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GEBIET DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft mikrobielle Xyloglucanendotransglycosylasen
(XETs) und ihre Herstellung und Verwendungen.
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HINTERGRUND
DER ERFINDUNG
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Xyloglucanendotransglycosylase
(XET) ist ein von Pflanzen bekanntes Enzym. XET aus Mikroorganismen
wurde nach unserem besten Wissen noch nie beschrieben.
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Stephen
C. Fry et al. weisen in Biochem. J (1992) 282, S. 821–828 darauf
hin, dass XET für
das Abschneiden und Wiederverbinden von intermikrofibrillären Xyloglucanketten
verantwortlich ist und XET folglich die zur Pflanzenzellvermehrung
erforderliche Wandauflockerung verursacht.
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XET
wurde zur Verwendung beim Regulieren der Morphologie einer Pflanze
empfohlen (siehe
EP 562 836 ,
Seite 21. 27–28).
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Man
nimmt an, dass XET in allen Pflanzen, insbesondere in allen Anbaupflanzen
vorliegt. XET wurde aus Dicotyledonen, Monocotyledonen, insbesondere
Grasmonocotyledonen und Lilienmonocotyledonen und auch aus Moos
und einem Leberblümchen
extrahiert, zur Bezugnahme siehe Biochem. J (1992) 282, S. 823.
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In
der gleichzeitig abhängigen
Patentanmeldung PCT/DK 96/00538 (WO 97/23683) zeigten wir, dass ein
Zellulosematerial nach Behandlung mit einem XET-Enzym verbesserte
Stärkeeigenschaften
und/oder verbesserte Formbeibehal tungseigenschaften und/oder verbesserte
Antischrumpfeigenschaften erhalten kann.
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Das
XET-Enzym weist einige sehr interessante Anwendungen auf, so dass
es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, mikrobiell abgeleitete
Xyloglucanendotransglycosylasen bereitzustellen, die z. B. für die vorstehend
beschriebenen Anwendungen nützlich
sind. Die mikrobiell abgeleiteten Xyloglucanendotransglycosylasen
würden
den großen
Vorteil dahingehend aufweisen, dass sie leicht in großen Mengen
hergestellt werden könnten.
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KURZE OFFENBARUNG
DER ERFINDUNG
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Es
wurde durch einen Screeningtest gefunden, dass XET-Aktivität durch
eine überwältigende
Anordnung von phylogenetisch verteilten Mikroorganismen hergestellt
werden kann.
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Demzufolge
betrifft die vorliegende Erfindung ein Xyloglucanendotransglycosylasen-Präparat, umfassend
eine XET von einem Mikroorganimus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus i) Pilzen und ii) Bacillusspezies; insbesondere betrifft die
vorliegende Erfindung:
ein Verfahren zur Herstellung eines
Xyloglucanendotransglycosylaseenzyms (XET), umfassend
- (a) Züchten
eines Mikroorganismus, umfassend eine XFT von einem Mikroorganismus,
ausgewählt
aus der Gruppe, bestehend aus i) Pilzen und ii) Bazillusspezies,
der eine mikrobielle XET unter Bedingungen, die die Herstellung
des XET-Enzyms leiten, exprimiert in einem geeigneten Nährmedium
und
- (b) Gewinnen des XET-Enzyms aus dem Nährmedium.
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Ferner
betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung des XET-Präparats der
vorliegenden Erfindung zur Behandlung von Zellulosematerial und
mikrobielle XET-Präparate
als solche.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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Die
vorliegende Erfindung wird weiter durch Bezugnahme auf die begleitenden
Zeichnungen beschrieben, in welchen
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1 die
pH-Profile der XET-Aktivität
von Dichotomocladium hesseltinei, Tiarosporella phaseolina und Pseudoplectiania
nigrella (Δ:
Tiarosporella phaseolina; ☐: Pseudoplectania nigrella;
und ♦:
Dichotomocladium hesseltinei), erhalten gemäß Beispiel 5 zeigt,
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2 die
pH-Profile der Xyloglucanaseaktivität von Dichotomocladium hesseltinei,
Tiarosporella phaseolina und Pseudoplectania nigrella (Δ: Tiarosporella
phaseolina; ☐: Pseudoplectania nigrella; und ♦: Dichotomocladium
hesseltinei), erhalten gemäß Beispiel
5 zeigt.
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DETAILLIERTE
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein Xyloglucanendotransglycosylasepräparat, umfassend
eine XET von einem Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend
aus i) Pilzen und ii) Bazillusspezies.
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Es
zeigte sich in der vorliegenden Anmeldung, dass XET durch Pilze
und Bazillusspezies hergestellt werden kann, und es wird erwogen,
dass XET auch durch Hefen hergestellt werden kann.
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Ein „XET-Papier" wurde zum Identifizieren
von XET herstellenden Mikroorganismen verwendet. Das „XET-Papier" ist in der gleichzeitig
abhängigen
Patentanmeldung PCT/GB96/02351 (WO 97/11193) beschrieben; wobei
es sich um ein mit Xyloglucan beschichtetes Papier handelt, das
mit einem markierten Oligosaccharid getränkt ist.
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Das
markierte Oligosaccharid, das mit Xyloglucan imprägnierte
Papier und der Punkt-Tupfen-Test für XET-Aktivität wurden
in der folgenden Weise hergestellt:
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Herstellung von markiertem
Oligosaccharid
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Das
reduzierende Oligosaccharid 4-O-[4-O-[4-O-[6-O-α-D-Xylopyranosyl-β-D-glycopyranosyl]-6-O-(2-O-β-D-galactopyranosyl)-α-D-xylopyranosyl-β-D-glucopyranosyl]-6-O-(2-O-β-D-galactopyranosyl)-α-D-xylopyranosyl-β-D-glucopyranosyl]-D-glucose („XLLG") (1 Gramm) wird
in 25 ml einer gesättigten,
wässrigen
Lösung
von Ammoniumhydrogencarbonat, enthaltend 1 Gramm Natriumcyanoborhydrid
(NaCNBH3), gelöst und im Dunklen bei 25°C für eine Dauer
von 7 Tagen inkubiert, um eine reduktive Aminierung zu erlauben.
Das Ammoniumhydrogencarbonat wird dann durch Trocknen entfernt und
das (ninhydrinreaktive) aminierte Derivat von XLLG z. B. durch Gelpermeationschromatographie
oder Kationenaustauschchromatographie gereinigt. Es ist anzunehmen,
dass es sich bei dem Produkt um ein Oligosaccharidyl-1-amino-1-deoxyalditol,
d. h. ein Derivat von XLLG handelt, in welchem die reduzierende
terminale D-Glukoseeinheit
durch 1-Amino-1-deoxy-D-glucitol ersetzt wurde.
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Das
Oligosaccharidyl-1-amino-1-deoxyalditol (50 mg) wird in 3 ml 3%igem
Borax (Dinatriumtetraborat; pH=9,0–9,5) gelöst, und eine frisch hergestellte
Lösung
von 10 mg Lissaminrhodaminsulfonylchlorid [vertrieben von Molecular
Probes Inc., USA] in 0,75 ml trockenem Dimethylformamid (DMF) wird
stufenweise unter Rühren
zugesetzt und das Gemisch im Dunklen über Nacht inkubiert. Weitere
0,75 ml DMF, enthaltend 10 mg Lissaminrhodaminsulphonylchlorid,
werden zugesetzt und das Gemisch wird für eine weitere Dauer von 8 Stunden
inkubiert. Das leuchtend pinkfarbene Oligosaccharidyl-1-amino-1-deoxyalditol-Lissaminrhodamin-Konjugat
(XLLGol-SR) wird durch Gelpermeationschromato graphie, gefolgt von
Umkehrphasenchromatographie über
einer C18-Silicagelsäule gereinigt. Nach Waschen
von letzterer Säule
mit Wasser wird ein Methanolgradient aufgebracht, und das XLLGol-SR
eluiert in etwa 50% Methanol.
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Herstellung
von mit Xyloglucan imprägniertem
Papier
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Ein
Filterpapier des Typs Whatman Nr. 1 wird mit einer 1%igen, wässrigen
Lösung
von Xyloglucan befeuchtet und getrocknet. Das XLLGol-SR-Präparat wird
in ausreichendem 75%igem wässrigem
Aceton verdünnt,
um eine Absorption bei 580 nm (A580) von
0,2 zu erhalten; das mit Xyloglucan beschichtete Blatt des Papiers
des Typs Whatman Nr. 1 wird dann mit dieser Lösung getränkt und wieder getrocknet;
das Produkt wird als „XET-Papier" bezeichnet. Geeignet
bemessene Stücke
(z. B. 72 × 108
mm) des XET-Papiers können dann
mit einem nichtwässrigen
Klebstoff auf ein nicht-absorbierendes Medium wie ein Blatt aus
transparentem Acetat geklebt werden.
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Punkt-Tupfen-Test
für XET-Aktivität
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- i) Ein Tupfen der auf XET-Aktivität zu testenden
Lösung
wird auf eine markierte Position auf einem Stück XET-Papier pipettiert. Betragen
die Tupfen 4 μl,
kann der Abstand zwischen den Proben günstigerweise 9 mm (Mittelpunkt
zu Mittelpunkt, das heißt
in einem Standardtestplattenformat mit 96 Mulden) betragen.
- ii) Das XET-Papier wird dann schnell (bevor die Tupfen getrocknet
sind) zwischen zwei Kunststoffblätter
(z. B. wie auf Overheadprojektoren verwendete Acetatblätter) geklemmt
und z. B. bei 20°C
für eine
Dauer von 1 Stunde inkubiert.
- iii) Das inkubierte XET-Papier und sein Kunststoffträger wird
dann (mit der Papierseite nach unten) in eine Platte, enthaltend
etwa 150 ml eines Lö sungsmittels
[z. B. frisch hergestelltes Ethanol/Ameisensäure/Wasser (1:1:1 in Bezug
auf das Volumen)], gegeben, dass das nicht umgesetzte XLLGol-SR
jedoch kein in das Xyloglucan infolge der XET-katalysierten Transglycosylierung
eingebrachtes XLLGol-SR entfernt. Das Papier löst sich nun leicht vom Kunststoffträger ab.
- iv) Das Papier wird dann für
eine Dauer von 5 Minuten in Leitungswasser, dann für eine Dauer
von 5 Minuten in etwa 100 ml Aceton gespült und dann gründlich getrocknet.
Falls gewünscht,
kann das Trocknen durch eine 5-minütige Behandlung in einem Ofen
bei 80°C
beschleunigt werden.
- v) Das Papier wird dann unter einer Kurzwellenultraviolettlampe
(z. B. emittierend bei 254 nm, ein geeigneter Augen- und Hautschutz
sollte getragen werden) untersucht. Aktive XET wird dann durch einen
pinkfarbigen (orange fluoreszierenden) Tupfen angezeigt, der z.
B. durch die Verwendung eines Abtastspektrofluorimeters quantitativ
bestimmt werden kann.
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XET-Enzyme
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Wir
entdeckten, dass es sich bei mikrobiellen Enzyme mit XET-Aktivität entweder
um Transglycosylasen handeln können
(was bedeutet, dass ihnen Hydrolaseaktivität feht oder sie nur eine sehr
geringe Hydrolaseaktivität
aufweisen) oder sie sowohl Transglycosylierung als auch Hydrolyse
von Xyloglucan katalysieren können.
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XET-Enzyme
mit sowohl transglycosylierenden als auch hydrolytischen Aktivitäten sind
ebenso für
von Pflanzen erhaltene XET-Enzyme beschrieben (siehe Annu. Rev.
Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1995.46: Seite 509).
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Taxonomische
Klassifizierung
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Die
hier verwendete taxonomische Klassifizierung stützt sich primär auf das
System, das in der NIH-Datenbank (Entrez, Version Spring 1996),
erhältlich
im World Wide Web: (http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX)
verwendet wird.
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In
Bezug auf die Klassifizierung von in der Entrez-Datenbank nicht
eingeschlossenen Organismen wurden die folgenden allgemein verfügbaren und
weltweit akzeptierten Nachschlagewerke verwendet:
- Für Ascomycetes:
Eriksson, O.E. & Hawksworth,
D.L.: Systema Ascomycetum Band 12 (1993).
- Für
Basidiomycetes, Jülich,
W.: Higher Taxa of Basidiomycetes, Bibliotheca Mycologia 85, S.
485 (1981).
- Für
Zygomycetes: O'Donnell,
K.: Zygomycetes in culture, University of Georgia, US, S. 257 (1979).
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Allgemeine
mycologische Referenzbücher:
- Hawksworth, D.L., Kirk, P.M., Sutton, B.C. und Pegler, D.N.:
Dictionary of the fungi, International Mycological Institute, S.
616 (1995);
- Von Arx, J.A.: The genera of fungi sporulating in culture, S.
424 (1981).
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Bevorzugte
Pilze
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der vorliegenden Erfindung wird das XET-Präparat durch Züchten eines
Pilzes, insbesondere eines Pilzes, der zu einem Basidiomycota-,
Zygomycota-, Ascomycota-Pilz oder einem mitosporischen Pilz gehört, hergestellt.
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Bei
einem bevorzugten Basidiomycota-Stamm handelt es sich um einen Hymenomycetes-Stamm,
der zu den Ordnungen Coriolales, Schizophyllales, Ste reales oder
Xenasmatales gehört,
insbesondere einen Stamm, der zu einer der Familien Coriolaceae,
Corticiaceae, Schizophyllaceae, Stereaceae oder Tubulicrinaceae
gehört.
Bei einer bevorzugten Gattung handelt es sich um eine der folgenden:
Trametes, Corticium, Schizophyllum oder Tubulicrinis. Bei einer
bevorzugten Spezies handelt es sich um eine der folgenden: Trametes
hirsuta, Corticium roseum, Schizophyllum sp, Stereum hirsutum oder
Tubulicrinis subulatus.
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Bei
bevorzugten Ascomycota handelt es sich um Stämme, die zu den Klassen Loculoascomycetes, Discomycetes,
Pyrenomycetes und Plectomycetes gehören, vorzugsweise diejenigen,
die zu den Ordnungen Dothidaeles, Rhytismatales, Pezizales, Leotiales,
Xylariales, Hypocreales, Halosphaeriales, Phyllachorales, Diaporthales
und Eurotiales gehören.
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Bei
bevorzugten Stämmen
handelt es sich um Stämme,
die zu den Familien Botryosphaeriaceae, Dothioraceae, Mycosphaerellaceae,
Tubeufiaceae, Pleosporaceae, Leptosphaeriaceae, Rhytismataceae,
Sarcosomataceae, Pyronemataceae, Ascoboloaceae, Sclerotiniaceae,
Amphisphaeriaceae, Xylariaceae, Hypocreaceae, Halosphaeriaceae,
Phyllachoraceae, Valseceae, Melanconidaceae und Trichocomataceae
gehören; insbesondere
die zu der Gattung Diplodia, Plowrightia, Phyllosticta, Septoria,
Tubeufia, Alternaria, Coniothyrium, Phoma, Embellisia, Tiarioporella,
Galiella, Pseudoplectania, Pyronema, Oedocephalum, Botrytis, Aposphaeria,
Pestalotia, Pestalotiopsis, Poronia, Nodulisporium, Xylaria, Fusarium,
Verticillium, Volutella, Chaetapiospora, Lulworthia, Colletotrichum,
Cytospora, Discula, Phomospsis, Coryneum, Seimatosporioum, Aspergillus,
Eurotium, Eupenicillium, Penicillium, Petromyces und Talaromyces
gehören.
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Bevorzugt
sind die Spezies Diplodia gossypina, Plowrightia ribesia, Phyllosticta
sp, Septoria sp, Tubeufia amazonensis, Alternaria sp, Embellisia
hyacinthi, Phoma neoloba, Phoma tropica, Coniothyrium sp, Coniotlryrium olivaceoum,
Coniothyrium dunckii, Tiarosporella phaseolina, Tiarosporella sp,
Galiella celebica, Pseudoplectania nigrella, Pyronema domesticum,
Oedocephalum sp, Botrytis cinerea, Aposphaeria sp, Pestalotia sp,
Pestalotiopsis sp, Poronia punctata, Xylaria sp, Nodulisporium sp,
Fusarium solani, Verticillium sp, Volutella buxi, Chaetapiospora
rhododendri, Lulworthia uniseptata, Colletotrichum aculatum, Colletotrichum
crassipes, Cytospora spp, Discula sp, Phomospsis ilicis, Phomopsis
cirsii, Coryneum castaneicola, Seimatosporium lichenicola, Aspergillus
tamarii, Eurotium chevalierei, Eupenicillium javanicum, Penicillium
capsulatum, Penicillium olsonii, Penicillium pinophilum, Penicillium
roqueforti, Penicillium italicum, Penicillium canascens, Penicillium
verruculosum, Petromyces alliaceus und Talaromyces flavus.
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Beispiele
für nützliche
Zygomycota sind Stämme,
die zu der Ordnung Mucorales gehören,
vorzugsweise Stämme,
die zu den Familien Chaetocladiaceae und Mucoraceae gehören.
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Bevorzugte
Stämme
gehören
zu der Gattung Dichotomocladium, Actinomucor, Gongronella, Sporodiniella
und Mucor, insbesondere Dichotomocladium hesseltinei, Actinomucor
elegans, Gongronellla butleri, Sporodiniella umbellata und Mucor
miehei var minor.
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Ein
Beispiel für
einen Stamm von unbestimmter Taxonomie ist Vialaea insculpta.
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Beispiele
für Stämme, die
zu den mitosporischen Pilzen gehören,
sind Acrodontium crateriforme, Aureobasidium pullulans, Circinotrichum
sp, Cryptocline sp, Ellisiopsis sp, Epicoccum nugrum, Gliocladium
sp, Helicorhoidion irregulare, Hendersonia spp, Mariannaea sp, Microphaeropsis
sp, Ramularia sp, Sarcopodium sp, Spadicoides sto, Speiropsis pedatospora,
Spo rotrichum exile, Stilbella sp, Trichothecium sp, Trimmatostroma
abietes, Tubakia dryina, Wiesneriomyces sp und Zygosporium masonii.
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Bevorzugte
Bakterien
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In
einem anderen Aspekt betrifft die Erfindung ein neues XET-Präparat, das
durch Züchten
eines zur Gattung Bacillus gehörenden
Stamms herstellbar ist.
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Bevorzugte
Stämme
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Die
folgenden Stämme
wurden als XET-positiv befunden:
- 1. Dichotomocladium
hesseltinei. Zug.-Nr des Stamms: CBS 164.61. Klassifizierung: Zygomycota,
Mucorales, Chaetocladiaceae.
- 2. Actinomucor elegans. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 154.86. Klassifizierung: Zygomycota, Mucorales, Chaetocladiaceae.
- 3. Mucor miehei var minor. Zug.-Nr des Stamms: ATCC 36018. Klassifizierung:
Zygomycota, Mucorales, Mucoraceae.
- 4. Gongronella butleri. Ein Stamm von Gongronella butleri wurde
gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 448.97 hinterlegt.
Klassifizierung: Zygomycota, Mucorales, Chaetocladiaceae.
- 5. Sporodiniella umbellata. Zug.-Nr des Stamms: CBS 195.77.
Klassifizierung: Zygomycota, Mucorales, Mucoraceae.
- 6. Phyllosticta sp. isoliert von einem Blatt von Pithecolobium
sp aus China. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales,
Mycosphaellaceae.
- 7. Septoria sp. Ein Stamm von Septoria sp wurde gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 2. Januar 1996 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 831.95 hinterlegt.
Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Mycosphaellaceae.
- 8. Diplodia gossypina. Ein Stamm von Diplodia gossypina wurde
gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 12. März 1996 im Centraalbureau voor
Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 274.96 hinterlegt.
Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Botrysphaeriaceae.
- 9. Plowrightia ribesia. Isoliert von Ribes sp., Dänemark.
Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Dothioraceae.
- 10. Tubeufia amozonensis. Zug.-Nr des Stamms: ATCC 42524. Klassifizierung:
Ascomycota, Loculoascomycetes. Dothidiales, Tubeufiaceae.
- 11. Alternaria sp. Klassifizierung: Ascomycota, Loculociscomycetes,
Dothidiales, Pleosporaceae.
- 12. Embellisia hyacinthi. Zug.-Nr des Spezies IMI 211561. Klassifizierung:
Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales, Pleosporaceae.
- 13. Phoma neoloba. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes,
Dothidiales, Pleosporaceae.
- 14. Phoma tropica. Beispiel für eine Zug.-Nr der Spezies
CBS 537.66. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales,
Pleosporaceae.
- 15. Coniothyrium sp. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes,
Dothidiales, Leptosphaeriaceae
- 16. Coniothyrium olivaceoum. Beispiel für eine Zug.-Nr der Spezies:
CBS 304.68. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes, Dothidiales,
Leptosphaeriaceae
- 17. Coniothyrium dunckii. Klassifizierung: Ascomycota, Loculoascomycetes,
Dothidiales, Leptosphaeriaceae.
- 18. Tiarosporella phaseolina. Ein Stamm von Tiarosporella phaseolina
(Macrophomina sp) wurde gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 446.97 hinterlegt.
Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Rhytismatales, Rhytismataceae.
- 19. Tiarosporella sp. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes,
Rhytismatales, Rhytismataceae.
- 20. Galiella celebica. Isoliert aus einer Probe, gesammelt in
Japan. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Pezizales, Sarcosomataceae.
- 21. Pseudoplectania nigrella. Ein Stamm von Pseudoplectania
nigrella wurde gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 444.97 hinterlegt.
Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Pezizales, Sarcosomataceae.
- 22. Pyronema domesticum. isoliert aus einer Probe von Norwegen.
Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Pezizales, Pyronemataceae.
- 23. Oedocephalum sp. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes,
Pezizales, Ascobolaceae.
- 24. Botrytris cinerea. Ein Stamm von Botytris cinerea wurde
gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 447.97 hinterlegt.
Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes, Leotiales, Sclerotiniaceae.
- 25. Aposphaeria sp. Klassifizierung: Ascomycota, Discomycetes,
Leotiales, Sclerotiniaceae.
- 26. Pestalotia sp. Ein Stamm von Pestalotia sp. wurde gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 445.97 hinterlegt. Klassifizierung:
Ascomycota, Pyrenomycetes, Xylariales, Amphisphaeriaceae.
- 27. Pestalotiopsis sp. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes,
Xylariales, Amphisphaeriaceae.
- 28. Poronia punctata. Isoliert aus einer Probe von Schweden.
Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Xylariales, Xylariaceae.
- 29. Xylaria sp. isoliert aus einem Blatt der Palme, Sabal jamaicensis,
die in Mona, Jamaica wächst.
Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Xylariales, Xylariaceae
Xylariaceae.
- 30. Nodulisporium sp. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes,
Xylariales, Xylariaceae.
- 31. Fusarium solani. Isoliert aus einer Probe von Maiskorn von
Indien. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales,
Hypocreaceae.
- 32. Verticillizcm sp. Ein Stamm von Verticillium sp. wurde gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 2. Januar 1996 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 830.95 hinterlegt. Klassifizierung:
Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales, Hypocreaceae.
- 33. Volutella buxi. Zug.-Nr des Stamms: IMI 049467. Klassifizierung:
Ascomycota, Pyrenomycetes, Hypocreales, Hypocreaceae.
- 34. Chaetapiospora rhododendri. Klassifizierung: Ascomycota,
Pyrenomycetes, Xylariales, Xylariaceae, Hyponectriaceae.
- 35. Lulworthia uniseptata. Ein Stamm von Lusworthia uniseptata
wurde gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hin terlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 442.97 hinterlegt.
Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes, Halosphaeriales, Halosphaeriaceae.
- 36. Colletotrichum aculatum. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes,
Phyllachorales, Phyllachoraceae.
- 37. Colletotrichum crassipes. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes,
Phyllachorales, Phyllachoraceae.
- 38. Cytospora sp. Ein Stamm von Cytospora sp. wurde gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 23. Januar 1997 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 424.97 hinterlegt. Klassifizierung:
Ascomycota, Pyrenomycetes, Diaporthales, Valsaceae.
- 39. Cytospora sp. Ein Stamm von Cytospora sp. wurde gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 23. Januar 1997 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 425.97 hinterlegt. Klassifizierung:
Ascomycota, Pyrenomycetes, Diaporthales, Valsaceae.
- 40. Discula sp. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes,
Diaporthales, Valsaceae.
- 41. Phomopsis ilicis. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes,
Diaporthales, Valsaceae.
- 42. Phomopsis cirsii. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes,
Diaporthales, Valsaceae.
- 43. Coryneum castaneicola. Klassifizierung: Ascomycota, Pyrenomycetes,
Diaporthales, Melanconidaceae.
- 44. Seimatosporium lichenicola. Klassifizierung: Ascomycota,
Pyrenomycetes, Diaporthales, Melanconidaceae.
- 45. Aspergillus tamarii. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 821.72. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales,
Trichocomataceae.
- 46. Eurotium chevalieri. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 472.91. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales,
Trichocomataceae.
- 47. Penicillium capsulatum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 273.86. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales,
Trichocomataceae.
- 48. Penicillium olsonii. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 523.89. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales,
Trichocomataceae.
- 49. Penicillium pinophilum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 440.89. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales,
Trichocomataceae.
- 50. Penicillium roqueforti. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 167.91. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales,
Trichocomataceae.
- 51. Penicillium italicum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
IMI 078 681. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales,
Trichocomataceae.
- 52. Penicillium canescens. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 579.70. Isoliert von einer Salzmine in Ägypten. Klassifizierung: Ascomycota,
Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
- 53. Eupenicillium javanicum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 448.74. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales,
Trichocomataceae.
- 54. Penicillium verruculosum. Beispiel für eine Zug.-Nr des Stamms:
CBS 563.92. Klassifizierung: Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales,
Trichocomataceae.
- 55. Talaromyces f1avus. Zug.-Nr des Stamms: ATCC 52201. Klassifizierung:
Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
- 56. Petromyces alliaceus. Zug.-Nr des Stamms: CBS 511.69. Klassifizierung:
Ascomycota, Plectomycetes, Eurotiales, Trichocomataceae.
- 57. Trametes hirsuta. Isoliert aus einer Probe, gesammelt in
Dänemark.
Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Coriolales, Coriolaceae.
- 58. Schizophyllum sp. Ein Stamm von Schizophyllum sp. wurde
gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 28. Januar 1997 im Centraalbureau
voor Schimmelcultures (CBS) unter der Zugangsnummer CBS 443.97 hinterlegt.
Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Schizophyllales,
Schizophyllaceae.
- 59. Corticium roseum. Isoliert aus einer Probe, gesammelt in
Dänemark.
Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Aleurodiscales, Cortiaceae.
- 60. Tubulicrinis subulatus. Isoliert aus einer Probe, gesammelt
in Dänemark.
Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Xenasmatales, Tubulicrinaceae.
- 61. Stereum hirsutum. Isoliert aus einer Probe, gesammelt in
Dänemark.
Klassifizierung: Basidiomycota, Hymenomycetes, Stereales, Stereaceae.
- 62. Acrodontium crateriforme. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 63. Aureobasidizim pullulans. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 64. Circinotrichum sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 65. Cryptocline sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 66. Ellisiopsis sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 67. Epicoccum nigrum. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 68. Gliocladium sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 69. Helicorhoidion irregulare. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 70. Hendersonia sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 71. Mariannaea sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 72. Micropsphaeropsis sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 73. Ramularia sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 74. Sarcopodium sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 75. Spadicoides sto. Zug.-Nr des Stamms IMI 203428. Klassifizierung:
Mitosporic fungus.
- 76. Speiropsis pedatospora. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 77. Sporotrichum exile. Zug.-Nr des Stamms CBS 350.47. Klassifizierung:
Mitosporic fungus.
- 78. Stilbella sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 79. Trichothecium sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 80. Trimmatostroma abietes. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 81. Tubakia dryina. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 82. Wiesneriomyces sp. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 83. Zygosporium masonii. Klassifizierung: Mitosporic fungus.
- 84. Vialaea insculpta. Klassifizierung: ungewiss.
- 85. Bacillus alcalophilus. Ein Stamm von Bacillus alcalophilus
wurde gemäß dem Budapester
Vertrag der Internationalen Anerkennung der Hinterlegungen von Mikroorganismen
zum Zwecke von Patentverfahren am 12. Februar 1997 in Deutsche Sammlung
von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH unter der Zugangsnummer
DSM 11404 hinterlegt.
-
Herstellung von XET
-
Das
XET-Enzym der Erfindung kann durch aerobes Züchten der vorstehend erwähnten Mikrobenstämme auf
einem geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen enthaltenden
Nährmedium
wie auf dem Fachgebiet bekannten Medien hergestellt werden.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann das XET-Enzym der Erfindung durch aerobes Züchten eines transformierten
Wirtsmikroorganismus hergestellt werden, der die geeignete genetische
Information z. B. von einem der vorstehend erwähnten Stämme enthält. Demzufolge betrifft die
vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung eines Xyloglucanendotransglycosylaseenzyms
(XET) umfassend:
- a) Züchten in einem geeigneten Nährmedium
eines Wirtsorganismus, wobei der Wirtsorganismus mit einer DNA-Sequenz,
die eine XET von einem Mikroorganismus, ausgewählt aus der Gruppe bestehend
aus i) Pilzen und ii) Bazillusspezies, kodiert, transformiert ist
und der die mikrobielle XET unter die Herstellung des XET-Enzyms
leitenden Bedingungen exprimiert; und
- b) Wiedergewinnen des XET-Enzyms aus dem Nährmedium.
-
Solche
Transformanten können
durch auf dem Fachgebiet bekannte Verfahren hergestellt und gezüchtet werden:
-
Klonen einer
XET kodierenden DNA-Sequenz
-
Die
ein XET-Enzym der Erfindung kodierende DNA-Sequenz kann von einem
beliebigen die fragliche XET herstellenden Mikroorganismus unter
Verwendung von verschiedenen auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren
isoliert werden.
-
Zuerst
sollte eine Genom-DNA- und/oder cDNA-Genbank unter Verwendung von
Chromosomen-DNA oder Messenger-RNA von dem die zu untersuchende
XET herstelltenden Organismus konstruiert werden. Dann können, wenn
die Aminosäuresequenz
der XET bekannt ist, homologe markierte Oligonukleotidsonden synthetisiert
und zum Indentifizieren der XET kodierenden Klone von einer von
dem fraglichen Organismus hergestellten Genomgenbank oder cDNA verwendet
werden. In einer anderen Ausführungsform
könnte
eine markierte Oligonukleotidsonde, enthaltend zu einem bekannten
XET-Gen homologe Sequenzen als Sonde zum Identifizieren von XET-kodierenden
Klonen unter Verwendung von Hybridisierungs- und Waschbedingungen
von geringerer Strenge verwendet werden.
-
Noch
ein anderes Verfahren zum Identifizieren von XET-kodierenden Klonen
beinhaltet das Einfügen von
Genom-DNA- oder cDNA-Fragmenten in einen Expressionsvektor wie ein
Plasmid, Transformieren eines XET-negativen Wirtsorganismus mit
der erhaltenen DNA-Genbank, dann Auftragen der transformierten Zellen auf
Agarplatten und Exprimieren lassen der Klone die zu identifizierende
XET unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Versuchs.
-
In
einer anderen Ausführungsform
kann die das Enzym kodierende DNA-Sequenz durch etablierte Standardverfahren
z. B. das Phosphoamiditverfahren, beschrieben von S.L. Beaucage
und M.H. Caruthers in Tetrahedron Letters 22, 1981, S. 1859–1869, oder
das Verfahren, beschrieben von Matthes et al. in The EMBO J. 3,
1984, S. 801–805,
synthetisch hergestellt werden. Im Phosphoamiditverfahren werden
Oligonukleotide z. B. in einer automatischen DNA-Syntheseapparatur
synthetisiert, gereinigt, ausgehärtet,
gebunden und in geeignete Vektoren geklont.
-
Schließlich kann
die DNA-Sequenz vom gemischten genomischen und synthetischen Ursprung,
gemischtem synthetischen und cDNA-Ursprung oder gemischten genomischen
und cDNA-Ursprung durch Binden von Fragmenten des synthetischen,
genomischen oder cDNA-Ursprungs (wie geeignet, wobei die Fragmente
verschiedenen Teilen der gesamten DNA-Sequenz entsprechen) gemäß Standardtechniken
hergestellt werden. Die DNA-Sequenz kann auch durch Polymerasekettenreaktion
(PCR) unter Verwendung von spezifischen Primern z. B. wie in
US 4,683,202 oder R.K. Saiki
et al. in Science 239, 1988, S. 487–491 beschrieben, hergestellt
werden.
-
Expression
von XET
-
Erfindungsgemäß kann eine
XET kodierende DNA-Sequenz, die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren
oder durch ein beliebiges alternatives auf dem Fachgebiet bekanntes
Verfahren hergestellt ist, unter Verwendung eines Expressionsvektors,
der typischerweise Steuerungssequenzen einschließt, die einen Promoter, einen
Operator, eine Ribosombindungsstelle, ein Translationsinitiierungssignal
und gegebenenfalls ein Repressorgen und verschiedene Aktivatorgene
kodieren, in Enzymform exprimiert werden.
-
Bei
dem rekombinanten Expressionsvektor, der die ein XET-Enzym der Erfindung
kodierende DNA-Sequenz trägt,
kann es sich um einen beliebigen Vektor handeln, der günstigerweise
rekombinanten DNA-Verfahren unterzogen wird, und die Wahl des Vektors
hängt häufig von
der Wirtszelle ab, in welche er einzubringen ist. Folglich kann
es sich bei dem Vektor um einen autonom replizierenden Vektor, z.
B. einen als extrachromosomale Einheit vorliegenden Vektor, wobei
dessen Replikation von der Chromosomenreplikation unabhängig ist,
z. B. ein Plasmid, einen Bakteriophagen oder ein extrachromosomales
Element, ein Mi nichromosom oder ein künstliches Chromosom handeln.
In einer anderen Ausführungsform
kann es sich bei dem Vektor um einen handeln, der beim Einbringen
in eine Wirtszelle in das Wirtszellengenom integriert ist und zusammen
mit dem(n) Chromosom(en), in welche er integriert wurde, repliziert.
-
Im
Vektor sollte die DNA-Sequenz funktionsfähig an eine geeignete Promotersequenz
gebunden sein. Bei dem Promoter kann es sich um eine beliebige DNA-Sequenz handeln,
die transkriptionale Aktivität
in der Wirtszelle der Wahl zeigt, und kann von Proteine entweder
homolog oder heterolog zu der Wirtszelle kodierenden Genen abgeleitet
sein. Beispiele für
geeignete Promoter zum Leiten der Transkription der eine XET der Erfindung
kodierenden DNA-Sequenz insbesondere in einen Bakterienwirt, sind
Promoter des lac operons von E. coli, die Agarasegen-dagA-Promoter
von Streptomyces coelicolor, die Promoter des α-Amylasegens (amyL) von Bacillus licheniformis,
die Promoter des maltogenen Amylasegens (amyM) von Bacillus stearothermophilus,
die Promoter der α-Amylase (amyQ) von
Bacillus Amyloliquefaciens, die Promoter der xylA- und xylB-Gene
von Bacillus subtilis usw. Zur Transkription in einen Pilzwirt sind
Beispiele für
nützliche
Promoter diejenigen, die von Genen abgeleitet sind, die TAKA-Amylase
von A. oryzae, Aspartamproteinase von Rhizomucor miehei, neutrale α-Amylase
von A. niger, säurestabile α-Amylase
von A. niger, Glucoamylase von A. niger, Lipase von Rhizomucor miehei,
alkalische Protease von A. oryzae, Triosephosphatisomerase von A.
oryzae oder Acetamidase von A. nidulans kodieren.
-
Der
Expressionsvektor der Erfindung kann auch einen geeigneten Transkriptionsterminator
und in Eukaryoten funktionsfähig
an die das XET-Enzym der Erfindung kodierenden DNA-Sequenz gebundene
Polyadenylierungssequenzen umfassen. Terminierungs- und Polyadenylierungssequenzen
können
geeigneterweise von denselben Quellen wie der Promoter abgeleitet
sein.
-
Der
Vektor kann ferner eine DNA-Sequenz umfassen, die es dem Vektor
ermöglicht,
dass er in die fragliche Wirtszelle repliziert. Beispiele für solche
Sequenzen sind die Replikationsursprünge der Plasmide pUC19, pACYC177,
pUB110, pE194, pAMB1 und pIJ702.
-
Der
Vektor kann auch eine selektierbare Markierung, z. B. ein Gen, dessen
Produkt einen Defekt in der Wirtszelle ergänzt, wie die dal-Gene von B.
subtilis oder B. licheniformis, oder eine, die Anstibiotikumresistenz
wie Ampicillin-, Kanamycin-, Chloramphenicol- oder Tetracyclinresistenz
verleiht, umfassen. Weiterhin kann der Vektor Aspergillus-Selektionsmarkierungen
wie amdS, argB, niaD und sC umfassen, wobei eine Markierung eine
Zunahme der Hygromycinresistenz bereitstellt, oder die Selektion
kann durch eine wie z. B. in WO 91/17243 beschriebene Kotransformation
erzielt werden.
-
Während eine
intrazelluläre
Expression in einigen Gesichtspunkten, z. B. unter Verwendung von
bestimmten Bakterien als Wirtszellen vorteilhaft sein kann, ist
es allgemein bevorzugt, dass die Expression extrazellulär erfolgt.
-
Verfahren,
die zum Konstruieren von Vektoren der Erfindung geeignet sind, die
ein XET-Enzym kodieren und den Promoter, Terminator bzw. andere
Elemente enthalten, sind dem Fachmann bekannt (vgl. z. B. Sambrook
et al. in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausgabe, Cold
Spring Harbor, 1989).
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Die
entweder ein DNA-Konstrukt oder einen wie vorstehend definierten
Expressionsvektor der Erfindung umfassende Zelle der Erfindung wird
bei der rekombinanten Herstellung einer XET der Erfindung vorteilhaft
als Wirtszelle verwendet. Die Zelle kann mit dem die XET kodierenden
DNA-Konstrukt der Erfindung günstigerweise
durch Integrieren des DNA-Konstrukts (in einer oder mehreren Kopien)
in das Wirtschromosom transformiert werden. Es ist allgemein anzunehmen,
dass diese Integration vorteilhaft ist, da die DNA-Sequenz in der
Zelle wahrscheinlicher stabil beibehalten wird. Die Integration
der DNA-Konstrukte in das Wirtschromosom kann gemäß herkömmlichen
Verfahren, z. B. durch homologe oder heterologe Rekombination durchgeführt werden.
In einer anderen Ausführungsform
kann die Zelle mit einem wie vorstehend beschriebenen Expressionsvektor
in Verbindung mit verschiedenen Wirtszelltypen transformiert werden.
-
Bei
der Zelle der Erfindung kann es sich um eine Zelle eines höheren Organismus
wie eines Säugers oder
eines Insekts handeln, ist jedoch vorzugsweise eine Mikrobenzelle,
z. B. eine Bakterien- oder Pilz- (einschließlich Hefe-) Zelle.
-
Beispiele
für geeignete
Bakterien sind grampositive Bakterien wie Bacillus subtilis, Bacillus
licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus,
Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans,
Bacillus circulars, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus
thuringiensis oder Streptomyces lividans oder Streptomyces murinus,
oder gramnegative Bakterien wie E. coli. Die Transformation der
Bakterien kann z. B. durch Protoplasttransformation oder unter Verwendung
von kompetenten Zellen in einer an sich bekannten Weise bewirkt
werden.
-
Der
Hefeorganismus kann vorteilhaft aus einer Spezies von Saccharomyces
oder Schizosaccharomyces, z. B. Saccharomyces cerevisiae ausgewählt werden.
Der Fadenpilz kann vorteilhaft zu einer Spezies von Aspergillus,
z. B. Aspergillus oryzae oder Aspergillus niger gehören. Pilzzellen
können
durch ein Verfahren transformiert werden, das Protoplastbildung
und Transformation der Protoplaste, gefolgt von Regenerierung der
Zellwand in einer an sich bekannten Weise beinhaltet. Ein geeignetes
Verfahren zur Transformation von Aspergillus-Wirtszellen ist in
EP 238 023 beschrieben.
-
In
noch einem anderen Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein
Verfahren zur Herstellung eines XET-Enzyms der Erfindung, wobei
das Verfahren das Züchten
einer wie vorstehend beschriebenen Wirtszelle unter die Herstellung
der XET leitenden Bedingungen und Gewinnen der XET von den Zellen
und/oder aus dem Kulturmedium umfasst.
-
Bei
dem zum Züchten
der Zellen verwendeten Medium kann es sich um ein beliebiges herkömmliches Medium
handeln, das zum Wachsen der fraglichen Wirtszelle und Erhalt von
Expression der XET der Erfindung geeignet ist. Geeignete Medien
sind von kommerziellen Lieferanten verfügbar oder können gemäß veröffentlichten Rezepturen (z.
B. wie beschrieben in den Katalogen der American Type Culture Collection)
hergestellt werden.
-
Die
aus den Wirtszellen sekretierte XET kann günstigerweise durch bekannte
Verfahren, einschließlich
Abtrennen der Zellen von dem Medium durch Zentrifugation oder Filtration,
und Ausfällen
von proteinhaltigen Komponenten des Mediums mittels eines Salzes
wie Ammoniumsulfat, gefolgt von der Verwendung von chromatographischen
Verfahren wie Ionenaustauschchromatographie, Affinitätschromatographie
oder dergleichen, aus dem Kulturmedium gewonnen werden.
-
Industrielle
Anwendungen
-
Erfindungsgemäß kann ein
Zellulosematerial nach Behandlung mit einem XET-Enzym verbesserte Stärken und/oder verbesserte Formbewahrungseigenschaften
und/oder verbesserte Antischrumpfungseigenschaften erhalten. Das
XET-Enzym weist die Fähigkeit
auf, die an Zellulosefasern wasserstoffgebundenen Xyloglucanmoleküle umzuordnen
und zu binden, wodurch die vorstehend erwähnten Merkmale erzielt werden können.
-
Zur
Verbesserung der Wirkung des XET-Enzyms kann es in manchen Fällen vorteilhaft
sein, Xyloglucan dem Zellulosematerial zuzusetzen, wodurch die Enzyme
mehr Zellulosematerial zusammenbinden können.
-
Die
Behandlung des Zellulosematerials mit dem XET-Enzym kann in Wasser
oder in Wasser in Gegenwart von bestimmten Komponenten wie eines
Puffers und/oder eines Netzmittels und/oder eines Stabilisators
und/oder eines Polymers und/oder eines die Wasseraktivität reduzierenden
organischen Bestandteils wie DMSO durchgeführt werden.
-
Bei
dem Puffer kann es sich geeigneterweise um einen Phosphat-, Borat-,
Citrat-, Acetat-, Adipat-, Triethanolamin-, Monoethanolamin-, Diethanolamin-,
Carbonat(insbesondere als Alkalimetall- oder Erdalkalimetall-, insbesondere
Natrium- oder Kaliumcarbonat-, Ammonium- und HCl-Salz), Diamin-,
insbesondere Diaminoethan-, Imidazol-, Tris- oder Aminosäurepuffer
handeln.
-
Das
Netzmittel dient zur Verbesserung der Benetzungsfähigkeit
des Zellulosematerials. Das Netzmittel ist vorzugsweise vom nichtionischen
oberflächenaktiven
Typ.
-
Bei
dem Stabilisator kann es sich um ein das XET-Enzym stabilisierendes
Mittel handeln.
-
Erfindungsgemäß kann die
Konzentration von XET in wässrigem
Medium 0,01–1000 μg Enzymprotein pro
Gramm Zellulosematerial, vorzugsweise 0,05–100 μg Enzymprotein pro Gramm Zellulosematerial
betragen.
-
Es
ist allgemein geeignet, das Reaktionsmedium (enthaltend das Zellulosematerial
und das XET-Enzym) für
eine Dauer von mindestens wenigen Minuten zu inkubieren. Eine Inkubationszeit
von 1 Minute bis 20 Stunden ist im allgemeinen geeignet, insbesondere
ist häufig
eine Inkubationszeit von 30 Minuten bis 10 Stunden bevorzugt.
-
Die
Temperatur des Reaktionsmediums im Verfahren der Erfindung kann
geeigneterweise im Bereich von 10–90°C, insbesondere im Bereich von
15–70°C, wie für das fragliche
XET-Enzym geeignet, liegen.
-
Die
Erfindung wird weiter in den folgenden, nicht beschränkenden
Beispielen veranschaulicht.
-
Beispiel 1
-
Screenen nach positiven
XET-Stämmen
-
- Medien
PD-Agar: | 39
g Kartoffeldextroseagar, DIFCO 0013; Zusatz von deionisiertem Wasser
auf 1000 ml
Autoklavenbehandlung bei 121 °C für eine Dauer von 15–20 Min. |
YPG-Agar: | 4
g Hefeextrakt (DIFCO 0127),
1 g KH2PO4 (Merck 4873),
0,5 g MgSO4 7H2O (Merck 5886)
15 g Dextrose (Roquette
101–0441)
20
g Agar (Merck 1614)
deionisiertes Wasser auf 1000 ml
Autoklavenbehandlung
bei 121°C
für eine
Dauer von 15–20
Min. |
MEA: | 20
g Malzextraktpulver (DIFCO 0186)
1 g Pepton (DIFCO 0118)
20
g Glucose (Roquette France 1010441)
20 g Agar (Merck 1614)
deionisiertes
Wasser auf 1000 ml
Autoklavenbehandlung bei 121 °C für eine Dauer
von 15 Min. |
Medium
A pro Kolben: | 30
g Weizenflocken, 45 ml der folgenden Lösung: 10 g Rofec (Roquette
101–0441),
10 g NH4NO3 (Merck 1187),
10 g KH2PO4 (Merck
4873), 40 g Solcafloc (Dicacel hergestellt von Dicalite-Europe-Nord, 9000 Gent,
Belgien), 0,75 g MgSO4 7H2O
(Merck 5886), 15 g CaCO3, Leitungswasser
bis 1000 ml, pH eingestellt auf 6,5.
Autoklavenbehandlung für eine Dauer
von 40 Min. bei 121 °C. |
Medium
B: | 20
g Sojabohnenmehl, 5 g Maltodex 01, (Roquette 101–7845), 15 g Weizenflocken,
3 g Pepton (DIFCO 0118), 10 g Zellulose avicel (Merck 2331), 0,2
ml Pluronic (PE-6100, 101–3068),
1 g Olivenöl,
deionisiertes Wasser auf 1000 ml. 100 ml in einem Erlenmeyer-Kolben mit einem
500 ml und zwei Scheidewänden.
Autoklavenbehandlung
bei 121°C
für eine
Dauer von 40 Min. |
Medium
C: | 100
g Saccharose, 40 g Sojabohnenmehl, 10 g Na2HPO4 12H2O (Merck 6579),
0,1 ml Pluronic (PE 6100), Leitungswasser auf 1000 ml·0,5 g
CaCO3 in einem Erlenmeyer Kolben mit zwei
Scheidewänden
mit 100 ml Medium. Autoklavenbehandlung bei 121°C für eine Dauer von 40 Min. Direkt
vor der Verwendung Zugabe von 10 ml 1M NaHCO3 pH
9 pro 100 ml Medium. |
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FERMENTATIONSVERFAHREN
-
Die
Pilzstämme
wurden auf Agar in Petrischalen (9 cm) oder auf Schrägflächen mit
PDA, YPG oder MEA (siehe Liste der Medien) gehalten. Eine Agarschrägfläche wurde
mit 10 ml sterilem destilliertem Wasser ausgewaschen, und 3 ml wurden
zum Beimpfen eines Schüttelkolben
verwendet.
-
Man
ließ die
Pilzstämme
in Schüttelkolben
unter den folgenden Wachsbedingungen wachsen:
Medien: | A
und B (siehe Liste der Medien) |
Temperatur: | 26°C |
RPM: | A:
stationär
B:125–200 |
Inkubationszeit: | A:
6 bis 30 Tage
B: 2 bis 21 Tage: |
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Das
Bakterienisolat wurde auf Agarschrägflächen mit TY-Agar, pH 9, gehalten,
das aus Folgendem bestand:
20 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 0,7
ml einer 1%igen Lösung
von FeCl2·4H2O,
0,1 ml einer 1%igen Lösung
von MnCl2·4H2O,
1,5 ml einer 1%igen Lösung
von MgSO4·7H2O,
20 g Agar und deionisiertes Wasser auf 1000 ml. Autoklavenbehandlung
bei 121°C
für eine
Dauer von 20 Min. Vor Gießen
in die Platten Zugabe von 10 ml steriler 1M NaHCO3,
pH 9, auf 100 ml Agar.
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Die
Schrägflächen wurden
bei 30°C
für eine
Dauer von 4 Tagen inkubiert. Eine Schrägfläche wurde mit 10 ml sterilem
destilliertem Wasser ausgewaschen, und 3 ml wurden zum Beimpfen
jedes Kolbens verwendet.
-
Man
ließ das
Bakterium im Medium C enthaltenden Schüttelkolben bei 30°C für eine Dauer
von 4 Tagen bei 300 UpM wachsen.
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AKTIVITÄTSTEST:
-
Die
in B und C hergestellten Kulturbrühen wurden bei 10.000 UpM für eine Dauer
von 10 Minuten zentrifugiert. Die Überstände wurden auf XET-Aktivität getestet.
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Jedem
Kolben mit Weizenflocken und vollständig gewachsener Kultur wurden
200 ml Leitungswasser zugesetzt und dies bei 200 UpM für eine Dauer
von 2 Stunden geschüttelt.
Die Kulturbrühe
wurde dann zentrifugiert und der Überstand auf XET getestet.
-
XET-ANALYSE
-
Die
Proben wurden unter Verwendung des vorstehend beschriebenen „Punkt-Tupfen-Tests" analysiert.
-
ERGEBNISSE
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Unter
Verwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde 1 Bacillus
sp. und mehrere zu verschiedenen taxonomischen Gruppen gehörende Pilze
als positiv befunden. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle
dargestellt.
-
Der
Bacillus alcalophilus war positiv, als er auf Medium C, pH 9 (siehe
Liste der Medien) für
eine Dauer von 4 Tagen bei 30°C
bei 300 UpM wuchs.
-
-
-
-
-
Beispiel 2
-
Reinigung und Charakterisierung
der XET von Dichotomocladium hesseltinei.
-
15
PDA-Agarschrägflächen wurden
mit Dichotomocladium hesseltinei (CBS 164.61) beimpft und bei 26°C für eine Dauer
von 7 Tagen inkubiert. Sie wurden mit etwa 250 ml sterilem destilliertem
Wasser mit 0,1% Tween 80 ausgewaschen und zum Beimpfen von 80 Medium
B (2–3
ml/Kolben) enthaltenden Schüttelkolben verwendet.
Die Kolben wurden bei 200 UpM, 26°C
für eine
Dauer von 5 Tagen geschüttelt,
wonach die Kulturbrühe
bei 4000 UpM für
eine Dauer von 15 Minuten zentrifugiert wurde.
-
Der
Xyloglucanendotransglucosylase (XET) enthaltende Überstand
wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens gereinigt:
Eine
Filterhilfe wurde der Kulturbrühe
zugesetzt, die durch ein Filtergewebe filtriert wurde. Diese Lösung wurde weiter
durch eine Seitz-Tiefen-Filterplatte filtriert, wodurch eine klare
Lösung
erhalten wurde. Der pH-Wert des Filtrats wurde auf pH 8,0 eingestellt
und das Filtrat mit deionisiertem Wasser verdünnt, um dieselbe Leitfähigkeit
wie 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, zu erhalten.
-
Das
XET-Enzym wurde auf eine Säule
des Typs Q-Sepharose FF, äquilibriert
in 20mM Tris/HCl, pH 8,0, aufgebracht und das Enzym mit einem zunehmenden
linearen NaCl-gradierenden (0→ 0,5M)
eluiert. Die XET-Aktivität
eluierte als einzelner Peak. Das gepoolte XET wurde in 20 mM Tris/HCl,
pH 8,0, auf eine Säule des
Typs Sephadex G25 überführt und
wieder auf einer Säule
des Typs Q-Sepharose FF, äquilibriert
in 20mM Tris/HCl, pH 8,0, chromatographiert. Die Säule wurde
mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,2 M)
eluiert. XET-enthaltende Fraktionen wurden gepoolt, und (NH4)2SO4 wurde
auf eine Endkonzentration von 1,4 M zugesetzt. Eine Säule des
Typs Phenyl Toyopearl 6505 wurde in 1,4 M (NH4)2SO4, 10 mM Bernsteinsäure, pH
7,0, äquilibriert,
und das XET-Enzym wurde auf diese Säule aufgebracht und mit einem
abnehmenden linearen (NH4)2SO4-Gradienten (1,4→ 0 M) eluiert. XET-enthaltende
Fraktionen wurden gepoolt und auf einer Ultrafiltrationszelle mit
einem Abschnitt von 10 kDa einer regenerierten Zellulosemembran
eingeengt. Das eingeengte Enzym wurde auf eine Größenausschlusssäule des
Typs Superdex 200, äguilibriert
in 100 mM H3BO3,
10 mM Dimethylglutarsäure,
2 mM CaCl2, pH 7,0, aufgebracht. Die von
der Säule
des Typs Superdex 200 eluierten Fraktionen wurden durch SDS-PAGE analysiert und
reine XET Fraktionen gepoolt.
-
Die
XET von Dichotomocladium hesseltinei durchlief die SDS-PAGE als
Bande mit Mr = 24 kDa. N-terminale Aminosäuresequenzen
der Komponente mit 24 kDa wurden durch Verfolgen von SDS-PAGE und
Elektroblotten auf PVDF-Membran durchgeführt. Die folgende N-terminale
Aminosäuresequenz
(SEQ ID Nr. 1) konnte gefolgert werden:
Ala-Glu-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Thr-Gln-Thr-Val-Gly-Asn-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ala.
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein die in SEQ-ID Nr. 1 dargestellte
Aminosäuresequenz
umfassendes mikrobielles XET-Enzym oder ein XET, das zumindest zu
80% homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ-ID
Nr. 1 ist, vorzugsweise mindestens zu 85% homolog zu SEQ-ID Nr.
1, stärker
bevorzugt mindestens zu 90% homolog zu SEQ-ID Nr. 1, noch stärker bevorzugt
mindestens zu 95% homolog zu SEQ-ID Nr. 1, insbesondere mindestens
zu 98% homolog zu SEQ-ID Nr. 1 ist.
-
Ein
Polypeptid wird als X% homolog zu der Stamm-XET erachtet, wenn ein
Vergleich der entsprechenden Aminosäuresequenz, der über bekannte
Algorithmen, wie denjenigen, beschrieben durch Lipman und Pearson
in Science 227, 1985, S. 1435, durchgeführt wird, eine Identität von X%
zeigt.
-
Zudem
ergaben Massenspektrometrieanalysen der XET von Dichotomocladium
hesseltinei einen Wert von 23 006 Da.
-
Beispiel 3
-
Reinigung
und Charakterisierung von XET von Tiarosporella phaseolina
-
15
PDA-Agarschrägflächen wurden
mit Tiarosporella phaseolina (CBS 446.97) beimpft und bei 26°C für eine Dauer
von 7 Tagen inkubiert. Sie wurden mit etwa 250 ml sterilem destilliertem
Wasser mit 0,1% Tween 80 ausgewaschen und zum Beimpfen von 80 Medium
B (2–3
ml/Kolben) enthaltenden Schüttelkolben
verwendet. Die Kolben wurden bei 200 UpM, 26°C für eine Dauer von 7 Tagen geschüttelt, wonach
die Kulturbrühe bei
4000 UpM für
eine Dauer von 15 Minuten zentrifugiert wurde.
-
Der
Xyloglucanendotransglucosylase (XET) enthaltende Überstand
wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens gereinigt.
-
Eine
Filterhilfe wurde der Kulturbrühe
zugesetzt, die durch ein Filtrationsgewebe filtriert wurde. Diese Lösung wurde
weiter durch eine Seitz-Tiefenfilter-Platte filtriert, wodurch eine
klare Lösung
erhalten wurde. Das Filtrat wurde durch Ultrafiltration auf Polyethersulfonmembranen
mit einem Abschnitt von 3 kDa, gefolgt von Dialfiltration mit destilliertem
Wasser zum Reduzieren der Leitfähigkeit
eingeengt. Der pH-Wert des eingeengten Enzyms wurde auf pH 5,0 eingestellt.
Die Leitfähigkeit
des eingeengten Enzyms betrug 1,7 mS/cm.
-
Das
XET-Enzym wurde auf eine Säule
des Typs S-Sepharose FF, äquilibriert
in 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5,0, aufgebracht,
und das Enzym mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,5 M)
eluiert. Die XET-Aktivität
eluierte als einzelner Peak. Die gepoolte XET wurde in 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 4,0, durch Dialyse überführt. Das
dialysierte Enzym wurde auf eine Säule des Typs SOURCE 305, äquilibriert
in 20mM CH3COOH/NaOH, pH 4,0, aufgebracht.
Nach Waschen der Säule
wurde die XET-Aktivität
mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,5 M)
eluiert. Fraktionen mit XET-Aktivität wurden gepoolt und gegen
20 mM Tris/HCl, pH 8,0, dialysiert. Das dialysierte Enzym wurde
auf eine Säule
des Typs SOURCE 30Q, äquilibriert
in 20 mM Tris/HCl, pH 8,0, aufgebracht. Nach Waschen der Säule wurde
die XET-Aktivität
mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,5 M)
eluiert. Fraktionen mit XET-Aktivität wurden gepoolt und auf einer
Ultrafiltrationszelle mit einer regenerierten Zellulosemembran mit
einem 10kDa-Abschnitt eingeengt. Das eingeengte Enzym wurde auf
eine Größenausschlusssäule des
Typs Superdex 200, äquilibriert
in 100 mM H3BO3,
10 mM Dimethylglutarsäure,
2 mM CaCl2, pH 7,0, aufgebracht. Die Fraktionen,
die von der Säule
des Typs Superdex 200 eluierten, wurden durch SDS-PAGE analysiert
und reine XET-Fraktionen gepoolt.
-
Die
XET von Tiarosporella phaseolina durchlief die SDS-PAGE als Bande
mit Mr = 24 kDa. Ein Sequenzieren der N-terminalen
Aminosäure
der Komponente mit 24 kDa wurde durch Verfolgen von SDS-PAGE und
Elektroblotten auf einer PVDF-Membran durchgeführt. Die folgende N-terminale
Aminosäuresequenz (SEQ
ID Nr. 2) konnte gefolgert werden:
Xaa-Asp-Fhe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Asn-val-Lys-Asn-Gly-Pro-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Asn-Asn-Leu-Gly-Gly-Lys
-
Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein die in SEQ-ID Nr. 2 dargestellte
Aminosäuresequenz
umfassendes mikrobielles XET-Enzym oder ein XET, das zumindest zu
80% homolog zu der Aminosäuresequenz SEQ-ID
Nr. 2 ist, vorzugsweise mindestens zu 85% homolog zu SEQ-ID Nr.
2, stärker
bevorzugt mindestens zu 90% homolog zu SEQ-ID Nr. 2, noch stärker bevorzugt
mindestens zu 95% homolog zu SEQ-ID Nr. 2, insbesondere mindestens
zu 98% homolog zu SEQ-ID Nr. 2 ist.
-
Ein
Polypeptid wird als X% homolog zu der Stamm-XET erachtet, wenn ein
Vergleich der entsprechenden Aminosäuresequenz, der über bekannte
Algorithmen, wie denjenigen, beschrieben durch Lipman and Pearson
in Science 227, 1985, Seite 1435, durchgeführt wird, eine Identität von X%
zeigt.
-
Beispiel 4
-
Reinigung und Charakterisierung
von XET von Pseudoplectania nigrella
-
15
PDA-Agarschrägflächen wurden
mit Pseudoplectania nigrella (CBS 444.97) beimpft und bei 26°C für eine Dauer
von 7 Tagen inkubiert. Sie wurden mit etwa 250 ml sterilem destilliertem
Wasser mit 0,1% Tween 80 ausgewaschen und zum Beimpfen von 80 Medium
B (2–3
ml/Kolben) enthaltenden Schüttelkolben
verwendet. Die Kolben wurden bei 200 UpM, 26°C für eine Dauer von 7 Tagen geschüttelt, wonach
die Kulturbrühe bei
4000 UpM für
eine Dauer von 15 Minuten zentrifugiert wurde.
-
Der
Xyloglucanendotransglucosylase (XET) enthaltende Überstand
wurde unter Verwendung des folgenden Verfahrens gereinigt.
-
Eine
Filterhilfe wurde der Kulturbrühe
zugesetzt, die durch ein Filtrationsgewebe filtriert wurde. Diese Lösung wurde
weiter durch eine Seitz-Tiefenfilter-Platte filtriert, wodurch eine
klare Lösung
erhalten wurde. Der pH-Wert des Filtrats wurde auf pH 5,0 eingestellt
und das Filtrat mit deionisiertem Wasser verdünnt, um dieselbe Leitfähigkeit
wie 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5,0 zu erhalten.
-
Das
XET-Enzym wurde auf eine Säule
des Typs S-Sepharose FF, äquilibriert
in 20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5,0, aufgebracht,
und das Enzym mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,25 M)
eluiert. Die XET-Aktivität
eluierte als einzelner Peak. Die gepoolte XET wurde in 20 mM Hepes/NaOH,
pH 7,0, auf eine Säule
des Typs Sephadex G25 überführt und
auf eine Säule
des Typs Q-Sepharose FF, äquilibriert
in 20 mM Hepes/NaOH, pH 7,0, aufgebracht. Die Säule wurde mit einem zunehmenden
linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,5
M) elu iert. Fraktionen mit XET-Aktivität wurden gepoolt und gegen
20 mM CH3COOH/NaOH, pH 5,0, dialysiert.
Eine Säule
des Typs SOURCE 15S wurde in 20mM CH3COOH/NaOH,
pH 5,0, äquilibriert
und das dialysierte Enzym aufgebracht. Nach Waschen der Säule wurde
die XET-Aktivität
mit einem zunehmenden linearen NaCl-Gradienten (0→ 0,2 M)
eluiert. Fraktionen mit XET-Aktivität wurden
gepoolt und auf einer Ultrafiltrationszelle mit einer regenerierten
Zellulosemembran mit einem Abschnitt von 10kDa eingeengt. Das eingeengt
Enzym wurde auf eine Größenausschlusssäule des
Typs Superdex 200, äquilibriert
in 20 mM CH3COOH/NaOH, 100 mM NaCl, pH 5,0,
aufgebracht. Die Fraktionen, die von der Säule des Typs Superdex 200 eluierten,
wurden durch SDS-PAGE analysiert und reine XET-Fraktionen gepoolt.
-
Die
XET von Pseudoplectania nigrella durchlief die SDS-PAGE als Bande
mit Mr = 58 kDa. Nach SDS-PAGE und Elektroblotten
auf einer PVDF-Membran wurde gefunden, dass die Komponente mit 58
kDa einen gesperrten N-Terminus aufwies.
-
Ein
hochreines Präparat
der XET von Pseudoplectania nigrella wurde reduziert und alkyliert.
Eine Probe des Enzyms wurde dann mit Lys-C zersetzt. Peptide wurden
durch RP-HPLC auf einer langen Vydac C18 in einem SMART-System unter
Verwendung von TFA/AN isoliert und wieder in TFA/Isopropanol gereinigt.
Selektierte Peptide wurden durch Edman-Zersetzung analysiert.
-
In
Tabelle 1 sind die von 8 Peptiden erhaltenen Sequenzen dargestellt.
Zwei Peptide wurden als zu Glucanase- und Xylanaseähnlichen
Enzymen homolog befunden, jedoch zeigte der Hauptteil keine oder
nur irrelevante Homologie zu bekannten Sequenzen.
-
Tabelle
1. Sequenz von Lys-C-Peptiden von XET von P.nigrella
-
Beispiel 5
-
pH-Profil der XET von
Dichotomocladium hesseltinei, Tiarosporella phaseolina und Pseudoplectania
nigrella und Xyloglucanase
-
Die
Xyloglucanendotransglycosylase von Dichotomocladium hesseltinei,
Tiarosporella phaseolina und Pseudoplectania nigrella wurden auf
ihr pH-Profil überprüft. Die
reinen Enzyme wurden in Puffer im Bereich von pH 3,0 bis 11,0 verdünnt, so
dass es sich bei der Proteinkonzentration um dieselbe Endkonzentration,
d. h. A280 = 0,004 handelte. Die Beispiele
wurden dann unter Verwendung des XET-Punkt-Tupfen-Tests (früher beschrieben)
auf XET getestet. Die fluoreszierenden Tupfen wurden visuell bewertet
und von 0 bis 10 unterteilt. Bei den in 1 verwendeten
Einheiten handelt es sich deshalb um willkürliche Einheiten.
-
Es
ist aus 1 ersichtlich, dass die XET
zwischen pH 3 und pH 11, insbesondere zwischen pH 4 und pH 9 aktiv
ist.
-
Alle
der Isolate mit XET-Aktivität
wurden ebenso auf Xyloglucanase-Aktivität getestet. Das Verhältnis zwischen
den 2 Enzymen variierte von Isolat zu Isolat. Die Enzyme wurden
in denselben Puffern wie für
die pH-Profil-Aktivität
der XET verdünnt,
bis die Endproteinkonzentration dieselbe war, und auf Xyloglucanaseaktivität getestet.
AZCL-Xyloglucan wurde verwendet. Das verwendete Xyloglucanase-Verfahren
lautete wie folgt:
Substrat: 0,4% AZCL-Xyloglucan, suspendiert
in entmineralisiertem Wasser
Puffer: 100 mM H3BO3, 10 mM Dimethylglutarsäure, 2 mM CaCl2,
pH 7
Analyse:
- – Ein Eppendorf-Thermomischer
wird bei 40°C
eingeschaltet.
- – 500 μl 0,4%iges
AZCL-Xyloglucan werden mit 500 μl
Puffer gemischt und auf Eis gegeben.
- – 20 μl Enzym werden
zugesetzt und in den Eppendorf-Thermomischer bis zum Erreichen einer
stabilen Farbe inkubiert.
- – Die
Proben werden zurück
auf das Eisbad gegeben, um eine weitere Reaktion während des
Zentrifugierens der Proben bei 0° C
zu vermeiden.
- – Proben
mit 200 μl
werden auf Mikrotiterplatten überführt und
die blaue Farbe bei 650 nm gemessen.
-
Die
Ergebnisse sind in 2 dargestellt.
-
Beispiel 6
-
Klonen und Expression
eines Xyloglucanendotransglycosylase-Enzyms (XET) von Tiarosporella
phaseolina CBS Nr. 446.97
-
Hinterletge Organismen:
-
- Tiarosporella phaseolina CBS Nr. 446.97
-
Andere Stämme:
-
Hefestamm:
Bei dem verwendeten Stamm von Saccharomyces cerevisiae handelte
es sich um W 3124 (van den Hazel, H.B; Kielland-Brandt, M.C.; Winther,
J.R. in Eur. J. Biochem., 207, 207–283, 1992; (MATa; ura 3–52; leu
2–3, 112;
his 3-D200; pep 4–1137;
prcl::HIS3; prbl::LEU2; cir+).
E. coli Stamm: DH10B (Life Technologies)
-
Plasmide:
-
Bei
dem Aspergillus-Expressionsvektor pHD414 handelt es sich um ein
Derivat des Plasmids p775 (beschrieben in
EP 238 023 ). Die Konstruktion von pHD414
ist ferner in WO 93/11249 beschrieben.
pYES 2,0 (Invitrogen)
-
Medien:
-
- YPD:
10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H2O
auf 900 ml. Im Autoklaven behandelt, Zugabe von 100 ml 20%iger Glukose (steril
filtriert).
- YPM:
10 g Hefeextrakt, 20 g Pepton, H2O
auf 900 ml. Im Autoklaven behandelt, Zugabe von 100 ml 20%igen Maltodextrin
(steril filtriert).
- 10 × Basalsalz:
75
g Hefestickstoffbase, 113 g Bernsteinsäure, 68 g NaOH, H2O
auf 1000 ml, steril filtrert.
- SC-URA:
100 ml 10 × Basalsalz,
28 ml 20%ige Casaminosäuren
ohne Vitamine, 10 ml 1%iges Tryptophan, H2O
auf 900 ml, im Autoklaven behandelt, Zugabe von 3,6 ml 5%igem Threonin
und 100 ml 20%iger Glukose oder 20%iger Galactose.
- SC-Agar:
SC-URA, Zugabe von 20 g/l Agar.
- AZCL Xyloglucan (Megazyme, Australien)
-
Expressionsklonen in Hefe
-
Das
Expressionsklonen in Hefe wurde wie von H. Dalboege et al. (H. Dalboege
et al Mol. Gen. Genet (1994) 243:253–260; WO 93/11249; WO 94/14953),
die hier unter Bezugnahme eingebracht sind, beschrieben durchgeführt. Alle
einzelnen Schritte der Extraktion der Gesamt-RNA-, cDNA-Synthese,
Mungobohnennukleasebehandlung, Endenabstumpfung mit T4-DNA-Polymerase
und Konstrukti on von Genbanken wurden gemäß den vorstehend erwähnten Literaturangaben
durchgeführt.
-
Fermentationsverfahren
von Tiarosporella phaseolina CBS Nr. 446.97 zur mRNA-Isolation:
-
Tiarosporella
phaseolina CBS Nr. 446.97 wurde von einer Platte mit ausgewachsenem
Mycelium in einen 100 ml Medium B (siehe Medien) enthaltenden Schüttelkolben
beimpft. Die Kultur wurde bei 26°C
und 200 UpM für
eine Dauer von 7 Tagen inkubiert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde
durch Miracloth filtriert und das Mycelium in flüssigem Stickstoff eingefroren.
-
mRNA
wurde von Mycelium aus dieser Kultur wie in (H. Dalboege et al Mol.
Gen. Genet (1994) 243:253–260;
WO 93/11249; WO 94/14953) beschrieben isoliert.
-
Die
Extraktion von Gesamt-RNA wurde mit Guanidinium-Thiocyanat, gefolgt
von Ultrazentrifugation durch ein 5,7 M CsCl-Kissen durchgeführt, und
die Isolation von Poly(A)+RNA wurde durch
Oligo(dT)-Zellulose-Affinitätschromatographie
unter Verwendung der in WO 94/14953 beschriebenen Verfahren durchgeführt.
-
cDNA-Synthese:
-
Doppelstrang-cDNA
wurde aus 5 mg Poly(A)+RNA durch das RNase-H-Verfahren (Gubler
und Hoffman (1983) Gene 25:263–269,
Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory manual, Cold
Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) synthetisiert. Die Poly(A)+RNA (5 μg
in 5 μl
DEPC-behandeltem Wasser) wurde bei 70°C für eine Dauer von 8 Minuten
in einem vorsilikonisierten RNase-freien Eppendorphröhrchen erwärmt, auf
Eis abgeschreckt und in einem Endvolumen von 50 μl mit Umkehrtranskriptasepuffer
(50 mM Tris-Cl, pH 8,3, 75 mM KCl, 3 mM MgCl2,
10 mM DTT, Bethesda Research Laboratories), enthaltend 1 mM dATP,
dGTP und dTTP und 0,5 mM 5-Methyl-dCTP (Pharmacia), 40 Einheiten
menschliche Placentaribonukleasehemmer (RNasin, Promega), 1,45 μg Oligo(dT)18-Not-1-Primer (Pharmacia) und 1000 Einheiten
SuperScript-II-RNase-H-Umkehrtranskriptase
(Bethesda Research Laboratories) kombiniert. Einzelstrang-cDNA wurde
durch Inkubieren des Reaktionsgemischs bei 45°C für eine Dauer von 1 Stunde synthetisiert.
Nach der Synthese wurde das mRNA:cDNA-Hybridgemisch durch eine Spin-Säule des
Typs MicroSpin 5–400
HR (Pharmacia) gemäß den Anweisungen
des Herstellers gelfiltriert.
-
Nach
der Gelfiltration wurden die Hybride in 250 μl Doppelstrangpuffer (20 mM
Tris-Cl, pH 7,4, 90 mM KCl, 4,6 mM MgCl2,
10 mM (NH4)2SO4, 0,16 mM bNAD+), enthaltend 200 μl jedes dNTP,
60 Einheiten DNA-Polymerase I von E. coli (Pharmacia), 5,25 Einheiten
RNase-H (Promega) und 15 Einheiten DNA-Ligase von E. coli (Boehringer Mannheim)
verdünnt.
Die Doppelstrang-cDNA-Synthese
wurde durch Inkubieren des Reaktionsröhrchens bei 16°C für eine Dauer
von 2 Stunden und zusätzlichen
15 Minuten bei 25°C
durchgeführt.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration
von 20 mM gestoppt, gefolgt von Phenol- und Chloroformextraktionen.
-
Mungobohnennukleasebehandlung:
-
Die
Doppelstrang-cDNA wurde bei –20°C für eine Dauer
von 12 Stunden durch Zugabe von 2 Volumen 96%igen EtOH, 0,2 Volumen
10 M NH4Ac, gefällt, durch Zentrifugation gewonnen,
in 70%igem EtOH gewaschen, getrocknet und in 30 μl Mungobohnennukleasepuffer
(30 mM NaAc, pH 4,6, 300 mM NaCl, 1 mM ZnSO4,
0,35 mM DTT, 2% Glycerin), enthaltend 25 Einheiten Mungobohnennuklease
(Pharmacia) resuspendiert. Die Einzelstrang-Haarnadel-DNA wurde
durch Inkubieren der Reaktion bei 30°C für eine Dauer von 30 Minuten,
gefolgt von Zugabe von 70 μl
10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, Phenolextraktion und Ausfällung mit
2 Volumen 96%igen EtOH und 0,1 Volumen 3 M NaAc, pH 5,2 auf Eis
für eine
Dauer von 30 Minuten abgeschnitten.
-
Endenabstumpfung mit T4-DNA-Polyrmerase:
-
Doppelstrang-cDNAs
wurden durch Zentrifugation gebunden und die Enden in 30 ml T4-DNA-Polymerasepuffer
(20 mM Tris-Acetat, pH 7,9, 10 mM MgAc, 50 mM KAc, 1 mM DTT), enthaltend
0,5 mM jedes dNTP und 5 Einheiten T4-DNA-Polymerase (New England Biolabs) durch
Inkubieren des Reaktionsgemischs bei 16°C für eine Dauer von 1 Stunde abgestumpft.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von EDTA auf eine Endkonzentration
von 20 mM gestoppt, gefolgt von Phenol- und Chloroformextraktionen und Ausfällung für eine Dauer
von 12 Stunden bei –20°C durch Zugabe
von 2 Volumen 96%igen EtOH und 0,1 Volumen 3 M NaAc pH 5,2.
-
Adaptorbindung, NotI-Aufschluß und Größenselektion:
-
Nach
der Einfüllreaktion
wurden die cDNAs durch Zentrifugation gewonnen, in 70%igem EtOH
gewaschen und getrocknet. Das cDNA-Pellet wurde in 25 μl Bindungspuffer
(30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10
mM DTT, 0,5 mM ATP), enthaltend 2,5 μg nichtpalindrome BstXI-Adaptoren
(Invitrogen) und 30 Einheiten T4-Ligase (Promega) resuspendiert
und bei 16°C
für eine
Dauer von 12 Stunden inkubiert. Die Reaktion wurde durch Erwärmen auf
65°C für eine Dauer
von 20 Minuten und dann Abkühlen
auf Eis für
eine Dauer von 5 Minuten gestoppt. Die adaptierte cDNA wurde mit
NotI-Restriktionsenzym durch Zugabe von 20 μl Wasser, 5 μl 10 × NotI-Restriktionsenzympuffer
(New England Biolabs) und 50 Einheiten NotI (New England Biolabs)
aufgeschlossen, gefolgt von Inkubation für eine Dauer von 2,5 Stunden
bei 37°C.
Die Reaktion wurde durch Erwärmen
auf 65°C
für eine
Dauer von 10 Minuten gestoppt. Die cDNAs wurden durch Gelelektrophorese
auf einem 0,8%igen, bei niedriger Temperatur schmelzenden Agarosegel
des Typs SeaPlaque GTG (FMC) in 1 × TBE größenfraktio niert, um ungebundene
Adaptoren und kleine cDNAs abzutrennen. Die cDNAs wurden mit einem
Abschnitt von 0,7 kb größenselektiert
und unter Verwendung von β-Agarase
(New England Biolabs) gemäß den Anweisungen
des Herstellers aus dem Gel befreit und für eine Dauer von 12 Stunden
bei –20°C durch Zugabe
von 2 Volumen 96%igen EtOH und 0,1 Volumen 3 M NaAc, pH 5,2 ausgefällt.
-
Genbankkonstruktion:
-
Die
gerichteten, größenselektierten
cDNAs wurden durch Zentrifugation gewonnen, in 70%igem EtOH gewaschen,
getrocknet und in 30 μl
10 mM Tris-Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, resuspendiert. Die cDNAs wurden durch
Gelfiltration durch eine Spin-Säule
des Typs MicroSpin 5–300
HR (Pharmacia) gemäß den Anweisungen des
Herstellers entsalzt. Drei Testbindungen wurden in 10 μl Bindungspuffer
(30 mM Tris-Cl, pH 7,8, 10 mM MgCl2, 10
mM DTT, 0,5 mM ATP), enthaltend 5 μl Doppelstrang-cDNA (Reaktionsröhrchen #1
und #2), 15 Einheiten T4-Ligase (Promega) und 30 ng (Röhrchen #1),
40 ng (Röhrchen
#2) und 40 ng (Röhrchen
#3, die Vektorhintergrundkontrolle) von BstXI-NotI-gespaltenem pYES-2,0-Vektor
durchgeführt.
Die Bindungsreaktionen wurden durch Inkubation bei 16°C für eine Dauer
von 12 Stunden, Erwärmen
bei 70°C
für eine
Dauer von 20 Minuten und Zugabe von 10 μl Wasser zu jedem Röhrchen,
durchgeführt.
1 μl jedes
Bindungsgemischs wurde in 40 μl
elektrokompetente Zellen DH10B von E. coli (Bethesda research Laboratories)
wie beschrieben (Sambrook et al. (1989) Molecular cloning: A laboratory
manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY) elektroporiert.
Unter Verwendung der optimalen Bedingungen wurde eine aus Pools
bestehende Genbank in E. coli aufgebaut. Jeder Pool wurde durch
Verteilung von transformiertem E. coli auf LB+Ampicillin-Agarplatten aufgebaut,
wodurch nach Inkubation bei 37°C
für eine
Dauer von 24 Stunden 15.000–30.000
Kolonien/Platte erhalten wurden. 20 ml LB+Ampicillin wurden der
Platte zugesetzt und die Zellen darin suspendiert. Die Zellsuspension
wurde in einem Röhrchen
mit einem Volumen von 50 ml bei 37°C für eine Dauer von 1 Stunde geschüttelt. Plasmid-DNA
wurde aus den Zellen gemäß den Anwei sungen
des Herstellers unter Verwendung eines QIAGEN-Plasmid-Bausatzes
isoliert und bei –20°C gelagert.
-
Aliquote
mit 1 μl
von gereinigter Plasmid-DNA (100 ng/ml) von einzelnen Pools wurden
in S. cerevisiae W3124 durch Elektroporation (Becker and Guarante
(1991) Methods Enzymol. 194:182–187)
transformiert und die Transformanten auf 2% Glukose enthaltendem
SC-Agar aufgetragen und bei 30°C
inkubier.
-
Identifikation von positiven
Kolonien:
-
Kolonien
wurden indirekt auf XET durch Finden von Xyloglucanase-positiven
Kolonien gescreent.
-
Nach
3-5-tägigem
Wachstum wurden die Agarplatten auf einem Satz von SC-URA-Agaplatten (unter Zugabe
von 20% Galactose), enthaltend 0,1% AZCL-Xyloglucan, replikationsbeschichtet.
Diese Platten wurden für
eine Dauer von 3–7
Tagen bei 30°C
inkubiert. Xyloglanase-positive Kolonien wurden als von einem blauen
Halo umgebene Kolonien identifiziert.
-
Zellen
von Enzym-positiven Kolonien wurden zur Einzelkolonieisolierung
auf Agar verteilt und eine Enzym herstellende Einzelkolonie wurde
für jede
der identifizierten Xyloglucanase herstellenden Kolonien selektiert.
-
Alle
Xyloglucanase-positiven Kolonien wurden auf XET getestet und als
positiv befunden.
-
Isolierung eines cDNA-Gens
zur Expression in Aspergillus:
-
Eine
XET herstellende Hefekolonie wurde in 20 ml YPD-Brühe in ein
Glasteströhrchen
mit einem Volumen von 50 ml geimpft. Das Röhrchen wurde für eine Dauer
von 2 Tagen bei 30°C
geschüttelt.
Die Zellen wurden durch Zentrifugation für eine Dauer von 10 Minuten
bei 3000 UpM geerntet.
-
DNA
wurde gemäß WO 94/14953
isoliert und in 50 ml Wasser gelöst.
Die DNA wurde durch Standardverfahren in E. coli transformiert.
Plasmid-DNA wurde unter Verwendung von Standardverfahren von E.
coli isoliert und durch Restriktionsenzymanalyse analysiert. Die
cDNA-Einfügung
wurde unter Verwendung des Restriktionsenzyms BamH I und Xba I exzidiert
und in den Aspergillus-Expressionsvektor
pHD414 gebunden, wodurch das Plasmid pA2XG80 erhalten wurde.
-
Die
cDNA-Einfügung
der mit gereinigten Qiagen-Plasmid-DNA von pA2XG80 (Qiagen, USA)
wurde mit dem Taq-Deoxy-Terminalzyklus-Sequenzierbausatz (Perkin
Elmer, USA) und synthetischen Oligonukleotidprimern unter Verwendung
einer DNA-Sequenzapparatur des Typs Applied Biosystems ABI PRISMTM 377 DNA gemäß den Anweisungen des Herstellers
sequenziert.
-
Transformation
von Aspergillus oryzae oder Aspergillus nieger
-
Protoplaste
werden wie in WO 95/02043, Seite 16, Zeile 21 bis Seite 17, Zeile
12, die hier unter Bezugnahme eingebracht ist, beschrieben hergestellt.
-
100 μl Protoplastsuspension
wird mit 5–25 μg der entsprechenden
DNA in 10 μl
STC (1,2 M Sorbit, 10 mM Tris-HCl, pH = 7,5, 10 mM CaCl2)
gemischt. Protoplaste werden mit p3SR2 (einem amdS-Gen tragenden Plasmid
von A. nidulans) (Tove Christensen et al. Bio/Technology, S. 1419–1422, Band
6, Dezember 1988) gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur
für eine
Dauer von 25 Minuten stehen gelassen. 0,2 ml 60%iger PEG 4000 (BDH
29576), 10 mM CaCl2 und 10 mM Tris-HCl,
pH 7,5 werden zugesetzt und vorsichtig gemischt (zweimal), und schließlich werden
0,85 ml derselben Lösung
zugesetzt und vorsichtig gemischt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur
für eine
Dauer von 25 Minuten stehen gelassen, bei 2500 g für eine Dauer von
15 Minuten gedreht und das Pellet in 2 ml 1,2 M Sorbit resuspendiert.
Nach einer weiteren Sedimentation der Protoplaste werden die Protoplaste
auf Minimalplatten (Cove, Biochem. Biophys. Acta 113 (1966) 51–56), enthaltend
1,0 M Saccharose, pH 7,0, 10 mM Acetamid als Stickstoffquelle und
20 mM CsCl zum Hemmen von Hintergrundwachstum verteilt. Nach Inkubation
für eine
Dauer von 4–7
Tagen bei 37°C
werden Sporen aufgenommen und auf einzelne Kolonien verteilt. Dieses
Verfahren wird wiederholt, und die Sporen einer einzelnen Kolonie
nach der zweiten Reisolation werden als definierter Transformant
aufbewahrt.
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Tests von Transformanten
von A. oryzae
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Jeder
der Tranformanten von A. oryzae wird in 10 ml YPM (vergleiche nachstehend)
geimpft und vermehrt. Nach 2-5-tägiger
Inkubation bei 30°C
wird der Überstand
entfernt.
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Die
XET-Aktivität
wird unter Verwendung des früher
beschriebenen XET-Punkt-Tupfen-Tests
identifiziert.
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Bei
der folgenden Sequenz (SEQ ID Nr. 3) handelt es sich um die cDNA-Einfügung in
pYES2,0 von XG80 (XET von Tiarosporella phaseolina), einschließlich der
BamHI- und NotI-Erkennungsstellen, die zum Klonen verwendet werden:
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Bei
der folgenden Sequenz (SEQ ID Nr. 4) handelt es sich um die Aminosäuresequenz
der Kodierungsregion von XG80:
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Die
vorliegende Erfindung betrifft auch ein die in SEQ-ID Nr. 4 dargestellte
Aminosäuresequenz
umfassendes mikrobielles XET-Enzym oder eine XET, die zumindest
zu 80% homolog zu der Aminosäuresequenz
SEQ-ID Nr. 4 ist, vorzugsweise mindestens zu 85% homolog zu SEQ-ID
Nr. 4, stärker
bevorzugt mindestens zu 90% homolog zu SEQ-ID Nr. 4, noch stärker bevorzugt
mindestens zu 95% homolog zu SEQ-ID Nr. 4, insbesondere mindestens
zu 98% homolog zu SEQ-ID Nr. 4 ist.
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Ein
Polypeptid wird als X% homolog zu der Stamm-XET erachtet, wenn ein
Vergleich der entsprechenden Aminosäuresequenz, der über bekannte
Algorithmen, wie denjenigen beschrieben durch Lipman and Pearson
in Science 227, 1985, Seite 1435, durchgeführt wird, eine Identität von X%
zeigt.
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Ein
Klon Cl.XG80 wurde bei DSMZ am 24. Februar 1998 unter der Zugangsnummer
DSM 12032 hinterlegt.
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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Indikationen
betreffend einen hinterlegten Mikroorganismus (PCT
Regel 13bis)
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