KR101415165B1 - 셀룰로시마이크로비움 속 ｈｙ－１３ 균주로부터 생산된 신규한 만난아제 - Google Patents

셀룰로시마이크로비움 속 ｈｙ－１３ 균주로부터 생산된 신규한 만난아제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로 부터 생산된 만난아제에 관한 것으로, 구체적으로 무척추동물로부터 분리한 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13균주로부터 생산된 고활성의 신규한 만난아제 (mannanase)에 관한 것이다. 상기의 균주로부터 생산된 만난아제는 곡물 및 식물에 포함된 헤미셀룰로오스 중 만난을 분해하여 이를 이용한 가수분해물의 바이오 매스 전환 또는 사료 원료로의 이용 가치를 높이는데 사용할 수 있다.

Description

셀룰로시마이크로비움 속 ＨＹ－１３ 균주로부터 생산된 신규한 만난아제{Novel mannanase produced from Cellulosimicrobium sp. HY-13 strain}
본 발명은 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 생산된 신규한 만난아제(mannanase)에 관한 것이다.
셀룰로스(cellulose) 및 헤미셀룰로스(hemicellulose) 분해 미생물은 토양, 비료와 같은 생태계, 및 초식동물 및 무척추 동물의 소화관에서 작용하며, 이러한 미생물은 식물 바이오매스(bio mass)의 생물학적 전환에 중요한 역할을 수행한다 (Flint et al., 2008, Nat. Rev. Microbiol. 6, 121-131; Kim et al., 2009, Appl. Environ. Microbiol. 75, 7275-7279; Perez et al., 2002, Int. Microbiol. 5, 53-63 참조).
식물 바이오매스에 존재하는 구조적 폴리사카라이드(polysaccharide) 중, β-1,4-만난은 기본적으로 연질목(softwood)의 헤미셀룰로스 성분이고, 글루코스(glucose) 및/또는 갈락토스(galactose) 단위를 포함하는 헤테로폴리사카라이드(heteropolysaccharide)로서 종종 다양한 리그노셀룰로스(lignocellulose) 바이오매스에서 발견된다(van Zyl et al., 2010, Proc. Biochem. 45, 1203-1213). 이러한 셀룰로스 및 자일란(xylan)의 생분해 과정 동안, 만난 폴리사카라이드(mannan polysaccharide)의 완전한 분해 역시 β-만난아제(β-mannanase), β-만노시다제(β-mannosidase), β-글루코시다제(β-glucosidase), α-갈락토시다제(α-galactosidase), 및 아세틸 만난 에스터라제(acetyl mannan esterase)와 같은 다양한 가수분해 효소의 협동적 작용에 의해 수행된다는 선행 연구들이 보고되었다(Shallom and Shoham, 2003, Curr. Opin. Microbiol. 6, 219-228; Walker and Wilson, 1991. Bioresour. Technol. 36, 3-14 참조).
β-1,4-만난아제는 무작위로 만난 폴리사카라이드의 내부 β-1,4-만노시딕 결합을 분해하는 엔도(endo)-효소이다. 이러한 글리코시드 가수분해효소(Glycoside hydrolase, GH)는 아노머(anomer) 구조를 보유하는 이중 대치 메커니즘을 나타내는 (β/α)8-배를(barrel)로 구성된 전형적인 분자 구조를 갖는다(Moreira and Filho, 2008, Appl. Microbiol. Biotechnol. 79, 165-178 참조). 미생물의 β-1,4-만난아제는, 아미노산 서열, 구조적 및 기계적 상동성에 기초하여, 3개의 GH 패밀리인, 5, 26, 및 113과 연계된다(http://www.cazy.org 참조). 또한, 140개 이상의 β-1,4-만난아제 유전자 서열은 NCBI 데이터베이스에서 얻을 수 있다. 그러나, 비록 β-1,4-만난아제를 암호화하는 많은 유전자 상동성이 게놈 분석을 통하여 다양한 박테리아 및 균류 유래로부터 확인되었으나, β-1,4-엔도글루카나제(β-1,4-endoglucanases) 및 β-1,4-자일라나제(β-1,4-xylanases)와 비교하여, 미생물의 β-1,4-만난아제의 유전적 및 생화학적 특성은 아직까지 밝혀지지 않은 실정이다.
최근 무척추동물 및 초식동물의 내장의 다양한 호기성 및 혐기성 섬유소분해 미생물은 특정 구조 및 기능적 특성을 갖는 신규한 GH 효소를 생산할 수 있는 후보물질로서 주목받고 있다(Brennan et al., 2004, Appl. Environ. Microbiol. 70, 3609-3617; Selinger et al.,1996, Anaerobe 2, 263-284). 그러나, 비록 토양 유기물을 자화하는 지렁이와 같은 무척추동물이 이의 내장에 다양한 섬유소 분해 미생물을 가질 것이라고 예측되나, 확인된 카보하이드로라제(carbohydrolase)의 대부분은 박테리아 반추위(rumen) 및 곤충의 내장 박테리아로부터 유래된 셀루로스 분해 및 자일란 분해 효소이다.
현재까지 2개의 헤미셀룰로스 분해 박테리아인, 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 (Cellulosimicrobium sp. HY-13)(Kim et al., 2009, Proc.Biochem. 44, 1055-1059; Kim et al., 2009, Appl. Environ. Microbiol. 75, 7275-7279 참조) 및 스트렙토마이시스 더모카복시더스 HY-15(Streptomyces thermocarboxydus HY-15) (Kim et al., 2010, J. Mol. Catal. B: Enzym. 62, 32-39 참조)가 지렁이인, Eisenia fetida의 내장으로부터 분리되었고, 그들의 세포외 엔도-β-1,4-자일라나제(endo-β-1,4-xylanase)가 동정되어 분자적으로 확인되었다. 그럼에도 불구하고 분자수준에서 지렁이 공생 미생물이 생산하는 만난아제의 특성에 관한 어떠한 선행연구도 지금까지 진행된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 지렁이 공생 박테리움인 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주로부터 신규한 만난아제를 동정하였으며, 상기 만난아제의 구조적 및 생화학적 특성, 및 특이적 활성을 갖는 최적의 조건과 함께, 상아야자열매 만난 및 로커스트콩검(locust bean gum)에 대한 높은 특이적 활성이 나타내는 GH5 β-1,4-만난아제임을 규명하여 사료효율 개선제로의 가능성이 있음을 확인함으로써 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 생산된 신규한 만난아제(mannanase)를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 생산되는 만난아제(mannanase)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 만난아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환한 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 균주를 배양하여 만난아제를 생산하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 만난아제를 유효성분으로 포함하는 만난 당화를 위한 사료첨가제를 제공한다.
아울러, 본 발명은 상기 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 만난 당화도가 증가된 식물성 사료를 제공한다.
본 발명은 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 신규한 만난아제(mannanase)의 유전자 서열과 아미노산 서열을 제공하고, 분리된 만난아제의 기질에 대한 특성 자료를 제공함으로써 곡물과 식물에 포함된 헤미셀룰로오스를 이용하여 바이오매스 및 사료용 원료로 이용하는데에 있어서 상기 만난아제를 산업적으로 유용하게 활용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 만난아제(mannanase)를 생산하는 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주의 16S rDNA 동정결과를 나타낸 도이다.
도 2은 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주로부터 만난아제 유전자서열을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은 본 발명의 만난아제의 아미노산 서열을 분석하여 분자영역에 있어서의 상동성과 분류를 조사한 결과를 나타낸 도이다 :
Csp : 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 만난아제;
Msp : 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) β-1,4-만노시다제(mannosidase) (GenBank accession number:GG657738);
Ssp : 스트렙토마이시스 속 s6-204(Streptomyces sp. s6-204) β-1,4-만난아제 (ABY90130);
Sco : S, 코엘리컬러 A3(S. coelicolor A3) β-1,4-만노시다제(CAA20610); 및
Sli : S. 리비단스 TK24 (S. lividans TK24) β-1,4-만난아제(EFD65759).
도 4는 본 발명의 만난아제를 정제한 후, 12,0% SDS-PAGE으로 전기영동하여 분자량을 분석한 결과와 자이모그래피(zymography) 분석 결과를 나타낸 도이다;
래인(lane) S : 기준 마커 단백질 ;
래인 1 ; IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside) 유도 후 수용성 세포 용해물 ;
래인 2 ; 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography) 후 농축된 단백질 ;
래인 3 ; 젤 퍼미에이션 크로마토그래피(gel permeation chromatography)후 농축된 단백질 ;
래인 4 ; 음이온 교환 크로마토그래피(anion exchange chromatography) 후 농축된 단백질 ; 및
래인 5 ; 친화성 크로마토그래피로부터 수득된 단백질의 활성 염색 (콩고 레드 염색).
도 5는 본 발명의 정제된 만난아제의 최적 반응 온도와 pH 그리고 각각의 안정성에 대한 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 본 발명의 정제된 만난아제의 불용성 폴리머에 대한 결합을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 수탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 생산되는 만난아제(mannanase)를 제공한다.
상기 만난아제는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 가지는 것을 특징으로 하나 이에 한정하지 않는다.
상기 만난아제는 43.0 ~ 45.0 kDa의 분자량인 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 만난아제는 pH 5.0 ~ 7.0 에서 최대 활성을 나타내고, pH 6.0에서 최대활성을 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 만난아제는 45 ~ 55℃ 온도하에서 최대 활성을 나타내고, 50℃에서 최대활성을 나타내는 것이 바람직하나 이에 한정하지 않는다.
상기 만난아제는 Ca, Ni, Cu, Zn, Mg, Mn, Sn, Ba, Co 및 Fe 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 금속이온에 대해 효소활성이 안정적인 것을 특징으로 하나 이에 한정하지 않는다.
상기 만난아제는 Ca, Mn 및 Ba 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 금속이온 첨가 시 효소활성이 증가하나, 이에 한정하지 않는다.
상기 만난아제는 기질로서 로커스트콩검 및 상아야자열매 만난에 대해 높은 활성을 보이나, 상기 기질에 한정하지 않는다.
상기 만난아제는 엔도-β-1,4-만난아제 활성을 나타내나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 지렁이 장내 세균중, 만난아제(mannanase) 활성을 나타내는 균주를 아조 만난(Azo-mannan)을 함유한 LB 한천배지상에서 균총을 확보하였고, 셀룰로시마이크로비움 펀케이(Cellulosimicrobium funkei) ATCC BAA-886균주와 99.8% 이상의 높은 상동성을 나타내어 본 균주를 셀룰로시마이크로비움 속으로 동정하였으며 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13으로 명명하였다(도 1 참조). 상기 균주는 2008년 3월 12일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁되었다(기탁번호: KCTC 11302BP).
셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주로부터 크로모솜(chromosome) DNA를 추출하여 GH5 endo-베타-1,4-만난아제(endo-β-1,4-mannanase)의 공통된 유전자 서열에 대한 PCR반응을 수행하였다. 상기의 PCR 산물은 pGEM-T 벡터(Promega)를 클로닝하여 전체 만난아제 유전자 서열을 얻었다. 만난아제 유전자와 다른 유사 효소들의 서열을 멀티플 시퀀스 얼라인먼트(multiple sequence alignment)한 결과, 만난아제가 세포외 GH5 endo-β-1,4-만난아제와 매우 유사한 것으로 확인됨으로써 endo-β-1,4-만난아제의 분자 구조를 가지는 효소임을 확인하였다(도 2 참조). 또한, 만난아제의 카탈리틱(catalytic) GH5 도메인과 세포외 GH5 만난-분해 효소와의 서열 상동성 수준은 비교적 낮게 나타났고, 가장 높은 서열 상동성은 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) β-1,4-만노시다제(mannosidase)(GenBank accession number:GG657738)에 대하여 65%로 나타남으로써, 본 발명의 만난아제는 신규한 효소임을 확인하였다(도 3 참조).
유전자 서열이 확인된 만난아제 유전자를 발현하여 효소를 분리 정제하고,
정제된 효소의 분자량을 검토하기 위하여 SDS-PAGE를 실시한 결과, 만난아제 단백질은 약 44 kDa의 분자량을 갖는 효소임을 확인하였다.
또한, 만난아제의 특성을 확인하기 위하여, 만난아제의 최적 반응온도를 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65 및 70℃에서 확인하고, 최적 반응 pH 역시 4.0 ~ 10.0 범위에서 확인하였다. 그 결과, pH 6.0에서 50℃의 온도하에 로커스트콩검(locust bean gum)과 반응할 때 기질에 대한 만난아제의 분해활성이 최대값을 나타냈다(도 5의 a 및 b 참조). 또한, 만난아제의 열불안전성의 지표로서, 최적 온도(50℃)에서 효소의 반감기가 약 15분으로 나타났고, 55℃에 노출된 경우 만난아제의 열 불활성이 급격히 증가하였다(도 5의 c 참조).
만난아제의 활성에 대한 금속이온 및 화학 물질의 영향을 확인하기 위해, 금속이온(1 mM)과 화학 물질(5 mM)을 50℃ 하에서 10분 동안 50 mM 소디움 포스패이트 버퍼 (pH 6.0) 조건에서 처리하고 만난아제의 활성을 확인하였다. 그 결과, 만난아제의 촉매 활성은 Ca2 +의 존재하에서 약 1.4배 이상 증가하였고, Mn2 + 및 Ba2 +와 같은 이가양이온 존재 시 만난아제의 활성은 약 1.2배 증가하였다(표 1 참조).
따라서, 셀룰로시마이크로움 속 HY-13 균주로부터 생산되는 신규한 효소는 만난아제로서 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 만난아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 암호화하는 것을 특징으로 하는 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
또한, 본 발명은 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 벡터를 숙주세포에 형질전환한 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서는 지렁이 공생 박테리움인 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주로부터 신규한 만난아제를 동정하였으며, 상기 만난아제의 구조적 및 생화학적 특성, 및 특이적 활성을 갖는 최적의 조건과 함께, 상아야자열매 만난 및 로커스트콩검(locust bean gum)에 대한 높은 특이적 활성이 나타내는 GH5 β-1,4-만난아제임을 규명하였으므로, 상기 만난아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 벡터, 및 상기 벡터의 형질전환체로서 유용하게 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 만난을 포함하는 배지에서 수탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주를 배양한 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및
4) 상기 단계 3)의 조효소액으로부터 만난아제를 정제하는 단계를 포함하는 만난아제 생산방법을 제공한다.
상기 단계 2)의 침전제는 황산암모늄, 아세톤, 아이소프로판올, 메탄올, 에탄올 및 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 자일라나제 생산방법이나 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 배양액으로부터 세포를 분리하기 위하여 원심분리하였다. 분리된 세포는 단백질 분리 용액(Novagen)을 처리하여 원심분리하여 조효소액을 획득하였다. 원심분리를 통해 수득된 조효소액은 HisTrap HP 친화성 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)에 처리하여 효소를 용출하였으며, 용출된 분획물을 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(desalting column)에 처리하여 염을 제거하였다. 염이 제거된 분획물을 사전에 20 mM 트리스-HCl 버퍼(Tris-HCl buffer) (pH 7.6)으로 평형화된 Hiload 26/60 Superdex 200 에 로딩(loading)하였다. 더 정제를 하기 위해 수득된 활성 분획물을 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) Hiprep 16/10 DEAE FF 음이온 교환 크로마토그래피(anion-exchange column chromatography)에 로딩(loading)하였고, 결과적으로, 1.0 M NaCl의 농도와 2.0 ㎖/min의 조건에서 정제된 만난아제를 수득하였다.
상기 생산방법에 의해 생산되는 만난아제는 만난 기질에 대한 높은 기질 특이성을 갖는 GH-5 β-1,4-만난아제이므로, 상기 방법은 셀룰로시마이크로움 속 HY-13균주로부터 신규한 만난아제의 생산을 위해 유용하게 이용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 만난아제를 유효성분으로 포함하는 만난 당화를 위한 사료첨가제를 제공한다.
상기 사료첨가제는 단위동물(non-ruminant)의 사료에 첨가되나, 이에 한정하지 않는다.
아울러, 상기 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 만난 당화도가 증가된 식물성 사료를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서는, 다양한 기질에 대한 만난아제의 활성을 비교하기 위하여 로커스트콩검(locust bean gum), 상아야자열매 만난(ivory nut mannan) 및 구아검(guar gum)의 기질을 이용하여 상기 정제된 만난아제 효소의 활성을 비교하였다. 그 결과, 본 발명의 만난아제는 상아야자 열매 만난에 대해 14,711 IU/mg의 고활성을 나타내는 효소이며, 로커스트콩검 및 구아검에 대해서 각각 8,498 IU/mg 및 967 IU/mg의 분해활성을 나타냈다. 카복시메틸셀룰로스, 버치우드 자일란(Birchwood xylan), 가용성녹말(soluble starch), 및 펙틴(pectin)과 같은 탄수화물은 만난아제에 의해 분해되지 않았으므로, 만난아제는 글리코시드 가수분해효소 활성이 결여된 엄격한 GH5 β-1,4-만난아제임을 알 수 있었다. 이에, 본 발명의 만난아제는 특이성을 갖고 효율적으로 만난을 분해하는 것을 확인할 수 있었으며, 동물에 가장 많이 사용하는 식물성 곡물 사료에 만난 함유가 높은 것을 고려할 경우 동물성 사료에 효율적이라고 사료된다. 따라서, 이와 같은 결과를 살펴볼 때 본 발명의 만난아제는 식물성 사료의 만난 분해 증진을 목적으로 하는 사료 첨가제로 적합하므로, 본 발명의 만난아제는 만난 당화를 위한 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 식물 세포벽을 분해할 수 있는 효소가 없어서 세포벽 내에 들어있는 곡물의 전분이나 단백질 이용 효율이 매우 떨어지는, 돼지나 닭 같은 단위동물(non-ruminant)의 사료에 첨가되어 세포벽의 주요 성분인 만난을 당화함으로써 사료의 가치를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 사료첨가제의 유효성분인 만난아제가 첨가될 사료에 대해 0.01 내지 10 중량부로 구성되는 것이 바람직하며, 만난아제가 0.05 내지 5 중량부로 구성되는 것이 더욱 바람직하며, 만난아제가 0.12 중량부로 구성되는 것이 가장 바람직하다.
또한 상기 사료첨가제는 추가적으로 단위동물에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 단위동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
지렁이 공생 박테리움인 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주로부터 신규한 만난아제를 동정하였으며, 상기 만난아제의 구조적 및 생화학적 특성, 및 특이적 활성을 갖는 최적의 조건과 함께, 상아야자열매 만난 및 로커스트콩검(locust bean gum)에 대한 높은 특이적 활성이 나타내는 GH5 β-1,4-만난아제임을 규명하였으므로, 상기 만난아제를 유효성분으로 포함하는 만난 당화를 위한 사료첨가제를 제공할 수 있으며, 단위동물(non-ruminant)의 사료에 첨가되거나, 상기 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 만난 당화도가 증가된 식물성 사료에 사용할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 자세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 셀룰로시마이크로비움 속 HY -13( Cellulosimicrobium sp . HY -13)의 균주의 동정
지렁이 장내 세균에 만난아제(mannanase) 활성을 나타내는 균주를 아조 만난(Azo-mannan)을 함유한 LB 한천배지상에서 균총을 확보하였다. 분리한 가장 높은 활성을 지닌 만난아제를 생산하는 균주의 특성을 분석하였다. 분리된 균주의 동정을 위하여 16S rDNA 염기서열을 결정한 결과 셀룰로시마이크로비움 펀케이 (Cellulosimicrobium funkei)ATCC BAA-886균주와 99.8% 이상의 높은 상동성을 나타내어 본 균주를 셀룰로시마이크로비움 속으로 동정하였으며 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 으로 명명하였다(도 1). 상기단계에서 분리된 만난아제 활성이 높은 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주는 장기간 보존할 수 있게 냉동보관 후 상기 균주는 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁되었다(KCTC 11302BP).
< 실시예 2> 셀룰로시마이크로비움 속 HY -13 균주로부터 만난아제 유전자의 확보
<2-1> 만난아제 유전자의 분리
셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주로부터 크로모솜(chromosome) DNA를 추출하여 GH5 endo-베타-1,4-만난아제(endo-β-1,4-mannanase)의 공통된 유전자 서열(VDAPNW(서열번호 3) 및 GWSWSGN(서열번호 4))을 근거로 하여 PCR용 DNA프라이머인 정방향 프라이머: 5'-GTCGACGCSCCGAACTGG-3'(서열번호 5)및 역방향 프라이머: 5'-GTTGCCCGACCACGACCAGC-3'(서열번호 6)을 디자인하였다. 상기 프라이머를 이용하여 2.5unit 중합효소(FastStart Tag DNA polymerase), 2.5 mM의 각각의 dNTP, 20 pmol 프라이머, 50 ng의 DNA와 완충용액을 첨가하여 50 ㎕의 PCR 혼합물을 조성하였다. PCR 반응은 95℃에서 5분간 변성(denaturation)한 후 95℃에서 30초 변성, 59℃에서 30초 어닐링(annealing), 72℃에서 3분동안 연장(extension)을 35회 반복한 후 마지막으로 72℃에서 30초간 연장으로 마무리하였다. 상기의 PCR 산물은 pGEM-T 벡터(Promega)에 클로닝하여 전체 만난아제 유전자 서열을 얻었다(도 2).
<2-2> 만난아제 유전자의 특성 확인
상기 만난아제 유전자와 다른 유사 효소들의 서열을 멀티 시퀀스 얼라인먼트(multiple sequence alignment)한 결과, 만난아제가 세포외 GH5 endo-β-1,4-만난아제와 매우 유사한 것으로 확인됨으로서 endo-β-1,4-만난아제의 분자 구조를 가지는 효소임을 확인하였다(도 2). 또한 GH5 카탈리틱 도메인 이외에 두 개의 유사한 CBM을 C-말단에 갖는 멀티 도메인(multi-domain)단백질로 확인되었다.
또한, 만난아제의 카탈리틱(catalytic) GH5 도메인과 세포외 GH5 만난-분해 효소와의 서열 상동성 수준은 비교적 낮게 나타났고, 가장 높은 서열 상동성은 마이크로모노스포라 속(Micromonospora sp.) β-1,4-만노시다제(mannosidase) (GenBank accession number:GG657738)에 대하여 65%로 나타났다. 또한, 만난아제는 스트렙토마이시스 속 s6-204(Streptomyces sp. s6-204) β-1,4-mannanase (ABY90130)와 62% 유사하고 S, 코엘리컬러 A3(S. coelicolor A3) β-1,4-mannosidase(CAA20610)와 62% 유사하였으며, S. 리비단스 TK24(S. lividans TK24) β-1,4-mannanase(EFD65759)와 61% 유사하였다. 따라서 본 발명의 만난아제는 신규한 효소임을 확인하였다(도 3).
< 실시예 3> 만난아제의 발현, 정제 및 분석
<3-1> 만난아제의 발현 및 정제
유전자 서열이 확인된 만난아제 유전자를 발현하여 효소를 분리 정제하기 위하여 NdeI/HindIII 의 제한효소를 이용하여 발현벡터인 pET-28a(+) 벡터를 절단하여 준비하였고, 상기 <실시예 2>의 pGEM-T 벡터에 재조합된 만난아제 유전자는 N-말단과 C-말단에 각각 NdeI/HindIII 제한효소 사이트를 포함하는 DNA 프라이머를 제작하여 PCR 중합반응으로 DNA 단편을 획득하였다. pGEM-T(+) 발현벡터와 중합된 만난아제 유전자를 재조합하고, E. coli BL21 균주에 형질전환하여 콜로니를 획득하였다. 형질전환된 균주는 500 ㎖의 Luria-Bertani 배지를 포함하는 2 ℓbaffled-플라스크에서 30℃ 온도와 180 rpm의 회전수에서 7시간 동안 배양하였다. 만난아제(mannanase)의 과발현을 유도하기 위하여 배지에는 1 mM의 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactoside)를 첨가하였다. 배양물의 흡광도 (A600)가 0.4 ~ 0.5에 이르면, 배양액을 7000 rpm에서 20분간 원심분리하여 배양상등액을 버리고 침전물(세포)을 -20℃에서 1시간 동안 보관하였다. 분리된 세포는 버그버스터(BugBuster) 단백질 분리 용액(Novagen)을 처리하여 12000 rpm에서 20분간 원심분리하여 조효소액을 획득하였다. 수득된 조효소액은 HisTrap HP 친화성 컬럼 크로마토그래피(affinity column chromatography)에 처리하여 제조사의 제품사용 방법에 따라 수행하였으며 재조합된 효소를 용출하였다. 활성이 있는 분획물을 얻은 후 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) 조건에서 HiPrep 26/10 탈염 컬럼(desalting column)에 처리하여 염을 제거하였다. 염이 제거된 분획물은 사전에 20 mM Tris-HCl buffer (pH 7.6) 으로 평형화된 Hiload 26/60 Superdex 200에 로딩(loading)하였다. 더 정제를 하기 위해서 수득된 활성 분획물을 컬럼 크로마토그래피(column chromatography) Hiprep 16/10 DEAE FF 음이온 교환 크로마토그래피(anion-exchange column chromatography)에 로딩(loading)하였고 결과적으로, 1.0 M NaCl의 농도와 2.0 ㎖/min의 조건에서 정제된 만난아제를 수득하였다.
<3-2> 만난아제 효소의 분석
12.0% 젤(gel) 조건에서 SDS-PAGE(sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하였고 쿠마지 브릴리언트 블루(Coomassie brilliant blue) R-250 염색으로 단백질을 확인하였다. 친화성 크로마토그래피(chromatography)를 통해 정제된 재조합 단백질의 자이모그래피(Zymography) 분석을 0.5% 로커스트콩검(locust bean gum)을 포함한 12.0% 폴리아크릴아마이드 젤(polyacrylamide gel) 조건에서 수행하였다. SDS-PAGE 후에 50℃ 하에 15분 동안 생분해 반응을 수행하였으며, 반응 후 β-1,4-만난아제의 활성은 콩고 레드(Congo red)염색으로 확인하였다.
그 결과, 만난아제는 약 44 kDa의 분자량을 갖는 효소임을 확인하였다. 이미 보고된 바 있는 미생물의 β-1,4-만난아제와 비교하였을 때 재조합된 만난아제의 분자량은 아스퍼질러스 액쿨레투스(Aspergillus aculeatus)의 엔도 β-1,4-만난아제와 가장 유사하였다. 하지만 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13)균주의 ManK(35.0 kDa) 및 S. 리비단스(S. lividans) 66의 β-만난아제(36.0 kDa) 보다는 큰것으로 나타난다(도 4). 또한 재조합된 유전자의 분자량은 상대적으로 큰 분자량을 갖는다고 알려진 다기능이 없는 GH-5 β-만난아제 (>60.0 kDa)보다는 작았다(도 4).
< 실시예 4> 만난아제의 특성 확인
<4-1> 만난아제의 최적 온도, pH 및 화학적 특성
만난아제의 최적 반응온도는 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65 및 70℃에서 각각의 온도에서의 활성을 측정함으로써 확인하였고, 온도 안정성은 각각의 온도에서 15, 30, 및 60분간 열처리한 후 잔존활성을 측정하여 비교하였다. 최적 반응 pH는 4.0 ~ 10.0 범위에서 구연산염 완충용액(pH 4.0 ~ 5.5), 인산염 완충용액(pH 5.5 ~ 7.5), Tris-HCl 완충용액(pH 7.5 ~ 9.0), 및 glycine-NaOH 완충용액(pH 9.0 ~ 10.0)을 각각 50 mM의 농도로 50℃에서 15분간 처리하여 효소 반응을 측정함으로써 확인하였다.
그 결과, pH 6.0에서 50℃의 온도하에 로커스트콩검(locust bean gum)과 반응할 때 기질에 대한 만난아제의 분해활성이 최대값을 나타냈다(도 5의 a 및 b). 또한, 만난아제의 열불안전성의 지표로서, 최적 온도(50℃)에서 효소의 반감기가 약 15분으로 나타났고, 55℃에 노출된 경우 만난아제의 열 불활성이 급격히 증가하였다(도 5의 c).
<4-2> 만난아제의 활성에 대한 금속이온 및 화학 물질의 영향
만난아제의 활성에 대한 금속이온 및 화학 물질의 영향을 확인 하기 위해, 각각의 금속이온(1 mM)과 화학 물질(5 mM)을 50 mM 소디움 포스패이트 버퍼 (pH 6.0)안에서 50℃ 에서 10분 동안 처리하고 만난아제의 분해 효소 활성을 확인하였다.
그 결과, 만난아제의 촉매 활성은 Ca2 +의 존재하에서 약 1.4배 이상 증가하였고, Mn2 + 및 Ba2 +와 같은 이가양이온 존재 시 만난아제의 활성은 약 1.2배 증가하였으며, Mg2+ 또는 Sn2 +는 효소 활성에 영향을 주지 않았다. 반면에, Hg2 + 및 N-브로모숙시니마이드(N-bromosuccinimide)와 같은 강력한 Trp 조절물질은 만난아제를 불활성화시켰고, Cu2 +, Zn2 + 및 Fe2 +와 같은 금속 이온은 만난아제 활성을 50% 이상 현저히 억제하였다(표 1).
화합물
( Compound ) 		상대적 활성
( Relative activity )(%)
None 100.0
HgCl2 0
CaCl2 146.9
NiSO4 67.1
CuCl2 16.7
ZnSO4 47.4
MgSO4 99.9
MnCl2 125.2
SnCl2 103.7
BaCl2 118.5
CoCl2 111.9
FeSO4 42.2
람다-브로모쑥시니마이드
(N-Bromosuccinimide)		 0
오도아세트마이드
(odoacetamide)		 113.3
소디움 아자이드
(Sodium azide)		 145.7
람다-에칠말레이마이드
(N-Ethylmaleimide)		 121.4
이디티에이(EDTA) 19.0
트윈 80(Tween 80) (0.5%) 103.5
트리톤 X-100
(Triton X-100) (0.5%)		 98.9
< 실시예 5> 만난아제의 기질 특이성 확인
다양한 기질에 대한 만난아제의 활성을 비교하기 위하여, 로커스트콩검(locust bean gum), 상아야자열매 만난(ivory nut mannan) 및 구아검(guar gum)의 기질을 이용하여 상기 정제된 만난아제 효소의 활성을 비교하였다.
β-1,4-만난아제 활성은 3.5-디나이트로살리실릭산(3,5-dinitrosalicylic acid. DNS)을 이용하여 로커스트콩검에서 분리되는 감소하는 당의 양을 측정함으로써 분석하였다. D-만노스(mannose)는 표준물질로 쓰였다. 0.5% 로커스트콩검으로 구성된 기준 분석 혼합물 0.5 ㎖과 효소 수용액 0.05 ㎖의 생분해 반응을 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 6.0) 50 mM 안에서 50℃ 15분 동안 수행하였다. 만난 기질에 대한 1 IU의 재조합된 만난아제 활성은 표준 분석 조건하에서 1분당 1 μmol의 환원당이 분비되기 위해 필요한 단백질의 양인 것으로 정의하였다. 크로모제닉 PNP-당 유도체는 재조합된 효소의 다른 분해활성을 측정하기 위해 쓰였다. 크로모제닉 기질에 대한 재조합된 만난아제의 분해 활성은 β-1,4-만난아제 활성의 기준 분석에서 쓰인 반응 조건에서 측정되었다. PNP-당 유도체에 대한 1 IU의 분해 활성은 표준 분석 조건하에서 1분 동안 1 μmol의 PNP를 생산하기 위해서 필요한 단백질의 양인 것으로 정의하였다.
그 결과, 본 발명의 만난아제는 상아야자 열매 만난에 대해 14,711 IU/mg의 고활성을 나타내는 효소이며, 로커스트콩검 및 구아검에 대해서 각각 8,498 IU/mg 및 967 IU/mg의 분해활성을 나타냈다. 이러한 결과를 통하여 상아야자 열매 만난에 대한 만난아제의 특이적 활성은 로커스트콩검 및 구아검에 대한 효소 활성에 비하여 각각 1.7배 및 15.2배 높은 것을 알 수 있었다(표 2 및 표 3). 아울러, 카복시메틸셀룰로스(Carboxymethylcellulose), 버치우드 자일란(Birchwood xylan), 가용성 녹말(soluble starch), 및 펙틴(pectin)과 같은 탄수화물은 만난아제에 의해 분해되지 않았으므로, 만난아제는 글리코시드 가수분해효소 활성이 결여된 엄격한 GH5 β-1,4-만난아제임을 알 수 있었다.(표 3)


균주

효소
M.W.
(kDa)
Opt.
pH
Opt. temp.
(oC)
특이적활성
(Specific activity)
(IU/mg)
셀룰로시마이크로비움 속 HY-13
(Cellulosimicrobium sp. HY-13)		 rManHa 44.0 6.0 50 14,711c
셀룰로시마이크로비움 속 HY-13
(Cellulosimicrobium sp. HY-13)		 rManHa 44.0 6.0 50 8,498d
스트렙토마이시스 속 S27 (Streptomyces sp. S27) Man5S27a 43.0 7.0 65 2,107d
바실러스 써큘란스 CGMCC1554 (Bacillus circulans CGMCC1554) Man5Aa 32.0 7.6 60 4,839d
바실러스 서브틸리스 WY34 (Bacillus subtilis WY34) Mannanaseb 39.6 6.0 65 8,302d
a : E. coli에서 만들어진 재조합형의 GH5 β-1,4-만난아제(Recombinant GH5 β-1,4-mannanase produced in E. coli).
b : 야생형 β-1,4-만난아제(Wild type β-1,4-mannanase).
c : 불용성 상아야자 열매 만난에 대한 특이적 활성(Specific activity toward insoluble ivory nut mannan).
d : 로커스트콩검에 대한 특이적 활성(Specific activity toward locust bean gum).
기질 특이적 활성( IU mg -1 ) a
로커스트콩검
(Locust bean gum)		 8,498±105
구아 검(Guar gum) 967±18
불용성 상아야자열매 만난
(Insoluble ivory nut mannan)		 14,711±183
펙틴(Pectin) ND b
버치우드 자일란
(Birchwood xylan)		 ND
용해성 녹말(Soluble starch) ND
카르복시메칠셀룰로스
(Carboxymethylcellulose)		 ND
PNP-셀로비오시드
(PNP-cellobioside)		 ND
PNP-글루코파이라노시드
(PNP-glucopyranoside)		 ND
PNP-자일로파이라노시드
(PNP-xylopyranoside)		 ND
PNP-만노파이라노시드
(PNP-mannopyranoside)		 ND
< 실시예 6> 분해 산물의 분석
만노올리고머(M2 내지 M5 각 1 mg/100 ㎕)와 로커스트콩검(1.4 mg/100 ㎕)을 재조합 만난아제 1 ㎍이 포함된 50 mM 소디움 포스패이트 버퍼 (pH 6.0)와 30℃ 하에서 12시간 동안 반응시켜 분해 산물을 확인하였다. HPLC(High performance liquid chromatography, HPLC) 분석은 Asahipak NH2P-50 2D 컬럼(column) (5 μm, 2.0 × 150 mm, Shodex)이 장착되어 있고, Xcalibur software (version 1.3 SP2, Thermo Electron Co.)로 운영되는 Finnigan Surveyor™ Modular HPLC systems (Thermo Electron Co.)을 이용하여 수행하였다. 용출용액 A(0.05% 포말산/멸균수)와 용출용액 B(0.05% 포말산이 첨가된 아세토니트릴 및 메탄올 (7:3) 이동상을 이용하였다. Finnigan LCQ Advantage MAX ion trap mass spectrometer (Thermo Electron Co.)을 이용하여 LC-MS/MS(liquid chromatography/tandem mass spectrometry, LC-MS/MS)를 수행하였다.
HPLC 분석을 통하여 만난아제의 만난 가수분해 산물을 확인한 결과, 로커스트콩검에 대하여 만난 폴리사카라이드는 M6 이상(39.4%)의 만노올리고머(mannooligomer)와 더불어 일차적으로 M5(44.2%)로 분해되었고, 소량의 M1(1.1%), M2(6.4%), M3(1.5%) 및 M4(7.4%)로 효율적으로 분해됨을 확인하였다. 한편, 상아야자열매 만난은 주로 M4(25.2%)로 분해되었다. 또한, M3 내지 M5는 만난아제에 의해 대부분 M2로 분해되었고, 기질로서 M2는 만난아제에 분해되지 않는 것을 확인하였다(표 4). 이러한 결과를 통하여 만난아제는 2 보다 큰 중합으로 주로 만노스 물질의 주요 백본 내 β-1,4-만노스 결합을 분해할 수 있는 유일한 endo-β-1,4-만난아제인 것을 확인하였다.

기질		 가수분해 반응에 의해 생성된 구성물
Composition (%) of products formed by hydrolysis reaction
M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8
M2 100.0
M3 3.5 60.1 31.6 4.0 0.8
M4 3.9 55.5 28.8 9.9 1.9
M5 4.1 46.9 21.8 16.6 7.9 2.8 0.9
로커스트콩검
(Locust bean gum)		 1.1 6.4 1.5 7.4 44.2 16.1 21.4 1.9
상아야자열매만난
(Ivory nut mannan)		 3.3 17.5 13.9 25.2 19.7 12.9 7.5 2.9
a LC 면적(LC area%)
< 실시예 7> 만난아제의 소수성 폴리머에 대한 결합 활성 확인
본 발명의 만난아제는 C 말단에 2개의 패밀리 10 CBMs을 포함하고 있고, 이는 효소-기질 상호작용에 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있으므로, 만난아제는 다양한 탄수화물 폴리머에 부착될 것으로 예상되는바, 폴리사카라이드(polysaccharide), 폴리(3HB)그래뉼(poly(3HB)granules), 및 리그닌(lignin)을 포함하는 미세구조를 갖는 다양한 소수성 물질을 사용하여, 만난아제의 효소-기질 결합 활성을 분석하였다.
결합 활성 분석을 하기 전에 불용성 기질은 50 mM 소디움 포스페이트 버퍼 (pH 6.0)로 5 회 세척하고 소수성의 물질에 대한 효소의 결합 수용능을 확인하였다. 5.0 IU/㎖로 희석된 효소를 준비하고 같은 부피의 기질 폴리머와 함께 두시간 동안 얼음에 치상하였고 5분 마다 섞어주었다. 12,000×g 조건에서 혼합물을 원심분리하고 상층액을 수득하고 즉시 β-1,4-만난아제의 활성을 측정하였다.
그 결과, 만난아제는 아비셀(Avicel), 키토산(chitosan), 키틴(chitin), 및 불용성 상아야자열매 만난에는 강하게 결합되었으나, 불용성 오트 스펠트 자일란(oat spelt xylan), 리그닌(lignin), 커들란(curdlan), 및 폴리 (3HB) 그래뉼 (poly(3HB)granules)에는 결합하지 않았다(도 6). 이를 통하여, 만난아제는 다양한 불용성 폴리머에 결합 친화성을 나타내는 신규한 모듈러 β-1,4-만난아제임을 확인하였다.
한국생명공학연구원 KCTC11302BP 20080312
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel mannanase produced from Cellulosimicrobium sp. HY-13 strain <130> 11p-05-37 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 423 <212> PRT <213> Cellulosimicrobium sp. HY-13 <400> 1 Met Arg Arg Leu Phe Ala Ile Val Leu Gly Ala Val Leu Ala Leu Leu 1 5 10 15 Ala Val Pro Ala Leu Ala Gln Gly Ala Ser Val Ala Ser Asp Gly Phe 20 25 30 Ser Val Gln Asp Gly Arg Ile Tyr Asp Ala Asn Gly Asn Arg Phe Val 35 40 45 Pro Val Gly Val Asn His Ala His Ala Trp Tyr Pro Ser Gln Thr Gln 50 55 60 Ser Phe Ala Asp Ile Arg Ala Ala Gly Ala Asn Thr Val Arg Val Val 65 70 75 80 Leu Ser Gly Gly Arg Tyr Gly Thr Ser Ser Ala Ala Asp Val Ser Ala 85 90 95 Val Val Glu Arg Cys Lys Gln Asn Gln Leu Val Cys Ile Leu Glu Asn 100 105 110 His Asp Thr Thr Gly Tyr Gly Glu Asp Gly Ser Ala Arg Ser Leu Ala 115 120 125 Ser Ala Ala Gln Tyr Trp Thr Ser Ile Ala Ser Val Leu Arg Gly Gln 130 135 140 Glu Arg Tyr Val Met Ile Asn Ile Gly Asn Glu Pro Phe Gly Asn Ser 145 150 155 160 Gly Phe Gln Ser Trp Thr Thr Asp Thr Ile Ala Ala Ile Arg Thr Leu 165 170 175 Arg Ala Ala Gly Leu Asp His Thr Leu Val Val Asp Ala Pro Asn Trp 180 185 190 Gly Gln Asp Trp Ser Phe Thr Met Arg Asp Asn Ala Pro Thr Val Ala 195 200 205 Ala Ala Asp Gly Asn Val Val Phe Ser Val His Met Tyr Gly Val Phe 210 215 220 Asp Thr Gly Ala Glu Val Arg Ala Tyr Leu Asp Ser Phe Thr Ser Arg 225 230 235 240 Gly Leu Pro Ile Met Val Gly Glu Phe Gly Asp Asn His Ser Asp Gly 245 250 255 Asn Pro Asp Glu Ala Thr Ile Met Ser Tyr Thr Arg Ser Gln Gly Ile 260 265 270 Gly Met Leu Gly Trp Ser Trp Ser Gly Asn Gly Gly Gly Val Glu Tyr 275 280 285 Leu Asp Met Val Asn Gly Phe Ser Ala Ser Ser Leu Thr Pro Trp Gly 290 295 300 Gln Arg Phe Val His Gly Ala Asp Gly Leu Arg Ala Arg Asn Ala Pro 305 310 315 320 Ala Ala Ser Val Tyr Gly Gly Asp Gly Gly Asp Gly Asp Gly Gly Ala 325 330 335 Gly Thr Ala Pro Asn Gly Tyr Pro Tyr Cys Ala Ser Ala Ser Ser Asp 340 345 350 Pro Asp Gly Asp Gly Trp Gly Trp Glu Ser Ser Ala Ser Cys Val Val 355 360 365 Arg Gly Ser Ser Ala Asp Thr Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly 370 375 380 Ser Thr Ala Pro Asn Gly Tyr Pro Tyr Cys Ala Ser Ala Ser Ser Asp 385 390 395 400 Pro Asp Gly Asp Gly Trp Gly Trp Glu Ser Ser Ala Ser Cys Val Val 405 410 415 Arg Gly Ser Ser Ala Asp Arg 420 <210> 2 <211> 1272 <212> DNA <213> Cellulosimicrobium sp. HY-13 <400> 2 atgagacgac tgttcgccat cgtcctgggc gcggtgctcg ccttgctcgc cgtgccggcg 60 ctcgcgcagg gggcgagcgt cgcgagcgac gggttctccg tccaggacgg gaggatctac 120 gacgcgaacg gcaaccgctt cgtgccggtc ggcgtcaacc acgcgcacgc ctggtacccg 180 tcgcagacgc agtccttcgc cgacatccgc gccgccggcg cgaacaccgt ccgcgtcgtg 240 ctgtcgggcg gccggtacgg gacgagctcg gcggccgacg tgagcgccgt ggtcgagcgc 300 tgcaagcaga accagctcgt gtgcatcctc gagaaccacg acacgacggg ctacggcgag 360 gacggcagcg cccggtcgct cgcgagcgcg gcgcagtact ggaccagcat cgcgtcggtc 420 ctgcgcggcc aggagcggta cgtgatgatc aacatcggca acgagccctt cggcaactcc 480 ggcttccaga gctggacgac ggacacgatc gcggcgatcc ggaccctgcg cgcggcgggc 540 ctcgaccaca cgctcgtcgt ggacgccccg aactggggac aggactggtc gttcaccatg 600 cgcgacaacg ccccgacggt cgcggccgcg gacgggaacg tggtcttctc cgtccacatg 660 tacggcgtct tcgacaccgg ggcggaggtg cgcgcgtacc tcgactcctt cacgagccga 720 gggctgccga tcatggtcgg cgagttcggt gacaaccact cggacgggaa cccggacgag 780 gccacgatca tgagctacac gcggtcgcag gggatcggga tgctcggctg gtcgtggtcc 840 ggcaacgggg gcggcgtcga gtacctggac atggtgaacg ggttctccgc gagctcgctc 900 acgccgtggg ggcagcggtt cgtccacggc gccgacgggc tcagggcccg caacgcgccc 960 gcggcctcgg tgtacggggg cgacggcggc gatggagacg gcggagccgg tacggcaccc 1020 aacgggtacc cgtactgcgc gagcgcgtcg tcggacccgg acggggacgg gtggggctgg 1080 gagagcagcg cgtcgtgcgt ggtgcgcggc tcctccgcgg acacgggttc cggcggtggc 1140 tccgggagcg ggagcacggc accgaacggg tacccgtact gcgcgagcgc gtcgtcggac 1200 ccggacgggg acgggtgggg ctgggagagc agcgcctcgt gcgtcgtgcg cggctcgtcc 1260 gccgaccgct ga 1272 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> Cellulosimicrobium sp. HY-13 <400> 3 Val Asp Ala Pro Asn Trp 1 5 <210> 4 <211> 7 <212> PRT <213> Cellulosimicrobium sp. HY-13 <400> 4 Gly Trp Ser Trp Ser Gly Asn 1 5 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> endo-beta-1,4-mannanase forward primer <400> 5 gtcgacgcsc cgaactgg 18 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> endo-beta-1,4-mannanase reverse primer <400> 6 gttgcccgac cacgaccagc 20

Claims (17)

  1. 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 만난아제(mannanase).
  2. 제 1항에 있어서, 상기 만난아제는 수탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 생산되는 것을 특징으로 하는 만난아제.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 만난아제는 43.0 ~ 45.0 kDa의 분자량인 것을 특징으로 하는 만난아제.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 만난아제는 pH 5.0 ~ 7.0 에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 만난아제.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 만난아제는 45 ~ 55℃ 온도하에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 만난아제.
  6. 삭제
  7. 제 1항에 있어서, 상기 만난아제는 Ca, Mn 및 Ba 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 금속이온 첨가 시 효소활성이 증가하는 것을 특징으로 하는 만난아제.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 만난아제는 기질로서 로커스트콩검 및 상아야자열매 만난에 대해 활성을 보이는 것을 특징으로 하는 만난아제.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 만난아제는 엔도-β-1,4-만난아제 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 만난아제.
  10. 제 1항의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 만난아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 만난아제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 것을 특징으로 하는 폴리뉴클레오티드.
  12. 제 10항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터.
  13. 제 12항의 벡터를 숙주세포에 형질전환한 형질전환체.
  14. 1) 만난을 포함하는 배지에서 수탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주를 배양한 후 원심분리하여 상층액을 수득하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;
    3) 상기 단계 2)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및
    4) 상기 단계 3)의 조효소액으로부터 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 만난아제를 정제하는 단계를 포함하는 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 만난아제 생산 방법.
  15. 제 1항의 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열로 구성되는 만난아제를 유효성분으로 포함하는 만난 당화를 위한 사료첨가제.
  16. 제 15항에 있어서, 사료첨가제는 단위동물(non-ruminant)의 사료에 첨가되는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
  17. 제 15항의 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 만난 당화도가 증가된 식물성 사료.
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