KR20130077929A - 셀룰로시마이크로비움 속 ｈｙ－１３ 균주로부터 생산되는 신규한 활성 도메인을 갖는 자일라나제 - Google Patents

셀룰로시마이크로비움 속 ｈｙ－１３ 균주로부터 생산되는 신규한 활성 도메인을 갖는 자일라나제 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규 자일라나제 및 이의 용도에 관한 것으로, 구체적으로는 무척추동물로부터 분리한 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주에서 분리한 자일라나제, 상기 자일라나제는 N-말단 부분에 촉매 글리코시드 하이드롤라제-6 영역(GH-6 domain)과 피브로넥틴 3형 영역(fibronectin type 3 domain, Fn3), C-말단 부분에 탄수화물 결합 영역-2(carbohyrate binding module-2, CBM-2)를 포함하는 이들의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 자일라나제는 기질특이성을 가지고 중성 및 염기성 pH에서 고효율로 자일란을 분해하며, 특이적으로 자일란의 최종 가수분해 산물인 자일로바이오스에 의해 효소활성이 유의적으로 증대되며 셀로바이오스를 분해하는 기질특이성을 가지는 것으로 확인하였으므로 본 발명의 자일라나제는 다양한 식품산업용 효소, 사료용 효소, 바이오매스 전처리 효소, 펄프 공정용 등의 다양한 산업군에 유용하게 사용할 수 있다.

Description

셀룰로시마이크로비움 속 ＨＹ－１３ 균주로부터 생산되는 신규한 활성 도메인을 갖는 자일라나제{Novel xylanase containing a novel catalytic domain produced from Cellulosimicrobium sp. strain HY-13}
본 발명은 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주에서 분리된 글리코시드 하이드롤라제-6 유사 도메인(glycoside hydrolase6-like domain; GH6-like domain)을 가지는 신규한 자일라나제에 관한 것이다.
곡물원료 또는 식물원료로부터 다양한 탄소원을 원료로 사용하기 위하여 많은 연구가 진행되고 있다. 이러한 원료에 포함된 전분계(Starch) 다당(polysaccharides)은 가수분해가 용이하여 주로 식품산업에서 주로 이용하고 있다. 따라서, 다른 산업에서 탄소원으로 이 원료를 이용하기 위해서는 비전분계 다당(Non starch polysaccharides)을 이용할 필요성이 대두되고 있다.
특히, 곡물부산물의 사료원료로의 이용과 바이오매스(biomass)의 생전환(bioconversion)을 위하여 비전분계 다당을 가수분해하여 이를 탄소원으로 활용할 필요가 있다. 곡물부산물과 목질계 원료를 이용하기 위하여 자일라나제(xylanase), 만난아제(mannanase), 글루카나제(glucanase) 등의 다양한 효소를 필요로 한다.
이와 같은 효소를 이용하여 헤미셀룰로오스(hemicellulose)를 다량 함유한 곡물부산물을 사료원료로 사용하여 곡물가격 급등으로 인한 사료가격의 상승분을 상쇄할 수 있고, 옥수수 전분이나 사탕수수와 같은 비교적 가수분해가 용이한 원료를 이용한 1세대 바이오에탄올 생산기술에서 목질계 또는 식물계 원료를 이용한 2세대 바이오 에탄올 생산기술에 직접적으로 활용할 수 있다.
자일란(xylan)은 식물계 바이오매스의 주요한 성분으로, 자일라나제(xylanase)를 이용하여 이를 가수분해 할 수 있다. 베타-1,4-자일로스 구조로 결합된 자일란을 가수분해하는 글리코사이드 하이드로레이즈 패밀리(glycoside hydrolase family, GH family)는 5, 8, 10, 11, 30, 그리고 43의 6가지로 알려져 있다.(http://www.cazy.org, Luo et al., 2010). 이러한 자일라나제의 대부분은 글리코시드 하이드롤라제 패밀리(GH family) 10과 11에 속한다.
탄수화물 폴리머(carbohydrate polymer)의 해중합(depolymerization)과 관련하여 다양한 모듈(module)효소와 마찬가지로, 베타-1,4-자일라나제(β-1,4-xylanase)도 종종 하나 이상의 기능을 갖는 영역을 포함한다. 이것은 피브로넥틴 3형 영역(fibronectin type 3 domain, Fn3)과 탄수화물 결합 영역(carbohyrate binding module, CBM), 셀룰로오스 결합 영역 등의 다양한 부분들이 결합되어 베타-1,4-자일라나제(β-1,4-xylanase)의 반응에 영향을 줄 수 있다.
한편, 대한민국 공개번호 10-2010-0107966호에는 신규한 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주 및 이로부터 생산되는 자일라나제가 개시되어 있고, 대한민국 공개번호 10-2011-0092511호에는 셀룰로시마이크로비움 펀케이 HY-13 균주로부터 생산되는 신규한 자일라나제가 개시되어 있으나, N-말단 부분에 촉매 글리코시드 하이드롤라제-6 영역(GH-6 domain)과 피브로넥틴 3형 영역(fibronectin type 3 domain, Fn3), C-말단 부분에 탄수화물 결합 영역-2(carbohyrate binding module-2, CBM-2)를 포함하는 신규한 엔도-베타-1,4-자일라나제(endo-β-1,4-xylanase)에 대해서는 개시된 바 없다.
이에, 본 발명자들은 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주로부터 N-말단 부분에 촉매 글리코시드 하이드롤라제-6 영역(GH-6 domain)과 피브로넥틴 3형 영역(fibronectin type 3 domain, Fn3), C-말단 부분에 탄수화물 결합 영역-2(carbohyrate binding module-2, CBM-2)를 포함하는 신규한 엔도-베타-1,4-자일라나제(endo-β-1,4-xylanase)를 확인하였고, 그 유전자 서열과 아미노산 서열을 분석하였다. 또한, 상기의 효소의 기질에 대한 특성 및 온도와 pH에 대한 특성을 분석하여 산업적으로 유용함을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주로부터 분리한 신규한 자일라나제 및 이의 용도에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 분자량이 76 kDa이고, pH 5 내지 pH 6.5 및 온도 35 내지 50℃인 조건에서 최대 활성을 가지며, 자일로바이오스에 의해 효소활성이 증대되는 자일라나제를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 자일라나제를 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
또한, 본 발명은,
1) 본 발명의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
2) 상기 단계 1)에서 수득된 조효소액에서 자일라나제를 정제하는 단계를 포함하는 자일라나제 생산 방법을 제공한다.
또한, 본 발명 본 발명의 자일라나제, 본 발명의 형질전환체 또는 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 자일라나제, 본 발명의 형질전환체 또는 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명의 자일라나제, 본 발명의 형질전환체 또는 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나제를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
아울러 본 발명은 동물의 사료 재료에 본 발명의 자일라나제, 본 발명의 형질전환체 또는 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나제를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.
본 발명의 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주에서 분리된 GH6(glycoside hydrolase family 6) 효소와 상동성을 가지는 신규한 자일라나제는 자일란을 포함한 당 기질을 분해하고, 자일로바이오스(xylobiose; X2) 자일로트리오스(xylotriose; X3) 및 자일로테트라오스(xylotetraose; X4)를 가수분해하며, 셀로바이오스(cellobiose)를 분해하며, 특이적으로 자일란의 최종 가수분해 산물인 자일로바이오스에의해 효소활성이 유의적으로 증가되는 신규한 효소이다. 이에, 본 발명의 자일라나제는 식품산업용 효소, 사료용 효소, 바이오매스 전처리 효소, 펄프 공정용 등의 다양한 산업군에 유용한 효소로 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명에서 분리한 신규 자일라나제(XylK2)의 폴리펩티드 서열 및 NCBI에서 등록된 GH6 계열의 효소[셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp. strain) HY-13 (Cfu) 자일라나제 (HQ533142); 셀룰로모나스 플라비제나 (Cellulomonas flavigena DSM 20109) (Cfl) 유래의 베타-1,4-셀로바이오 하이드롤라제(β-1,4-cellobiohydrolase (ADG74793)); 자일라니모나스 셀룰로시라이티카(X. cellulosilytica DSM 15894) (Xce) 유래의 베타-1,4-셀로바이오 하이드롤라제(β-1,4-cellobiohydrolase (ACZ30181)); 셀룰로모나스 피미(Cellulomonas fimi) (Cfi) 유래의 베타-1,4-엑소셀로바이오 하이드롤라제(β-1,4-exocellobiohydrolase(AAC36898)); 스트렙토마이세스 속(Streptomyces sp. SPB78) (Ssp) 유래의 엑소글루카나제 A(exo-glucanase(EFK98327)] 서열의 상동성을 조사한 결과를 나타낸 도이다:
이때, 검은 박스는 같은 아미노산이고 회색 박스는 유사 아미노산을 각각 표시한 것이고;
추측된 신호 펩티드는 검은 막대로 표시하였으며;
효소반응에서 중요한 역할을 하는 고도로 보존된 아미노산 잔기는 별표(*)로 표시하였고; GH6(glycoside hydrolase family 6), Fn3(Fibronectin type 3) 및 CBM2(carbohydrate-binding module2) 도메인은 각각 실선, 긴 점선 및 점선으로 각각 외곽선을 표시하였다.
도 2는 본 발명의 자일라나제(XylK2)의 최적 반응조건을 조사하기 위하여 버치우드 자일란(birchwood xylan)을 기질로 하여 반응 pH와 온도에 대한 영향을 나타낸 도이다.
도 3은 버치우드 자일란(birchwood xylan, BX), 자일로바이오스(xylobiose, X2), 자일로트리오스(xylotriose, X3) 및 자일로테트라오스(xylotetraose, X4)를 기질로 하여 자일란 분해산물의 특성을 나타낸 도이다.
도 4는 단당류인 글루코오스(D-glucose)와 자일로오스(D-xylose), 이당류인 셀로바이오스(cellobiose)와 자일로바이오스(xylobiose)를 이용하여 자일라나제(XylK2)의 가수분해 활성에 대한 영향을 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 분자량이 76 kDa이고, pH 5 내지 pH 6.5 및 온도 35 내지 50℃인 조건에서 최대 활성을 가지며, 자일로바이오스에 의해 효소활성이 증대되는 자일라나제를 제공한다.
본 발명은 본 발명의 자일라나제를 암호화하는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 자일라나제는 수탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 유래한 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 자일라나제는 pH 5 내지 pH 6.5에서 최대 활성을 나타내는 것이 바람직하고, pH 6.0에서 최대 활성을 나타내는 것이 가장 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 자일라나제는 35 내지 50℃에서 최대 활성을 나타내는 것이 바람직하고, 35 내지 45℃에서 최대 활성을 나타내는 것이 보다 바람직하고, 45℃에서 최대 활성을 나타내는 것이 가장 바람직하다.
상기 자일라나제는 기존에 보고된 다른 자일라나제들과는 달리 자일란의 최종가수분해 산물인 자일로바이오스에 의한 효소 활성 저해를 전혀 받지 않으며, 50 mM 자일로바이오스가 존재할 때 약 2배 이상의 효소활성이 증가되는 유의적인 특성을 가진다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주(수탁번호: KCTC 11302BP)의 게놈 DNA에서 GH6(glycoside hydrolase family 6) 계열의 자일라나제의 유전자서열을 기반으로 제작한 프라이머를 이용하여 자일라나제 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하여 클로닝(GenBank accession number : HQ533142)한 후, 유전자서열을 분석하여 NCBI 데이터베이스에서 단백질 블라스트 서베이(Protein blast survey)를 를 이용하여 아미노산 서열을 분석한 결과, 본 발명의 자일라나제(XylK2)는 GH6 효소 도메인과 같은 N-말단에 GH6 효소 계열의 카탈라이틱 도메인(catalytic domain), Fn3 도메인, C-말단에 CBM2 도메인을 갖는 다중 도메인 효소(multi-domain enzyme)인 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주로 유래의 자일라나제 XylK2의 카탈라이틱 도메인(catalytic domain)의 아미노산 서열은 셀룰로모나스 플라비제나 (Cellulomonas flavigena DSM 20109) 유래의 베타-1,4-셀로바이오 하이드롤라제(β-1,4-cellobiohydrolase (ADG74793))와 70%, 자일라니모나스 셀룰로시라이티카(X. cellulosilytica DSM 15894) 유래의 베타-1,4-셀로바이오 하이드롤라제(β-1,4-cellobiohydrolase (ACZ30181))와 68%, 셀룰로모나스 피미(C. fimi ) 유래의 베타-1,4-엑소셀로바이오 하이드롤라제(β-1,4-exocellobiohydrolaseA(AAC36898))와 67% 상동성을 가지는 신규한 효소임을 확인하였다(도 1 참조).
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 자일라나제의 유전자 서열을 분석한 결과, 2304 bp의 ORF(open reading frame), 또는 767 개의 아미노산으로 이루어진 것으로 확인하였고, 또한, 순수 분리한 본 발명의 자일라나제를 10% 겔에서 SDS-PAGE를 수행한 결과, 약 77 KDa 크기임을 확인하였다.
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 자일라나제의 생화학적 특성을 확인한 결과, 본 발명의 자일라나제(XylK2)는 pH 6.0, 45℃에서 가장 높은 활성을 보였으며, pH 5.0~9.0 범위에서도 80% 이상의 활성을 보였다. 또한, 45℃에서 1시간 후에도 60% 이상의 활성을 유지하는 것을 확인하였다(도 2 참조).
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 본 발명의 자일라나제의 다양한 자일란 및 당 기질에 대한 분해능을 확인한 결과, 자일란 물질 중 귀리 스펠트 자일란이 본 발명의 자일라나제(XylK2)에 의해 가장 효과적으로 가수분해되었고, 버치우드 자일란, 비치우드 자일란 순으로 가수분해 활성을 나타내었다. 또한, 본 발명의 자일라나제(XylK2)는 PNP-셀로비오사이드(PNP-cellobioside)에 대한 높은 활성(788.3 IU/mg)을 나타내었고, 확인된 다른 PNP-당에 대한 가수분해 활성은 나타내지 않는 것을 확인하였다. 이는 GH6 셀로바이오 하이드롤라제와 자일라나제(XylK2)가 구조적으로 유사하다는 것을 의미한다(Denman et al., 1996). 또한, 본 발명의 자일라나제(XylK2)는 가용성 녹말 및 카복시 메틸셀룰로오스(Carboxyl Methylcellulose)와 같은 다른 GH에 대한 활성이 관찰되지 않았다(표 1 참조).
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 자일란 분해 산물을 특성을 확인한 결과, 버치우드 자일란에 대한 가수분해 산물은 자일로바이오스(xylobiose, X2)(59.2%)와 자일로트리오스(xylotriose, X3)(40.8%), X3에 대한 가수분해 산물은 X2(33.6%)와 X3(66.4%), 자일로데트라오스(xylotetraose, X4)에 대한 가수분해 산물은 X2(21.5%), X3(45.3%) 및 X4(33.2%)로 분해하였다. 이때, X2의 이동상의 시간은 3.8분, X3는 4.7분 및 xylotetraose, X4는 5.7분인 것을 확인하였다(도 3 참조).
본 발명의 또 다른 구체적인 실시예에서, 단당류인 글루코오스(D-glucose)와 자일로오스(D-xylose), 이당류인 셀로바이오스(cellobiose)와 자일로바이오스(xylobiose)를 이용하여 자일라나제(XylK2)의 가수분해 활성에 대한 영향을 검토한 결과, 본 발명의 자일라나제(XylK2)는 기존에 보고된 다른 자일라나제들과는 달리 자일란의 최종가수분해 산물인 자일로바이오스에 의한 효소활성저해를 전혀 받지 않았으며, 오히려 50 mM 자일로바이오스가 존재할 때 약 2배의 효소활성이 증가되는 매우 독특한 특성을 보였다. 또한, 본 효소는 500 mM 자일로오스, 글루코스, 및 셀로비오스에 의해서도 자일란 가수분해활성이 약 130% 이상 증가될 수 있음을 확인하였다(도 4 참조).
또한, 본 발명은 본 발명의 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 제공한다.
본 발명은 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주로부터 분리한 신규한 자일라나제를 코딩하는 신규한 유전자의 염기서열을 확인하였으므로 당업계 공지된 통상의 방법을 이용하면 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제작할 수 있다. 본 발명의 재조합 벡터는 상용화된 벡터를 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니며, 당업자가 적합한 재조합 벡터를 제조하여 이용하는 것도 무방하다.
또한, 본 발명은 본 발명의 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 제공한다.
본 발명에서 사용할 수 있는 숙주세포는 한정된 것은 아니며, 대장균을 포함한 원핵세포, 효모, 동물세포, 곤충세포를 포함하는 진핵세포로 이루어진 군으로부터 선택하여 이용하는 것이 바람직하며, 대장균을 이용하는 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은,
1) 본 발명의 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
2) 상기 단계 1)에서 수득된 조효소액에서 자일라나제를 정제하는 단계를 포함하는 자일라나제 생산 방법을 제공한다.
상기 단계 2)는
1) 본 발명의 형질전환체의 배양액을 원심분리하여 수득한 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
3) 상기 단계 2)의 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 이루어질 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 방법에 있어서, 배지는 본 발명의 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13 균주 또는 본 발명의 형질전환체에 적합한 배지를 당업자에게 공지된 상용 배지 중에서 선별하여 사용하는 것이 바람직하다.
상기 방법에서, 단계 1)의 침전제로는 황산 암모늄, 아세톤, 아이소프로판올, 메탄올, 에탄올, 폴리에틸렌글리콜로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 사용할 수 있다. 상기 침전은 다양한 구멍의 크기(pore size)를 가지는 막을 이용한 한외여과법으로 대체하여 농축하는 방법으로 수행할 수 있다.
상기 방법에서, 단계 3)의 컬럼 크로마토그래피는 실리카겔, 세파덱스, RP-18, 폴리아미드, 도요펄 및 XAD 수지로 이루어진 군으로부터 선택된 충진제를 이용한 컬럼 크로마토그래피를 수행하여 정제할 수 있다. 컬럼 크로마토그래피는 필요에 따라 적절한 충진제를 선택하여 수차례 실시할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 자일라나제, 본 발명의 형질전환체 또는 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나제를 포함하는 식품내 자일란 가공용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명의 자일라나제, 본 발명의 형질전환체 또는 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나제를 포함하는 제지공정용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 자일라나제, 본 발명의 형질전환체 또는 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나제를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제를 제공한다.
상기 자일라나제는 pH 6.0 및 35 내지 45℃에서 최대 활성을 나타내는 것이 바람직하고 45℃에서 최대 활성을 나타내는 것이 보다 바람직하나 이에 한정되지 않는다.
상기 자일라나제는 기존에 보고된 다른 자일라나제들과는 달리 자일란의 최종가수분해 산물인 자일로바이오스에 의한 효소 활성 저해를 전혀 받지 않으며, 50 mM 자일로바이오스가 존재할 때 약 2배의 효소활성이 증가되는 유의적인 특성을 가진다.
본 발명의 조성물은 본 발명의 자일라나제 외에 동일하거나 유사한 성분을 포함할 수 있으며, 본 발명의 자일라나제를 전체 조성물 중 1 내지 90%로 함유하는 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 결과로부터 본 발명의 자일라나제는 특이성을 갖고 효율적으로 자일란을 분해하는 것을 확인할 수 있었으며, 동물에 가장 많이 사용하는 식물성 곡물 사료에 자일란 함유가 높은 것을 고려할 경우 동물성 사료에 효율적이라고 사료된다. 이와 같은 결과를 살펴볼 때 본 발명의 자일라나제는 식물성 사료의 자일란 분해 증진을 목적으로 하는 사료 첨가제로 적합한 것을 알 수 있었다.
이에, 본 발명의 자일라나제는 자일란 당화를 위한 사료첨가제로 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 사료첨가제는 식물 세포벽을 분해할 수 있는 효소가 없어서 세포벽 내에 들어있는 곡물의 전분이나 단백질 이용 효율이 매우 떨어지는, 돼지나 닭 같은 단위동물(non-ruminant)의 사료에 첨가되어 세포벽의 주요 성분인 자일란을 당화함으로써 사료의 가치를 향상시킬 수 있다.
본 발명의 사료첨가제의 유효성분인 자일라나제가 첨가될 사료에 대해 0.01 내지 10 중량부로 구성되는 것이 바람직하며, 자일라나제가 0.05 내지 5 중량부로 구성되는 것이 더욱 바람직하며, 자일라나제가 0.12 중량부로 구성되는 것이 가장 바람직하다.
또한, 상기 사료첨가제는 추가적으로 단위동물에 허용되는 담체를 함유할 수 있다. 본 발명에 있어서는 상기 사료첨가제를 그대로 또는 공지의 담체, 안정제 등을 가할 수 있으며, 필요에 따라 비타민, 아미노산류, 미네랄 등의 각종 양분, 항산화제 및 기타의 첨가제 등을 가할 수도 있으며, 그 형상으로서는 분체, 과립, 펠릿, 현탁액 등의 적당한 상태일 수 있다. 본 발명의 사료첨가제를 공급하는 경우는 단위동물에 대하여 단독으로 또는 사료에 혼합하여 공급할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 사료첨가제를 유효성분으로 포함하는 자일란 당화도가 증가된 식물성 사료를 제공한다.
현재 자일라나제 효소시장을 점유하고 있는 용도는 크게 식품, 사료 및 기술로 분류할 수 있다(Bedford and Morgana, World's Poultry Science Journal 52:61-68, 1996). 식품(과일 및 야채생산, 양조 및 주류생산, 제빵 및 제과)시장에서는 재료의 연화 및 정제효율 개선, 점도감소, 추출 및 여과 효율증대 등을 통한 품질향상에 활용되고 있다. 사료시장에서는 돼지, 가금류, 반추동물 등의 사료의 비전분 탄수화물의 감소, 장내 점도개선, 단백질 및 전분의 소화흡수율 증대 등에 이용되고 있다(Kuhad and Singh, Crit. Rev. Biotechnol. 13, 151-172, 1993). 아울러 기술적으로는 제지공정에서 생물학적 백화공정, 염소소비의 감소, 기계적인 제지공정 단축을 통한 에너지 감소, 탈묵효과, 전분과 글루텐의 분리, 재생가능 연료(바이오에탄올) 및 화학원료생산 등에 활용되고 있다.
그러므로 본 발명의 신규 자일라나제는 용지 생산 및 폐지 재생, 사료 첨가 및 식품의 품질 향상 또는 산업상 사용하는 자일라나제의 분해에 유용하게 이용될 수 있으며 이는 당업자에게 자명하다. 상기 조성물들은 당업자에게 공지된 방법으로 제형화 되고 제제화될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 자일라나제, 본 발명의 형질전환체 또는 본 발명의 방법으로 생산된 자일라나제를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법을 제공한다.
상기 방법에 있어서, 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다.
아울러, 본 발명은 섬유소계 바이오매스 또는 자일란 함유액에 상기 자일라나제, 상기 방법으로 생산된 자일라나제 또는 상기 형질전환체를 가하는 단계를 포함하는 자일란 분해 방법을 제공한다.
본 발명의 자일란 분해 방법은 재생 가능 연료 또는 화학 원료의 생산 공정에 이용되는 것이 바람직하나 이에 제한되지 않는다. 상기 방법에 있어서, 상기 균주, 상기 형질전환체 또는 상기 균주 또는 상기 형질전환체가 생산하는 자일라나제의 첨가량은 당업자에 의해 조정될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 자일라나제의 클로닝
본 발명자들은 2008년 3월 12일자로 국제기탁기관인 한국생명공학연구원 내 유전자 은행에 기탁한 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주(수탁번호: KCTC 11302BP)의 게놈 DNA에서 GH6(glycoside hydrolase family 6) 계열의 자일라나제의 유전자서열을 기반으로 제작한 프라이머를 이용하여 자일라나제 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 증폭하여 클로닝하였다.
구체적으로, 상기 균주로부터 게놈 DNA를 분리한 다음, 상기 게놈 DNA를 주형으로 하여 10 × 완충액(MgCl2), 2.5 mM dNTPs, 5 × GCrich 완충액, FastStart Taq DNA 중합효소(Roche) 및, GH6-정방향 프라이머(서열번호:1)와 GH6-역방향 프라이머(서열번호: 2) 쌍을 이용하여 자일라나제 유전자에 대한 PCR을 수행하였다. 이때, PCR 조건은 95℃에서 5분, 95℃에서 30초간 변성, 50℃에서 30초간 어닐링, 72℃에서 40초간 신장의 조건으로 35회 반복한 다음, 72℃에서 7분 동안 최후신장을 수행하는 조건으로 수행하였다. 상기 PCR을 통해 수득한 342 bp의 자일라나제의 PCR 산물을 DNA Walking SpeedUp premix kit(Seegene, 한국)를 이용하여 게놈 워킹(Genome walking) 및 네스티드-PCR(nested-PCR)을 수행하여 전체 xy1K2 유전자에 대한 PCR 산물을 수득하였다. 상기 전체 xy1K2 유전자의 PCR 산물 및 pET-28a(+) 벡터(Novagen, 미국)를 NdeI 및 HindⅢ 제한효소로 각각 절단한 후 정제하였다. 상기 정제한 벡터 및 PCR 산물을 약 100 ng씩 사용하여, TaKaRa 사의 리가아제(ligase) 1 유닛(unit)을 첨가하여 16℃에서 16시간 반응시켰다. 라이게이션(ligation) 반응 후 BL21(Novagen)에 형질전환하여 카나마이신이 함유된 플레이트에서 선별한 후 적절한 제한효소로 절단하여 원하는 DNA 절편이 든 플라스미드를 확보하였으며 DNA 시퀀싱(sequencing)을 통해 최종적으로 클론을 확인하였다. 그런 다음, 상기 제조된 발현벡터를 'pET-xy1K2'로 명명하였고, Fn3 도메인과 CBM2 도메인을 결손시킨 발현벡터를 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머 쌍을 사용하는 것을 제외하고는 상기와 동일한 방법으로 클로닝을 수행하여 제조한 후, 'pET-xy1K2ΔFn3-CBM2'로 명명하였다. 또한, 상기의 자일라나제 유전자 서열은 유전자 은행에 그 서열을 등록하였다(GenBank accession number : HQ533142).
서열번호 1: 5`-CATATGGCCGAGCCACGCGTGAG-3`;
서열번호 2: 5`-AAGCTTTCAGGAGAGCTTCGGCGAGACG-3`;
서열번호 3: 5'-CATATGGCCACCGAGCCGCTCG-3'; 및
서열번호 4: 5'-AAGCTTTCAGGACCTCGGCGATCGC-3'.
< 실시예 2> 자일라나제의 정제
상기 <실시예 1>에서 제조한 pET-xy1K2 또는 pET-XylK2ΔFn3-CBM2 발현벡터를 대장균에서 과발현시킨 후 재조합 Xy1K2(rXylK2) 또는 재조합 XylK2ΔFn3-CBM2(rXylK2ΔFn3-CBM2)를 분리하였다.
구체적으로, 각 발현벡터를 형질전환시킨 대장균을 액체 LB 배지에 접종한 뒤, 37℃에서 흔들면서 배양하였다. 각각의 대장균 배양액의 OD600 값이 0.4 내지 0.5에 이르렀을 때 1.0 mM의 IPTG를 첨가한 뒤 30℃에서 5시간 더 흔들면서 배양시켰다. 상기 배양액을 원심분리하여 음파분쇄기로 세포를 분쇄한 뒤 관찰한 결과 rXylK2은 활성화 포함체(inclusion bodies)에서, rXylK2ΔFn3-CBM2는 불활성화 포함체에서 과발현되는 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 rXylK2를 과발현하는 대장균은 세포를 분쇄한 뒤 포함체를 가용화시켜 주었다. 가용화된 rXylK2 세포 분쇄물 또는 rXylK2ΔFn3-CBM2 세포 분쇄물을 HisTrap HP(GE Healthcare, 스웨덴)(5-ml) 컬럼을 이용하여 재접힘 및 정제한 후, 액체 크로마토그래피(LC) system(Amersham Pharmacia Biotech, 스웨덴)를 수행하였다. 공지의 방법인 HiLoad 26/60 Superdex 200 prep-grade(Amersham Biosciences, 스웨덴) 컬럼을 이용한 겔 투과 크로마토그래피를 수행하여 정제된 rXylK2 또는 rXylK2ΔFn3-CBM2 단백질의 전기영동 동질성을 확인하였다. 상기에서 정제한 rXylK2 또는 rXylK2ΔFn3-CBM2 단백질을 브래드포드 시약(Bio-Rad, 미국)을 이용하여 단백질을 정량한 후, 동결건조하여 -20℃에 보관하였다.
상기 효소활성은 DNS(Dinitrosalicylic acid) 정량법(Miller GL, Anal.Chem., 55:952-959, 1959)을 사용하였다.
구체적으로, 일정비율로 희석한 100 ㎕의 효소용액에 350 ㎕의 기질용액(1% 버치우드자일란) 및 50 ㎕ 0.5 M 인산완충용액(pH6.0)을 넣고 55℃에서 10분간 반응시킨 후 750 ㎕의 DNS(3,5-Dinitrosalicylic acid) 용액을 첨가한 다음 100℃에서 5분간 방치한 후 흡광도 540 ㎚에서 측정하였다. 효소의 1 유닛(unit)은 1분 동안에 1 μ㏖의 환원당을 방출시키는 효소양으로 정하였다.
< 실시예 3> 자일라나제의 특성분석
<3-1> 서열분석
본 발명자들은 NCBI 데이터베이스에서 단백질 블라스트 서베이(Protein blast survey)를 이용하여 본 발명의 아미노산 서열을 분석하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 자일라나제(XylK2)는 2304 bp의 ORF(open reading frame), 또는 767 개의 아미노산으로 이루어졌으며, GH6 효소 도메인과 같은 N-말단에 GH6 효소 계열의 카탈라이틱 도메인(catalytic domain), Fn3 도메인, C-말단에 CBM2 도메인을 갖는 다중 도메인 효소(multi-domain enzyme)인 것을 확인하였다. 또한, 본 발명의 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주 유래의 자일라나제 XylK2의 카탈라이틱 도메인(catalytic domain)의 아미노산 서열은 셀룰로모나스 플라비제나 (Cellulomonas flavigena DSM 20109) 유래의 베타-1,4-셀로바이오 하이드롤라제(β-1,4-cellobiohydrolase (ADG74793))와 70%, 자일라니모나스 셀룰로시라이티카(X. cellulosilytica DSM 15894) 유래의 베타-1,4-셀로바이오 하이드롤라제(β-1,4-cellobiohydrolase (ACZ30181))와 68%, 셀룰로모나스 피미(C. fimi ) 유래의 베타-1,4-엑소셀로바이오 하이드롤라제(β-1,4-exocellobiohydrolaseA(AAC36898))와 67% 상동성을 가지는 신규한 효소임을 확인하였다(도 1).
<3-2> 분자량 분석
상기의 <실시예 2>에서 순수 분리한 자일라나제의 분자량을 확인하기 위하여 10% 겔에서 SDS-PAGE를 수행한 결과, 본 발명의 자일라나제는 약 77 KDa 크기임을 확인하였다.
<3-3> 생화학적 특성
본 발명의 자일라나제(XylK2)의 최적 반응조건을 확인하기 위하여 버치우드 자일란(birchwood xylan)을 기질로 하여 반응 pH와 온도에 대한 영향을 확인하였다.
구체적으로, 효소활성 최적 pH는 50 mM 나트륨 시트레이트 완충용액(Sodium citrate buffer)(pH 3.5-5.5), 50 mM 나트륨 인산염 완충용액(pH 5.5-7.5), 50 mM Tris-HCl 완충용액(pH 7.5-9.0) 및 50 mM glycine-NaOH 완충용액(pH 9.0-10.5)을 사용하여 측정하였고, 효소활성 최적 온도는 30~70℃ 범위에서 5℃ 간격으로 효소활성을 측정하였다.
또한, 효소의 pH에 대한 안정성을 확인하기 위하여, 각각의 pH별로 조제된 완충용액에 4℃에서 10분 동안 전처리 한 후, 50mM 나트륨 인산염 완충용액(pH 6.0), 45℃의 조건하에서 효소의 활성을 확인하였다(2C). 온도에 대한 안정성은 50mM 나트륨 인산염 완충용액을 포함하는 효소액을 각각의 온도의 조건에서 1시간동안 방치한 다음, 45℃의 조건에서 효소의 활성을 확인하였다(2D).
그 결과, 도 2에 나타낸 바와 같이 본 발명의 자일라나제(XylK2)는 pH 6.0, 45℃에서 가장 높은 활성을 보였으며, pH 5.0~9.0 범위에서도 80% 이상의 활성을 보였다. 또한, 45℃에서 1시간 후에도 60% 이상의 활성을 유지하는 것을 확인하였다(도 2).
<3-4> 기질 특이성
본 발명의 자일라나제(XylK2)의 다양한 자일란 및 당 기질에 대한 분해능을 상기 <실시예 2>의 DNS 정량법을 이용하여 확인하였다. 이때 대조군으로서 버치우드 자일란(birchwood xylan)(1.0%) 또는 PNP(p-nitrophenyl)당 유도체(5 mM)를 50 mM 인산나트륨완충액(pH 6.0)에 희석한 효소 용액(0.05 ml)을 포함하는 표준 분석 혼합물(0.5 ml)을 45℃에서 10분 동안 효소 반응을 수행하여 비교하였다. 자일란 또는 PNP-당 유도체에 대한 자일라나제 활성의 1 유닛(unit)은 표준 분석 조건하에서 1분당 1 μmol의 환원당 또는 PNP를 생산하는데 필요한 효소의 양으로 정의되었다.
그 결과, 표 1에 나타낸 바와 같이, 평가된 자일란 물질 중 귀리 스펠트 자일란이 자일라나제(XylK2)에 의해 가장 효과적으로 가수분해되었고, 버치우드 자일란, 비치우드 자일란 순으로 가수분해 활성을 나타내었다. 또한, 본 발명의 자일라나제(XylK2)는 PNP-셀로비오사이드(PNP-cellobioside)에 대한 높은 활성(788.3 IU/mg)을 나타내었고, 특히, PNP-셀로비오사이드에 대한 분해활성은 기존에 보고된 자일라나제들의 분해활성보다 특이적으로 높은 것으로 확인되었다. 이는 GH6 셀로바이오 하이드롤라제와 자일라나제(XylK2)가 구조적으로 유사하다는 것을 의미한다(Denman et al., 1996). 또한, 본 발명의 자일라나제(XylK2)는 가용성 녹말 및 카르복시 메틸셀룰로오스(Carboxyl Methylcellulose)와 같은 다른 GH에 대한 활성은 나타내지 않는 것을 확인하였다(표 1).
기질(Substrate) 특이적 활성(Specific activity) (IU/mg)a
버치우드 자일란(Birchwood xylan) 100.0 ± 1.2
비치우드 자일란(Beechwood xylan) 90.8 ± 1.7
귀리 스펠트 자일란(Oat spelt xylan) 109.2 ± 2.3
가용성 녹말(Soluble starch) ND b
카르복시 메틸셀룰로오스
(Carboxyl Methylcellulose)		 ND
PNP-셀룰로비오사이드(PNP-cellobioside) 788.3 ± 9.8
PNP-글루코피라노사이드(PNP-glucopyranoside) ND
PNP-자일로피라노사이드(PNP-xylopyranoside) ND
PNP-만노피라노사이드(PNP-mannopyranoside) ND
<3-5> 자일란 분해산물의 특성
상기 <실시예 2>와 동일한 방법으로, 버치우드 자일란(birchwood xylan, BX), 자일로바이오스(xylobiose, X2), 자일로트리오스(xylotriose, X3) 및 자일로데트라오스(xylotetraose, X4)를 기질로 하여 반응 혼합물을 100℃에서 5분간 가열하여 효소 반응을 정지시킨 다음, 가수분해 산물을 용출용액 A(0.05% 포말산/멸균수) 용출용액 B(0.05% 포말산/멸균수: 아세토니트릴/메탄올 = 6:4)의 이동상의 조건하에 Asahipak NH2P-50 2D 컬럼(5㎛, 2.0×150㎜, Shodex)을 이용한 고성능 액상 크로마토그래피(High performance liquid chromatography, HPLC) 분석법을 수행하여 측정하였다(Kim DY et al., 2011).
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이 버치우드 자일란에 대한 가수분해 산물은 X2(59.2%)와 X3(40.8%), 자일로트리오스에 대한 가수분해 산물은 X2(33.6%)와 X3(66.4%), 자일로데트라오스에 대한 가수분해 산물은 X2(21.5%), X3(45.3%) 및 X4(33.2%)로 분해하였다. 이때, 자일로바이오스의 이동상의 시간은 3.8분, 자일로트리오스는 4.7분 및 자일로데트라오스는 5.7분인 것을 확인하였다(도 3).
<3-6> 자일라나제 ( XylK2 ) 활성에 대한 당의 효과
단당류인 글루코오스(D-glucose)와 자일로오스(D-xylose), 이당류인 셀로바이오스(cellobiose)와 자일로바이오스(xylobiose)를 각각의 농도(0, 50, 또는 500mL)로 함유하는 0.2% (w/v) 아조-자일란(azo-xylan)을 기질로 하여 효소 활성을 상기<실시예 3>에서 확인한 최적 반응 조건에서 효소활성을 확인하였다.
구체적으로, 효소의 활성은 0.2% 아조-자일란(azo-xylan)을 함유하는 50mM 나트륨 인산 완충용액(pH 6.0)에 효소를 첨가하여 45℃에서 1시간동안 반응하고, 반응액에 2배량(v/v)의 에탄올(ethanol)을 첨가하여 반응을 정지지키고, 13,000rpm에서 5분 동안 원심분리하여 상등액을 590 nm의 파장에서 흡광도를 측정하였다.
그 결과, 도 4에 나타난 바와 같이 자일라나제(XylK2)는 기존에 보고된 다른 자일라나제들과는 달리 자일란의 최종가수분해 산물인 자일로바이오스에 의한 효소활성저해를 전혀 받지 않았으며, 오히려 50 mM 자일로바이오스가 존재할 때 약 2배 이상 효소활성이 증가되는 매우 독특한 특성을 보였다. 또한, 본 효소는 500 mM 자일로오스, 글루코스, 및 셀로비오스에 의해서도 자일란 가수분해활성이 약 130% 이상 증가하는 것을 확인하였다(도 4).
본 발명의 셀룰로시마이크로비움 속(Cellulosimicrobium sp.) HY-13 균주에서 분리된 GH6(glycoside hydrolase family 6) 효소와 상동성을 가지는 신규한 자일라나제는 기존의 식품산업과 펄프공정 등에 유용하게 이용될 수 있으며, 비교적 이용하기 쉬운 1세대 바이오에탄올에서 헤미셀룰로오스를 이용하는 2세대 바이오에탄올 공정에 꼭 필요한 것으로, 공정의 효율과 생산성에 도움을 줄 수 있을 것이다. 또한, 곡물가격 급등으로 전세계에서 곡물 부산물을 사료용 원료로 이용하기 위하여 자일라나제와 같은 효소를 필요로 하고 있다. 이에, 본 발명의 자일라나제는 식품산업용 효소, 사료용 효소, 바이오매스 전처리 효소, 펄프 공정용 등의 다양한 산업군에 유용한 효소이다.
한국생명공학연구원 KCTC11302BP 20080312
<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel xylanase containing a novel catalytic domain produced from Cellulosimicrobium sp. strain HY-13 <130> 11p-12-37 <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH6-forward primer <400> 1 catatggccg agccacgcgt gag 23 <210> 2 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GH6-reverse primer <400> 2 aagctttcag gagagcttcg gcgagacg 28 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer <400> 3 catatggcca ccgagccgct cg 22 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer <400> 4 aagctttcag gacctcggcg atcgc 25 <210> 5 <211> 767 <212> PRT <213> Cellulosimicrobium sp. HY-13 <400> 5 Met Pro Ser Arg Ser Ser Arg Pro Arg Arg Gly Ala Ala Val Ala Ala 1 5 10 15 Ser Leu Ala Leu Leu Ala Ala Pro Leu Val Ala Thr Ala Ala Pro Ala 20 25 30 Asn Ala Ala Glu Pro Arg Val Ser Asn Pro Phe Ala Gly Ala Thr Gln 35 40 45 Tyr Val Asn Asp Phe Trp Ser Ala Asn Val Glu Ala Ala Ala Asp Arg 50 55 60 Ala Gly Gly Asp Leu Gly Ser Arg Met Arg Ala Ile Ala Asp Glu Pro 65 70 75 80 Thr Ala Val Trp Met Asp Arg Ile Ser Ala Ile Glu Gly Asn Ala Asp 85 90 95 Gly Pro Gly Leu Arg His His Leu Asp Ala Ala Ile Glu Gln Lys Gln 100 105 110 Pro Gly Val Pro Met Phe Phe Asn Leu Val Ile Tyr Asp Leu Pro Gly 115 120 125 Arg Asp Cys Tyr Ala Leu Ala Ser Asn Gly Glu Leu Lys Pro Asn Ala 130 135 140 Thr Asp Met Ala Arg Tyr Lys Thr Glu Tyr Ile Asp Val Ile Ala Asp 145 150 155 160 Ile Leu Asp Asp Pro Ala Tyr Glu Asp Leu Arg Val Val Ala Thr Ile 165 170 175 Glu Pro Asp Ser Leu Pro Asn Leu Val Thr Asn Ile Ser Thr Pro Asp 180 185 190 Cys Gln Ala Ser Ala Pro Tyr Tyr Arg Glu Gly Val Ala Tyr Ala Leu 195 200 205 Asp Ala Leu His Ala Val Gly Asn Val Tyr Ser Tyr Ile Asp Ala Ala 210 215 220 His Ala Gly Trp Leu Gly Trp Pro Ser Asn Gly Gly Pro Ala Ala Lys 225 230 235 240 Leu Phe Lys Glu Val Val Leu Ser Thr Glu Ala Gly Tyr Ala Ser Val 245 250 255 Ala Gly Phe Val Thr Asn Thr Ala Asn Ser Thr Pro Leu His Glu Pro 260 265 270 Phe Leu Glu Asp Val Gln Leu Gly Ser Thr Pro Val Arg Ser Ala Ser 275 280 285 Phe Tyr Glu Trp Asn Ala Asp Phe Asp Glu Ala Asp Trp Thr Ala His 290 295 300 Leu Tyr Asp Leu Leu Val Ala Glu Gly Phe Pro Thr Ser Ile Gly Met 305 310 315 320 Leu Ile Asp Thr Ser Arg Asn Gly Trp Gly Gly Ala Asp Arg Pro Thr 325 330 335 Ala Val Ser Thr Ser Thr Asn Leu Asn Thr Tyr Val Asp Glu Ser Arg 340 345 350 Val Asp Arg Arg Ile His Arg Gly Ala Trp Cys Asn Pro Ala Gly Ala 355 360 365 Gly Ile Gly Glu Arg Pro Gln Ala Ser Pro Ala Gly Phe Pro Glu Ser 370 375 380 His Leu His Ala Tyr Val Trp Val Lys Pro Pro Gly Glu Ser Asp Gly 385 390 395 400 Ala Ser Ser Asp Ile Pro Asn Asp Gln Gly Lys Arg Phe Asp Arg Met 405 410 415 Cys Asp Pro Thr Phe Val Ser Pro Lys Leu Ser Asn Gln Leu Thr Gly 420 425 430 Ala Leu Pro Asp Ala Pro Leu Ala Gly Gln Trp Phe Glu Ser Gln Phe 435 440 445 Arg Met Leu Val Glu Asn Ala Tyr Pro Ala Ile Glu Gly Asp Gly Thr 450 455 460 Gly Gly Pro Ala Asp Thr Thr Ala Pro Ser Val Pro Thr Gly Leu Thr 465 470 475 480 Ala Gly Ala Thr Thr Thr Thr Ser Ala Ser Val Ser Trp Thr Ala Ser 485 490 495 Thr Asp Asp Arg Gly Val Thr Gly Tyr Thr Val Leu Val Asp Gly Ala 500 505 510 Ala Val Gly Thr Thr Ser Thr Thr Ser Phe Thr Val Thr Gly Leu Glu 515 520 525 Ala Gly Thr Ser Tyr Ala Val Thr Val Arg Ala Arg Asp Ala Ala Gly 530 535 540 Asn Val Ser Ala Ala Ser Ala Pro Leu Thr Val Thr Thr Asp Glu Asp 545 550 555 560 Asp Gly Ser Gly Gly Asp Asp Gln Pro Pro Ser Ala Pro Thr Gly Leu 565 570 575 Arg Val Thr Gly Thr Thr Thr Ser Thr Val Ala Leu Ala Trp Asn Ala 580 585 590 Ser Thr Asp Asp Thr Gly Val Thr Gly Tyr Arg Val Phe Arg Asp Gly 595 600 605 Thr Gln Val Ala Glu Ile Ser Ala Thr Ser Phe Thr Asp Thr Gly Leu 610 615 620 Ala Ala Gly Thr Ala His Val Tyr Ala Val Arg Ala Val Asp Ala Ala 625 630 635 640 Gly Asn Leu Ser Ala Thr Ser Gly Thr Val Thr Gly Glu Thr Asp Glu 645 650 655 Asp Gly Gly Gln Pro Ala Gly Ala Cys Thr Val Val Tyr Ser Ala Ser 660 665 670 Ser Trp Asn Thr Gly Phe Thr Gly Ser Ile Arg Leu Thr Asn Asp Ser 675 680 685 Ala Gln Ala Leu Gln Ser Trp Thr Leu Thr Phe Asp Phe Pro Asp Gly 690 695 700 Gln Ser Ile Thr Gln Gly Trp Ser Ala Gln Tyr Ala Gln Thr Gly Ser 705 710 715 720 Thr Val Thr Val Thr Pro Ala Ala Trp Asn Thr Thr Leu Gly Ala Gly 725 730 735 Ala Ser Val Glu Ile Gly Phe Asn Gly Ser His Ser Gly Thr Asn Asp 740 745 750 Glu Pro Thr Ala Phe Thr Leu Asn Gly Ala Ser Cys Thr Val Gly 755 760 765 <210> 6 <211> 2304 <212> DNA <213> Cellulosimicrobium sp. HY-13 <400> 6 gtgccatccc gatccagccg accgcgcagg ggcgcggccg tcgccgcgtc gctcgcgctg 60 ctcgccgccc cgctggtcgc gaccgccgcg ccggcgaacg ccgccgagcc acgcgtgagc 120 aacccgttcg ccggtgccac gcagtacgtc aacgacttct ggtccgccaa cgtcgaggcc 180 gccgccgacc gcgccggtgg ggacctcggg tcccgcatgc gggcgatcgc cgacgagccc 240 accgcggtct ggatggaccg catcagcgcg atcgagggca acgccgacgg cccgggcctg 300 cggcaccacc tcgacgccgc gatcgagcag aagcagcccg gcgtgccgat gttcttcaac 360 ctcgtgatct acgacctgcc cggtcgcgac tgctacgcgc tcgcgtccaa cggcgagctc 420 aagccgaacg ccacggacat ggcgcggtac aagaccgagt acatcgacgt catcgccgac 480 atcctcgacg acccggccta cgaggacctg cgcgtcgtcg cgacgatcga gccggactcg 540 ctgccgaacc tcgtcaccaa catcagcacg cccgactgcc aggcgtccgc gccgtactac 600 cgcgagggcg tggcgtacgc gctggacgct ctccacgccg tcggcaacgt ctactcctac 660 atcgacgcgg cgcacgccgg ctggctcggc tggccgagca acgggggccc ggcggcgaag 720 ctcttcaagg aggtcgtgct gtcgacggag gcgggctacg cgtcggtcgc gggcttcgtc 780 acgaacacgg ccaactccac gccgctgcac gagccgttcc tcgaggacgt ccagctcggc 840 agcacgcccg tgcgctcggc gagcttctac gagtggaacg ccgacttcga cgaggccgac 900 tggaccgcgc acctctacga cctgctcgtg gcggagggct tcccgacgtc gatcggcatg 960 ctcatcgaca cctcgcgcaa cggctggggc ggcgccgacc gcccgacggc ggtgagcacg 1020 tcgacgaacc tcaacaccta cgtggacgag tcgcgcgtcg accggcggat ccaccgtggc 1080 gcctggtgca acccggccgg cgccgggatc ggcgagcgcc cgcaggcctc gcccgcgggc 1140 ttccccgagt cgcacctgca cgcgtacgtg tgggtcaagc ctccgggcga gtccgacggc 1200 gcgtcgtccg acatcccgaa cgaccagggc aagcggttcg accgcatgtg cgacccgacg 1260 ttcgtctcgc cgaagctctc caaccagctc accggcgccc tgcccgacgc cccgctcgcg 1320 ggccagtggt tcgagtccca gttccggatg ctcgtcgaga acgcctaccc ggccatcgag 1380 ggcgacggga ccggcggccc tgcggacacc accgcgccgt cggtgccgac gggcctcacg 1440 gcgggcgcga ccacgaccac gtcggcgagc gtgagctgga ccgcgtccac cgacgaccgt 1500 ggcgtcacgg gatacaccgt gctcgtcgac ggcgcggccg tgggcacgac ctccacgacc 1560 tcgttcaccg tcaccgggct cgaggcgggc acgtcctacg ccgtgacggt ccgggcgcgc 1620 gacgccgcgg gcaacgtctc cgccgcgtcc gcgccgctca ccgtgaccac ggacgaggac 1680 gacggctcgg gcggtgacga ccagccgccg tccgccccga ccgggctgcg ggtcaccggc 1740 accacgacgt ccacggtcgc gctcgcgtgg aacgcgtcca cggacgacac cggcgtgacc 1800 ggctaccgcg tgttccgcga cgggacccag gtcgccgaga tctcggcgac gtcgttcacc 1860 gacaccggcc tcgccgcggg cacggcgcac gtctacgcgg tgcgcgcggt cgacgcggcg 1920 ggcaacctct cggccacgtc cggcaccgtg accggcgaga cggacgagga cggcggccag 1980 cccgccgggg cctgcaccgt cgtctactcg gcgagctcct ggaacacggg cttcaccggc 2040 tcgatccggc tcacgaacga ctcggcccag gcgctgcaga gctggaccct gaccttcgac 2100 ttcccggacg gtcagagcat cacccagggc tggtccgcgc agtacgcgca gaccggctcg 2160 acggtgaccg tgaccccggc ggcgtggaac accacgctgg gcgcgggcgc gagcgtcgag 2220 atcggcttca acggctccca ctcggggacc aacgacgagc cgacggcctt cacgctgaac 2280 ggcgcgtcct gcaccgtcgg ctga 2304

Claims (12)

  1. 서열번호 5로 기재되는 아미노산 서열을 가지며, 분자량이 76 kDa이고, pH 5 내지 pH 6.5 및 온도 35 내지 50℃인 조건에서 최대 활성을 가지며, 자일로바이오스에 의해 효소활성이 증대되는 자일라나제.
  2. 제 1항에 있어서, 최대 활성 조건이 pH 6 및 온도 30 내지 45℃인 것을 특징으로 하는 자일라나제.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 자일라나제는 수탁번호 KCTC 11302BP로 기탁된 셀룰로시마이크로비움 속 HY-13(Cellulosimicrobium sp. HY-13) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 자일라나제.
  4. 1) 제 1항의 자일라나제를 암호화하는 서열번호 6으로 기재되는 염기서열을 가지는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 발현벡터를 숙주세포에 도입한 형질전환체를 배양한 후 원심분리하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
    2) 상기 단계 1)에서 수득된 조효소액에서 자일라나제를 정제하는 단계를 포함하는 자일라나제 생산 방법.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 숙주세포는 원핵세포는 대장균이고, 진핵세포는 효모, 동물세포 및 곤충세포로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 자일라나제 생산 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 단계 2)는
    1) 제 4항의 형질전환체의 배양액을 원심분리하여 수득한 상층액에 침전제를 가하여 수용성 단백질 침전을 유도하는 단계;
    2) 상기 단계 1)의 침전물에서 불용성 침전물을 제거한 후 투석하여 조효소액을 수득하는 단계; 및,
    3) 상기 단계 2)의 조효소액을 컬럼 크로마토그래피로 정제하는 단계를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 자일라나제 생산방법.
  7. 제 1항의 자일라나제를 포함하는 제지공정용 조성물.
  8. 제 7항에 있어서, 상기 자일라나제는 pH 6 및 온도 35 내지 45℃에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 제지공정용 조성물.
  9. 제 1항의 자일라나제를 유효성분으로 포함하는 사료첨가제.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 자일라나제는 pH 6 및 온도 35 내지 45℃에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 사료첨가제.
  11. 동물의 사료 재료에 제 1항의 자일라나제를 가하는 단계를 포함하는 사료 제조 방법.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 자일라나제는 pH 6 및 온도 35 내지 45℃에서 최대 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 사료 제조 방법.


KR1020110146600A 2011-12-30 2011-12-30 셀룰로시마이크로비움 속 ｈｙ－１３ 균주로부터 생산되는 신규한 활성 도메인을 갖는 자일라나제 KR20130077929A (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN116656650A (zh) * 2023-07-31 2023-08-29 云南师范大学 一种基于魔芋白绢病bj-y1菌株获得复合型糖苷水解酶的方法

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