KR102044517B1

KR102044517B1 - 하늘소 장내 미생물인 루테이마이크로비움 속 hy-24가 생산하는 신규한 자일라나제 및 리신 도메인의 기능

Info

Publication number: KR102044517B1
Application number: KR1020180007387A
Authority: KR
Inventors: 박호용; 손광희; 김도영; 조한영
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2018-01-19
Filing date: 2018-01-19
Publication date: 2019-11-13
Also published as: KR20190088832A

Abstract

본 발명은 신규한 자일라나제 단백질, 이의 분리된 리신(RICIN) 도메인(ricin-type beta-trefoil lectin domain-like(RICIN) domain), 상기 자일라나제 단백질을 포함하는 사료 및 이를 이용한 헤미셀룰로오스 분해 생성물의 제조방법 또는 사료의 제조방법에 관한 것으로, 특히 리신(RICIN) 도메인을 포함하는 재조합 자일라나제의 경우 비수용성 사료 기질의 활용도 증진에 경쟁력을 제공할 수 있다.

Description

하늘소 장내 미생물인 루테이마이크로비움 속 HY-24가 생산하는 신규한 자일라나제 및 리신 도메인의 기능 {The function of the novel xylanase and lysine domains produced by Luteimicrobium xylanilyticum HY-24, a microorganism in the intestinal tract of Massicus raddei}

셀룰로스 바이오매스 분해미생물과 같이, 세균 혹은 곰팡이 균주는 베타-1,4-D-결합의 자일란, 만난 또는 알파-1,5-L-아라비난과 같은 헤미셀룰로스 기질을 분해할 수 있는 종들이 널리 분포되어 있다(D. Shallom, et. al., Microbiol. 6 (2003) 219-228). 이들은 다양한 엑소 혹은 엔도 타입의 글리코사이드 하이드롤라제(GH)를 분비하여 다당류의 중심체를 이루는 글리코사이드 결합을 완전히 분해하는데 효소간 상호 협력 작용을 나타낸다. 그러한 목질계 헤미셀룰로스 중에서 베타-1,4-D-자일란은 다당류의 주요 구조를 구성하는 성분이며, 다수의 D-자일로스 당이 베타-1,4-자일로스 결합으로 연결되어 있다(M.L.T.M. Polizeli, et. al., Microbiol. Biotechnol. 67 (2005) 577-591).

자일란(Xylan)은 식물의 세포벽을 구성하는 헤미셀룰로오스(hemicellulose)의 주성분으로 셀룰로오스 다음으로 자연계에 풍부하며 재생 가능한 탄수화물이다. 자일란은 자일로피라노제(xylopyranose)의 β-1,4 결합으로 이루어진 고분자 물질로서 일반적으로 아세틸 그룹(acetyl group), L-아라비노퓨라노제(Larabinofuranose) 및 D-글루쿠론산(D-glucuronic acid) 등이 치환된 이질 탄수화물로 존재하고 있다. 그러므로 자일란을 완전하게 분해하여 당화하기 위해서는 엔도-1,4-β-자일라나제(endo-1,4-β-xylanase), β-자일라나제(β-xylanase), α-글루크로니다제(α-glucuronidase), α-L-아라비노퓨라노제(α-L-arabinofuranose) 및 아세틸에스테라제(acetylesterase) 등의 몇가지 효소의 협동적 작용이 필요하다(Bachmann, S. L., et.al., Appl. Environ. Microbiol, 57, 2121-2130, 1991). 이 중 자일라나제(xylanase)는 기질에 대한 분해 양식에 따라 엔도자일라나제, 엑소자일라나제 및 자일로시다제(xylosidase)의 세 가지 종류로 구분될 수 있으며 자일란의 가수분해 과정에서 가장 중요한 역할을 담당한다.

자일라나제(Xylanase)는 제지의 표백공정, 사료효율 개선, 과일음료의 청징, 제빵의 고품질화 또는 농산 부산물 이용 등에서 널리 이용되고 있으며 다양한 미생물에 의해 생산된다. 제지산업에서는 표백공정에 응용하기 위한 내알칼리성 또는 내열성 자일라나제가 여러 세균으로부터 분리되었으며, 셀룰라제의 활성이 없는 자일라나제 생산균도 다수 보고되어 제지용 셀룰라제의 손실을 줄이고자 하는 연구결과가 보고되었다. 또한, 자일라나제를 처리하여 빵의 품질을 개선하거나, β-자일로시다제(β-xylosidase) 및 자일라나제의 유전자가 도입된 효모로서 농임산 부산물을 미생물이 이용할 수 있도록 당화시키는 연구가 보고되었다. 현재 사료산업에서는 자일라나제가 사료첨가용 효소로 시판되어 사용되고 있는데, 상기 효소는 곡물 사료 섭취시 헤미셀룰로오스로 인한 가축의 장내의 점질도를 낮추어주는 기능을 함으로써 가축의 소화기 질병을 예방하고 사료효율을 향상시키는 것으로 알려져있다.

자일라나아제 중에서도 엔도베타자일라나제(endo-beta-1,4-xylanase)는 베타-1,4-D-자일란 다당류의 분해에 있어서 중요 가수분해 효소로 알려져 있다(D. Shallom, et. al., Microbiol. 6 (2003) 219-228). 이들 생촉매는 일차구조의 유사성에 근거하여 현재 여섯 개의 GH 그룹 즉, GH-5, 8, 10, 11, 30, 그리고 GH-43으로 분류한다(www.cazy.org). 특히, 다양한 종류의 미생물 유래 엔도베타자일라나제는 유전적 다양성 기준으로 주로 GH10 혹은 GH11이 산업적 효소로 주목받고 있다 (M.L.T.M. Polizeli., et.al., Microbiol. Biotechnol. 67 (2005) 577-591, V. Juturu, J.C, et.al., Biotechnol. Adv. 30 (2012) 1219-1227). GH11 엔도베타자일라나제가 하나의 베타-젤리 롤 구조로 촉매 도메인이 구성되는 것과 비교하여, GH10 엔도베타자일라나제는 하나의 (베타/알파)8-배럴 형태가 촉매 구조를 구성하고 있다(S. Subramaniyan., et.al., Biotechnol. 22 (2002) 33-64). 덧붙여, GH10 효소는 두 개 이상의 중복 기능의 도메인(탄수화물 결합 도메인, 피브로넥틴 타입3 도메인, 리신 형태의 베타-트리포일 렉틴 도메인 등)과 링커 부분으로 구성되는 것으로 종종 밝혀지고 있다(D.Y. Kim, et.al., Environ. Microbiol. 75 (2009) 7275-7279).

지난 십여 년간, 리그노셀룰로스를 분해하는 여러 종의 공생세균이 지렁이, 목질부 가해 곤충 등의 소화관에서 분리되었고 관련 효소의 유전자 및 기능규명이 이루어져 왔다(J. Zhou, H, et.al., Microbiol. Biotechnol. 85 (2009) 323-333). 더구나, 메타지놈의 서열 분석을 통해서 장내 미생물이 목질부 가해 곤충인 딱정벌레나 흰개미의 바이오매스 분해 효소와 연관이 있음이 밝혀졌다(D.Y. Kim, et.al., Antonie van Leeuwenhoek 109 (2016) 1-12). 이러한 맥락에서 다양한 곤충들로부터 비롯된 자일라나제가 발굴되고 있으나 실제로 국내 여러 분야에 사용되지 못하고 있는 실정이다.

이에 본 발명자는 독특한 생화학적, 분자적 특성을 갖는 신규한 엔도베타자일라나제를 발굴할 목적으로 하늘소(Massicus raddei)의 소화관에 서식하는 자일란 분해 미생물을 조사하였다. 그 결과 상기 하늘소의 장내 공생세균인 루테이마이크로비움 자일라니리티쿰(L. xylanilyticum) HY-24 (KCTC 19882)로부터, GH10에 속하는 효소 엔도베타자일라나제(XylM) 및 RICIN 도메인(ricin-type beta-trefoil lectin domain-like(RICIN) domain)의 유전적 생화학적 특성을 확인하였다. 아울러 재조합효소 rXylM과 동 효소 유전자의 C-말단의 리신 도메인이 제거된 변이효소를 발현 및 정제하여 두 효소간의 특성을 비교함으로써, 리신 도메인의 자일란 분해에 대한 기능 및 효과를 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 자일라나제 단백질을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 자일라나제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 RICIN 도메인을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 RICIN 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 헤미셀룰로오스성 물질, 리그닌, 키토산 및 키틴으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 기질 및 상기 자일라나제 단백질 또는 이를 포함하는 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 사료를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 (a) 상기 자일라나제 단백질, 또는 이를 포함하는 미생물 또는 이의 배양물을 헤미셀룰로오스성 물질과 반응하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 단계의 반응 혼합물로부터 헤미셀룰로오스 분해 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 헤미셀룰로오스 분해 생성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 자일라나제 단백질, 또는 이를 포함하는 미생물 또는 이의 배양물을 헤미셀룰로오스성 물질, 리그닌, 키토산, 및 키틴으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 기질에 처리하는 단계를 포함하는, 사료의 제조방법을 제공하는 것이다.

이하에서는, 본 발명을 더욱 상세히 설명한다.

한편, 본원에서 개시되는 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술되는 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 할 수 없다.

또한, 당해 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 통상의 실험만을 사용하여 본 출원에 기재된 본 발명의 특정 양태에 대한 다수의 등가물을 인지하거나 확인할 수 있다. 또한, 이러한 등가물은 본 발명에 포함되는 것으로 의도된다.

상기 과제를 해결하기 위해 본 발명은 하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 자일라나제 단백질을 제공한다.

본 발명에서 "자일라나제(xylanase)"는 자일란을 가수분해하는 효소의 총칭이다. 구체적으로, 자일라나제는 엔도베타자일라나제(endo-β-xylanase), 엑소자일라나제(exo-β-xylanase) 및 자일로시다제(β-xylosidase) 등을 포함할 수 있다. 본 발명에서 상기 자일라나제는 하늘소(Massicus raddei) 장내 미생물인 루테이마이크로비움 속(Luteimicrobium sp.) HY-24 유래 엔도베타 자일라나제일 수 있며, 보다 구체적으로, 서열번호 1의 아미노산 서열을 포함하는 자일라나제일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 공생 세균 루테이마이크로비움 속(Luteimicrobium sp.) HY-24로부터 신규한 엔도자일라나제(XylM)를 규명하였다. 이 단백질의 N-말단에는 촉매기능의 GH10 도메인이 자리 잡고 있으며, C-말단에는 리신(ricin-type beta-trefoil lectin domain-like) 도메인 서열이 존재한다. 그 GH10 도메인 서열은 균주 마이크로모노스포라 루피니가 생산하는 엔도자일라나제와 72%의 상동성을 보일 뿐이고, 리신 도메인은 균주 액티노스피카 로비니에로부터 보고된 미규명 단백질과 67%의 상동성만 보일뿐, 신규한 서열을 보여주고 있다.

또한, 본 발명에 따른 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어지는 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열과 적어도 80 %, 90 %, 95 %, 97 % 또는 99 %의 상동성 혹은 서열 동일성을 가지는 폴리펩티드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 이러한 상동성을 가지며, 상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 효능을 나타내는 아미노산 서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 가지더라도 본원의 범위 내에 포함됨은 자명하다.

또한, 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 단백질과 상응하는 활성을 가지는 경우라면 서열번호 1의 아미노산 서열 앞뒤의 무의미한 서열 추가 또는 자연적으로 발생할 수 있는 돌연변이, 혹은 이의 잠재성 돌연변이 (silent mutation)를 제외하는 것이 아니며, 이러한 변형을 가지는 단백질 또한 본원의 범위 내에 속한다.

본 발명에서 용어, "상동성"은 두 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 모이티 사이의 동일성의 퍼센트를 말한다. 하나의 모이티로부터 다른 하나의 모이티까지의 서열간 상동성은 알려진 당해 기술에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 서열정보를 정렬하고 용이하게 입수 가능한 컴퓨터 프로그램을 이용하여 두 개의 폴리뉴클레오티드 분자 또는 두 개의 폴리펩티드 분자 간의 서열 정보를 직접 정렬하여 두 개의 모이티 사이의 상동성이 결정될 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드 간 상동성은 상동 영역 간의 안정된 이중가닥을 이루는 조건하에서 폴리뉴클레오티드의 혼성화한 후, 단일-가닥-특이적 뉴클레아제로 분해시켜 분해된 단편의 크기를 결정함으로써 결정할 수 있다.

본 발명에서 자일라나제는 "XylM" 또는 "XylM 단백질"과 혼용될 수 있다. 또한 하기에 설명할 RICIN 도메인이 결여된 변이효소인 자일라나제는 "XylM△RICIN" 또는 "XylM△RICIN 단백질"과 혼용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 RICIN 도메인을 제공한다..

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 RICIN 도메인은 L. xylanilyticum HY24의XylM를 구성하는 C-말단의 ricin-type beta-trefoil lectin domain-like (RICIN) 도메인을 의미한다.

본 발명의 실시예에서는 이러한 RICIN 도메인이 결여된 자일라나제(rXylM△RICIN) 에 비해 RICIN 도메인이 보존된 재조합 효소(rXylM)는 높은 열안정성 및 비수용성 기질에 대한 효소-기질 결합능이 더 뛰어난 것으로 확인하였다.

본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 자일라나제 단백질 또는 RICIN 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 이를 포함하는 발현 벡터 및 상기 발현벡터가 도입된 형질전환체를 제공하는 것이다.

상기 자일라나제에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드 단위체(monomer)가 공유결합에 의해 길게 사슬모양으로 이어진 뉴클레오티드의 중합체(polymer)로 일정한 길이 이상의 DNA 또는 RNA 가닥으로서, 보다 구체적으로는 상기 변이형 폴리펩티드를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 단편을 의미한다.

본 발명에서 자일라나제의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하늘소 장내 미생물인 루테이마이크로비움 속(Luteimicrobium sp.) HY-24 유래, 구체적으로 서열번호 1의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 3의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다. 코돈 축퇴성에 따라 서열번호 1의 아미노산 서열에 기초하여 서열번호 3 외에 다양한 폴리뉴클레오티드 서열이 설계될 수 있음은 당업자에게 자명하다.

본 발명에서 RICIN 도메인의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드는 하늘소 장내 미생물인 루테이마이크로비움 속(Luteimicrobium sp.) HY-24 유래 자일라나제 C 말단의 RICIN 도메인 유래, 구체적으로 서열번호 2의 아미노산 서열을 코딩하는 폴리뉴클레오티드일 수 있으며, 보다 구체적으로 서열번호 4의 폴리뉴클레오티드 서열일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "발현벡터"란, 세포 내에서 삽입물이 발현되도록 삽입물에 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 의미한다. 상기 발현벡터는 표준적인 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조 및 정제될 수 있다. 상기 발현벡터의 종류는 원핵세포 및 진핵세포의 각종 숙주세포에서 원하는 유전자를 발현하고, 원하는 단백질을 생산하는 기능을 하는 한 특별히 한정되지 않지만, 강력한 활성을 나타내는 프로모터와 강한 발현력을 보유하면서 목적 단백질을 대량으로 생산할 수 있는 벡터가 바람직하다. 상기 발현벡터는 적어도, 프로모터, 개시코돈, 원하는 단백질을 코드하는 유전자, 및 종결코돈 터미네이터를 포함하고 있는 것이 바람직하나, 이에 제한되지 않는다. 그 외에 시그널 펩타이드를 코드하는 DNA, 인핸서 서열, 원하는 유전자의 5'측 및 3'측의 비번역 영역, 선택마커 영역, 또는 복제가능단위 등을 적절하게 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본원에서 사용되는 벡터는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 통상 사용되는 벡터의 예로는 천연 상태이거나 재조합된 상태의 플라스미드, 코스미드, 바이러스 및 박테리오파지를 들 수 있다. 예를 들어, 파지 벡터 또는 코스미드 벡터로서 pWE15, M13, MBL3, MBL4, IXII, ASHII, APII, t10, t11, Charon4A, 및 Charon21A 등을 사용할 수 있으며, 플라스미드 벡터로서 pBR계, pUC계, pBluescriptII계, pGEM계, pTZ계, pCL계 및 pET계 등을 사용할 수 있다. 구체적으로는 pDZ, pACYC177, pACYC184, pCL, pECCG117, pUC19, pBR322, pMW118, pCC1BAC 벡터 등을 사용할 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 발현벡터는 자일라나제 단백질 또는 RICIN 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 "형질전환체"란 본 발명의 발현벡터가 숙주 균주에 도입되어 상기 발현벡터에 포함된 목적 단백질을 코딩하는 유전자를 발현시키도록 형질전환된 균주를 의미하며, 상기 "형질전환"이란 유전자조작 기법을 사용하여 외부로부터 도입된 유전자를 포함하는 플라스미드 또는 유전체에 의해 숙주세포(원핵 및 진핵생물, 동물세포 및 식물세포)의 유전형질이 변화되는 현상을 의미한다. 상기 형질전환의 방법은 특별히 제한되지 않으며, 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법에 의해 수행될 수 있다. 예를 들어, 전기천공법 (electroporation), 인산칼슘 (CaPO₄) 침전, 염화칼슘 (CaCl₂) 침전, 미세주입법 (microinjection), 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.

구체적으로, 본 발명의 형질전환체는 자일라나제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현벡터가 도입된 형질전환체일 수 있으나 이에 제한되지 않는다.

본 발명에서 형질전환체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 상기 벡터가 도입되어 형질전환된 대장균 (E. coli), 코리네박테리움 속, 스트렙토미세스, 살모넬라 티피뮤리움 등의 박테리아 세포; 효모 세포; 피치아 파스토리스 등의 균류세포; 드로조필라, 스포도프테라 Sf9 세포 등의 곤충 세포; CHO (중국 햄스터 난소 세포, chinese hamster ovary cells), SP2/0 (마우스 골수종), 인간 림프아구 (human lymphoblastoid), COS, NSO (마우스 골수종), 293T, 보우 멜라노마 세포, HT-1080, BHK (베이비 햄스터 신장세포, baby hamster kidney cells), HEK (인간 배아신장 세포, human embryonic kidney cells), PERC.6 (인간망막세포) 등의 동물 세포; 또는 식물 세포가 될 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 헤미셀룰로오스성 물질, 리그닌, 키토산 및 키틴으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 기질 및 상기 자일라나제 단백질, 또는 이를 포함하는 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 사료를 제공하는 것이다.

상기 자일라나제에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 "헤미셀룰로오스성 물질"은 헤미셀룰로오스 또는 이를 포함하는 물질을 의미한다. 헤미셀룰로오스는 식물 세포벽에서 셀룰로오스의 미섬유 사이의 기질겔을 구성하는 다당류 중 펙틴질 이외의 다당류의 총칭하는 것으로, 펙틴질을 제거한 세포벽(홀로셀룰로오스)에서 알칼리용액으로 추출되어 수득될 수 있다.

구체적으로, 상기 헤미셀룰로오스성 물질은 β-1,4 결합의 D-자일로오스 잔기를 포함하는 다당류일 수 있다.

주요한 헤미셀룰로오스 다당으로서는 자일란 (글루쿠로노자일란, 아라비노자일란 등), β-1,3-글루칸, β-1,4-글루칸, 크실로글루칸, 글루코만난 등이 있다.

상기 자일란은 버치우드 자일란, 비치우드 자일란, 오트스펠트 자일란, 및 아라비노 자일란으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 (1) 상기 자일라나제 단백질, 또는 이를 포함하는 미생물 또는 이의 배양물을 헤미셀룰로오스성 물질과 반응하는 단계, 및 (b) 상기 (a) 단계의 반응 혼합물로부터 헤미셀룰로오스 분해 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 헤미셀룰로오스 분해 생성물의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 자일라나제에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

상기 헤미셀룰로오스성 물질에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 헤미셀룰로오스 분해 생성물은 헤미셀룰로오스성 물질을 자일라나제로 가수분해한 후 생성되는 자일로오스 다당류를 의미하며, 구체적으로 자일로비오스 (xylobiose), 자일로트리오스 (xylotriose), 자일로테트라오스 (xylotetraose) 및 자일로펜토스 (xylopentose)로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 생산된 헤미셀룰로오스 분해 생성물을 회수하는 방법은 배양방법에 따라 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 반응 혼합물 또는 배양액으로부터 목적하는 아미노산을 수집할 수 있다. 예를 들어, 원심분리, 여과, 음이온 교환 크로마토그래피, 결정화 및 HPLC 등이 사용될 수 있으며, 당해 분야에 공지된 적합한 방법을 이용하여 배지 또는 미생물로부터 목적하는 L-라이신을 회수할 수 있다. 또한, 상기 회수 단계는 정제 공정을 포함할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 자일라나제 단백질, 또는 이를 포함하는 미생물 또는 이의 배양물을 헤미셀룰로오스성 물질, 리그닌, 키토산 및 키틴으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 기질에 처리하는 단계를 포함하는, 사료의 제조방법을 제공하는 것이다.

상기 자일라나제에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명에서 "사료"는 동물에게 주는 먹이를 말한다. 상기 사료는 동물의 생명을 유지, 또는 고기, 젖 등을 생산하는데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 말한다. 상기 사료는 사료 자체 혹은 사료 첨가제를 모두 의미하며, 본 출원의 사료 첨가제는 사료 관리법상의 보조사료에 해당할 수 있다.

상기 사료의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 사료를 사용할 수 있다. 상기 사료의 비제한적인 예로는, 곡물류, 근과류, 식품 가공 부산물류, 조류, 섬유질류, 제약 부산물류, 유지류, 전분류, 박류 또는 곡물 부산물류 등과 같은 식물성 사료; 단백질류, 무기물류, 유지류, 광물성류, 단세포 단백질류, 동물성 플랑크톤류 또는 음식물 등과 같은 동물성 사료를 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.

본 출원의 사료용 조성물을 적용할 수 있는 개체는 특별히 한정되지 않고, 어떠한 형태의 것이든 적용 가능하다. 예를 들면, 소, 양, 기린, 낙타, 사슴, 염소 등과 같은 동물에 제한없이 적용가능하다.

본 출원의 일 양태에 따르면, 상기 RICIN 도메인을 포함하는 자일라나제 단백질이 헤미셀룰로오스성 물질을 포함하는 사료에 포함되면 상기 자일라나제 단백질에 의해 헤미셀룰로오스성 물질이 분해되어 동물이 사료를 영양분으로 충분히 사용할 수 있다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 RICIN 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드 또는 이를 포함하는 발현벡터가 도입된, 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 형질전환체를 이용하여 헤미셀룰로오스성 물질을 분해하는 방법을 제공하는 것이다.

상기 RICIN 도메인에 대해서는 앞서 설명한 바와 같다.

본 발명의 신규한 자일라나제 단백질, 이의 분리된 리신(RICIN) 도메인(ricin-type beta-trefoil lectin domain-like(RICIN) domain), 상기 자일라나제 단백질을 포함하는 사료 및 이를 이용한 헤미셀룰로오스 분해 생성물의 제조방법 또는 사료의 제조방법에 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은 루테이마이크로비움 속(Luteimicrobium sp.) HY24 유래 GH10 자일라나제의 유전자 서열(서열번호 3)이다.
도 2는 루테이마이크로비움 속(Luteimicrobium sp.) HY24 유래 RICIN 도메인(ricin-type beta-trefoil lectin domain-like (RICIN) domain)의 유전자 서열(서열번호 4)이다.
도 3은 상기 루테이마이크로비움 속(Luteimicrobium sp.) HY24 유래 GH10 자일라나제 아미노산 1차 서열의 상동성 비교도이다(서열 (GenBank 서열번호): Lxy, L. xylanilyticum HY-24 유래 엔도-β-1,4-자일라나제 (KY997451); Mlu, M. 루피니엔도-β-1,4-자일라나제 (WP_007459199); Agl, A. 글로비스포루스엔도-β-1,4-자일라나제(WP_020516021); Ame, A. 메디터레인엔도-β-1,4-자일라나제 (WP_013225148); Cfl, C. 플라비게나엔도-β-1,4-자일라나제 (WP_013115627)).
여기서 동일하거나 유사한 아미노산은 각각 검은색 및 회색 상자로 나타냈다. 예측된 신호 펩타이드는 검정색 막대로 나타냈다. 축퇴된 PCR 프라이머 설계에 사용된 내부 펩타이드 서열은 화살표로 나타냈다. 생체 촉매 작용에 중요한 역할을 하는 고도로 보존된 아미노산 잔기는 별표로 나타냈다. GH10 및 RICIN 도메인은 각각 실선 및 점선으로 나타냈다.
도 4는 정제된 재조합 자일라나제 2종인, RICIN 도메인을 포함하는 재조합 자일라나제 (rXylM) 및 RICIN 도메인이 결여된 변이효소(rXylM△RICIN)의 친화크로마토그래피 HisTrapTMHP 이후 단일밴드 확인결과이다.
도 5는 재조합 자일라나제 2종인, RICIN 도메인을 포함하는 재조합 엔도베타자일라나제 (rXylM, ○로 표시) 및 RICIN 도메인이 결여된 변이효소(rXylM△RICIN, ●로 표시) 의 온도에 따른 활성(a) 및 안정성(b)을 나타냈다.
도 6은 난용성 기질에 대한 재조합 자일라나제 2 종인, RICIN 도메인을 포함하는 재조합 엔도베타자일라나제 (rXylM, 흰 막대로 표시) 및 RICIN 도메인이 결여된 변이효소(rXylM△RICIN, 검은 막대로 표시) 의 비수용성 물질에 대한 결합 분석결과이다.

이하, 하기 실시예에 의하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들로 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 루테이마이크로비움 속( Luteimicrobium sp .) HY -24 균주 유래의 자일라나제 유전자의 확보

루테이마이크로비움 속(Luteimicrobium sp.) HY-24 균주(수탁번호: KCTC 19882)의 게놈 DNA에서 GH10(glycoside hydrolase family 10) 계열 자일라나제의 유전자를 클로닝하기 위하여, 보존서열을 기반으로 제작한 프라이머를 이용한 PCR 기법으로 자일라나제 (XylM)를 암호화하는 유전자 서열(서열번호 3) 및 상기 자일라나제의 RICIN 도메인을 암호화하는 유전자 서열 (서열번호 4)을 확보하였다. 상기 XylM는 자일라나제 또는 엔도베타자일라나제로 명명되며, 혼용되어 사용될 수 있다.

구체적으로, 상기 균주로부터 게놈 DNA를 분리한 후 게놈 DNA를 주형으로 하여 10× 완충액(MgCl₂), 2.5 mM dNTPs, 5× 완충액, FastStart Taq DNA 중합효소(Roche) 및 프라이머[XylM-F 프라이머: 5`-TGGGACGTCSTCAACGAG-3`(서열번호 5); XylM-R 프라이머: 5`-GATGTCGAGCTCSGTGAT-3`(서열번호 6)]를 이용하여 자일라나제 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 40초간 신장의 조건으로 35회 반복한 다음, 72℃에서 7분 동안 최후신장을 수행하는 조건으로 수행하였다. 상기 PCR을 통해 수득한 351 bp의 PCR 산물을 DNA Walking SpeedUp premix kit(Seegene, 한국)을 이용하여 게놈 워킹(Genome walking) 및 네스티드-PCR(nested-PCR)을 수행하여 전체 자일라나제 유전자(XylM)에 대한 PCR 산물을 확보하였다.

서열번호 3: XylM 의 유전자 서열 (도 1)

서열번호 4: RICIN 의 유전자 서열 (도 2)

서열번호 5: 5`-TGGGACGTCSTCAACGAG-3'

서열번호 6: 5`-GATGTCGAGCTCSGTGAT-3'

실시예 2. 자일라나제 재조합 벡터의 제조

상기의 실시예 1에서 확보한 유전자를 이용하여 재조합 자일라나제(XylM) 발현 벡터를 제조하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 상기 PCR 산물을 NucleoSpinGel 및 PCR Clean-up kit(Machery-Nagel)를 이용하여 정제하고, pGEM-T easy vector(Promega, Madison, USA)에 라이게이션(ligation) 반응 후, E. coli DH5α에 형질전환하여 암피실린이 함유된 LB 한천 플레이트에서 형질전환된 균주를 선별하였다. 선별된 형질전환 균주로부터 pGEM-T-XylM을 정제하여 주형으로 이용하였다.

재조합 자일라나제 벡터(pET-28a(+)/xylM)를 구성하기 위하여, 프라이머[mXylM-F 프라이머: 5`-CATATGGCAACGCCCGCACAGG-3`(서열번호 7); mXylM-R 프라이머: 5`-AAGCTTTCAGTGGCTGGTCAGGGTCC-3`(서열번호 8)]를 이용하여 95℃에서 4분, 95℃에서 30초간 변성, 54℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 90초간 신장의 조건으로 30회 반복하여, mXylM PCR 산물을 확보하였다. 발현 벡터 pET-28a(+)(Novagen, 미국)와 mXylM PCR 산물을 NdeI 및 HindⅢ 제한효소로 각각 절단한 후, NucleoSpinGel 및 PCR Clean-up kit(Machery-Nagel)를 이용하여 정제하였고, 라이게이션(ligation) 반응 후 발현 균주 E. coli BL21(Novagen)에 재조합된 발현 벡터 pET-28a(+)를 형질전환하여 카나마이신이 함유된 플레이트에서 콜로니를 선별한 후 균주로부터 재조합 자일라나제 벡터(pET-28a(+)/xylM)와 형질전환 균주를 확보하였다.

상기의 방법으로, 프라이머[mXylM△RICIN-F 프라이머: 5`-CATATGGCAACGCCCGCACAGG-3`(서열번호 9); mXylM△RICIN-R 프라이머: 5`-AAGCTTTCAGTTGATCGTGCTCCCACCG-3`(서열번호 10)]를 이용하여 재조합 자일라나제 벡터(pET-28a(+)/xylM△RICIN)와 형질전환 균주를 확보하였다. 상기 XylM△RICIN은 RICIN 도메인이 결여된 XylM을 나타낸다.

서열번호 7 : 5`-CATATGGCAACGCCCGCACAGG-3'

서열번호 8 : 5`-AAGCTTTCAGTGGCTGGTCAGGGTCC-3'

서열번호 9 : 5`-CATATGGCAACGCCCGCACAGG-3'

서열번호 10 : 5`-AAGCTTTCAGTTGATCGTGCTCCCACCG-3'

실시예 3. 재조합 엔도베타자일라나제 단백질의 정제

상기 실시예 2에서 제조한 재조합 발현벡터를 이용하여 대장균에서 과발현시킨 후 재조합 단백질 XylM(rXylM) 및 변이효소 XylM△RICIN(rXylM△RICIN)를 분리 정제하기 위해 하기와 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, 각 발현벡터를 형질전환시킨 대장균을 액체 LB 배지에 접종한 뒤, 37℃에서 흔들면서 배양하였다. 각각의 대장균 배양액의 OD600 값이 0.4 내지 0.6에 이르렀을 때 1.0 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 30℃에서 5시간 더 흔들면서 배양시켰다. 상기 배양액을 원심분리하여 균체를 회수하고, 초음파분쇄기로 세포를 분쇄하여 활성화 포함체(inclusion bodies)를 확보하였다. 확보한 각각의 활성화 포함체(inclusion bodies)는 20 mM 이미다졸(imidazole), 0.5 M 염화나트륨을 포함하는 20 mM 인산나트륨 완충욕액(sodium phosphate buffer, pH 7.4)으로 가용화시켜 주었다. 가용화된 세포 분쇄물을 His-Trap HP(GE Healthcare) 5 ml 컬럼을 이용한 에 150 내지 200 mM의 이미다졸(imidazole)을 이용하여 재접힘시켜 정제하여 정제된 후, 액체 크로마토그래피(LC) system(GE Healthcare, 영국)를 수행하였다. 정제된 재조합 엔도베타자일라나제 (rXylM) 및 변이효소 (rXylM△RICIN) 를 12 % SDS-PAGE로 확인하였다. 상기 정제한 재조합 엔도베타자일라나제 (rXylM) 및 변이효소 (rXylM△RICIN) 을 브래드포드 시약(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 단백질을 정량한 후, 동결건조하여 -20℃에 보관하였다.

클로닝된 재조합 효소인, 재조합 엔도베타자일라나제(rXylM)는 친화성 크로마토그래피로 정제하여 SDS-PAGE로 분석한 결과, 49kDa의 분자량을 확인할 수 있었다. 또한, 리신 도메인 (RICIN domain)이 제거된 유전자 변이 엔도베타자일라나제(rXylMΔRICIN)는 34kDa의 분자량을 확인할 수 있었다(도 4).

실시예 4. 엔도-베타-1,4- 자일라나제 재조합 효소 및 변이 효소의 특성

효소활성을 측정하기 위해 DNS(Dinitrosalicylic acid) 정량법(Miller GL, Anal.Chem., 55:952-959, 1959)을 사용하였다. 1% (w/v)의 비치우드자일란(beechwood xylan)을 포함하는 50 mM 글리신 수산화나트륨 완충용액(glycine-NaOH buffer, pH 9.0)에 단계별 희석한 100 ㎕의 효소용액을 넣고 55℃에서 15분간 반응시킨 후 750 ㎕의 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid) 용액을 첨가한 다음 100℃에서 5분간 방치한 후 흡광도 540 ㎚에서 측정하였다. 효소의 1 유닛(unit)은 1분 동안에 1 μ㏖의 환원당을 방출시키는 효소의 양으로 정하였다.

재조합 효소의 최적 pH는 50 mM 시트르산나트륨 완충용액(sodium citrate buffer, pH4.0-5.5), 50 mM 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer, pH5.5-7.5), 50 mM 트리스염산 완충용액(Tris-HCl buffer, pH 7.5-9.0) 및 50 mM 글리신수산화나트륨 완충용액(glycine-NaOH buffer, pH 9.0-11.0)을 사용하여 65℃에서 15분 동안 반응하여 효소활성을 측정하였다.

재조합 효소의 최적반응 온도를 확인하기 위해 30℃ 내지 75℃범위에서 5 간격으로 효소활성을 측정하였고, 온도에 대한 안정성을 확인하기 위해 최대 활성을 나타내는 완충용액에서 1시간 동안 방치한 후, 30℃ 내지 55℃범위에서 10분 동안 반응하여 효소활성을 측정하였다.

재조합 엔도베타자일라나제(rXylM)는 비치우드자일란 기질을 대상으로 65℃, pH 6.0, 50mM 인산 완충액에서 최대 활성을 보였으며, 한편 변이효소(rXylMΔRICIN)는 같은 기질에 대해 45℃, pH 5.0, 50mM 구연산 완충액에서 최대 활성을 보였다(도 5). rXylM은 pH 6.5-9.5 구간에서 rXylMΔRICIN보다 더 높은 활성안정성을 보여서, 1시간 동안 pH 4.0-8.0의 넒은 구간에서 전처리하여도 처음 활성의 80% 이상이 남았고, rXylMΔRICIN는 단지 pH 4.0-6.0의 상대적으로 좁은 구간에서만 80% 이상의 활성이 유지되었다. rXylM은 기질이 없는 상태에서 60℃에서 1시간의 전처리 후에도 비치우드자일란을 가수분해하는 활성의 85% 이상이 남아있어서, 40℃에서 1시간 전처리 후에도 온도에 따라 활성을 잃는 rXylMΔRICIN)에 비해서 상대적인 열 안정성이 높음을 보여주고 있다. 상기의 결과에 따르면, 엔도베타자일라나제 (XylM) C-말단의 리신 도메인을 제거하면 비치우드 자일란 기질을 가수분해하는 효소 활성의 pH 및 열안정성이 현저히 감소하여, 리신 도메인의 존재가 효소의 활성에 매우 중대한 역할을 함을 시사하고 있다 (도 5).

실시예 5. 재조합 엔도베타자일라나제 (rXylM) 및 변이효소 (rXylMΔRICIN)의 기질 특이성

본 발명의 재조합 엔도베타자일라나제(rXylM)와 변이효소(rXylMΔRICIN)의 다양한 자일란 및 당 기질에 대한 분해능을 확인하였다. 비치우드 자일란(beechwood xylan), 버치우드자일란(birchwood xylan), 오트스펠트자일란(oatspelt xylan)등의 다양한 1% (w/v) 자일로스 고분자 등을 이용하여 기질 특이성을 확인하였다. 기질에 대한 효소의 활성은 최적 반응 조건하에서 분석하였다. 또한, 자일란 분해산물의 특성을 분석하기 위하여, 버치우드자일란(birchwood xylan, BX), 자일로바이오스(xylobiose, X₂), 자일로트리오스(xylotriose, X₃), 자일로데트라오스(xylotetraose, X₄), 그리고 자일로펜토스(xylopentose, X₅)를 기질로 하여 반응 혼합물을 100℃에서 5분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 다음, 가수분해 산물을 용출용액 A(0.05% 포말산/멸균수) 용출용액 B(0.05% 포말산/멸균수: 아세토니트릴/메탄올 = 6:4)의 이동상의 조건하에 Asahipak NH2P-50 2D 컬럼(5㎛, 2.0×150㎜, Shodex)을 이용한 고성능 액상 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC) 분석법을 수행하여 측정하였다

재조합 엔도베타자일라나제(rXylM)의 단위 무게 당 효소 활성은 기질 오트스펠트자일란에 대해서 254.1U/mg을 보였고, 동일 조건에서 변이효소(rXylMΔRICIN)는 더 낮은 활성(74.7U/mg)을 보여서 리신 도메인의 존재로 효소 활성이 약 3.4배 차이를 보여 주었다. 리신 도메인의 존재로 인해 촉매활성(kcat/Km)이 4.2배 내지는 최고 11.8배까지 증가하는 효과가 있으며, 절대적 크기로는 kcat/Km=309.4 mg^-1s^-1mL의 수치를 나타낸다 (표 1).

GH10 엔도베타자일라나제의 활성에 대한 리신 도메인의 용도 (기질 농도 범위, 0.2-1.5%)

기질	rXylM				rXylM△RICIN
기질	Vmax (U mg^-1)	Km (mg mL^-1)	kcat (s^-1)	kcat/Km (mg^-1s^-1mL)	Vmax (U mg^-1)	Km (mg mL^-1)	kcat (s^-1)	kcat/Km (mg^-1s^-1mL)
비치우드 자일란	294.7	1.4	248.0	178.4	140.6	2.0	84.4	42.2
버치우드자일란	263.5	1.5	221.8	153.0	80.8	2.5	48.5	19.4
오트스펠트 자일란	463.1	1.3	389.8	309.4	100.1	2.3	60.1	26.1
밀 아라비노자일란	100.7	2.8	84.8	29.9	37.1	3.9	22.3	5.7

자일로올리고당 기질에 대한 상기 엔도베타자일라나제 효소 가수분해물의 HPLC 분석결과에 따르면 (표 2), 지금껏 보고된 다양한 GH10 엔도베타자일라나제가 보여주곤 했던 글리코실 전이반응(transglycosylation) 반응(D.Y. Kim, et.al., Environ. Microbiol. 75 (2009) 7275-7279; D.Y. Kim, et.al., J. Microbiol. Biotechnol. 24 (2014) 943-953;

; M.J. Vazquez, et.al., Trends Food Sci. Technol. 11 (2000) 387-393)에 비해 rXylM)은 더 긴 중합체를 구성하는 반응을 보이지 않아 부차반응 없는 가수분해 기능(D.Y. Kim, et.al., J. Microbiol. 52 (2014) 863-870; X. Jia, et.al., Sci. Rep. 2 (2016)21672)만 확인할 수 있었다.

재조합 엔도베타자일라나제 (rXylM)의 가수분해물 분석 (LC)

기질	가수분해반응물 조성 (%, 액체크로마토그래피 분석)
기질	X₁	X₂	X₃	X₄	X₅
X₂	0.3	99.7
X₃	0.8	16.7	82.5
X₄	1.9	34.9	49.2	14.0
X₅	1.2	38.4	49.1	6.7	4.6
X₆	1.2	29.8	56.4	10.9	1.7
버치우드 자일란	1.4	37.1	58.9	2.6

실시예 6. 재조합 엔도베타자일라나제의 기질 결합특성

본 발명의 재조합 엔도베타자일라나제(rXylM)와 변이효소(rXylMΔRICIN)를 이용하여 비수용성 고분자에 대한 결합능을 비교하였다. 기질에 대한 결합능을 비교하기 위하여 리그닌(lignin), 키토산(chitosan), 키틴(chitin), 오트스펠트 자일란(oatspelt xylan), 아비셀(Avicel PH-101), 아이보리넛 만난(ivory nut mannan) 등의 톡특한 미세구조를 가지는 각각의 기질을 50 mM 인산나트륨 완충용액(sodium phosphate buffer, pH6.0)으로 5회 세척하고, 효소액 5unit/mL을 첨가하여 1.5mL 튜브에서 2시간 동안 4도에서 방치한 후, 상등액을 취하여 효소의 활성을 비교하였다.

다양한 난용성 기질, 예컨대 5탄당 혹은 6탄당으로 이뤄진 다당류, 리그닌, PHB 등에 대한 GH10 엔도베타자일라나제의 결합에 관한 기작은 알려져 있으나(D.Y. Kim, et.al., J. Microbiol. Biotechnol. 24 (2014) 943-953; Y. Hu, G. Zhang, et.al., Microbiol. Biotechnol. 80 (2008) 823-830), 리신 도메인이 개입된 기작은 미규명의 부분이다. 상기의 두 가지 효소인 재조합 엔도베타자일라나제 (rXylM) 및 변이효소 (rXylMΔRICIN)를 사용한 효소-기질 결합에 관한 실시사례에 따르면 (도 6), 자일란 중합체 분해를 위한 중요한 역할로 리신 도메인이 효소-기질 복합체를 만드는데 중요한 역할을 함을 알 수 있다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

<110> KOREA RESEARCH INSTITUTE OF BIOSCIENCE AND BIOTECHNOLOGY <120> The function of the novel xylanase and lysine domains produced by Luteimicrobium xylanilyticum HY-24, a microorganism in the intestinal tract of Massicus raddei <130> KPA171462-KR <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 495 <212> PRT <213> Luteimicrobium xylanilyticum <400> 1 Met Lys His Glu Glu Gln Arg Ser Arg Ser Val Met Gly Val Pro Arg 1 5 10 15 Arg Leu Ala Ala Leu Ala Ala Ala Ala Gly Leu Ala Leu Thr Gly Val 20 25 30 Ser Val Val His Ala Ala Thr Pro Ala Gln Ala Ala Pro Ala Gly Ser 35 40 45 Leu Asp Ala Leu Ala Glu Gln Thr Gly Arg Tyr Phe Gly Thr Ala Val 50 55 60 Glu Ala Ser Lys Leu Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Ser Ile Val Ser Gly 65 70 75 80 Asp Phe Gly Met Leu Thr Pro Thr Asn Glu Met Lys Ala Asp Ala Thr 85 90 95 Glu Pro Thr Arg Gly Gln Phe Asn Tyr Ser Gly Gly Asp Ala Val Val 100 105 110 Ser Tyr Ala Gln Ser His Gly Met Arg Val Arg Gly His Thr Leu Ala 115 120 125 Trp His Ser Gln Gln Pro Gly Trp Met Gln Ser Leu Ser Gly Ser Asp 130 135 140 Leu Arg Ser Ala Met Leu Asn His Ile Thr Asn Val Val Ser His Tyr 145 150 155 160 Lys Gly Lys Ile Tyr Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Ala Glu 165 170 175 Ser Gly Gly Arg Arg Asp Ser Asn Leu Gln Gln Thr Gly Asn Asp Trp 180 185 190 Ile Glu Ala Ala Phe Lys Ala Ala His Ala Ala Asp Pro Ser Ala Lys 195 200 205 Leu Cys Tyr Asn Asp Tyr Asn Thr Asp Gly Val Asn Ala Lys Ser Thr 210 215 220 Gly Val Tyr Asn Met Val Lys Asp Phe Lys Ala Arg Gly Val Pro Ile 225 230 235 240 Asp Cys Val Gly Phe Gln Ser His Leu Gly Ser Thr Ile Pro Ser Asp 245 250 255 Tyr Gln Ala Asn Leu Gln Arg Phe Ser Asp Leu Gly Val Asp Val Gln 260 265 270 Ile Thr Glu Leu Asp Val Ala Ser Gly Ser Asn Gln Ala Ser Ile Tyr 275 280 285 Ser Thr Val Thr Arg Ala Cys Leu Ala Val Ala Arg Cys Lys Gly Ile 290 295 300 Thr Val Trp Gly Val Arg Asp Ser Asp Ser Trp Arg Gln Gly Glu Asp 305 310 315 320 Pro Leu Leu Phe Asp Ala Ser Gly Ala Lys Lys Thr Ala Tyr Thr Phe 325 330 335 Val Leu Thr Ala Leu Gln Ala Ala Ala Gly Gly Ser Thr Gly Gly Ser 340 345 350 Thr Ile Asn Ala Gly Thr Tyr Ser Ile Lys Asn Val Asn Ser Gly Leu 355 360 365 Val Leu Gly Val Gln Asn Met Ser Thr Ser Trp Gly Ala Ser Val Ile 370 375 380 Gln Trp Ser Asp Ser Gly Thr Ser Asp His Leu Trp Lys Val Val Ala 385 390 395 400 Ala Gly Asn Gly Gln Tyr Lys Ile Gln Asn Val Asn Ser Gly Leu Val 405 410 415 Leu Gly Val Gln Asn Ala Ser Thr Ser Ala Gly Ala Ala Ile Val Gln 420 425 430 Trp Gly Asp Ser Gly Thr Ser Asp His Leu Trp Thr Phe Val Ser Ala 435 440 445 Gly Asn Gly Gln Tyr Lys Ile Arg Asn Val Asn Ser Gly Leu Val Leu 450 455 460 Gly Ile Thr Asn Ala Ser Thr Ser Thr Gly Ala Thr Ala Leu Gln Trp 465 470 475 480 Asn Asp Ser Gly Thr Ser Asp His Leu Trp Thr Leu Thr Ser His 485 490 495 <210> 2 <211> 143 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> RICIN domain <400> 2 Thr Ile Asn Ala Gly Thr Tyr Ser Ile Lys Asn Val Asn Ser Gly Leu 1 5 10 15 Val Leu Gly Val Gln Asn Met Ser Thr Ser Trp Gly Ala Ser Val Ile 20 25 30 Gln Trp Ser Asp Ser Gly Thr Ser Asp His Leu Trp Lys Val Val Ala 35 40 45 Ala Gly Asn Gly Gln Tyr Lys Ile Gln Asn Val Asn Ser Gly Leu Val 50 55 60 Leu Gly Val Gln Asn Ala Ser Thr Ser Ala Gly Ala Ala Ile Val Gln 65 70 75 80 Trp Gly Asp Ser Gly Thr Ser Asp His Leu Trp Thr Phe Val Ser Ala 85 90 95 Gly Asn Gly Gln Tyr Lys Ile Arg Asn Val Asn Ser Gly Leu Val Leu 100 105 110 Gly Ile Thr Asn Ala Ser Thr Ser Thr Gly Ala Thr Ala Leu Gln Trp 115 120 125 Asn Asp Ser Gly Thr Ser Asp His Leu Trp Thr Leu Thr Ser His 130 135 140 <210> 3 <211> 1488 <212> DNA <213> Luteimicrobium xylanilyticum <400> 3 atgaagcacg aagaacaacg atcacggagc gtgatgggcg ttccccgacg tctggccgct 60 ctcgctgcgg ccgcggggct ggctctcacc ggagtgtccg tcgtccacgc ggcaacgccc 120 gcacaggcgg cgcccgcggg gtcgctcgac gccctcgccg agcagacggg ccggtacttc 180 ggcaccgccg tcgaggcctc gaagctcggt ggctccgcgt actcgtcgat cgtctcgggc 240 gacttcggga tgctcacccc cacgaacgag atgaaggccg acgcgacgga gccgacgcgg 300 ggacagttca actactcggg tggggacgcc gtcgtgtcct acgcccagtc tcacgggatg 360 agggtgcgtg ggcatacgct cgcgtggcac tcccagcagc 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cggcgtccag 1260 aatgcttcga ccagcgcggg agccgcgatc gtgcagtggg gcgactccgg gaccagcgac 1320 cacctgtgga ccttcgtgtc ggcgggcaac ggccagtaca agatccgcaa cgtcaactcc 1380 ggcctggtcc tgggcatcac gaacgcctcg accagcaccg gcgccaccgc gctgcagtgg 1440 aacgactccg ggaccagcga ccacctgtgg accctgacca gccactga 1488 <210> 4 <211> 432 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> RICIN domain <400> 4 acgatcaacg cggggacgta ctcgatcaag aacgtgaact cgggcctggt cctgggcgtg 60 cagaacatgt cgacctcgtg gggcgcctcg gtgatccagt ggagcgactc gggcacgagc 120 gaccacctgt ggaaggtcgt ggcggccggc aacggccagt acaagatcca gaacgtcaac 180 tccggcctcg tgctcggcgt ccagaatgct tcgaccagcg cgggagccgc gatcgtgcag 240 tggggcgact ccgggaccag cgaccacctg tggaccttcg tgtcggcggg caacggccag 300 tacaagatcc gcaacgtcaa ctccggcctg gtcctgggca tcacgaacgc ctcgaccagc 360 accggcgcca ccgcgctgca gtggaacgac tccgggacca gcgaccacct gtggaccctg 420 accagccact ga 432 <210> 5 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XylM-F primer <400> 5 tgggacgtcs tcaacgag 18 <210> 6 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> XylM-R primer <400> 6 gatgtcgagc tcsgtgat 18 <210> 7 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mXylM-F primer <400> 7 catatggcaa cgcccgcaca gg 22 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mXylM-R primer <400> 8 aagctttcag tggctggtca gggtcc 26 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 catatggcaa cgcccgcaca gg 22 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 aagctttcag ttgatcgtgc tcccaccg 28

Claims

서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 자일라나제 단백질.
제1항의 자일라나제 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제2항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터.
제3항의 발현 벡터가 도입된, 인간을 제외한 형질전환체.
서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는, 분리된 리신(RICIN) 도메인.
제5항의 리신 도메인을 코딩하는 폴리뉴클레오티드.
제6항의 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 발현 벡터.
제7항의 발현 벡터가 도입된, 인간을 제외한 형질전환체.
헤미셀룰로오스성 물질, 리그닌, 키토산 및 키틴으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 기질 및 제1항의 자일라나제 단백질, 또는 이를 포함하는 미생물 또는 이의 배양물을 포함하는 사료.
제9항에 있어서, 상기 헤미셀룰로오스성 물질은 버치우드 자일란(birchwood xylan), 비치우드 자일란(beechwood xylan), 오트스펠트 자일란(oatspelt xylan), 및 아라비노 자일란으로 이루어진 군에서 선택되는 자일란인 것인, 사료.
(a) 제1항의 자일라나제 단백질, 또는 이를 포함하는 미생물 또는 이의 배양물을 헤미셀룰로오스성 물질과 반응하는 단계,
및 (b) 상기 (a) 단계의 반응 혼합물로부터 헤미셀룰로오스 분해 생성물을 회수하는 단계를 포함하는, 헤미셀룰로오스 분해 생성물의 제조방법.
제1항의 자일라나제 단백질, 또는 이를 포함하는 미생물 또는 이의 배양물을 헤미셀룰로오스성 물질, 리그닌, 키토산, 및 키틴으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 기질에 처리하는 단계를 포함하는, 사료의 제조방법.