계를 포함하는, 엔도-베타-1,4-글루카나제의 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 형질전환체를 배양하기 위한 배지 및 배양조건은 숙주 세포에 따라 적절히 선택하여 이용할 수 있다. 영양배지는 숙주세포의 생육에 필요한 탄소원 무기질소원 또는 유기질소원을 포함하고 있는 것이 바람직하다. 탄소원으로는 글루코오스, 덱스트란, 가용성 전분, 수크로오스, 및 메탄올 등이 예시된다. 무기질소원 또는 유기질소원으로는 암모늄염류, 질산염류, 아미노산, 콘스팁 리쿼(corn steep liquer), 펩톤, 카제인, 소 추출물, 대두백, 및 감자추출물 등이 예시된다. 필요에 따라 다른 영양소, 예를 들어 염화나트륨, 염화칼슘, 인산이수소나트륨, 염화마그네슘 같은 무기염, 비타민류, 및 항생물질(테트라사이클린, 네오마신, 암피실린, 및 카나마이신) 등을 포함할 수 있다. 배양시는 세포의 생육과 단백질의 대량 생산에 적합하도록 온도, 배지의 pH 및 배양 시간 등의 조건들을 적절하게 조절할 수 있다.

상기 엔도-베타-1,4-글루카나제를 회수하는 단계는 통상적인 생화학 분리 기술에 의하거나 단백질의 한 부분 또는 다른 부분에 대한 항체를 사용하는 면역친화적인 방법으로 엔도글루카나제를 분리, 정제할 수 있다. 또 다른 방법은 단백질 서열에 태그(tag)를 가하여, 항체 또는 이러한 태그에 대하여 적절하게 높은 친화성을 갖는 기타 물질을 이용하는 친화 방법에 의해 정제할 수도 있다. 통상적인 생화학 분리 기술로는 단백질 침전제의 의한 처리(염석법), 원심분리, 초음파파쇄, 한외여과, 투석법, 분자체 크로마토그래피(겔여과), 흡착크로마토그래피, 이온교환크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피 등의 각종 크로마토그래피 등이 있고, 통상적으로 이들을 조합, 사용하여 순도가 높은 단백질을 분리할 수 있다.

본 발명의 엔도-베타-1,4-글루카나제는 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 (Cellulosimicrobium funkei HY-13, KCTC 11302BP) 균주 유래의 신규한 효소로, 대맥 유래 글루칸(Barley β-1,3-1,4-glucan)을 분해하는 효능이 아주 우수하며, 45~55℃의 온도 및 pH 4.0~6.0의 pH에서 최적화된 효소 활성을 나타낸다.

상기 비전분성 다당체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 바람직하게는 엔도-베타-1,4-글루카나제에 의해 분해될 수 있는 글루칸(glucan) 또는 다당류(polysaccharide)일 수 있으며, 보다 바람직하게는 대맥 유래 글루칸(Barley β-1,3-1,4-glucan), 리케난(Lichenan), 카복시메틸셀룰로스(carboxymethyl cellulose) 또는 콘작 글루코만난(konjac glucomannan) 등으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 상기 비전분성 다당체를 생물학적으로 분해하는 방법은 비전분성 다당체를 가수분해하는 단계를 사용하는 식품, 사료 및 기타 산업용 공정의 어떠한 곳에도 사용될 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 글루카나제 유전자의 확보

지렁이 공생 미생물 유래의 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 (Cellulosimicrobium funkei HY-13, KCTC 11302BP) 균주의 게놈 DNA에서 GH6(glycoside hydrolase family 6) 계열의 글루카나제 유전자서열을 기반으로 제작한 프라이머를 이용하여 글루카나제 단백질(이하 CelL)을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하여 클로닝하였다.

구체적으로, 상기 균주의 게놈 DNA 서열에서 글루카나제 유전자 서열을 확인하고, NdeI 및 HindⅢ 제한효소 사이트를 포함하는 CelL-F 프라이머(5'-CATATGGCCCCCGTCCCGACCCC-3'; 밑줄 NdeI 자리, 서열번호 3)와 CelL-R 프라이머(5'-AAGCTTTCAGACGACGTGGCACGGGC-3'; 밑줄 HindⅢ 자리, 서열번호 4)를 이용하여 95℃에서 5분, 95℃에서 30초간 변성, 65℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 95초간 신장의 조건으로 30회 반복한 다음, 72℃에서 7분 동안 최후 신장을 수행하는 조건으로 PCR을 수행하여 제한효소 사이트를 포함하는 CelL PCR 산물을 확보하였다. 그 후, 증폭한 유전자서열을 분석하여 NCBI 데이터베이스에서 단백질 블라스트 서베이(Protein blast survey)를 이용하여 아미노산 서열을 분석하였다.

본 발명의 CelL은 아미노-말단 쪽에 GH-6 도메인에 해당하는 활성 도메인과 카복시-말단 쪽에 셀룰로오스 바인딩 모듈 그룹 2(cellulose-binding module family 2; CBM2)를 포함하고 있음을 확인하였고, 유전자 서열분석에서 535개의 아미노산으로 이루어진 단백질을 암호화하는 1608 bp의 전사 해독틀(Open Reading Frame)을 가지며 분자량은 56,007 Da, pI 4.46으로 확인되었다. 또한, SignalP 3.0 데이터베이스(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) 상에서 분비시그널 영역을 조사한 결과 본 발명의 CelL 단백질은 최종 507개의 아미노산으로 이루어졌으며, 분자량은 53,389 Da, pI 4.37로 확인되었다. 또한, 다른 GH 단백질들과의 아미노산 유사성을 비교한 결과, 셀룰로모나스 속 (Cellulomonas sp.) KRMCY2 GH6 단백질 (WP_034662937)과 최대 71%의 유사성을 보여 신규한 효소임을 확인하였다(도 1).

실시예 2. 재조합 글루카나제의 발현과 정제

상기 실시예 1에서 얻은 전체 CelL 유전자를 이용한 발현 벡터를 구성하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 구체적으로, PCR 산물을 NucleoSpinGel 및 PCR Clean-up 키트(MACHEREY-NAGEL, 독일)를 이용하여 정제하고, pGEM-T easy vector(Promega, 미국)에 라이게이션(ligation) 반응 후, E. coli DH5α에 형질전환하여 암피실린이 함유된 LB 고체 배지에서 형질전환된 균주를 선별하였다. 선별된 형질전환 균주로부터 재조합된 pGEM-T 벡터를 정제한 후 pGEM-T-CelL로 명명하였으며, pGEM-T-CelL을 NdeI 및 HindⅢ 제한효소로 각각 절단한 후 CelL 유전자를 NucleoSpinGel 및 PCR Clean-up 키트를 이용하여 정제하였고, 새로운 발현 벡터 pET-28a(+)(Novagen, 미국)도 NdeI 및 HindⅢ 제한효소로 절단하여 정제하였다. 상기 정제한 CelL 유전자 및 발현벡터 pET-28a(+)를 약 100 ng씩 사용하여, TaKaRa 사의 리가아제(ligase) 효소 1 unit을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션 반응 후 발현 균주 E. coli BL21(Novagen, 미국)에 재조합된 발현 벡터 pET-28a(+)를 형질전환하여 카나마이신이 함유된 고체 배지에서 콜로니를 선별한 후 균주로부터 재조합 발현 벡터 pET-28a(+)를 정제하여 적절한 제한효소로 절단하고 CelL 유전자 절편이 든 벡터를 확보하였으며, 시퀀싱 확인을 통해 최종적으로 CelL 유전자가 재조합된 발현 벡터를 확보하였다.

각 발현벡터를 형질전환시킨 대장균을 액체 LB 배지에 접종한 뒤, 37℃에서 흔들면서 배양하였다. 각각의 대장균 배양액의 흡광도(OD₆₀₀) 값이 0.4 내지 0.5에 이르렀을 때 1.0 mM의 IPTG(isopropyl-1-thio-β-D-galactopyranoside)를 첨가한 뒤 30℃에서 5시간 더 흔들면서 배양시켰다. 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 초음파분쇄기로 세포를 분쇄하여 봉입체(inclusion bodies)를 확보하였다. 확보한 각각의 봉입체는 20 mM 이미다졸(imidazole), 0.5 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer, pH 7.4)으로 가용화시켜 주었다. 가용화된 세포 분쇄물을 His-Trap HP(GE Healthcare, 영국) 5 ml 컬럼에 150~200 mM의 이미다졸을 이용하여 재접힘시켜 정제한 후, 액체 크로마토그래피(LC, liquid chromatography)를 수행하였다. 또한, 공지의 방법인 HiLoad 26/60 Superdex 200 prep-grade(GE Healthcare, 영국) 컬럼을 이용한 겔 투과 크로마토그래피를 수행하여 정제된 CelL 단백질을 12% SDS-PAGE로 확인하였다(도 2). 상기 정제한 CelL 단백질을 브래드포드 시약(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 단백질을 정량한 후, 동결건조하여 -20℃에 보관하였다.

실시예 3. 글루카나제의 효소적 활성 측정

분리한 CelL의 효소적 활성과 최적 반응 조건(온도 및 pH)을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

효소활성을 측정하기 위해 DNS(Dinitrosalicylic acid) 정량법(Miller GL, 1959, Anal. Chem. 55:952-959)을 사용하였다. 1 %(w/v)의 카복시메틸셀룰로스(carboxymethyl cellulose; 이하 CMC)를 포함하는 50 mM 시트르산나트륨 완충용액(sodium citrate buffer, pH 5.0)에 단계별 희석한 100 ㎕의 CelL 효소용액을 넣고 55℃에서 15분간 반응시킨 후 750 ㎕의 DNS 용액을 첨가한 다음 100℃에서 5분간 방치한 후 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 1 unit은 1분 동안에 1 ㎕의 환원당을 방출시키는 효소의 양으로 정하였다.

효소의 최적반응 pH를 확인하기 위해, 50 mM 시트르산나트륨 완충용액(pH 3.5-5.5), 50 mM 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer, pH 5.5-7.5), 50 mM 트리스염산 완충용액(Tris-HCl buffer, pH 7.5-9.0) 및 50 mM 글리신수산화나트륨 완충용액(glycine-NaOH buffer, pH 9.0-10.5)을 사용하여 50℃에서 15분 동안 반응시켜 효소활성을 측정하였다.

효소의 최적반응 온도를 확인하기 위해 35~65℃ 범위에서 5℃ 간격으로 효소활성을 측정하였고, 온도에 대한 안정성을 확인하기 위해 35~55℃ 범위에서 50 mM 시트르산나트륨 완충용액(pH 5.0)에서 1시간 동안 방치한 후, 50℃에서 10분 동안 반응하여 효소활성을 측정하였다.

그 결과, 본 발명의 CelL은 pH 5.0 및 50℃의 온도에서 가장 높은 활성을 보였으며, pH 4.0~10.0의 범위에서 1시간 후에도 90% 이상의 높은 잔존 활성을 보여주었다. 또한, 45℃에서 1시간 동안 70% 이상의 잔존 활성을 유지하였다(도 3).

실시예 4. 글루카나제의 기질특이성

본 발명의 글루카나제 단백질, CelL의 다양한 자일란 및 당 기질에 대한 분해능을 확인하기 위해, 대맥 유래 글루칸(Barley β-1,3-1,4-glucan), 리케난(Lichenan), 카복시메틸셀룰로스(CMC) 및 콘작 글루코만난(konjac glucomannan)등의 다양한 글루코스 중합체와 아비셀(Avicel), 커드란(Curdlan), 라미나린(Laminarin) 등의 다당체를 이용하여 기질특이성을 조사하였다. 간단하게, 각각의 기질(1 %(w/v))을 포함하는 50 mM 시트르산나트륨 완충용액(pH 5.0)에 희석된 CelL 효소 용액(0.05 ml)을 포함하는 표준 분석 혼합물(0.5 ml)을 50℃에서 10분 동안 효소 반응을 수행하여 효소 활성을 측정하였다.

그 결과, 하기 표 1과 같이, 대맥 유래 글루칸에 대해 가장 높은 분해 활성을 보였으며, 리케난, CMC 그리고 글루코만난 순으로 가수분해 활성이 확인되었다.

CelL의 다양한 기질에 대한 가수분해 활성 비교

기질	Specific activity(U/㎎)	상대 활성(%)
대맥 유래 글루칸	6.2	100.0
리케난	3.0	48.4
CMC	2.8	45.2
콘작 글루코만난	2.5	40.3
아비셀	0.6	9.7
커드란	ND	-
라미나린	ND	-
수용성 전분	ND	-
자일로글루칸	ND	-

(ND, 검출되지 않음)

실시예 5. 글루카나제에 의한 글루칸 분해산물의 특성

본 발명의 CelL의 효소적 특성을 확인하기 위하여 글루칸 분해산물을 분석하였으며 하기와 같은 실험을 수행하였다.

앞선 실시예 3과 같은 방법으로 대맥 유래 글루칸(Barley β-1,3-1,4-glucan)과 셀로바이오스(cellobiose, C2), 셀로트리오스(cellotriose, C3), 셀로테트라오스(cellotetraose, C4) 및 셀로펜토스(cellopentose, C5) 및 셀로헥소스(cellohexose, C6)를 기질로 하여 CelL와 효소 반응을 시킨 혼합물을 100℃에서 5분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 다음, 가수분해 산물을 용출용액 A(0.05 % 포말산/멸균수), 용출용액 B(0.05 % 포말산/멸균수:아세토니트릴/메탄올 = 6:4)의 이동상 조건하에 Asahipak NH2P-50 2D 컬럼(5 ㎛, 2.0x150 mm, Shodex)을 이용한 고성능 액상 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC)를 수행하여 분석하였다.

그 결과, 하기 표 2와 같이, 대맥 유래 글루칸에 대한 가수분해 산물은 100% 셀로트리오스(C3)로 확인되었고, 셀로헥소오스는 셀로바이오스와 셀로트리오스로, 셀로펜토오스는 셀로바이오스와 셀로트리오스로, 셀로테트라오스, 셀로트리오스 및 셀로바이오스는 가수분해되지 않는 양상을 확인하였다.

CelL를 이용한 자일로스 기질에 대한 가수분해물 조성 분석

	가수분해에 의해 생성된 산물의 조성(%)
기질	C1	C2	C3
C2		100
C3			100
C4		100
C5		68.6	31.4
C6		63.2	36.8
대맥 유래 글루칸			100

실시예 6. 글루카나제의 결합특성

본 발명의 CelL는 글리코시드 GH 6 도메인과 CBM2 도메인을 포함하는 분자 구조로, 바인딩 모듈에 따른 효소의 기질에 대한 결합력 또는, 고정화 효소의 담체로의 활용이 가능함을 확인하기 위하여 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 다양한 불용성 다당폴리머인 아비셀(Avicel), 아이보리 넛 만난(ivory nut mannan), 키틴(chitin), 리케난(lichenan) 및 리그닌(lignin) 등에 5.0 I.U./ml의 CelL을 첨가하여 혼합한 다음, 50 mM 시트르산나트륨 완충용액(pH 5.0)을 이용하여 다섯 번 세척하여 불용성 기질을 제거한 상등액을 이용하여 실시예 3과 같은 방법으로 잔존활성을 측정하여 기질에 대한 결합특성을 분석하였다.

그 결과, CelL은 아비셀, 아이보리 넛 만난, 키틴에 88%의 가장 높은 친화도를 나타내었고, 리케난, 리그닌 등에는 상대적으로 작은 결합력을 확인하였다(도 4). 이의 결과는 기질에 따라 바인딩 모듈 그룹을 달리하여 효소의 기질에 대한 결합력 또는 고정화 효소의 담체로의 활용이 가능함을 의미했다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel endo-beta-1,4-glucanase derived from Cellulosimicrobium sp. and uses thereof <130> PN15351 <160> 4 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 535 <212> PRT <213> Cellulosimicrobium funkei HY-13 <400> 1 Met Arg Arg Arg Ala Val Leu Ser Ala Val Ala Ala Leu Ala Leu Ala 1 5 10 15 Ser Pro Leu Leu Ala Ala Ala Gly Ser Ala Gly Ala Ala Pro Val Pro 20 25 30 Thr Pro Ala Val Pro Arg Ala Thr Ala Ala Pro Ala Ala Asp Asp Val 35 40 45 Val Gly Pro Gly Thr Arg Leu Tyr Val Asp Pro Phe Ser Thr Thr Leu 50 55 60 Gln Ala Ala Ala Val Leu Thr Gly Gln Ala Arg Ala Asp Ala Gln Leu 65 70 75 80 Leu Gly Ser Phe Pro Ser Ala Ser Trp Phe Thr Gly Gly Thr Pro Asp 85 90 95 Glu Val Arg Asp Asp Val Ala Ser Val Val Arg Ala Ala Ala Thr Asp 100 105 110 Gly Ser Val Pro Thr Val Val Val Tyr Asn Leu Pro Phe Arg Asp Cys 115 120 125 Ala Gln Tyr Ser Ala Gly Gly Ala Ala Asp Thr Ala Ala Tyr Thr Ala 130 135 140 Trp Val Asp Ala Val Ala Glu Gly Ile Gly Asp Asp Pro Ala Ile Val 145 150 155 160 Val Leu Glu Pro Asp Gly Leu Gly Ile Ile Pro Trp Tyr Thr Asp Ile 165 170 175 Asn Gly Asn Pro Glu Trp Cys Arg Pro Ala Glu Leu Asp Pro Glu Thr 180 185 190 Ala Ala Ala Asp Arg Phe Val Gln Leu Asn His Ala Val Asp Ala Leu 195 200 205 Thr Ala Leu Pro Ala Thr Ser Val Tyr Leu Asp Gly Thr His Ser Gly 210 215 220 Trp Leu Gly Val Gly Asp Ile Thr Asp Arg Leu Ile Lys Ala Gly Val 225 230 235 240 Glu Arg Ala Asp Gly Val Phe Val Asn Ala Ser Asn Tyr Val Glu Thr 245 250 255 Glu Arg Leu Val Lys Tyr Gly Thr Trp Ile Ser Asp Cys Val Asn Leu 260 265 270 Ser Val Asn Ser Trp Trp Glu Pro Ala Trp Cys Ala Ser Gln Tyr Tyr 275 280 285 Pro Ala Asn Pro Asp Asp Val Glu Thr Trp Gly Leu Thr Asp Ala Ala 290 295 300 Tyr Ala Gln Ala Tyr Ala Asp Thr Gly Val Val Arg Asp Pro Ala Ala 305 310 315 320 Gln Lys His Val Val Val Asp Thr Ser Arg Asn Gly Gln Gly Pro Trp 325 330 335 Thr Ala Pro Ser Gly Val Tyr Ala Asp Pro Glu Val Trp Cys Asn Pro 340 345 350 Pro Asp Arg Gly Leu Gly Glu Arg Pro Thr Thr Asp Thr Ala Asp Pro 355 360 365 Phe Val Asp Ala Tyr Leu Trp Ile Lys Val Pro Gly Glu Ser Asp Gly 370 375 380 Lys Cys Tyr Arg Gly Thr Gly Gly Pro Leu Asp Pro Ala Arg Gly Ile 385 390 395 400 Glu Asp Pro Ala Ala Gly Gln Trp Phe Val Glu Gln Ala Ala Glu Leu 405 410 415 Leu Ala Leu Ala Ser Pro Ala Val Glu Arg Pro Thr Cys Glu Val Ala 420 425 430 Tyr Thr Val His Gly Thr Trp Gln Gly Lys Lys Gly Asn Gly Phe Ile 435 440 445 Ala Gln Val Glu Leu Arg Asn Thr Gly Ala Ser Pro Leu Asp Gly Trp 450 455 460 Glu Leu Arg Trp Thr Pro Asp Gly Asp Gln Arg Leu Thr Asp Val Trp 465 470 475 480 Gly Ala Gln Ala Gly Arg Asp Gly Ala Ala Leu Thr Ala His Ser Leu 485 490 495 Ser Trp Asn Ala Arg Val Arg Pro Gly Ala Thr Ala Thr Phe Gly Phe 500 505 510 Val Ala Ser Gly Ala Pro Gly Ala Gly Pro Gln Leu Val Thr Leu Gly 515 520 525 Gly Arg Pro Cys His Val Val 530 535 <210> 2 <211> 1608 <212> DNA <213> Cellulosimicrobium funkei HY-13 <400> 2 atgagacgtc gtgccgtcct gtccgccgtc gccgctctcg cgctcgcgag cccgctgctc 60 gccgccgccg ggagcgccgg cgccgccccc gtcccgaccc ccgccgtgcc ccgggcgacg 120 gccgcccccg cggcggacga cgtcgtcggg ccggggaccc gcctctacgt ggacccgttc 180 tccacgaccc tccaggccgc cgccgtgctc acgggccagg cccgcgccga cgcccagctc 240 ctcgggtcct tcccgtcggc ctcatggttc acgggcggca cgcccgacga ggtgcgcgac 300 gacgtcgcgt ccgtcgtccg ggcggccgcg accgacgggt cggtgccgac cgtcgtcgtc 360 tacaacctgc cgttccggga ctgcgcgcag tactccgcgg gcggcgccgc cgacacggcc 420 gcctacacgg cctgggtgga cgccgtcgcc gaggggatcg gcgacgaccc ggcgatcgtg 480 gtcctcgagc cggacgggct cgggatcatc ccctggtaca ccgacatcaa cggcaacccc 540 gagtggtgcc ggccggccga gctcgacccg gagaccgccg cggccgaccg gttcgtccag 600 ctcaaccacg ccgtcgacgc gctcacggcg ctcccggcca cctcggtcta cctcgacggg 660 acgcacagcg ggtggctcgg ggtcggcgac atcaccgatc gcctcatcaa ggcgggcgtc 720 gagcgcgccg acggcgtgtt cgtcaacgcg tcgaactacg tcgagaccga gcgcctcgtg 780 aagtacggga cgtggatcag cgactgcgtc aacctgtcgg tgaacagctg gtgggagccc 840 gcgtggtgcg cgagccagta ctacccggcg aaccccgacg acgtcgagac ctggggcctc 900 accgacgccg cgtacgccca ggcctacgcg gacacgggcg 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acgacgtggc acgggc 26

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진, 셀룰로시마이크로비움 속 (Cellulosimicrobium sp.) 유래의 엔도-베타-1,4-글루카나제(endo-β-1,4-glucanase).
제1항의 엔도-베타-1,4-글루카나제를 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 상기 유전자는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 유전자.
제2항 또는 제3항의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제4항의 재조합 벡터로 형질전환된 재조합 미생물.
(a) 제5항의 재조합 미생물을 배양하는 단계; 및
(b) 상기 (a) 단계의 배양물 또는 배양상등액으로부터 엔도-베타-1,4-글루카나제를 회수하는 단계를 포함하는, 엔도-베타-1,4-글루카나제의 생산 방법.
제6항의 방법에 의해 생산된 엔도-베타-1,4-글루카나제.
제5항의 재조합 미생물을 배양하여 수득한 배양물 또는 배양상등액에 비전분성 다당체를 첨가하여 비전분성 다당체를 생물학적으로 분해하는 방법.