KR20100034358A - 불용성 베타-1,3-글루칸을 분해하는 신규한 베타-글루카네이즈 및 그의 생산방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신규한 베타-글루카네이즈에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 베타-글루카네이즈 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 베타-글루카네이즈 단백질, 상기 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질 전환 균주 및 상기 균주로부터 베타-글루카네이즈를 생산하는 방법에 관한 것이다.

베타-1,3-글루칸, 베타-글루카네이즈

Description

불용성 베타-1,3-글루칸을 분해하는 신규한 베타-글루카네이즈 및 그의 생산방법{NOVEL BETA-GLUCANASE DIGESTING INSOLUBLE BETA-1,3-GLUCAN AND METHOD THEREOF}

본 발명은 신규한 베타-글루카네이즈에 관한 것으로, 보다 상세하게는 신규한 베타-글루카네이즈 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 유전자에 의해 코딩되는 베타-글루카네이즈 단백질, 상기 유전자의 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터, 상기 벡터를 포함하는 형질 전환 균주 및 상기 균주로부터 베타-글루카네이즈를 생산하는 방법에 관한 것이다.

베타 글루칸(β-glucan)은 베이커의 이스트, 귀리 및 보리 섬유, 및 많은 약용 버섯의 세포벽으로부터 유도된 섬유형 복합 다당체(polysaccharide)로, 이러한 베타-글루칸의 두 가지 주요한 용도는 면역계를 고양하고 혈액의 콜레스테롤 수준을 낮추는 것으로 알려져 있다. 베타 글루칸은 구미에서 이미 50여 년 전부터 상기와 같은 면역계 고양과 관련하여, 항산화효과 및 항암기능, 피부보호제 등 매우 다양한 생리활성을 보이는 것으로 알려져 있으며, 광범위하게 사용되어 오고 있 다(Industrial Gums and Their Derivatives, R.L. Whistler, J.N. BeMiller(Eds.), Academic Press, San Die해, New York, Boston (1993), p.537). 포도당의 고분자인 베타 글루칸은 효모의 세포벽에 가장 많이 존재하는 고분자로서 효모 세포벽의 구조를 강화시켜 효모의 구조를 지탱하는 역할을 한다. 글루칸으로 이루어진 세포벽은 불용성(insoluble)으로서, 일반적으로 β(1→3) 또는 β(1→6) 결합으로 이루어져 있다.

베타-글루카네이즈(β-glucanase)는 베타글루칸(β-glucan)을 분해하는 효소로서 베타글루칸은 포도당이 베타-1,3 결합으로 중합된 다당을 총칭하는데 버섯류, 곡류, 효모의 세포벽에 존재하며 세포외 다당으로 생산되는 미생물 유래의 베타글루칸이 있다 (Zekovic D.B. 등, Crit. Rev. Biotechnol. 25:205-230, 2007). 베타글루칸은 중합체를 구성하고 있는 결합의 종류에 따라 베타-1,3-글루칸, 베타-1,3-1,4-글루칸, 베타-1,3-1,6-글루칸으로 나누어지며, 이와 같이 중합체를 구성하는 결합과 베타글루칸 유래가 상이함으로 인하여 약리적인 특성의 차이가 발생하는데, 보리와 귀리에 주로 존재하는 베타-1,3-1,4-글루칸은 혈당강하와 콜레스테롤 저하의 효과를 나타내며 미생물, 효모와 버섯에 존재하는 베타-1,3-글루칸과 베타-1,3-1,6-글루칸은 생물학적 면역반응의 증대에 효과를 보이고 있다. 하지만 대부분의 베타글루칸은 구조적인 특징으로 인하여 물에 녹지 않는 불수용성의 특징을 보이고 있어 다양한 약리 효능을 내포하고 있음에도 불구하고 제품으로서의 사용에 제약을 받고 있다.

물에 불용성인 베타글루칸을 수용성 다당으로 생산하는 방법으로는 크게 화학적 분해법과 효소 분해법이 있다. 화학적 분해법은 강산을 사용하여 분해하는 방법으로 분해공정이 간단한 장점이 있지만 동일한 반응산물을 얻기가 어려우며 분리정제에 따른 환경오염 등의 문제를 내포하고 있다. 효소 분해법은 효소의 반응특성에 따라 중합도가 조절된 특정 올리고머를 생산할 수 있는 이점이 있고, 환경 오염물질 배출의 문제가 없다. 하지만 효소분해법은 활성이 우수한 효소를 개발하여야 하고, 최적의 생산물을 얻기 위하여 효소의 최적 반응 조건을 탐색해야한다.

이에 본 발명자들은 불용성 베타-1,3-글루칸을 효과적으로 분해하는 베타-글루카네이즈를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 셀룰로모나스 속(Cellulomonas sp.) 균주에서 활성이 우수한 베타-글루카네이즈를 생산하는 균주를 선별하여 이들로부터 베타-글루카네이즈 단백질을 코딩하는 유전자를 클로닝하고, 이러한 유전자를 대장균 및 효모에 형질전환시켜 베타-글루카네이즈를 생산하였으며, 이러한 베타-글루카네이즈를 이용하여 수용성 베타글루칸을 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 신규한 베타-글루카네이즈 및 이의 아미노산 서열을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-글루카네이즈를 코드하는 핵산 분자를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 베타-글루카네이즈 핵산 분자를 포함하는 벡터를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 형질전환체로부터 베타-글루카네이즈를 생산하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기 생산 방법으로 수득된 베타-글루카네이즈를 이용하여 수용성 베타-글루칸을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 베타-글루카네이즈 효소 활성을 가질 것으로 예상되는 균주를 아닐린 블루(Aniline blue)를 포함하는 한천배지에 도말하는 단계를 포함하는 베타-글루카네이즈 활성을 갖는 균주의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

하나의 양태로서, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지며, 베타-글루카네이즈(β-glucanase) 효소 활성을 갖는 단백질에 관한 것이다.

본 발명에서 "베타-글루카네이즈(β-glucanase)"는 베타글루칸(β-glucan)을 분해하는 효소를 의미하는 것으로, 특히 다당류의 일종인 β-1,3-글루칸을 가수분해하는 활성을 가지는 단백질을 말한다.

또한, 본 발명의 베타-글루카네이즈(β-glucanase) 효소 활성을 갖는 단백질은 셀룰로모나스 속(Cellulomonas sp.) 균주로부터 유래된 것이다.

본 발명의 베타-글루카네이즈(β-glucanase) 단백질은 야생형뿐만 아니라 90% 이상의 아미노산 상동성을 가지고 효소 활성을 가지는 기능적 상동체를 포함할 수 있다.

본 발명에서 용어 “상동성”이란 야생형(wild type) 단백질의 아미노산 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 베타-글루카네이즈 단백질은 서열번호 1의 서열로 정의되는 야생형 아미노산 서열과 70% 이상, 바람직하게는 90% 이상, 더욱 바람직하게는 95% 이상 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

본 기술 분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 90% 이상의 상동성 이 유지되고 본 발명에서 효소 활성을 보유하는 한 균등한 단백질임을 쉽게 이해할 것이다.

본 발명의 베타-글루카네이즈 단백질은 효소 활성을 보유하는 한 이들의 아미노산 서열 변이체를 포함할 수 있다. 여기서 변이체란 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다.

이러한 변이체는 야생형과 실질적으로 동등한 활성을 갖는 기능적 상동체 또는 물리 화학적 성질을 증가 또는 감소시키는 변형을 가지는 단백질을 포함한다. 바람직하게는 단백질의 물리 화학적 성질이 변형된 변이체이다. 예를 들어, 온도, 수분, pH, 전해질, 환원당, 가압, 건조, 동결, 계면장력, 광선, 동결과 해동의 반복, 고농도 조건 등의 물리적 요인과 산, 알카리, 중성염, 유기용매, 금속이온, 산화환원제, 프로티아제 등의 화학적 요인의 외부 환경에 대한 구조적 안정성이 증대된 변이체이다. 또한 아미노산 서열상의 변이로 효소 활성이 증대된 변이체일 수 있다.

본 발명의 베타-글루카네이즈 효소 활성을 갖는 단백질은 베타글루칸의 분해능을 높일 수 있는 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan) 결합 도메인(binding domain)을 포함하며, 이러한 베타-1,3-글루칸 결합 도메인은 단백질의 C-말단 쪽에 위치하며, 135 내지 145개 아미노산으로 구성될 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 베타-글루카네이즈 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

본 발명의 베타-글루카네이즈 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 바람직하게는 서열번호 2로 기재되는 핵산 서열을 가질 수 있으며, 이와 90% 이상의 상동성을 갖는 핵산 서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 이들과 기능적으로 동일한 작용을 수행하는 이의 작용성 등가물을 포함하는데, 상기 작용성 등가물은 인위적인 변형에 의해 뉴클레오타이드의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution), 삽입(insertion) 또는 이들의 조합(combination)에 의해 변형된 변이체(variants) 또는 동일한 작용을 수행하는 상기 핵산 분자의 작용성 단편(fragments)을 포함할 수 있다.

본 기술분야의 당업자라면 이러한 인위적인 변형에 의해 70% 이상 상동성이 유지되는 염기서열이 본 발명에서 목적하는 유전자 발현을 위한 베타-글루카네이즈 효소 활성을 보유하는 한, 본 발명의 핵산 분자와 균등물로서 본 발명의 권리 범위에 속함을 쉽게 이해할 수 있을 것이다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 베타-글루카네이즈 핵산 분자를 포함하는 벡터에 관한 것이다.

본 발명의 베타-글루카네이즈 효소 활성을 갖는 단백질을 코딩하는 핵산 분자는 이를 발현하는 벡터에 의해 제공되어 단백질로 발현될 수 있다.

본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 염기서열을 함유하는 DNA 제조물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트, 분비시그널 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대 플라스미드, 코즈미드, 파지 입자, 바이러스 벡터 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있으며, 바람직하게는 대장균용 발현벡터 pBluescript KSⅡ(+) 또는 효모 발현벡터 YEG α-HIR525를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 벡터는 적당한 숙주 내로 형질전환된 후, 숙주 게놈과 무관하게 복제되거나 기능할 수 있으며, 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

또한, 본 발명의 벡터는 효모에서 발현되는 벡터일 수 있는데, 이때 상기 효모발현 벡터는 핵산분자를 전사시키기 위한 프로모터 및 생성된 단백질을 세포 외로 분비시키기 위한 분비시그널 유전자를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 상기 효모발현 벡터에 포함될 수 있는 프로모터는 GAL10, GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1, SED1, MOX, TEF 및 TPI 등이 가능하며, 바람직하게는 GAL10 프로모터이지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 상기 효모발현 벡터에 포함될 수 있는 분비시그널 유전자는 MFα, PHO5, SUC2, AMY, SED 및 킬러톡신(Killer Toxin, KT) 등이 가능하며, 바람직하게는 MFα 유전자이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 벡터는 선별 마커(selection market)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환된 세포를 선별, 즉, 목적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 것이다. 본 발명의 형질전환체는 벡터를 프로모터가 작용할 수 있는 양태로 숙주세포 내에 도입시키는 것에 의해 구축될 수 있다.

본 발명에서 용어 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.

발현벡터로 형질전환되는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 본 발명에서 이용될 수 있는 숙주세포로는 효모, 진균, 세균 또는 조류가 가능하며, 예를 들면, 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus), 아스페르길러스(Aspergillus), 파라코커스 (Paracoccus), 플라보박테리움(Flavobacterium), 아그로박테리움 (Agrobacterium), 알칼리제네스 (Alcaligenes), 에르위니아 (Erwinia), 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa ) 등이 있다. 바람직하게는 대장균(Escherichia coli ) 또는 효모이며, 더욱 바람직하게는 효모 균주의 일종인 사카로마이세스 세레비지애를 이용할 수 있으며, 가장 바람직하게는 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 또는 갈락토오즈가 없는 배지에서도 성장이 가능한 변이주 사카로마이세스 세레비지애 Y2805Δgal80이지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명에서는 셀룰로모나스 속으로부터 유래한 신규한 베타-글루카네이즈 핵산 분자를 포함하는 효모발현벡터를 사카로마이세스 세레비지애 Y2805에 형질전환시켜 이를 사카로마이세스 세레비지애 Y2805/pGal-Mfa opt-Glu7 이라 명명하고, 2008년 9월 3일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구, 과학로 111, 한국생명공학연구원 생물자원센터)에 수탁번호 KCTC 11384BP로 기탁하였다.

또한, 본 발명의 베타-글루카네이즈 핵산 분자를 포함하는 효모발현벡터를 사카로마이세스 세레비지애 Y2805Δgal80에 형질전환시켜 이를 사카로마이세스 세레비지애 Y2805Δgal80/pGal-Mfa opt-Glu7 이라 명명하고, 2008년 9월 3일자로 KCTC(Korean Collection for Type Cultures, 한국 대전광역시 유성구, 과학로 111, 한국생명공학연구원 생물자원센터)에 수탁번호 KCTC 11385BP로 기탁하였다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계 및 배양물로부터 베타-글루카네이즈를 회수하는 단계를 포함하는 베타-글루카네이즈의 생산 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 형질전환체의 배양은 널리 공지된 방법에 따라서 수행될 수 있고, 배양 온도, 배양 시간 및 배지의 pH 등의 조건은 적절하게 조절될 수 있다. 이들 공지된 배양 방법은 문헌[Chmiel; Bioprozesstechnik 1. Einfuhrung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991), 및 Storhas; Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Braunschweig / Wiesbaden, 1994)]에 상세히 기술되어 있다. 또한, 배양 방법에는 회분식 배양(batch culture), 연속식 배양(cintinuous culture) 및 유가식 배양(fed-batch culture)이 포함되며, 바람직하게는 배치 공정 또는 주입 배치 또는 반복 주입 배치 공정 (fed batch or repeated fed batch process)에서 연속식으로 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

사용되는 배양 배지는 특정한 균주의 요구 조건을 적절하게 충족시켜야 한다. 다양한 미생물에 대한 배양 배지는 공지되어 있다(예를 들면, "Manual of Methods for General Bacteriology" from American Society for Bacteriology (Washington D.C., USA, 1981)). 배지 내 탄소 공급원은 당 및 탄수화물(예: 글루코오스, 슈크로오스, 락토오스, 프럭토오스, 말토오스, 몰라세, 전분 및 셀룰로오스), 유지 및 지방(예: 대두유, 해바라기씨유, 땅콩유 및 코코넛유), 지방산(예: 팔미트산, 스테아르산 및 리놀레산), 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올) 및 유기산(예: 아세트산) 등을 이용할 수 있다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 질소 공급원은 질소-함유 유기 화합물(예: 펩톤, 효모 추출액, 육즙, 맥아 추출액, 옥수수 침지액, 대두 박분 및 우레아), 또는 무기 화합물(예: 황산암모늄, 염화암모늄, 인산암모늄, 탄산암모늄 및 질산암모늄)을 이용할 수 있으며, 이들 물질 또한 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 인 공급원으로서 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨 함유 염을 이용할 수 있다. 또한, 배양 배지는 성장에 필수적인 금속염(예: 황산마그네슘 또는 황산철)을 함유할 수 있으며, 최종적으로, 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장-촉진 물질을 상기 언급한 물질 외에 사용할 수 있다. 적합한 전구체를 상기 배양 배지에 추가로 가할 수 있다. 상기 공급 물질은 배양물에 한번에 모두 가하거나, 배양중 적절하게 공급할 수 있다.

배양물의 pH는 염기성 화합물(예: 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아) 또는 산성 화합물(예: 인산 또는 황산)을 적절히 사용하여 조절할 수 있다. 발포는 지방산 폴리글리콜 에스테르와 같은 거포제를 사용하여 조절할 수 있다. 산소 또는 산소-함유 가스 혼합물, 예를 들어 공기를 배양물 중으로 도입시켜 호기성 조건을 유지시킬 수 있다. 배양 온도는 통상적으로 20 내지 45℃, 바람직하게는 25 내지 40℃이며, 가장 바람직하게는 30℃이다. 배양은 원하는 베타-글루카네이즈 생성량이 최대로 얻어질 때까지 계속할 수 있다.

본 발명의 상기 배양에 의해 생성된 배양물 내의 베타-글루카네이즈 회수는 원심분리, 여과 등 당 분야의 통상의 방법으로 회수할 수 있다. 또한, 상기 방법으로 회수된 베타-글루카네이즈 단백질은 당 분야 통상의 방식으로 정제될 수 있으 며, 예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합으로 적용시켜 본 발명의 단백질을 정제할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 생산 방법으로 수득된 베타-글루카네이즈를 이용하여 수용성 베타-글루칸을 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명에서 "수용성 베타글루칸"은 불수용성 베타-글루칸이 베타-글루카네이즈에 의해 가수분해되어 수용성으로 전환된 형태를 의미하는 것으로, 본 발명의 생산방법으로 수득된 상기 베타-글루카네이즈 단백질을 통상적 형태인 불수용성 베타글루칸에 처리함으로써 수용성 베타-글루칸을 제조할 수 있다.

또 다른 양태로서, 본 발명은 베타-글루카네이즈 효소 활성을 가질 것으로 예상되는 균주를 아닐린 블루(Aniline blue)를 포함하는 한천배지에 도말하는 단계를 포함하는 베타-글루카네이즈 활성을 갖는 균주의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

아닐린 블루 염색약은 베타-1,3-글루칸과 특이적인 결합을 하는 지시약으로 베타-1,3-글루칸과 결합을 하면 푸른색을 띄는 것을 특징으로 하며, 이러한 결합이 끊어지면 발색이 저하되게 된다. 그러므로, 아닐린 블루 염색약을 배지에 포함시키고, 기질로서 베타 글루칸을 포함시켜 푸른색을 띠는 한천배지를 제조하여 베타-글루카네이즈 활성을 갖는 균주를 스크리닝하는데 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 베타-글루카네이즈는 불수용성 베타글루칸에 대해 뛰어난 가수분해 활성을 나타내므로, 수용성 베타글루칸 생산에 효율적으로 이용될 수 있다.

본 발명의 베타-글루카네이즈를 이용한 수용성 베타글루칸 생산방법은 효소법을 이용한 것으로, 유해한 화학적 물질을 사용하지 않고 기질에 특이적으로 작용하는 효소를 사용하여 물질을 분해하는 방법으로 공정과정에서 발생하는 화학 폐기물을 생산하지 않기 때문에 공정 개선 및 비용 절감의 효과를 가진다.

본 발명의 내용은 이하의 실시예를 통하여 설명한다. 하기 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것에 불과하며 이로써 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 베타글루카네이즈 활성의 한천배지 상에서의 간편한 스크리닝 방법

베타글루카네이즈 활성이 있는 균주를 탐색하는 방법은 효소 생산 여부를 확인하기 위해 미생물을 배양하고 조효소액을 분리해야하는 복잡한 과정을 수행하여야하고, 효소 분비를 확인하기까지 많은 시간이 소요되는 단점이 있다. 따라서 베타글루카네이즈를 분비하는 미생물을 보다 쉽고 간편하게 탐색하기 위한 방법을 개 발하고자 하였다.

아닐린 블루(Aniline blue) 염색약은 베타-1,3-글루칸과 특이적인 결합을 하는 지시약으로 베타-1,3-글루칸과 결합을 하면 푸른색을 띄는 것을 특징으로 한다. 이와 같은 특징으로 인하여 본 발명에서는 아닐린 블루 지시약을 이용하여 한천 배지 상에서 베타글루칸 분해 균주를 손쉽게 육안관찰로 선별이 용이하도록 선별방법을 개발하였다.

아닐린 블루 플레이트의 활성환 (halo) 형성을 측정하기 위해서 한국미생물보존센터(KCCM)로부터 베타글루카네이즈를 분비한다고 알려진 셀룰로모나스 속(Cellulomonas sp.) KCCM 40831을 분양받아 사용하였다. 아닐린 블루 플레이트 조제에 사용한 시약은 Acros organics사의 아닐린 블루 지시약을 사용하였으며 아닐린 블루 플레이트의 활성환 형성을 측정하기 위하여 사용한 상업용 효소는 Megazyme사의 endo-1,3-glucanase와 Novozyme사의 Viscozyme을 구매하여 사용하였다.

수용성 베타글루칸을 생산하기 위해 사용한 기질은 아그로박테리움(Agrobacterium) 속 세균 유래의 것으로서 (주)더멋진바이오텍에서 생산한 베타-1,3-글루칸 발효액을 사용하여 조제하였다. 베타-1,3-글루칸 발효액을 6,000 rpm에서 15 분간 원심분리 하여 침전물을 분리하고, 얻어진 침전물에 3배 부피의 증류수를 첨가하여 3회의 세척 과정을 반복하였다. 세척 과정 후, 6,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 얻어진 침전물을 수용성 베타글루칸의 생산에 사용하였고 베타글루칸 페이스트(BGAP)로 명명하였다.

아닐린 블루 플레이트법은 기본적으로 베타글루카네이즈에 의해서 생성된 활성환을 측정하는 방법으로서 아닐린 블루 플레이트에 베타글루칸이 존재하는 부분은 푸른색을 띄고 베타글루카네이즈에 의해서 베타글루칸이 분해된 부분은 활성환을 형성한다 (도 1). 도 1은 상업적으로 시판되는 베타글루카네이즈 효소와 베타글루카네이즈를 분비한다고 알려진 셀룰로모나스 속을 이용하여 아닐린 블루 플레이트에서 활성환의 형성 유무를 관찰한 실험이다. 아닐린 블루 플레이트법은 제조과정이 간편하기 때문에 비교적 손쉽게 베타글루카네이즈를 탐색할 수 있고, 하나의 플레이트로 여러 가지 시료를 시험할 수 있는 장점을 지니고 있다.

그러나 아닐린 블루 지시약은 베타글루칸과 결합을 하고 있어도, pH가 높아지면 푸른색을 소실하는 경향을 띄는 특징을 가지고 있어 본 발명에서는 이와 같은 단점을 보완하기 위하여 아닐린 블루 플레이트의 pH를 약산성 유지하고자 완충용액 성분을 배지에 첨가하였고 반응기질 역시 수용성 베타글루칸의 개발에 직접 사용할 BGAP를 사용하였다 <표 1>.

구분	성분	조성	비고
용액 1	아닐린 블루(aniline blue)	0.005%	β-1,3-glucanase 특이적 결합
	KH2PO4	2.49%	완충용액 성분(pH 5.8)
	K2HPO4	0.3%
	Agar	2%
용액 2	BGAP	1%	반응 기질

아닐린 블루 플레이트의 제조방법은 조성에 맞게 용액(Solution) 1과 용액 2를 각각 제조한 다음 Sol'n1은 121℃의 고온고압 하에서 15분 동안 멸균을 실시하고 Sol'n 2는 75℃에서 항온 수조에서 15 min 동안 중탕을 실시하였다. 그 후, 용액 1과 용액 2를 잘 섞고 기포가 생기지 않게 플레이트에 붓고 무균 작업대 (Clean bench)에서 굳혔다.

위의 정성적인 아닐린 블루 플레이트 법과 아울러 베타글루카네이즈의 정량적인 효소 활성 측정을 위하여 미생물이 생산하는 효소를 분리하여 기질과 반응시킨 후, 생성되는 환원당을 정량하여 효소활성을 측정하는 방법인 베타글루카네이즈 assay법도 사용하였다. 효소활성은 기질용액 (1% BGAP solution) 500㎕, 완충용액 (25 mM sodium acetate buffer (pH 5.0)) 400 ㎕와 조효소액 100㎕를 첨가하고 50℃에서 30분간 효소반응을 실시한다. 효소 반응이 종료되면, 반응용액을 100℃에서 끓는물에 5분간 중탕을 실시하여 효소반응을 중지시키고 12,000 rmp에서 15분간 원심분리하여 상층액을 분리하고 효소 활성 측정의 시료로 사용하였다. 효소의 활성은 DNS법을 이용하여 환원당을 정량하는 방법으로 측정하였다. 효소 활성 측정시료 300 ㎕와 DNS 용액 900 ㎕을 넣고 100℃의 끓는 물에 10분간 반응시킨 후, 반응 시료를 냉각시키고 Spectrophotometer를 이용하여 570 nm의 파장에서 생성된 환원당을 측정하였다.

실시예 2. 활성이 우수한 베타글루카네이즈 생산 균주 스크리닝

우수한 베타글루카네이즈 생산 균주를 선별하기 위하여 셀룰로모나스(Cellulomonas) 속 균주를 국내 균주 보존기관으로부터 분양받아 선별하였다. 표 2에 표시한 24종의 셀룰로모나스 속 균주로부터 우수 균주를 선별하기 위해 각각의 균주별 최적 성장 배지 (LB, Nutrient, Marine broth) 10ml에서 30℃, 36시간 배양한 후, 상등액을 채취하였다

24종의 베타글루카네이즈 생산 균주 목록
	균주번호	균주이름
1	KCCM 11678	Cellulomonas cartae
2	KCCM 11705	Cellulomonas sp.
3	KCCM 40831	Cellulomonas sp.
4	KCTC 1038	Cellulomonas flavigena
5	KCTC 1370	Cellulomonas biazotea
6	KCTC 1371	Cellulomonas sp.
7	KCTC 1435	Cellulomonas sp.
8	KCTC 1438	Cellulomonas gelida
9	KCTC 1441	Cellulomonas uda
10	KCTC 3231	Cellulomonas gelida
11	KCTC 3252	Cellulomonas cellulans
12	KCTC 3259	Cellulomonas cellulans
13	KCTC 3410	Cellulomonas cellasea
14	KCTC 3430	Cellulomonas cellulans
15	KCTC 9084	Cellulomonas turbata
16	KCTC 9143	Cellulomonas fimi
17	KCTC 9982	Cellulomonas hominis
18	KCTC 9983	Cellulomonas iranensis
19	KCTC 9984	Cellulomonas persica
20	KCTC 9985	Cellulomonas variabile
21	KCTC 19030	Cellulomonas composti
22	KCTC 19081	Cellulomonas terrae
23	KCCM 40831	Cellulomonas sp.
24	KCTC 9919	Cellulomonas sp.

균주별 상등액으로부터 베타글루카네이즈의 활성을 확인하기 위해 아닐린 블루 플레이트 (0.005% aniline blue, 2.49% KH₂PO₄, 0.3% K₂HPO₄, 2% agar, 1% 베타글루칸 발효액(BGAP))에 상등액을 10μl씩 점적하였고, 30℃에서 48시간 반응하여 생성된 활성환의 크기로 베타글루카네이즈의 활성을 갖는 균주를 선별한 결과 균주를 배양하여 얻은 상등액에서 투명환의 크기가 큰 #1, 7번 2개의 균주를 선별하였다(도 2).

선별된 #1, 7번 균주와 실시예 1에서 사용하였던 #23번 균주를 대조구로 사용하여 Nutrient, YPD, LB 배지 10ml에서 각각 30℃, 36시간 배양하여 얻은 상등액을 10μl씩 아닐린 블루 플레이트에 점적하였고, 30℃에서 48시간 반응한 결과, LB 배지에서 가장 큰 투명환을 보였으며, LB 배지에서 배양하여 얻은 #1, 7, 23번의 상등액을 5% 베타글루칸 발효액 (BGAP, pH 5.5)과 동량 혼합하여 30℃, 24시간 반응시킨 결과, #7번 반응액에서 베타글루칸의 양이 감소한 것을 확인하였다(도 3).

또한 가장 큰 투명환을 보인 #7번 균주의 배양 상등액을 5% 베타글루칸 발효액 (BGAP, pH 5.5)과 동량 혼합하여 10분 동안 반응시키면서 추가적으로 sonication을 수행한 결과, sonication을 수행했을 때 베타글루칸이 모두 분해된 것을 확인하였다(도 4).

실시예 3. 선별된 균주로부터 베타글루카네이즈 유전자의 클로닝

실시예 3에서 최종적으로 선택한 #7번 Cellulomonas sp. (KCTC 1435) 균주에서 베타-1,3-글루카네이즈 유전자를 클로닝하기 위하여 genomic DNA를 얻은 후 Sau3AI으로 partial digestion 하였고, 약 5~8kb의 사이즈를 갖는 DNA 절편을 agarose gel로부터 분리하였다. 분리한 DNA 절편을 BamH I digestion 한 후, CIAP(Calf Intestine Alkaline Phosphatase) 처리 한 pBluescript KSⅡ(+) 벡터에 ligation 하였고 E. coli DH5α에 형질전환 하였다. X-gal blue/white screening을 통하여 얻은 약 800개의 하얀색 콜로니를 아닐린 블루 플레이트에 picking하여 30℃에서 투명환을 보이는 2개의 콜로니를 선별하였으며, 이 중 약 6kb의 insert 사이즈를 갖는 #2-38번 플라스미드를 시퀀싱 하였고 약 6kb의 이 염기서열을 BlastX 프로그램을 통하여 상동성을 분석한 결과는 <표 3>과 같으며 Oerskovia xanthineolytica (Cellulomonas cellulans) 유래의 beta-1,3-glucanase Ⅱa (GenBank accesion number AAC44371)와 가장 높은 상동성을 보였다. 결론적으로 약 1.3kb의 glucanase 유전자를 클로닝할 수 있었고, 이 유전자를 Glu7으로 명명하였으며 이들의 핵산 서열을 서열번호 2에 표시하고, 이들 핵산 분자가 코딩하는 아미노산 서열을 서열번호 1에 표시하였다(도 19 참조).

베타-1,3-글루카네이즈의 아미노산 서열 상동성 분석 (BlastX)
	Identities	Positives
Oerskovia xanthineolytica (Cellulomonas cellulans) beta-1,3-glucanase	73%	82%
Oerskovia xanthineolytica (Cellulomonas cellulans) beta-1,3-glucanase Ⅱa ⇒ AAC44371	75%	85%
Streptomyces avermitilis MA-4680 endo-1,3-beta-glucanase	50%	63%

Glu7을 Oerskovia xanthineolytica (Cellulomonas cellulans, AAC44371)의 베타-1,3-글루카네이즈의 아미노산서열과 alignment 한 결과는 도 5와 같으며 Glu7 유전자가 약 140개의 아미노산으로 구성된 C-말단 연장부위(C-terminal extension)을 가지는 것을 알 수 있다. 이 부분은 불용성 베타글루칸을 효과적으로 분해하는데 필요한 결합 도메인(binding domain)으로 추정되었다.

실시예 4. 대장균에서 Glu7 유전자의 발현

약 1.3kb의 Glu7 유전자와 Oerskovia xanthineolytica (Cellulomonas cellulans, AAC44371)의 베타-1,3-글루카네이즈의 아미노산서열과 alignment 한 결과, Glu7의 경우 Met(ATG) codon을 찾을 수 없어 도 6에서 표시한 Val(GTG), Gly(GGG) codon을 각각 ATG codon (1)과 (2)로 바꿀 수 있도록 프라이머(primer)를 디자인하였다 <표 4>.

Glu7 유전자를 대장균에서 발현하기 위해 사용한 primer
	primer 이름	primer 염기서열
(1)	Glu7-F1	GAATTCAAAAATGCACCCACCCGCCCGT
	Glu7-R1	CTCGAGTCAGAGCACCCAGCGCTG
(2)	Glu7-F4	GAATTCAAAAATGCGGCGCGTCGCCCGGCCC
	Glu7-R1	CTCGAGTCAGAGCACCCAGCGCTG

그리고 Trc 프로모터가 삽입되어 있는 pBluescript KSⅡ(+) 벡터의 EcoRI과 XhoI site에 PCR product (1)과 (2)를 각각 ligation 하고 E. coli DH5α에 형질전환하였다. 각각의 재조합 벡터는 pTrc-Glu7(1), pTrc-Glu7(2)로 명명하였다(도 7).

앰피실린이 첨가된 LB 배지 10ml에서 30℃, 24시간 배양하여 얻은 cell을 파쇄하여 얻은 crude extract를 각각 아닐린 블루 플레이트에 10μl씩 점적하였고, 30℃에서 24시간 반응한 결과, pTrc-Glu7(1)의 경우 투명환을 보여 활성을 나타냄을 확인하였다.

따라서 Cellulomonas sp. (KCTC 1435) 균주 유래 베타-1,3-글루카네이즈 유전자에서는 번역의 개시 코돈을 통상의 methionine 코돈이 아니라 세균에서 예외적으로 사용하는 것으로 알려진 valine 코돈을 사용하는 것으로 추정할 수 있었다.

실시예 5. 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 균주에서 Glu7 의 발현

실시예 3 및 4에서 얻은 Cellulomonas sp. (KCTC 1435) 균주 유래 베타-1,3-글루카네이즈 유전자 Glu7을 발현하는 데에 있어서 발현된 효소를 식품 등에 활용하는 데에 대장균 보다 훨씬 적합한 효모를 재조합 발현의 숙주세포로 사용하였다. 이렇게 생산된 효소 활성을 알려진 다른 베타-1,3-글루카네이즈 유전자를 발현했을 경우와 비교하기 위하여 Bacillus circulans WL-12 유래의 GlcA 유전자와 Bacillus circulans IAM1165 유래의 BglH 유전자도 발현시켰다.

재조합 발현의 숙주세포로서 인체에 안전한 GRAS (Generally Regarded as Safe) 생물체로 알려져 있는 효모 사카로마이세스 세레비지에 발현시스템을 이용하였으며, 이들 유전자를 S. cerevisiae Y2805에서 분비발현시키기 위해, 먼저 앞에서 얻은 약 1.3kb의 Glu7 유전자와 Oerskovia xanthineolytica (Cellulomonas cellulans, AAC44371)의 베타-1,3-글루카네이즈의 아미노산서열과 alignment 한 결과(도 8)을 바탕으로 Signal P 프로그램으로 예측한 cleavage site (1)과 문헌을 통해 확보한 cleavage site (2)의 두 가지 mature form으로 발현하도록 프라이머를 디자인하였고, GlcA와 BglH 유전자 또한 문헌을 참고로 하여 mature form으로 발현하도록 프라이머를 디자인하였다 <표 5>.

Glu7, GlcA, BglH 유전자를 S. cerevisiae 에서 발현하기 위해 사용한 프라이머
	primer	primer 염기서열
Glu7 (1)	Glu7-F2	TCTAGATAAGAGAGCGACCACCACGCCCGCC (서열번호 3)
	Glu7-R2	GCGGCCGCTCAGAGCACCCAGCGCTG (서열번호 4)
Glu7 (2)	Glu7-F3	TCTAGATAAGAGAGCCGTCGGGGACGTGCTG (서열번호 5)
	Glu7-R3	GCGGCCGCTCAGAGCACCCAGCGCTG (서열번호 6)
GlcA	GlcA-F	TCTAGATAAGAGAGCTGGGACCACAGTTACC (서열번호 7)
	GlcA-R	GCGGCCGCTTACTGTTCTTTATACAC (서열번호 8)
BglH	BglH-F	TCTAGATAAGAGAGCTGAGACTGCTGGAACC (서열번호 9)
	BglH-R	GCGGCCGCTTACTCCGGTGTTCCTTG (서열번호 10)

발현 프로모터로는 유도성 프로모터(inducible promoter)인 GAL10 promoter (Mylin ML 등, 1990)를 이용하였고 분비 시그널로는 사카로마이세스 세레비지에 유래의 교배인자 알파 프리프로 리더(mating factor α prepro leader, MFα ppL)을 이용하였다. 이들 구성요소를 가지고 있는 YEGα-HIR525 벡터에 (Choi E.S. 등, Appl. Microbiol. Biotechnol. 42, 587-594) Hitzeman 등의 방법 (Hitzeman RA 등, 1990)에 따라 벡터의 XbaI과 NotI site에 상기 PCR product를 각각 ligation하였다(효모에서 재조합단백질을 고효율로 분비발현시키는 방법. 특허 출원 번호 10-2007-0092823, 2007. 9. 12. 참고).

이렇게 제조된 사카로마이세스 발현 벡터를 S. cerevisiae Y2805 wild type (wt) 균주에 형질전환 하였다. 각각의 재조합 벡터는 pGAL-MFα opt-Glu7(1), pGAL-MFα opt-Glu7(2), pGAL-MFα opt-GlcA, pGAL-MFα opt-BglH로 명명하였다(도 9).

4종의 재조합 균주를 YPDG(glucose 1%, galactose 1%) 배지 25ml에서 30℃, 48시간 배양하여 얻은 상등액을 각각 아닐린 블루 플레이트에 10μl씩 점적하였고, 30℃에서 24시간 반응하였다. 먼저 Glu7(1)과 Glu7(2)의 두가지 mature form으로 발현시킨 경우, 투명환의 크기가 서로 비슷하였으나 Glu7(2)로 최종 결정하였다(도 10).

위에서 선택한 Glu7(2)와 GlcA, BglH의 활성을 비교하기 위해 배양 상등액을 각각 아닐린 블루 플레이트에 10μl씩 점적하였고, 30℃에서 24시간 반응한 결과, GlcA, BglH에 비해 Glu7(2)이 가장 큰 투명환을 보였다. 또 각각의 상등액을 5% 베타글루칸 발효액 (BGAP, pH 6.2)과 동량 혼합하여 30℃와 65℃에서, 24시간 반응시킨 결과, control에 비해 Glu7(2), GlcA, BglH 반응액 모두 65℃에서 반응 3시간 만에 베타글루칸의 양이 감소한 것을 확인하였다(도 11).

실시예 6. 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 △ gal80 균주에서 Glu7 의 발현

사카로마이세스 세레비지애 Y2805 wt 균주에서 Gal10 프로모터가 발현되기 위해서는 리프레서로 작용하는 포도당이 고갈되어야 하고 인듀서(inducer)로서 갈락토오즈(galactose)가 존재하여야 하는데 갈락토오즈는 매우 값비싼 당류이며 세포의 성장을 위하여 탄소원으로 사용되어 없어진다. 이러한 문제점을 해결하기 위하여 본 발명자들은 포도당만 사용하여 Gal10 프로모터를 발현할 수 있는 변이주 S. cerevisiae Y2805 △gal80 균주를 사용한 재조합 단백질 생산 방법을 발명한 바 있어 (이스트 gal80 결핍주를 이용한 재조합 단백질의 생산방법. 특허출원번호 10-2007-0080946, 2007. 8. 10.) 이를 사용하여 효율적인 재조합 생산을 시도하였다.

pGAL-MFα opt-Glu7(2), pGAL-MFα opt-GlcA, pGAL-MFα opt-BglH 3종의 재조합 벡터를 S. cerevisiae Y2805 △gal80 균주에 형질전환 하였고, YPD(glucose 2%) 배지 25ml에서 30℃, 48시간 배양하여 얻은 상등액을 각각 아닐린 블루 플레이트에 10μl씩 점적하였고, 30℃에서 24시간 반응하였다. 그 결과 S. cerevisiae Y2805 wt에서와 마찬가지로 GlcA, BglH에 비해 Glu7(2)이 가장 큰 투명환을 보였고, 또 각각의 상등액을 5% 베타글루칸 발효액 (BGAP, pH 6.2)과 동량 혼합하여 30℃와 65℃에서, 24시간 반응시킨 결과, control에 비해 Glu7(2)의 반응액이 65℃에서 반응 3시간 만에 베타글루칸의 양이 상당량 감소한 것을 확인하였다(도 12).

이들 재조합 균주를 이용하여 베타글루카네이즈의 정량적 활성 assay를 실시한 결과 <표 6>에서 표시한 바와 같이 재조합 효모로부터 생산된 Cellulomonas sp. Glu7/S. cerevisiae이 원래의 균주 Cellulomonas sp. KCTC 1435의 배양으로 얻은 효소량 보다 훨씬 많은 효소량을 보였다. 또한 Cellulomonas sp. Glu7/S. cerevisiae gal80의 경우가 B. circulans WL-12 GlcA/S. cerevisiae gal80나 B. circulans IAM1165 BgiH/S. cerevisiae gal80의 경우보다 훨씬 높은 활성을 보임을 알 수 있었다.

균주별 베타글루카네이즈 효소활성
번호	균주	효소활성	효소타입
1	Cellulomonas sp. KCTC 1435	0.0398 U	Extracellular
2	Cellulomonas sp. Glu7/S. cerevisiae gal80	0.0823 U	Extracellular
3	B. circulans WL-12 GlcA/S. cerevisiae gal80	0.0259 U	Extracellular
4	B. circulans IAM1165 BgiH /S. cerevisiae gal80	0.0134 U	Extracellular
※U : 1분당 1 mg의 환원당을 생성할 수 있는 단위

결론적으로 숙주세포로 효모를 사용함으로써 대장균에 비하여 식품용 효소로서 사용에 제약이 없으며, 생산되는 효소 또한 분비됨으로써 세포 밖으로 배출되는 extracellular enzyme 이기 때문에 수용성 베타글루칸의 생산에 가장 적합한 시스템으로 판단되었다.

실시예 7. 수용성 베타글루칸 생산

Cellulomonas sp. Glu7 / S. cerevisiae gal80 균주로부터 얻은 배양 상등액을 조효소로 하여 베타글루칸 기질과 반응시켜 수용성 베타글루칸을 생산하는 조건을 조사하였다.

효소 반응 후, 생성된 수용성 베타글루칸의 분석을 위하여 시료를 마이크로 피펫을 이용하여 TLC plate의 끝에서 20 mm 되는 위치에 10 ㎕ 점적하고 TLC plate를 상온에서 건조시켰다. TLC plate가 완전히 건조되면 TLC 챔버에 클로로포름(chloroform) : 아세트산(acetic acid) : 물(water) (3 : 12 : 1)의 조성으로 이루어진 전개용매를 넣고 TLC plate를 전개시켰고 전개용매가 TLC plate의 70% 지점까지 이동하면 TLC plate를 80℃ hot plate에서 10분간 건조시키고 발색 시약에 TLC plate를 담궜다가 80℃ hot plate에서 10분간 발색시키고 생성된 Spot을 확인하였다. 발색시약의 조성은 에탄올 95㎖에 5㎖의 H2SO4을 첨가하여 5% H2SO4 용액이 되도록 만들어 사용하였다.

또한 효소 반응 후, 생성된 수용성 베타글루칸을 1 ㎎/㎖의 농도로 HPLC water에 희석하고 0.2㎛의 PVDF filter를 이용하여 정제하고 HPLC 분석 시료로 사용하였다. 분석에 사용된 컬럼은 PL사의 aquagel-OH30 8㎛ (300 ㎜ × 7.5 ㎜)를 2개 연결하여 사용하였고 전개용매로는 water를 사용하였다. 분석에 사용된 조건은 50℃의 컬럼 온도에서 1 ㎖/min flow rate로 시료를 분석하였고 측정은 Waters사의 2414 굴절 검출기를 사용하여 검출하였다.

가. 반응 온도별 수용성 베타글루칸 생산

수용성 베타글루칸 생산 반응의 조성은 베타글루칸 페이스트 10 g에 80g의 D.W.를 첨가하고 pH를 7.0으로 조절하였다. 그 후, Cellulomonas sp. Glu7 / S. cerevisiae gal80로부터 분리한 조효소액 10 g을 첨가하고 30, 40, 50℃의 조건하에서 120 rpm로 3시간동안 효소 반응을 실시하고 100℃ 끓는 물에서 10분간 중탕하여 효소 반응을 종결시켰다. 효소반응이 종결되면 6,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 수용성 베타글루칸이 녹아 있는 상층액을 분리하고 동결건조하여 생성된 수용성 베타글루칸의 수율을 측정하였다.

수용성 베타글루칸의 수율은 다음과 같은 방법으로 계산하였다.

※ 수용성 베타글루칸 : 효소반응 후, 생성된 수용성 베타글루칸 무게

※ 기질의 베타글루칸 : 기질 속에 포함된 베타글루칸의 무게

※ Control : 기질 속에 포함된 물질의 동결건조 무게

※ 첨가효소 : 첨가효소에 포함된 물질의 동결건조 무게

Cellulomonas sp. Glu7 / S. cerevisiae gal80의 베타-글루카네이즈를 사용하여 반응 온도별 수용성 베타글루칸을 생산한 결과 40℃와 50℃에서 25.5%, 28.4%로 비슷한 생산 수율을 나타내었다. 최적 반응온도 또한 50℃로 나타났기 때문에 수용성 베타글루칸의 최적 반응온도는 50℃로 결정하였다<표 7>.

반응온도별 수용성 베타글루칸 생산
구분	30℃	40℃	50℃
수용성 베타글루칸 생산수율	17%	25.5%	28.4%

각각의 반응온도로 기질을 반응 후, 생성된 수용성 베타글루칸의 크기를 확인하기 위하여 TLC를 실시한 결과 도 13과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 각각의 반응 온도별로 생성된 수용성 베타글루칸은 2-8개 사이의 크기를 가진 것으로 밝혀졌으며 Spot의 발색 정도로 판단할 때 생성량 역시 비슷한 것으로 생각된다.

각의 반응온도로 기질을 반응 후, 생성된 수용성 베타글루칸의 크기를 GPC를 이용하여 보다 정확한 분자량을 확인한 결과 도 13과 같은 결과를 얻을 수 있었다. GPC 분석의 결과 R.T. 17.06 분대의 Peak가 생성되었고, 수용성 베타글루칸의 생산 수율이 높아짐에 따라 비례적으로 증가하였다. GPC 분석의 결과 2-8개 정도의 반응 산물이 생성되었고, 이는 TLC의 결과와 유사하였다.

나. 반응시간별 수용성 베타글루칸 생산

수용성 베타글루칸 생산 반응의 조성은 베타글루칸 페이스트 10 g에 80g의 D.W.를 첨가하고 pH를 7.0으로 조절하였다. 그 후, Cellulomonas sp. Glu7 / S. cerevisiae gal80로부터 분리한 조효소액 10 g을 첨가하고 50℃, 120 rpm에서 1, 3, 9, 12시간동안 효소 반응을 실시하고 100℃ 끓는 물에서 10분간 중탕하여 효소 반응을 종결시켰다. 효소반응이 종결되면 6,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 수용성 베타글루칸이 녹아 있는 상층액을 분리하고 동결건조 하여 생성된 수용성 베타글루칸의 수율을 측정하였다.

Cellulomonas sp. Glu7 / S. cerevisiae gal80의 β-glucanase를 사용하여 반응 시간별 수용성 베타글루칸을 생산한 결과 반응시간 증가함에 따라 생산 수율도 증가하였지만, 반응시간이 일정 시간 이상 증가함에 따라 생산 수율이 비례적으로 증가하지 않는 결과를 알 수 있었다 <표 8>. 9시간과 12시간의 효소 반응 후, 41%와 47%의 수용성 베타글루칸 생산 수율을 얻어 12시간이 우수한 생산 수율을 보여주었지만, 경제적인 측면을 고려하여 최적 반응시간을 9시간으로 결정하였다.

반응시간별 수용성 베타글루칸 생산
구분	1시간	3시간	9시간	12시간
수용성 베타글루칸 생산 수율	25%	32%	41%	47%

각각의 반응시간으로 기질을 반응 후, 생성된 수용성 베타글루칸의 크기를 확인하기 위하여 TLC를 실시한 결과 도 15와 같은 결과를 얻을 수 있었다. TLC의 결과로 볼 때, 반응 3시간부터 비교적 선명하게 분리되어진 수용성 베타글루칸의 생성을 확인할 수가 있었다. 또한 9시간과 12시간의 효소반응 결과로 볼 때, 반응시간이 증가함에 따라 상대적으로 큰 고분자의 수용성 베타글루칸이 분해되어 저분자의 수용성 베타글루칸으로 전환이 발생한다는 것을 알 수가 있었다.

각각의 반응시간으로 기질을 반응 후, 생성된 수용성 베타글루칸의 크기를 GPC를 이용하여 보다 정확한 분자량을 확인한 결과 도 16과 같은 결과를 얻을 수 있었다. GPC 분석의 결과 R.T. 17.06 분대의 Peak가 생성되었고, 수용성 베타글루칸의 생산 수율이 높아짐에 따라 비례적으로 증가하였다.

다. 효소농도별 수용성 베타글루칸 생산

수용성 베타글루칸 생산 반응의 조성은 베타글루칸 페이스트 10 g에 80g의 D.W.를 첨가하고 pH를 7.0으로 조절하였다. 그 후, Cellulomonas sp. Glu7 / S. cerevisiae gal80로부터 분리한 조효소액 1, 5, 10 g을 첨가하고 50℃, 120 rpm에서 9시간동안 효소 반응을 실시하고 100℃ 끓는 물에서 10분간 중탕하여 효소 반응을 종결시켰다. 효소반응이 종결되면 6,000 rpm에서 15분간 원심분리 하여 수용성 베타글루칸이 녹아 있는 상층액을 분리하고 동결건조 하여 생성된 수용성 베타글루칸의 수율을 측정하였다.

Cellulomonas sp. Glu7 / S. cerevisiae gal80의 베타-글루카네이즈를 사용하여 반응 효소의 농도별 수용성 베타글루칸을 생산한 결과 효소농도가 증가함에 따라 생산 수율도 증가하였지만, 효소농도가 일정량 이상 증가하면 생산 수율이 비례적으로 증가하지 않는 결과를 알 수 있었다 <표 9>. 효소 농도를 5 ml과 10 ml 첨가하였을 경우, 38%와 41%의 수용성 베타글루칸 생산 수율을 나타내어 최적의 효소 첨가량을 5 ml로 결정하였다.

효소농도별 수용성 베타글루칸 생산
구분	1㎖	5㎖	10㎖
수용성 베타글루칸 생산 수율	23%	38%	41%

다양한 효소 농도를 첨가하여 기질과 반응 후, 생성된 수용성 베타글루칸의 크기를 확인하기 위하여 TLC를 실시한 결과 도 17과 같은 결과를 얻을 수 있었다. 첨가된 효소 농도에 관계없이 2~8개의 크기를 가진 수용성 베타글루칸이 생성되었고, TLC에 분석된 Spot의 발색된 정도에서 알 수 있듯이 효소의 농도가 증가함에 따라 수용성 베타글루칸의 생성양이 증가하였다. 하지만 5 ml과 10 ml의 효소 첨가군의 뚜렷한 차이는 나타나지 않았으며, 이는 수용성 베타글루칸의 생산 수율 결과와 일치하고 있다.

다양한 효소 농도로 기질을 반응 후, 생성된 수용성 베타글루칸의 크기를 GPC를 이용하여 보다 정확한 분자량을 확인한 결과 도 18과 같은 결과를 얻을 수 있었다. GPC 분석의 결과 R.T. 17.06 분대의 Peak가 생성되었고, 첨가된 효소 농도별로 GPC peak가 증가함을 알 수 있었지만, 5 ml과 10 ml의 효소 첨가에 따른 Peak의 차이는 나타나지 않았다.

본 발명에 따른 베타-글루카네이즈는 불수용성 베타글루칸에 대해 뛰어난 가수분해 활성을 나타내므로, 수용성 베타글루칸을 필요로 하는 건강 기능성 식품 및 의약품 제조에 효율적으로 이용될 수 있다

도 1은 상업적으로 시판되는 베타글루카네이즈 효소와 베타글루카네이즈를 분비한다고 알려진 셀룰로모나스 속을 이용하여 아닐린 블루 플레이트에서 활성환의 형성 유무를 관찰한 실험을 나타낸 것이다.

도 2는 아닐린 블루 플레이트 상에서 균주별 상등액의 베타글루카네이즈의 활성을 확인한 결과를 나타낸 것이다.

도 3은 배지별 베타글루카네이즈의 활성 측정과 BGAP 반응 결과를 나타낸 것이다.

도 4는 선별된 균주로부터 얻은 베타글루카네이즈의 BGAP 반응 및 초음파분쇄(sonication) 효과를 나타낸 것이다.

도 5는 베타-1,3-글루카네이즈 아미노산 서열의 alignment를 나타낸 것이다.

도 6은 베타-1,3-글루카네이즈의 아미노말단 아미노산 서열을 나타낸 것이다.

도 7은 베타-1,3-글루카네이즈 재조합 발현 벡터인 pTrc-Glu7(1), pTrc-Glu7(2)의 모식도이다.

도 8은 베타-1,3-글루카네이즈 분비 시그널 펩타이드의 절단 부위를 나타낸 것이다.

도 9는 베타-1,3-글루카네이즈 재조합 발현 벡터인 pGAL-MFα opt-Glu7(1), pGAL-MFα opt-Glu7(2), pGAL-MFα opt-GlcA, pGAL-MFα opt-BglH의 모식도이다.

도 10은 S. cerevisiae Y2805 wt에서 배양한 상등액의 베타-글루카네이즈의 활성 결과을 나타낸 것이다.

(#1 : pGAL-MFα opt-Glu7(1) / S. cerevisiae Y2805 wt

#2 : pGAL-MFα opt-Glu7(2) / S. cerevisiae Y2805 wt

#C : S. cerevisiae Y2805 wt)

도 11은 S. cerevisiae Y2805 wt에서 재조합 발현시킨 배양 상등액의 베타글루카네이즈의 활성 측정 및 BGAP 반응 결과를 나타낸 것이다.

(#1 : pGAL-MFα opt-Glu7(2) / S. cerevisiae Y2805 wt

#2 : pGAL-MFα opt-GlcA / S. cerevisiae Y2805 wt

#3 : pGAL-MFα opt-BglH / S. cerevisiae Y2805 wt

#C : S. cerevisiae Y2805 wt)

도 12는 S. cerevisiae Y2805 △gal80에서 재조합 발현시킨 배양 상등액의 ß-glucanase의 활성 측정 및 BGAP 반응 결과를 나타낸 것이다.

(#1 : pGAL-MFα opt-Glu7(2) / S. cerevisiae Y2805 △gal80

#2 : pGAL-MFα opt-GlcA / S. cerevisiae Y2805 △gal80

#3 : pGAL-MFα opt-BglH / S. cerevisiae Y2805 △gal80

#C : S. cerevisiae Y2805 △gal80)

도 13은 반응온도별로 생성된 수용성 베타글루칸의 TLC 분석결과를 나타낸 것이다. (G : Glucose, M : Maltose, C : Control, 효소 반응하지 않음)

도 14는 반응온도별로 생성된 수용성 베타글루칸의 GPC 분석결과를 나타낸 것이다. (*E : Enzyme)

도 15는 반응시간별 생성된 수용성 베타글루칸의 TLC 분석결과를 나타낸 것이다. (G : Glucose, M : Maltose, C : Control, 반응 0 시간)

도 16은 반응시간별로 생성된 수용성 베타글루칸의 GPC 분석결과를 나타낸 것이다. (*E : Enzyme)

도 17은 효소농도별 생성된 수용성 베타글루칸의 TLC 분석결과를 나타낸 것이다.(G : Glucose, M : Maltose)

도 18은 효소농도별 생성된 수용성 베타글루칸의 GPC 분석결과를 나타낸 것이다.

도 19는 본 발명의 신규한 베타-글루카네이즈(β-glucanase) 효소 활성을 갖는 단백질의 아미노산 서열 및 핵산 서열을 나타낸 것이다.

<110> Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology <120> Novel beta-glucanase digesting insoluble beta-1,3-glucan and method thereof <130> PA080407/KR <160> 10 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 446 <212> PRT <213> Cellulomonas sp. <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(446) <223> amino acid sequence of novel beta-glucanase <400> 1 Val His Pro Pro Ala Arg Pro Ala His Ala Ala Ala Pro Ala Pro Thr 1 5 10 15 Ser Gln Pro Ala Pro Arg Val Arg Pro Ala Gly Arg Arg Val Ala Arg 20 25 30 Pro Ala Ala Leu Leu Ala Ala Leu Ala Leu Ala Val Ala Gly Ala Ala 35 40 45 Thr Thr Thr Pro Ala Ala Ala Arg Gly Pro Ala Pro Ala Ala Val Gly 50 55 60 Asp Val Leu Trp Ser Gln Glu Phe Asp Gly Pro Ala Gly Ala Ala Pro 65 70 75 80 Asp Pro Ala Val Trp Ser Tyr Asp Thr Gly Ala Asn Gly Trp Gly Asn 85 90 95 Ala Glu Leu Gln Asn Tyr Thr Thr Ser Arg Ala Asn Ser Ala Leu Asp 100 105 110 Gly Asp Gly Asn Leu Val Leu Thr Ala Arg Arg Glu Ala Asp Gly Ser 115 120 125 Tyr Thr Ser Ala Arg Leu His Thr Asn Asp Lys Val Glu Leu Arg Tyr 130 135 140 Gly Arg Val Glu Ala Arg Ile Gln Ile Pro Arg Gly Gln Gly Ile Trp 145 150 155 160 Pro Ala Phe Trp Met Leu Gly Ala Ser Phe Pro Gln Thr Pro Trp Pro 165 170 175 Gly Ser Gly Glu Ile Asp Val Met Glu Asn Val Gly Lys Glu Pro His 180 185 190 Leu Val His Gly Thr Val His Gly Pro Gly Tyr Ser Gly Gly Ala Gly 195 200 205 Ile Thr Gly Ser Ala Met His Pro Gln Gly Trp Ser Tyr Ala Asp Asp 210 215 220 Phe His Thr Phe Ala Val Asp Trp Arg Pro Gly Glu Ile Thr Trp Phe 225 230 235 240 Val Asp Gly Gln Gln Phe His Arg Val Thr Arg Ala Ser Val Gly Ser 245 250 255 Asn Ala Trp Val Phe Asp Gln Pro Phe Phe Leu Ile Leu Asn Val Ala 260 265 270 Val Gly Gly Gln Trp Pro Gly Tyr Pro Asp Ala Thr Lys Thr Phe Pro 275 280 285 Gln Gln Met Lys Val Asp Trp Ile Arg Val Thr Asp Asn Gly Ala Ala 290 295 300 Ser Gly Gly Asp Pro Gly Thr Pro Gly Gly Gly Thr Leu Pro Thr Gly 305 310 315 320 Thr Gly Thr Ile Arg Ala Asp Gly Arg Leu Cys Leu Asp Val Pro Trp 325 330 335 Gly Gln Thr His Asp Gly Asn Pro Ala Gln Ile Ala Thr Cys Asn Gly 340 345 350 Gly Ala Ala Gln Gln Trp Thr Arg Gly Ala Asp Gly Thr Val Arg Ala 355 360 365 Leu Gly Arg Cys Leu Asp Val Ala Gly Gly Gly Thr Ala Asp Gly Thr 370 375 380 Arg Val Gln Leu Trp Thr Cys Asn Gly Thr Ala Ala Gln Arg Trp Thr 385 390 395 400 Tyr Asp Ala Ala Thr Gln Thr Leu Arg Asn Pro Gln Ser Gly Arg Cys 405 410 415 Leu Asp Ala Asp Gly Gly Asn Pro Ile His Asp Gly Gln Lys Leu Val 420 425 430 Val Trp Ser Cys His Gly Ala Ala Asn Gln Arg Trp Val Leu 435 440 445 <210> 2 <211> 1341 <212> DNA <213> Cellulomonas sp. <220> <221> gene <222> (1)..(1341) <223> nucleotide sequence of novel beta-glucanase <400> 2 gtgcacccac ccgcccgtcc cgcccacgcc gcagcacccg ccccgacgtc ccagccggcg 60 ccgcgcgtcc gaccggccgg gcggcgcgtc gcccggcccg cggcgctgct cgcggccctc 120 gccctcgccg tcgcgggcgc ggcgaccacc acgcccgccg ccgcgcgcgg gcccgcaccc 180 gccgccgtcg gggacgtgct gtggtcgcag gagttcgacg gacccgccgg cgcggccccc 240 gaccccgccg tgtggtcgta cgacacgggg gcgaacgggt ggggcaacgc cgagctccag 300 aactacacga cgtcgcgcgc caactcggcc ctcgacggtg acgggaacct cgtcctcacc 360 gcgcgccgcg aggccgacgg ctcgtacacc tcggcccgcc tgcacacgaa cgacaaggtc 420 gagctgcgct acgggcgcgt cgaggcgcgc atccagatcc cgcgcgggca gggcatctgg 480 ccggcgttct ggatgctggg cgcgtccttc ccgcagaccc cgtggcccgg ctcgggcgag 540 atcgacgtca tggagaacgt cggcaaggag ccgcacctcg tgcacggcac cgtgcacggc 600 cccgggtact cgggcggtgc cggcatcacc gggtccgcga tgcaccccca ggggtggtcg 660 tacgccgacg acttccacac gttcgcggtc gactggcggc ccggcgagat cacgtggttc 720 gtcgacgggc agcagttcca ccgcgtgacg cgcgcgagcg tcgggtcgaa cgcttgggtg 780 ttcgaccagc ccttcttcct catcctcaac gtcgcggtcg gcggccagtg gcccgggtac 840 cccgacgcca ccaagacctt cccgcagcag atgaaggtcg actggatccg cgtgaccgac 900 aacggcgccg cgagcggcgg cgaccccggc acgcccggcg gcggcaccct cccgaccggc 960 acgggcacga tccgcgccga cggtcgcctc tgcctcgacg tgccctgggg gcagacgcac 1020 gacggcaacc ccgcgcagat cgccacctgc aacggcggcg ccgcgcagca gtggacccgc 1080 ggcgccgacg gcacggtccg cgcgctcggc aggtgcctcg acgtcgcggg cggcggcacc 1140 gccgacggca cgcgcgtgca gctctggacc tgcaacggca cggccgccca gcgctggacc 1200 tacgacgcgg cgacgcagac cctgcgcaac ccgcagtccg gccggtgcct cgacgccgac 1260 ggcggcaacc cgatccacga cgggcagaag ctcgtcgtgt ggtcgtgcca cggcgccgcc 1320 aaccagcgct gggtgctctg a 1341 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu7-F2 primer <400> 3 tctagataag agagcgacca ccacgcccgc c 31 <210> 4 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu7-R2 primer <400> 4 gcggccgctc agagcaccca gcgctg 26 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu7-F3 primer <400> 5 tctagataag agagccgtcg gggacgtgct g 31 <210> 6 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Glu7-R3 primer <400> 6 gcggccgctc agagcaccca gcgctg 26 <210> 7 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GlcA-F primer <400> 7 tctagataag agagctggga ccacagttac c 31 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GlcA-R primer <400> 8 gcggccgctt actgttcttt atacac 26 <210> 9 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BglH-F primer <400> 9 tctagataag agagctgaga ctgctggaac c 31 <210> 10 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> BglH-R primer <400> 10 gcggccgctt actccggtgt tccttg 26

Claims (19)

1. 서열번호 1의 아미노산 서열 또는 이와 90% 이상의 상동성을 가지며, 베타-글루카네이즈(β-glucanase) 효소 활성을 갖는 단백질.
2. 제1항의 단백질을 코딩하는 핵산 분자.
3. 제2항에 있어서, 상기 핵산 분자가 서열번호 2로 표시되는 핵산 서열을 갖는 것을 특징으로 하는 핵산 분자.
4. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 베타-1,3-글루칸(β-1,3-glucan) 결합 도메인(binding domain)을 포함하는 것을 특징으로 하는 단백질.
5. 제4항에 있어서, 상기 결합 도메인은 단백질의 C-말단 쪽에 위치하며, 135 내지 145개의 아미노산으로 구성되는 것을 특징으로 하는 단백질.
6. 제1항에 있어서, 상기 단백질은 셀룰로모나스 속(Cellulomonas sp.) 균주로부터 유래한 것을 특징으로 하는 단백질.
7. 제2항의 핵산 분자를 포함하는 벡터.
8. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 pBluescript KSⅡ(+)인 벡터.
9. 제7항에 있어서, 상기 벡터는 효모 발현 벡터이며, 프로모터 및 분비시그널 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 벡터.
10. 제9항에 있어서, 상기 프로모터는 GAL10, GAPDH, PGK, ADH, PHO5, GAL1, SED1, MOX, TEF 및 TPI로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것을 특징으로 하는 벡터.
11. 제9항에 있어서, 상기 분비시그널을 코딩하는 유전자는 MFα, PHO5, SUC2, AMY, SED 및 킬러톡신으로 구성된 군으로부터 선택되는 유전자인 것을 특징으로 하는 벡터.
12. 제7항의 벡터로 형질전환된 형질전환체.
13. 제12항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균(E.coli) 또는 효모인 형질전환체.
14. 제13항에 있어서, 상기 효모는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae)인 형질전환체.
15. 제14항에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비지애는 변이주 사카로마이세스 세레비지애 Y2805 Δgal80인 형질전환체.
16. 제14항에 있어서, 상기 사카로마이세스 세레비지애는 기탁번호 KCTC 11384BP 또는 KCTC 11385BP인 형질전환체.
17. 제12항 내지 제16항 중 어느 한 항의 형질전환체를 배지에서 배양하는 단계 및 배양물로부터 베타-글루카네이즈를 회수하는 단계를 포함하는 베타-글루카네이즈의 생산 방법.
18. 제17항의 생산 방법으로 수득된 베타-글루카네이즈를 이용하여 수용성 베타-글루칸을 제조하는 방법.
19. 베타-글루카네이즈 효소 활성을 가질 것으로 예상되는 균주를 아닐린 블루(Aniline blue)를 포함하는 한천배지에 도말하는 단계를 포함하는 베타-글루카네이즈 활성을 갖는 균주의 스크리닝 방법.

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