DE112014003580B4

DE112014003580B4 - Endo-β-1,3-Glucanase, Polynukleotid, rekombinanter Vektor, Transformant, Herstellungsverfahren für Endo-β-1,3-Glucanase, Enzymherstellung und Herstellung von Paramylon mit reduziertem Molekulargewicht

Info

Publication number: DE112014003580B4
Application number: DE112014003580.7T
Authority: DE
Inventors: Kengo Suzuki; Ryo Arashida; Yuka Marukawa; Eriko YOSHIDA; Takumi Takeda; Yuki Nakano; Naotake Konno; Machiko Takahashi
Original assignee: Euglena Co Ltd
Current assignee: Euglena Co Ltd
Priority date: 2013-08-02
Filing date: 2014-08-04
Publication date: 2018-04-26
Anticipated expiration: 2034-08-05
Also published as: US20160186153A1; DK179334B1; JPWO2015016375A1; US9644193B2; BR112016002344A2; WO2015016375A1; DE112014003580T5; CN105431534A; JP5856355B2; CN105431534B; DK201670069A1

Abstract

Eine Endo-β-1,3-Glucanase, die Zersetzungsaktivität in Bezug auf Paramylon zeigt, das von der Gattung Euglena abgeleitet ist. Die Endo-β-1,3-Glucanase ist von der Gattung Euglena abgleitet und zeigt Eigenschaften, die im Folgenden aufgeführt sind: (1) Wirkung: Hydrolysierung der β-1,3-Bindung des β-1,3-Glucans; und (2) Substratspezifität: Zersetzung von zumindest Paramylon. Die Endo-β-1,3-Glucanase zeigt zusätzlich Eigenschaften, die im Folgenden aufgeführt sind: (3) Zersetzungsaktivität: Das Verhältnis der Paramylon-Zersetzungsaktivität in Bezug auf die Laminarin-Zersetzungsaktivität ist 20% oder höher; (4) optimaler pH-Wert: 3,7-7,0; und (5) optimale Temperatur: 30-70°C.

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Endo-1,3-β-Glucanase, die Paramylon abbaut, ein Polynukleotid, einen rekombinanten Vektor, einen Transformant, ein Herstellungsverfahren für eine Endo-1,3-β-Glucanase, eine Enzymherstellung und Verfahren zur Herstellung von Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Ein β-1,3-Glucan ist ein Polysaccharid mit einer β-1,3-Bindung der Glukose als eine Hauptkette und ist als eine Hauptstruktur in Laminaran vorhanden, das viel in Braunalgen der Gattung Laminaria und in Paramylon („Curdlan“) enthalten ist, welches extrazellulär durch mutante Stämme von Bodenbakterien (Alcaligenes faecalis) erzeugt wird. Weiterhin ist Callose, das in Zellwänden von Getreide enthalten ist, ebenfalls bekannt.
β-1,3-Glucane haben die gemeinsame Eigenschaft, dass sie eine β-1,3-Struktur als Hauptkette aufweisen, jedoch abhängig von deren Ursprung und Ähnlichem unterscheiden sie sich voneinander durch die Anwesenheit/Abwesenheit und die Position einer verzweigten Seitenkette, die Kombination mit einer β-1,4-Bindung und β-1,6-Bindung, der Molekülgröße und Ähnlichem, wodurch sie unterschiedliche Strukturen beziehungsweise Eigenschaften aufweisen.
Eine β-1,3-Glucanase ist ein Enzym, das diese β-1,3-Glucane hydrolysiert, und wird als ein Zusatz für Futtermittel verwendet, um Körpergewichtszunahmen und Verhältnisse beim Nahrungsmittelbedarf bei Nutztieren zu verbessern, als Mittel, das die physikalischen Eigenschaften oder die Textur für Süßwaren, Brot und Ähnliches verbessert, als Mittel, das die Effizienz der Extraktion von Hefeextraketen erhöht, und als Mittel, das die Effizienz der Filtration von Bier erhöht, sowie für verschiedene andere Zwecke.
Es gibt β-1,3-Glucanasen, die von unterschiedlichem Ursprung abstammen und verschiedene Substratspezifitäten aufweisen, von denen diejenigen bekannt sind, die Zersetzungsaktivität in Bezug auf Laminaran, Curdlan, Hefezellwände, Lentinula Edodes Mycelium, Pastoran und Ähnliche aufweisen (Patentdokumente 1 bis 3).
QUELLENANGABEN
PATENTDOKUMENTE:

PATENTDOKUMENT 1: JP 2005-34146A
PATENTDOKUMENT 2: JP 2005-224230A
PATENTDOKUMENT 3: JP H10(1998)-507078A
Barras D.R. et al., β-1 3-Glucan hydrolases from Euglena gracilis. /; The nature of the hydrolases (1969) Biochim. Biophys. Acta, Vol. 191, S. 329-341 beschreibt zellfreie Euglena-Extrakte, wobei die Hydrolase vom exo-Typ ist.
US 5 401 647 A betrifft Verfahren zur Herstellung von Limulus Amoebocyte-Lysat (LAL), das im Wesentlichen frei ist von Faktor G.
EP 0 417 254 B1 betrifft die Bereitstellung von beta-1,3-Glucan als Immunstimulans für medizinische oder kosmetische Anwendungen.

Es ist kein Spaltungsenzym bekannt, das eine Zersetzungsaktivität im Hinblick auf Paramylon zeigen würde, das von der Gattung Euglena abgeleitet ist, wobei Paramylon eine Art von β-1,3-Glucan ist.
Unter den β-Glucanen hat Paramylon die Eigenschaft, dass nur die β-1,3-Bindungen abgebaut werden. Darüber hinaus kommt Paramylon in Euglena-Zellen aller Spezies und Varietäten in Granulatform vor, und die Anzahl, das Erscheinungsbild und die Uniformität der Paramylonpartikel werden abhängig von der Spezies charakterisiert. Es wird erwartet, dass Paramylon die gleiche Funktionalität hat, wie es bei den anderen β-Glucanen der Fall ist, in Bezug auf den Wirkmechanismus bleibt jedoch viel unbekannt.
Darüber hinaus ist weder ein Spaltungsenzym bekannt, das Paramylon zersetzt, noch eine Zusammensetzung, die aus der Zersetzung von Paramylon resultiert.
Im Übrigen ist ein Versuch zur Bestärkung eines Energieversorgungssystems gefördert worden, bei dem Biomasse und Ähnliches als unerschöpfliche Quelle verwendet wird, die eine örtlich nicht verwendete Ressource ist, und eine erschöpfbare Ressource, wie Erdöl, ersetzt.
Biomasse ist definiert als reproduzierbare organische Ressource, die von lebenden Organismen abgeleitet ist, mit Ausnahme von fossilen Ressourcen. Biomasse bezieht sich auf Ressourcen, die von lebenden Organismen unter Verwendung von Solarenergie synthetisiert werden, die unerschöpflich sind, solange Leben und die Sonne existiert, und das Kohlendioxid in der Atmosphäre nicht erhöht, selbst wenn sie verbrennt oder Ähnliches, das heißt, dass sie Kohlenstoff-neutrale Quellen sind.
Bioethanol ist als eine der Energiequellen entwickelt worden, die Biomasse verwendet. Bioethanol wird durch Ausführen einer Ethanol-Fermentation, Destillation und Dehydratisierung in Bezug auf Folgendes hergestellt: Saccharid aus Zuckerrohr, Mais oder Ähnliches; einer Substanz, erhalten durch Verzuckerung, mit einem Enzym, einem Stärke-basierten Rohmaterial wie Reis, Weizen, Mais oder Ähnliches; oder einer Substanz, erhalten durch Vorbehandeln eines Zellulose-Rohmaterials, wie Durchforstungsholz, Baustellenabfälle, Reisstroh, Bagasse oder Ähnliches, mit heißem Druckwasser, Säure oder Alkali und Verzuckerung derselben mit einem Enzym oder Ähnlichem (der Landwirtschaftsminister, Forst- und Fischereiwesen, „the Biomass Industrialization Strategy „(6. September 2012), Referenzmaterialien: Zusammenfassung der Grundtechniken).
Fossile Brennstoffe wie Erdöl und Ähnliches ist reichlich in Reserven vorhanden und global stabil vertrieben worden. Im Gegensatz dazu ist es unter den vorliegenden Umständen schwer, ausreichende Mengen an Bioethanol für den globalen Betrieb oder den Vertrieb über das gesamte Land sicherzustellen, da in vielen Fällen als Antwort auf die Forderung nach Nachhaltigkeit Abfallstoffe oder Ähnliches als Rohmaterial verwendet werden, wenn man in Betracht zieht, dass solche Rohmaterialien nicht mit Nahrungsmitteln in Konflikt stehen und keine Situation hervorrufen, bei der Ackerfläche für Nahrungsmittel als Ackerfläche für Rohmaterialien missbraucht wird. Im Allgemeinen werden Ansätze für den Vertrieb von Energie, die Biomasse oder Ähnliches verwenden, in individuellen Regionen gefördert.
Bioethanol hat praktische Verwendung in einem Teil der Regionen gefunden, jedoch verglichen mit fossilen Brennstoffen wie Erdöl und Ähnliches weist Bioethanol geringere Wettbewerbsfähigkeit auf und hat Probleme mit der stabilen Versorgung und der Dauerhaftigkeit. In Japan hat Bioethanol daher noch keine ausreichend verbreitete Verwendung gefunden. Die Entwicklung von Rohmaterialien für Bioethanol, die im Hinblick auf die Kosten, die stabile Versorgung und Nachhaltigkeit praktikabel sind, ist erwünscht.
Andererseits wurde in der Vergangenheit Massenkultur von Euglena als schwierig angesehen, jedoch in den letzten Jahren konnten als Ergebnis der ernsthaften Studien der Erfinder der vorliegenden Erfindung Techniken für die Massenkultur derselben etabliert werden und der Weg, um Paramylon in großen Mengen bereitzustellen, ist eröffnet worden. Dies führt zu dem Bestreben, funktionelle Substanzen, abgeleitet von Euglena, zu entwickeln, die nun in großen Mengen bereitgestellt werden können.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
TECHNISCHES PROBLEM
Die vorliegende Erfindung wurde durchgeführt angesichts der oben beschriebenen Problematik und ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist, eine Endo-β-1,3-Glucanase bereitzustellen, die Zersetzungsaktivität gegenüber Paramylon zeigt, das von der Gattung Euglena abgeleitet ist.
Ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist, eine Endo β-1,3-Glucanase bereitzustellen, die als Paramylon zersetzendes Enzym verwendbar ist, welches Paramylon, das von der Gattung Euglena abgeleitet ist, in ein Rohmaterial für Bioethanol umwandelt.
Noch ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Entwicklung einer neuen funktionellen Substanz, die von der Gattung Euglena abgeleitet ist, und die in großen Mengen vertrieben werden kann.
LÖSUNG DES PROBLEMS
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben als Ergebnis von ernsthaften Studien herausgefunden, dass eine neue β-1,3-Glucanase mit Zersetzungsaktivität für Paramylon aus der Gattung Euglena erhalten werden kann und gelangten so zur vorliegenden Erfindung.
Wie vorstehend beschrieben, wurde in der Vergangenheit die Massenkultur von Euglena, wobei Paramylon akkumuliert wird, als schwierig eingeschätzt, jedoch in den letzten Jahren konnten als Ergebnis der ernsthaften Studien der Erfinder der vorliegenden Erfindung Techniken für die Massenkultur derselben etabliert werden und der Weg, um Paramylon in großen Mengen bereitzustellen, ist eröffnet worden. Weiterhin kann die Massenproduktion von Paramylon in einem Kulturgefäß von Euglena durchgeführt werden und es erfordert kein ausgedehntes Ackerland, im Gegensatz zu Zuckerrohr, Mais oder Ähnliches. Desweiteren gibt es kein Problem mit der Nachhaltigkeit, da Euglena derzeit kein Nahrungsmittel ist. Darüber hinaus wird, aufgrund der verbesserten Produktionseffizienz von Euglena, erwartet, dass die Versorgungsstabilität sichergestellt werden kann, was dazu führt, dass Euglena voraussichtlich ein Kandidat für ein Rohmaterial für Bioethanol ist.
Darüber hinaus kann der Verzuckerungsschritt vereinfacht werden, da Paramylon ein lineares Polysaccharid ist, das nur aus β-1,3-Bindungen zusammengesetzt ist, verglichen mit Zellulose-Rohmaterialien.
Die oben beschriebenen Probleme wurden gelöst durch eine Endo-β-1,3-Glucanase, die von der Gattung Euglena abgeleitet ist, und Eigenschaften aufweist, die nachfolgend aufgeführt sind:

(1) Wirkung: Hydrolysierung der β-1,3-Bindung eines β-1,3-Glucans. Die Endo-1,3-β-Glucanase kann eine Endo-1,3-β-Glucanase sein, die zusätzlich folgende Eigenschaften aufweist:
(2) Substratspezifität: Zersetzung von zumindest Paramylon;
(3) Zersetzungsaktivität: das Verhältnis der Paramylon-Zersetzungsaktivität in Bezug auf die Laminarin-Zersetzungsaktivität ist 20 % oder höher;
(4) optimaler pH-Wert: 3,7-7,0;
(5) optimale Temperatur: 30-70°C; und
(6) Zersetzungsaktivität: das Verhältnis der Paramylon-Zersetzungsaktivität in Bezug auf Zersetzungsaktivität von Alkali-aufgequollenem Paramylon ist 25 % oder höher.

Die Studien der Erfinder der vorliegenden Erfindung in den letzten Jahren haben es möglich gemacht, eine neue Endo-1,3-β-Glucanase, abgeleitet von Euglena, zu finden, die nun in großen Mengen bereitgestellt werden kann, wodurch ein Weg für die neue Verwendung von Euglena eröffnet wird. Es ist bekannt, dass Eigenschaften der β-Glucanase, wie Substratspezifität und Ähnliches, abhängig von ihrer Quelle, variieren können und das Auffinden einer Endo-1,3-β-Glucanase, abgeleitet von Euglena, eröffnet den Weg, ein neues Glucan mit niedrigem Molekulargewicht und ein Verfahren für dessen Herstellung bereitzustellen, und eröffnet weiterhin den Weg, ein neues Rohmaterial für Bioethanol bereitzustellen, bei dem ein neues Glucan mit niedrigem Molekulargewicht verwendet wird.
Die Endo-1,3-β-Glucanase kann eine Substratspezifität für den Abbau von Alkali-aufgequollenes Paramylon und Laminarin haben, zusätzlich zur Substratspezifität für den Abbau von Paramylon. Darüber hinaus kann die optimalen Temperatur während der Reaktionszeit von bis zu einer Stunde 50°C oder höher sein, die optimale Temperatur während der Reaktionszeit von einer Stunde bis zwei Stunden 40°C oder höher sein, und die optimale Temperatur während der Reaktionszeit von 20 Stunden oder mehr 60°C oder niedriger sein.
Desweiteren wird das vorstehend beschriebene Problem gelöst durch eine Endo-1,3-β-Glucanase, die aus einer Aminosäuresequenz (a) oder (b) hergestellt wurde, die nachfolgend gezeigt ist:

(a) einer Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nummer 2 aufgeführt ist; und
(b) einer Aminosäuresequenz, die durch Deletion, Substitution oder Hinzufügen von einer oder nicht mehr als 75 Aminosäuren in Bezug auf eine Aminosäuresequenz, die in der SEQ ID Nummer 2 aufgeführt ist, erhalten wurde, und die Hydrolyseaktivität vom Endo-Typ für die Hydrolysierung einer β-1,3-Bindung eines β-1,3-Glucans aufweist, wobei das durch die Hydrolyse des Alkali-aufgequollenen erhaltene Hauptprodukt ein Oligosaccharid ist.

Desweiteren wird das vorstehend beschriebene Problem gelöst durch ein Polynukleotid, das aus einer Basensequenz (a) oder (b), wie nachfolgend gezeigt, hergestellt wird:

(a) eine Basensequenz, die in der SEQ ID Nummer 1 aufgeführt ist; und
(b) eine Basensequenz mit einer Identität von 70% oder mehr in Bezug auf eine Basensequenz, die in der SEQ ID Nummer 1, aufgeführt ist, erhalten wurde, und die Hydrolyseaktivität für die Hydrolysierung einer β-1,3-Bindung eines β-1,3-Glucans aufweist, wobei das durch die Hydrolyse des Alkali-aufgequollenen erhaltene Hauptprodukt ein Oligosaccharid ist.

Ein rekombinanter Vektor, der das vorstehend beschriebene Polynukleotid einschließt, kann hier bereitgestellt werden.
Desweiteren kann ein Transformant, der den vorstehend beschriebenen Vektor einschließt, bereitgestellt werden.
Desweiteren kann ein Verfahren zur Herstellung einer Endo-1,3-β-Glucanase bereitgestellt werden, wobei das Verfahren Züchten des vorstehend beschriebenen Transformanten in einem Kulturmedium, Erzeugen und Aufbewahren der Endo-1,3-β-Glucanase in dem Kulturprodukt und Sammeln der Endo-1,3-β-Glucanase aus dem Kulturprodukt umfasst.
Eine Enzymzubereitung zur Reduzierung des Molekulargewichts von Paramylon, die die vorstehend beschriebene Endo-1,3-β-Glucanase enthält, kann bereitgestellt werden.
Ein Verfahren zur Herstellung von Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht kann bereitgestellt werden, wobei das Verfahren einschließt: Aussetzen von Paramylon der Wirkung von Endo-1,3-β-Glucanase, um Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht herzustellen.
Eine Glukosidase kann zusammen mit der Endo-1,3-β-Glucanase auf Paramylon einwirken, so dass Glukose als Hauptprodukt aus dem Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht erzeugt wird.
VORTEILHAFTE EFFEKTE DER ERFINDUNG
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Hydrolysieren von Paramylon ein neues Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht erhalten werden, das zusammengesetzt ist aus geradkettigen Oligosacchariden und Funktionalität aufweist.
Desweiteren ermöglicht die vorliegende Erfindung β-1,3-Glucan, das Paramylon enthält, zu hydrolysieren. Durch Anwendung des Verfahrens zur Herstellung von Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht gemäß der vorliegenden Erfindung als ein Verzuckerungsschritt für Bioethanol, kann ein β-1,3-Glucan, wie Paramylon oder Ähnliches, als ein Rohmaterial für Bioethanol verwendet werden.
Figurenliste

1 ist eine graphische Darstellung, die die Auftrennung der Fraktionen der Laminarin-Zersetzungsaktivität einer Lösung von aufgebrochenen Euglena über eine hydrophobe Säule zeigt.
2 ist eine graphische Darstellung, die die Auftrennung der Fraktionen der Laminarin-Zersetzungsaktivität einer Lösung von aufgebrochenen Euglena über eine Gelfiltrationssäule zeigt.
3 ist eine graphische Darstellung, die die Auftrennung der Fraktionen der Laminarin-Zersetzungsaktivität einer Lösung von aufgebrochenen Euglena über eine Anionentauschersäule zeigt.
4 veranschaulicht eine SDS-PAGE-Silberfärbung, die die Fraktionen der Laminarin-Zersetzungsaktivität einer Lösung von aufgebrochenen Euglena zeigt.
5 veranschaulicht ein CBB-gefärbtes Bild eines SDS-PAGE-Gels von rekombinantem EgCel17A.
6 ist eine graphische Darstellung, die die Substratspezifität eines Enzyms EgCel17A zeigt, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist.
7 ist eine graphische Darstellung, die die optimale Temperatur für das Enzym EgCel17A zeigt, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist.
8 ist eine graphische Darstellung, die die Laminarin-Zersetzungsaktivität in den Fällen zeigt, bei denen das Enzym EgCel17A, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist, bei 30°C bis 70°C für 1 bis 20 Stunden inkubiert wird.
9 ist eine graphische Darstellung, die den optimalen pH-Wert für das Enzym EgCel17A zeigt, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist.
10 ist eine graphische Darstellung, die die Paramylon-Zersetzungsaktivität einer Trichoderma-Zellulase-Zubereitung und des Enzyms EgCel17A zeigt, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist.
11 ist eine graphische Darstellung, die die Paramylon-Zersetzungsaktivität einer Bacillus subtilis-Glucanase und des Enzyms EgCel17A zeigt, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist.
12 ist eine graphische Darstellung, die die Auswirkung der zugesetzten Menge an BSA auf die Aktivität des Enzyms EgCel17A zeigt, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist.
13 ist eine graphische Darstellung, die die Auswirkung des zugesetzten Metalls auf die Aktivität des Enzyms EgCel17A zeigt, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist.
14 ist eine graphische Darstellung, die die Auswirkung bei Bedingungen einer Alkalibehandlung von Euglena auf die Aktivität des Enzyms EgCel17A zeigt, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist.
15 ist eine graphische Darstellung, welche die durch die Menge an zugesetztem Natriumchlorid auf die Aktivität des Enzyms EgCel17A, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist, ausgeübten Auswirkungen zeigt.
16 zeigt die Ergebnisse der Papierchromatographie, die die Zersetzungsaktivität und Transglycosylierungsaktivität des Enzyms EgCel17A, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist, im Hinblick auf Laminarin und Laminarioligosaccharide zeigt.
17 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der HPLC der Reaktionsprodukte zeigt, die erhalten wurden durch Zugabe von EgCel17A und MoCel3A zu Alkali-aufgequollen Paramylon, um Reaktionen zu verursachen.
18 zeigt die Ergebnisse der Dünnschichtchromatographie, die die Zersetzungsaktivität und Transferaktivität des Enzyms EgCel17A, welches beispielhaft für die vorliegende Erfindung ist, im Hinblick auf Laminarin und Laminarioligosaccharide, zeigt.
19 ist eine Abbildung, die die Ergebnisse des Western-Blots von rekombinanter EgCel81A zeigt.
20 ist eine graphische Darstellung, die die Ergebnisse der Messung der Hydrolyseaktivität im Hinblick auf die entsprechenden Polysaccharide des rekombinanten Enzyms EgCel81A zeigt.

BESCHREIBUNG DER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung in Einzelheiten beschrieben. Die vorliegende Erfindung betrifft eine Endo-1,3-β-Glucanase, die von der Gattung Euglena abstammt.
In der Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung ist ein Protein mit Zersetzungsaktivität für Paramylon enthalten, das durch die Gattung Euglena erzeugt wird.
Paramylon ist ein Makromolekül (β-1,3-Glucan), in dem etwa 700 Glukosen mit β-1,3-Bindungen polymerisiert sind, und in der Gattung Euglena ist ein Speicherpolysaccharid enthalten. Paramylonpartikel sind Partikel, die jeweils eine flache spheroidale Form aufweisen und aus spiralförmig gewundenen β-1,3-Glucanketten gebildet werden.
Die Paramylonpartikel werden aus Kulturen der Gattung Euglena isoliert und in Form von Mikropartikeln über beliebige geeignete Verfahren aufgereinigt und gewöhnlich in Pulverform bereitgestellt.
Zum Beispiel können die Paramylonpartikel folgendermaßen erhalten werden: (1) Züchten der Euglena-Zellen in einem beliebigen geeigneten Kulturmedium; (2) Abtrennen der Euglena-Zellen vom Kulturmedium; (3) Isolieren von Paramylon aus den abgetrennten Euglena-Zellen; (4) Reinigen des Paramylons, das so isoliert wird; und gegebenenfalls (5) Abkühlen und darauffolgend gefriertrocknen. Als Euglena-Zellen können alle Arten von Euglena-Zellen verwendet werden, zum Beispiel Euglena gracilis, Euglena intermedia und Euglena piride, sowie andere Arten von Euglena, zum Beispiel Astaia longa.
Die Euglena-Zellkultur kann zum Beispiel über das „Batch“-Verfahren durchgeführt werden. Die Abtrennung der Euglena-Zellen kann zum Beispiel über Zentrifugation oder einfache Sedimentation der Kulturlösung durchgeführt werden. Die Isolierung von Paramylon kann zum Beispiel über die Verwendung eines größtenteils biologisch abbaubaren, nicht ionischen oder anionischen, oberflächenaktiven Mittels durchgeführt werden. Die Aufreinigung von Paramylon kann im Wesentlichen gleichzeitig mit der Isolierung erfolgen.
Konkreter kann zum Beispiel das folgende Verfahren angewandt werden: Euglena gracilis-Pulver (hergestellt von Euglena Co., Ltd.) wird in destilliertes Wasser gegeben und bei Raumtemperatur zwei Tage gerührt. Dieses wird dann einer Ultraschallbehandlung ausgesetzt, so dass die Zellschicht zerstört wird, und grobe Paramylonpartikel werden durch Zentrifugation gesammelt. Die gesammelten Paramylonpartikel werden in 1 %iger wässriger Lösung von Natriumdodecylsulfat dispergiert und bei 95°C für zwei Stunden behandelt. Die erneut mittels Zentrifugation gesammelten Paramylonpartikel werden in 0,1 %iger wässriger Lösung von Natriumdodecylsulfat dispergiert und bei 50°C für 30 Minuten behandelt. Die Lipide und Proteine werden mithilfe dieser Maßnahme entfernt und daraufhin werden die Partikel mit Aceton und Ether gewaschen und bei 50°C getrocknet, wodurch gereinigte Paramylonpartikel erhalten werden können. Die Isolierung und Reinigung von Paramylon aus Euglena ist bekannt, wie zum Beispiel in E. Ziegler, „Die natürlichen und künstlichen Aromen" Heidelberg, Deutschland, 1982, Kapitel 4.3 „Gefriertrocken", DE 43 28 329 und JP2003-529538A offenbart.
Beispiele für Endo-1,3-β-Glucanasen schließen Endo-1,3-β-Glucanasen ein, die von Euglena gracilis (E. gracilis), insbesondere Endo-1,3-β-Glucanasen, die vom Z-Stamm von Euglena gracilis (E. gracilis) abgeleitet sind.
Abgesehen von den vorstehend Beschriebenen kann die Endo-1,3-β-Glucanase zu den folgenden Spezies gehören: Euglena gracilis, Euglena gracilis Klebs und Euglena gracilis var. bacillaris. Alternativ kann die Endo-1,3-β-Glucanase ein SM-ZK-Stamm, ein mutierter Stamm von Euglena gracilis (E. gracilis), ein Z-Stamm (Chloroplasten-fehlender Stamm), var. Bacillaris, sowie eine Auswahl davon sein, Endo-1,3-β-Glucanase, die von einem genmutierten Stamm, wie Chloroplasten-mutierte Stämme dieser Spezies, usw. sein.
Die Gattung Euglena ist in frischem Wasser, in Teichen und Sümpfen weit verbreitet und die daraus abgetrennten Euglena können verwendet werden, oder alternativ können beliebige Euglena verwendet werden, die bereits isoliert wurden.
Die Gattung Euglena der vorliegenden Erfindung umfasst alle mutanten Stämme. Darüber hinaus schließen diese mutanten Stämme diejenigen ein, die über gentechnische Ansätze erhalten werden, zum Beispiel über Rekombination, Transduktion, Transformation und Ähnliches.
Weiterhin schließen andere Beispiele von Endo-1,3-β-Glucanasen der vorliegenden Erfindung Proteine ein, die aus einer Aminosäuresequenz hergestellt sind, die in den SEQ ID Nummern 2,4, oder 6 im Sequenzprotokoll aufgeführt sind.
Die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 2 aufgeführt ist, wird in der vorliegenden Beschreibung als „EgCel17A“ bezeichnet, welche als niedrigste Bande in der Fluoreszenzabbildung eines Gels nachgewiesen wurde, das einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE), wie in Beispiel 2 unterzogen wurde, wie in 4 dargestellt. In SEQ ID Nr. 1 ist eine Nukleotidsequenz aufgeführt, die ein Gen einschließt, und die das Protein kodiert, welches aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 hergestellt wird.
Die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 4 aufgeführt ist, wird in der vorliegenden Beschreibung als „EgCel81A“ bezeichnet, welche als zweitniedrigste Bande in der Fluoreszenzabbildung eines Gels nachgewiesen wurde, das einer SDS-PAGE wie in Beispiel 2 unterzogen wurde, wie in 4 dargestellt,. In SEQ ID Nr. 3 ist eine Nukleotidsequenz aufgeführt, die ein Gen einschließt, und die das Protein kodiert, welches aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 4 hergestellt wird.
Die Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nr. 6 aufgeführt ist, wird in der vorliegenden Beschreibung als „EgCel81B“, bezeichnet, welche als drittniedrigste Bande in der Fluoreszenzabbildung eines Gels nachgewiesen wurde, das einer SDS-PAGE wie in Beispiel 2 unterzogen wurde, wie in 4 dargestellt. In SEQ ID Nr. 5 ist eine Nukleotidsequenz aufgeführt, die ein Gen einschließt, und die das Protein kodiert, welches aus der Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 6 hergestellt wird.
Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung ein Protein, das durch Substitution, Deletion, Insertion und/oder Hinzufügen von einer oder mehreren Aminosäureresten in Bezug auf verschiedene Positionen in einem Protein, das aus einer Aminosäuresequenz hergestellt ist, die in den SEQ ID Nummern 2, 4, oder 6 aufgeführt ist, solange das Protein Zersetzungsaktivität für ein Paramylon aufweist. Der Begriff „mehrere“ bezeichnet den nummerischen Wert von nicht mehr als 75 und bezieht sich vorzugsweise auf den nummerischen Wert von nicht mehr als 50, weiterhin bevorzugt auf den nummerischen Wert von nicht mehr als 25, und stärker bevorzugt auf den nummerischen Wert von nicht mehr als 10.
Ein weiteres Beispiel eines Proteins, das von der vorliegenden Erfindung umfasst ist, ist ein Protein mit Nukleotidsequenz-Homologie, -Identität oder -Ähnlichkeit von 70 % oder mehr, stärker bevorzugt 80 % oder mehr, weiterhin bevorzugt 90 % oder mehr, oder besonders bevorzugt 95 % oder mehr in Bezug auf das Protein, das aus einer Aminosäuresequenz hergestellt ist, die in den SEQ ID Nummern 2, 4 oder 6 aufgeführt ist, solange das Protein Zersetzungsaktivität für ein Paramylon aufweist.
Der Ausdruck „Polynukleotid der vorliegenden Erfindung“ bezieht sich auf ein Polynukleotid, das die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung kodiert. Das Polynukleotid kann jede derzeit bekannte Morphologie aufweisen, wie cDNA, genomische DNA, künstlich modifizierte DNA oder chemisch synthetisierte DNA.
Beispiele für ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung schließen ein: Eine DNA, die die Nukleotidsequenz aufweist, die in den Nukleotidnummern 1 bis 1.611 in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, und die ein Protein mit Paramylon-Zersetzungsaktivität kodiert; eine DNA, die die Nukleotidsequenz aufweist, die in den Nukleotidnummern 1 bis 3.119 in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, und die ein Protein mit Paramylon-Zersetzungsaktivität kodiert; eine DNA, die die Nukleotidsequenz aufweist, die in den Nukleotidnummern 1 bis 2.756 in SEQ ID Nr. 5 gezeigt ist, und die ein Protein mit Paramylon-Zersetzungsaktivität kodiert.
Andere Beispiele für ein Polynukleotid der vorliegenden Erfindung schließen ein: Eine DNA die Nukleotidsequenz-Homologie, -Identität oder -Ähnlichkeit von 70 % oder mehr, stärker bevorzugt 80 % oder mehr, weiterhin bevorzugt 90 % oder mehr, oder besonders bevorzugt 95 % aufweist in Bezug auf die Nukleotidsequenz, die in den Nukleotidnummern 1 bis 1.611 in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, die Nukleotidsequenz, die in den Nukleotidnummern 1 bis 3.119 in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, oder die Nukleotidsequenz, die in den Nukleotidnummern 1 bis 2.756 in SEQ ID Nr. 5 gezeigt ist, und die Beispiele für solche DNAs schließen DNA-Varianten ein, die im natürlichen Umfeld vorkommen, künstlich modifizierte DNA-Varianten, homologe DNAs, die von verschiedenen Spezies des Organismus abgeleitet sind, identische DNAs oder ähnliche DNAs.
Andere Beispiele von Polynukleotiden der vorliegenden Erfindung schließen DNAs ein, die unter stringenten Bedingungen mit der Nukleotidsequenz, die in den Nukleotidnummern 1 bis 1.611 in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, mit der Nukleotidsequenz, die in den Nukleotidnummern 1 bis 3.119 in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, und der Nukleotidsequenz, die in den Nukleotidnummern 1 bis 2.756 in SEQ ID Nr. 5 gezeigt ist, hybridisiert und die ein Protein mit Paramylon-Zersetzungsaktivität kodieren.
Darüberhinaus ist ein Polynukleotid von der vorliegenden Erfindung umfasst, das aus der Nukleotidsequenz, die in den Nukleotidnummern 1 bis 3.119 in SEQ ID Nr. 3 gezeigt ist, und der Nukleotidsequenz, die in den Nukleotidnummern 1 bis 2.756 in SEQ ID Nr. 5 gezeigt ist, aufgebaut ist, solange das Polynukleotid eine Region einschließt, die ein Protein mit Paramylon-Zersetzungsaktivität kodiert.
Weitere Beispiele für die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung schließen Proteine ein, die aus den Aminosäuresequenzen aufgebaut sind, die durch die Polynukleotide der vorliegenden Erfindung kodiert werden.
Weitere Beispiele für die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung schließen Modifikationen ein, die durch Modifizieren des Polynukleotids der vorliegenden Erfindung durch bekannte Verfahren zum Verkürzen einer DNA an einem Ende oder durch Mutation einer Kassette erzeugt werden, so dass eine oder mehrere beliebige Aminosäuren daraus deletiert werden.
Auf diese Weise ist sogar ein Protein von der vorliegenden Erfindung umfasst, das basierend auf dem Polynukleotid der vorliegenden Erfindung gentechnische Verfahren erhalten wird, solange das Protein Paramylon-Zersetzungsaktivität aufweist.
Eine derartige Endo-1,3-β-Glucanase hat nicht notwendigerweise die Gesamtheit der Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nummern 2, 4, oder 6 aufgeführt ist, sondern es ist auch ein Protein von der Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung umfasst, das zum Beispiel aus einem Teil der Sequenz aufgebaut ist, solange das Protein Paramylon-Zersetzungsaktivität aufweist. Desweiteren ist auch eine DNA von der vorliegenden Erfindung umfasst, die eine derartige Endo-1,3-β-Glucanase kodiert.
Zur Kultivierung der Gattung Euglena kann als Kulturlösung zum Beispiel eine Kulturlösung verwendet werden, zu der Nährstoffsalze, wie eine Stickstoffquelle, eine Phosphorquelle, Mineralien und Ähnliches zugesetzt sind, wie zum Beispiel ein modifiziertes Cramer-Myers-Medium ((NH₄) ₂HPO₄: 1,0g/l, KH₂PO₄: 1,0g/l, MgSO₄·7H₂O: 0,2g/l, CaCl₂·2H₂O: 0,02g/l, Fe₂(SO₂)₃·7H₂O: 3mgl, MnCl₂·4H₂O: 1,8mg/l, CoSO₄·7H₂O: 1,5mg/l, ZnSO_4·7H₂O: 0,4mg/l, Na₂MoO₄·2H₂O: 0,2mg/l, CuSO_4·5H₂O: 0,02g/l, Thiaminhydrochlorid (Vitamin B₁): 0,1mg/l, Cyanocobalamin (Vitamin B₁₂), (pH3,5)). (NH₄) ₂HPO₄ kann durch (NH₄) ₂SO₄ oder NH₃aq ersetzt werden. Darüber hinaus können andere als die oben Beschriebenen verwendet werden, wie das bekannte Hutner-Medium oder das bekannte Koren-Hutner-Medium, das gemäß der Beschreibung in „Euglena physiology and biochemistry“, herausgegeben von Shozaburo Kitaoka, Gakkai Shuppan Center, hergestellt ist.
Die Kulturlösung hat vorzugsweise einen pH-Wert von 2 oder mehr und die obere Grenze des pH-Werts ist vorzugsweise 6 oder weniger und stärker bevorzugt 4,5 oder weniger. Durch Einstellen des pH-Werts auf der sauren Seite wird ermöglicht, dass die photosynthetischen Mikroorganismen im Vergleich zu anderen Mikroorganismen vorwiegend wachsen, wodurch Kontamination unterdrückt werden kann.
Die Temperatur, der pH-Wert, die Durchlüftung und die Schüttelgeschwindigkeit der Kultur kann jedoch passend für die Herstellung der Endo-1,3-β-Glucanase unter Verwendung von Euglena ausgewählt werden.
Die Kultur der Gattung Euglena kann weiterhin mithilfe einer beliebigen Flüssigkulturmethode durchgeführt werden, wie einer Kolbenkultur, einer Kultur unter Verwendung eines Fermenters, der Chargen-Kulturmethode, der Semi-Chargen-Kulturmethode (der „Fed-Batch“-Kulturmethode), oder der kontinuierlichen Kulturmethode (der Perfusionskulturmethode).
Die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung kann eine Endo-1,3-β-Glucanase sein, die durch Aufreinigen oder teilweises Aufreinigen der Lyseflüssigkeit der aufgebrochenen Gattung Euglena erhalten wird
Es kann auch eine Endo-1,3-β-Glucanase verwendet werden, die folgendermaßen erhalten werden kann: Nachdem die Kultivierung der Gattung Euglena abgeschlossen ist, wird eine Lyselösung erhalten, die aufgebrochene Gattung Euglena enthält, und die Lyselösung teilweise aufgereinigt, oder die Lyselösung wird aufgereinigt durch Aussetzen derselben einer normalen Rekonstruktionsbehandlung, einer Behandlung mit einem Proteinfällungsmittel (die Aussalzmethode), Zentrifugation, der osmotischen Schock-Methode, die Frost-Tau-Methode, Aufbrechen durch Ultraschall, Ultrafiltration, Gelfiltration, ein beliebiges der verschiedenen Verfahren der Flüssigchromatographie, wie Adsorptionschromatographie, Ionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie und Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), die Dialysemethode, oder eine Kombination davon.
Darüber hinaus kann die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung durch die folgenden Verfahren erhalten werden: Eine Wirtszelle wird mit einem rekombinanten Plasmid transformiert, das durch Einfügen der DNA der vorliegenden Erfindung in einen Plasmidvektor erhalten wird, und die Endo-1,3-β-Glucanase wird als Produkt aus einer Kultur dieser transformierten Zelle erhalten. Ein solches rekombinantes Plasmid, das durch Einfügen der DNA der vorliegenden Erfindung in einen passenden Plasmidvektor erhalten wird, ist von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Als Vektor ist ein Plasmidvektor geeignet, es können jedoch verschiedene Arten von bekannten Vektoren, wie ein Cosmidvektor, ein Bakteriophage, ein Virusvektor, ein künstlicher Chromosomenvektor, und Ähnliche verwendet werden.
Mit einem derartigen Vektor können Wirtszellen anderer Prokaryonten oder Eukaryonten transformiert werden. Desweiteren kann durch die Verwendung eines Vektors mit einer geeigneten Promotorsequenz und/oder einer Sequenz betreffend der Phänotyp-Expression, oder alternativ durch Transfektion einer solchen Sequenz, um denselben Expressionsvektor herzustellen, dazu veranlasst werden, ein Gen in jedem Wirt zu exprimieren.
Durch Transfizieren des Vektors in eine Wirtszelle kann die Zelle erhalten werden. Die Wirtszelle kann eine prokaryontische Zelle oder eine eukaryontische Zelle sein, solange sie eine Zelle ist, in die der Vektor transfiziert werden kann.
Als prokaryontische Wirtszelle kann zum Beispiel der Koji -Pilz (Aspergillus oryzae) in geeigneter Weise eingesetzt werden, es können jedoch auch andere, wie Escherichia coli, Bacillus subtilis, oder Ähnliche verwendet werden.
Als Koji-Pilze können weiterhin andere Arten als Aspergillus oryzae verwendet werden, wie die folgenden Arten von Koji-Pilzen, die zur Gattung Aspergillus gehören: Aspergillus sojae; Aspergillus awamori; Aspergillus kawachii; Aspergillus usami; Aspergillus tamari; und Aspergillus Glaucus.
Als eukaryontische Wirtszelle können zum Beispiel Zellen von Wirbeltieren, Insekten und Hefen verwendet werden.
Für den Fall, dass Aspergillus oryzae (A. oryzae) als Wirtszelle verwendet wird, ist es bevorzugt, dass als Plasmidvektor, ein Aspergillus oryzae-Expressionsvektor pPPamyBSP verwendet wird, der einen α-Amylase-Gen-Promotor (amyBp) benutzt.
Die Gentransfektion einer Zelle kann in geeigneter Weise durchgeführt werden durch Herstellen eines Protoplasten eines Aspergillus oryzae Wirts und Verwenden einer bekannten Protoplasten-PEG-Methode (die Polyethylenglycol-Methode). Das Gleiche kann jedoch auch durch andere bekannte Transfektionstechniken, wie das Lipofektionsverfahren, die Elektroporationsmethode, die Nukleofektionsmethode, die Calciumphosphatmethode, die Injektionsmethode, die Mikroinjectionsmethode oder Ähnliche erzielt werden.
Der Transformant der vorliegenden Erfindung, der durch Transfektion in einer Wirtszelle erhalten wird, kann in gewöhnlicher Art und Weise kultiviert werden und durch dessen Kultivierung wird die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung intrazellulär oder extrazellulär produziert.
Als Kulturmedium für die Kultivierung der Transformanten kann ein beliebiges aus verschiedenen Arten gewöhnlich verwendeter Medien, abhängig von der verwendeten Wirtszelle, in geeigneter Weise ausgewählt werden.
Für den Fall, dass Aspergillus oryzae als Wirtszelle verwendet wird, kann ein bekanntes Kulturmedium, wie das YPM-Medium, verwendet werden. Darüber hinaus können andere verwendet werden, wie ein Kartoffeldextrose-Agar (PDA)-Medium, ein Kartoffeldextrose-Brühe (PDB)-Medium, ein Kleie-Medium, das Weizenkleie enthält, oder Ähnliche verwendet werden.
Die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung, die als rekombinantes Protein im Inneren oder außerhalb der Zellen eines Transformanten durch Kultivieren des Transformanten hergestellt wurde, kann durch ein beliebiges Verfahren zur Auftrennung aus dem Kulturprodukt abgetrennt und aufgereinigt werden, wie das Ausnutzen der physikochemischen Eigenschaften, der chemischen Eigenschaften, der biochemischen Eigenschaften (Enzymaktivität usw.), und Ähnliche des Proteins. Zum Beispiel kann das Folgende angewendet werden: eine normale Rekonstruktionsbehandlung, eine Behandlung mit einem Proteinfällungsmittel (die Aussalzmethode), Zentrifugation, die osmotische Schock-Methode, die Frost-Tau-Methode, Aufbrechen durch Ultraschall, Ultrafiltration, Gelfiltration, ein beliebiges der verschiedenen Verfahren der Flüssigchromatographie wie Adsorptionschromatographie, Ionenaustauscherchromatographie, Affinitätschromatographie und Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC), die Dialysemethode, oder eine Kombination davon.
Zum Beispiel für den Fall, dass die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung, die als rekombinantes Protein hergestellt wird, außerhalb der Zelle sekretiert wird, wird destilliertes Wasser zu dem Kulturmedium gegeben und das Kulturmedium wird gerührt, bei Raumtemperatur für etwa 3 Stunden stehen gelassen und nachfolgend durch ein Filterpapier filtriert, wodurch die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung extrahiert werden kann.
Desweiteren für den Fall, dass die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung, die als rekombinantes Protein hergestellt wird, innerhalb der Zelle lokalisiert ist, wird zum Beispiel eine Pufferlösung dem Kulturmedium hinzugefügt und das Medium unter Verwendung eines Homogenisators diskontinuierlich homogenisiert, während eisgekühlt wird, die erhaltene homogenisierte Flüssigkeit wird zentrifugiert und Überstand gesammelt, wodurch die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung extrahiert werden kann.
Somit kann durch Kultivieren des Transformanten der vorliegenden Erfindung und Auftrennen und Reinigen des Kulturprodukts und so weiter die Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung im industriellen Maßstab hergestellt werden.
Spezifische Eigenschaften der Endo-1,3-β-Glucanase, die von dem Transformanten erhalten wurden, in den das Polynukleotid der vorliegenden Erfindung transfiziert wurde, sind unten aufgeführt, wobei die Eigenschaften der Endo-1,3-β-Glucanase der vorliegenden Erfindung nicht auf diese beschränkt sind:

(1) Wirkung: Hydrolysierung einer β-1,3-Bindung eines β-1,3-Glucans;
(2) Substratspezifität: Zersetzung von Paramylon;
(3) Zersetzungsaktivität: Ein Verhältnis der Paramylon-Zersetzungsaktivität in Bezug auf die Laminarin-Zersetzungsaktivität ist 20 % oder höher;
(4) optimaler pH-Wert: Der optimale pH-Wert ist 3,7-7,0;
(5) optimale Temperatur: Die optimale Temperatur während der Reaktionszeit von bis zu einer Stunde ist 50°C oder höher, die optimale Temperatur während der Reaktionszeit von einer Stunde bis zwei Stunden ist 40°C oder höher und die optimale Temperatur während der Reaktionszeit von 20 Stunden oder mehr ist 60°C oder niedriger; und
(6) Zersetzungsaktivität: ein Verhältnis der Paramylon-Zersetzungsaktivität in Bezug auf die Zersetzungsaktivität von Alkali-aufgequollenen Paramylon ist 25 % oder höher.

Weiterhin ist ein Verfahren zur Herstellung eines Paramylons mit niedrigem Molekulargewicht, wobei die Endo-1,3-β-Glucanase auf das Paramylon einwirkt, so dass Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht erzeugt wird, ist ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.
Bei dem Verfahren zur Herstellung eines Paramylons mit niedrigem Molekulargewicht gemäß der vorliegenden Erfindung wird die Endo-1,3-β-Glucanase, die von der Gattung Euglena gemäß der vorliegenden Erfindung abgeleitet ist, zu einer Paramylon-Suspensionsflüssigkeit zugegebenen, die durch Suspendieren von Paramylon-Pulver in einem Puffer, wie Wasser oder Phosphatpuffer, erhalten wird und bei einem pH-Wert von 3,7 bis 7,0, bei einer Temperatur von 30 bis 70°C, für 15 Minuten bis 20 Stunden inkubiert, so dass die Endo-1,3-β-Glucanase auf das Paramylon einwirkt.
Dadurch werden die β-1,3-Bindungen des Paramylons durch die Endo-1,3-β-Glucanase hydrolysiert, wodurch Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht erzeugt wird.
Hierin bezieht sich „Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht“ auf ein Saccharid, das durch Hydrolyse der β-1,3-Bindungen von Paramylon erzeugt wird, und schließt Glucose und Oligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad von 2 oder mehr ein, wobei zwei oder mehr Glucosen über β-1,3-Bindungen verknüpft sind.
Darüber hinaus kann bei dem Verfahren zur Herstellung eines Paramylons mit niedrigem Molekulargewicht gemäß der vorliegenden Erfindung MoCel3A als eine Glucosidase, abgeleitet von Magnaporthe oryzae zusammen mit der Endo-1,3-β-Glucanase, abgeleitet von der Gattung Euglena gemäß der vorliegenden Erfindung der Paramylon-Suspensionsflüssigkeit hinzugefügt werden.
Desweiteren ist das Enzym, das zusammen mit der Endo-1,3-β-Glucanase zugegeben wird, nicht darauf beschränkt und das Enzym kann eine andere Glucanase oder Glucosidase sein.
Desweiteren kann anstelle von Paramylon-Pulver Alkali-aufgequollenes Paramylon verwendet werden. Wenn Alkali-aufgequollenes Paramylon verwendet wird und eine Alkalibehandlung und Neutralisation durchgeführt wird, kann es einem Puffer zugesetzt werden, nachdem die Salzkonzentration vorab reduziert wird.
BEISPIELE
Nachfolgend wird die vorliegende Erfindung im Einzelnen über Beispiele beschrieben. Die vorliegende Erfindung ist jedoch nicht darauf beschränkt.
(Beispiel 1: Herstellung von Endo-1,3-β-Glucanase aus Euglena)
Euglena gracilis (E. gracilis) Z-Stamm wurde in einem Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,0) suspendiert und nachfolgend mit einem Ultraschallgerät sonifiziert, wodurch eine Lösung von aufgeschlossenem Euglena erhalten wurde. Die Lösung von aufgeschlossenem Euglena wurde zentrifugiert (22.000xg, 15 Minuten), der Überstand wurde gesammelt und Ammoniumsulfat (420 g/l) wurde zugesetzt.
Die Lösung wurde bei 4°C für 30 Minuten stehen gelassen und daraufhin wurde eine Zentrifugation (22.000xg, 15 Minuten) durchgeführt, wodurch ein Präzipitat erhalten wurde.
Das Präzipitat wurde in einem Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,0), der 0,2 M Ammoniumsulfat enthielt, aufgelöst und damit eine hydrophobe Säule (HiPrep Phenyl, GE Healthcare) beschickt, die mit dem gleichen Puffer äquilibriert wurde.
Die Säule wurde mit einem Phosphatpuffer gewaschen, der 0,2 M Ammoniumsulfat (10 mM, pH 7,0) enthielt, und daraufhin wurde die Konzentration des Ammoniumsulfats reduziert, so dass das in der Säule gebundene Protein eluiert wurde.
In 1 ist die Laminarin-Zersetzungsaktivität jeder Fraktion als weiße Kreise gezeigt und die Ammoniumsulfat-Konzentration nach dem Eluieren ist durch eine gepunktete Linie angegeben. Wie in 1 dargestellt, zeigten die Fraktionen mit den Fraktionsnummern 26 bis 36 hohe Zersetzungsaktivität. Diese Fraktionen mit den Fraktionsnummern 26 bis 36, die hohe Zersetzungsaktivität zeigten, wurden gesammelt.
Daraufhin wurden die aktiven Fraktionen mit den Fraktionsnummern 26 bis 36, die Zersetzungsaktivität im Hinblick auf Laminarin in der hydrophoben Säulen zeigten, auf eine Gelfiltrationssäule (Superdex75, GE Healthcare) geladen, die mit einem Phosphatpuffer äquilibriert war, der 0,2 M NaCl (10 mM, pH 7,0) enthielt.
Wie in 2 dargestellt, zeigten die Fraktionen mit den Fraktionsnummern 28 bis 36 hohe Zersetzungsaktivität für Laminarin. Diese Fraktionen mit den Fraktionsnummern 28 bis 36, die hohe Zersetzungsaktivität zeigten, wurden gesammelt.
Daraufhin wurden die aktiven Fraktionen mit den Fraktionsnummern 26 bis 34, die Zersetzungsaktivität im Hinblick auf Laminarin in der Gelfiltrationssäule zeigten, auf eine Anionenaustauschsäule (MonoQ, GE Healthcare) geladen, die mit einem Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) äquilibriert war. Nach dem Waschen der Säule mit Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,5) wurde die Konzentration von NaCl erhöht, so dass die in der Säule gebundenen Proteine eluiert werden.
Wie in 3 dargestellt, zeigten die Fraktionen mit den Fraktionsnummern 28 bis 34 hohe Zersetzungsaktivität für Laminarin. Diese Fraktionen mit den Fraktionsnummern 28 bis 34, die hohe Zersetzungsaktivität zeigten, wurden gesammelt, wodurch eine teilweise gereinigte Endo-1,3-β-Glucanase erhalten wurde.
(Beispiel 2: Bestimmung der Aminosäuresequenz der von Euglena abgeleiteten Endo-1,3-β-Glucanase)
Die aktiven Fraktionen mit den Fraktionsnummern 26 bis 36 mit Proteinen, die teilweise gereinigt sind und Zersetzungsaktivität im Hinblick auf Laminarin in der Ionenaustauschsäule zeigten, die die Säule in Beispiel 1 ersetzt, wurden durch Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) mit einem 12,5%igen Gel abgetrennt und wurden mit Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB) angefärbt. 4 stellt die Fluoreszenzabbildung des Gels dar, das bei der Elektrophorese erhalten wurde. Wie in 4 dargestellt, wurden vier Proteinbanden nachgewiesen.
Die angefärbten Proteine wurden aus dem Gel als Gelstücke ausgeschnitten und mit Trypsin verdaut, wodurch eine fragmentierte Peptidmischung erhalten wurde.
Die fragmentierte Peptidmischung, die mit Trypsin behandelt wurde, wurde abgetrennt und konzentriert, wobei ein Hybrid-Typ-Massenanalysesystem (LTQ Orbitrap XL Massenspektrometer; Thermo Fisher Scientific Inc.), gemäß dem von Kawamura et al. vorgeschlagenen Verfahren (Kawamura, Y. und Uemura, M. (2003) Mass spectrometric approach for identifying putative plasma membrane proteins of Arabidopsis leaves associated with cold acclimation. Plant J. 36, 141-154) verwendet wurde und die Massenanalyse des fragmentierten Peptids wurde zur gleichen Zeit durchgeführt, wobei die Werte der Massen des Peptids und das MS/MS-Spektrum der fragmentierten Ionen erhoben wurden. Daraufhin wurde die Aminosäuresequenz mithilfe der MASCOT MS/MS-Ionensuche (Matrix Science Inc.) über die Sequenz-Markierungs-Methode („sequence tag method“) analysiert.
Demzufolge wurden unter den vier Banden, die in 4 dargestellt sind, die drei Proteine, die nicht Malatsynthase sind, welche die größte ist, als Enzyme bestimmt, die für den Abbau der Polysaccharide ursächlich sind.
Die Bande 1 wurde als „EgCel17A“ bezeichnet. Die Banden 2 und 3 wurden als „EgCel81A“ beziehungsweise „EgCel81B“ bezeichnet.
Die Aminosäuresequenzen von EgCel17A, EgCel81A und EgCel81B sind in den SEQ ID Nummern 2, 4 und 6 gezeigt.
(Beispiel 3: Identifikation von Polynukleotiden, die die von Euglena stammenden Endo-1,3-β-Glucanasen EgCel17A, EgCel81A und EgCel81B kodieren)
Der Euglena gracilis (E. gracilis) Z-Stamm wurde in 10l Koren-Hutner-Medium, hergestellt gemäß der Beschreibung in Euglena physiology and biochemistry (herausgegeben von Shozaburo Kitaoka, Gakkai Shuppan Center) bei 29°C für 10 Tage kultiviert. Das Medium wurde mittels Zentrifugation auf das 6fache konzentriert und Stickstoffgas wurde durch dieses Medium geleitet, bis die gelöste Sauerstoffkonzentration 0,01 mg/l erreichte. Dies wurde hermetisch verschlossen und für 24 Stunden stehen gelassen, was als anaerob behandelte Zellen betrachtet wird.
Von den durch Zentrifugation gesammelten Euglena (100 mg) wurde Gesamt-RNA unter Verwendung eines RNA-Extraktions-Kits (QIAGEN) extrahiert. Von der so hergestellten Gesamt-RNA wurde mithilfe eines oligo(dT)-Primers eine cDNA mit reverser Transkriptase (Transcriptase III, Invitrogen, Inc.) synthetisiert. Für die in Beispiel 2 erhaltenen partiellen Gensequenzen EgCel17A, EgCel81A und EgCel81B mit den Aminosäuresequenzen der SEQ ID Nummern 2, 4 und 6 wurde Folgendes hergestellt: für EgCel17A, ein 5'-Race-Primer und ein 3'-Race-Primer, wie in SEQ ID Nr. 7 und 8 gezeigt; für EgCel81A, ein 5'-Race-Primer und ein 3'-Race-Primer, wie in SEQ ID Nr. 9 und 10 gezeigt; für EgCel81B, ein 5'-Race-Primer und ein 3'-Race-Primer, wie in SEQ ID Nr. 11 und 12 gezeigt.
Anschließend wurde die Gensequenz mithilfe der 5'-Race-Methode und der 3'-Race-Methode gelesen. Für die Synthese der cDNA wurde ein GeneRacer (eingetragenes Warenzeichen)-Kit (Invitrogen, Inc.) verwendet. Weiterhin wurde unter Verwendung der DNA-Primer, die in den SEQ ID Nummern 7 bis 12 gezeigt sind, und einer DNA-Polymerase (GXL DNA polymerase, Takara Bio Inc.) eine PCR durchgeführt.
Alle erhaltenen Gensequenzen wurden mit einem DNA-Sequenziergerät (Genome Analyzer IIx, Illumina, Inc.) gelesen. Die Ergebnisse der Gensequenzanalyse sind in den SEQ ID Nummern 1, 3 und 5 gezeigt.
(Beispiel 4: Herstellung des rekombinanten Proteins EgCel17A)
Gentransfektion in EgCel17A
Ein Sekretionssignal der Nukleotidnummern 72 bis 152 wurde von dem isolierten EgCel17A-Gen, das in SEQ ID Nr. 1 gezeigt ist, entfernt und eine Histidin-Markierung, bestehend aus sieben aufeinanderfolgenden Histidinen, wurde am 3' Ende von 5'-TTAGTGATGGTGATGGTGGTGATGGCTAGG-3' gemäß dem Verfahren von Takahashi et al. (Takahashi M, Takahashi H, Nakano Y, Konishi T, Terauchi R, Takeda T (2010), Characterization of a cellobiohydrolase (MoCel6A) produced from Magnaporthe oryzae. Appl. Environ. Microbiol., 76, 6583-6590.) hinzugefügt. Diese DNA wurde in einen Aspergillus oryzae-Expressionsvektor pPPamyBSP unter Verwendung eines α-Amylasegen-Promotors (amyBp) inseriert.
Die so hergestellte Plasmid-DNA wurde in einen Aspergillus oryzae-Stamm RIB40 mithilfe der PEG-Methode transfiziert und gemäß dem Verfahren von Takahashi et al. wurde der Gen-transfzierte Stamm in einem Czapek-Dox-Agarmedium, das 0,1 mg/ml Pyrithiamin und 1% Glucose enthielt, selektiert.
Aufreinigung des rekombinanten EgCel17A
Mit dem durch Selektion erhaltenen EgCel17A-Gen-transfzierten Stamm von Aspergillus oryzae i) wurde ein YPM-Flüssigmedium (1% Hefeextrakt, 2 % Pepton, 2 % Maltose) angeimpft und es wurde damit eine Schüttelkultur bei 25°C, 120 UpM, für zwei Tage durchgeführt. Der Gen-transfzierte Stamm von Aspergillus oryzae wurde mithilfe einer doppelschichtigen Gaze entfernt und anschließend wurde das Medium durch Ultrafiltration konzentriert. Die erhaltene Lösung wurde auf ein die Histidin-Markierung bindendes Harz aufgebracht (Talon-Metall-Affinitätsharz, Clontech Laboratories, Inc.), äquilibriert mit einer Pufferlösung (50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), 50 mM NaCl) und anschließend wurde das Harz mit der gleichen Pufferlösung gewaschen.
Weiterhin wurde das Harz mit 0,2 x Elutionspuffer (50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), 50 mM NaCl, 40 mM Imidazol) gewaschen. Die am Harz gebundenen Proteine wurden mit dem 1 x Elutionspuffer (50 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), 50 mM NaCl, 40 mM Imidazol) eluiert und der Austausch mit Phosphatpuffer (10 mM, pH 7,0) und die Konzentrierung wurde mittels Ultrafiltration durchgeführt. Über das vorstehend beschriebene Verfahren wurde unter Verwendung von Aspergillus oryzae als Wirt rekombinantes EgCel17A erhalten.
Das unter Verwendung von Aspergillus oryzae als Wirt hergestellte rekombinante EgCel17A (5 µg) wurde mittels SDS-PAGE, gemäß der gleichen Methode wie in Beispiel 2, abgetrennt und anschließend wurde eine CBB-Färbung durchgeführt. Die Ergebnisse der Elektrophorese sind in 5 dargestellt. Wie in 5 dargestellt, wurde eine Bande an einer Position nachgewiesen, die ähnlich zu derjenigen ist, die in Beispiel 2 für EgCel17A erhalten wurde.
(Testbeispiel 1: Eigenschaften von Endo-1,3-β-Glucanase, abgeleitet von der Gattung Euglena)
Substratspezifität
Um die Substratspezifität von EgCel17A zu untersuchen, wurde unter Verwendung des im Beispiel 4 erhaltenen rekombinanten EgCel17A (0,2 µg) die Zersetzungsaktivität in Bezug auf eine Vielzahl von Polysacchariden bestimmt.
Zuerst wurde Alkali-aufgequollenes Paramylon hergestellt. Paramylon-Pulver (bezogen von Euglena Co., Ltd.) wurde in Wasser suspendiert, NaOH-Lösung wurde hinzugefügt und die erhaltene Lösung wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt. Daraufhin wurde die Lösung mit Essigsäure neutralisiert, wodurch Alkali-aufgequollenes Paramylon erhalten wurde. Dieses Alkali-aufgequollene Paramylon wurde mit Wasser gewaschen.
Als nächstes wurden ein Substrat, ein Phosphatpuffer (100 mM, pH5,5) und ein Enzympräparat (Enzymreaktionslösung, 50 µl, die den Säulenelutionspuffer oder 0,2 µg rekombinantes EgCel17A enthielt) gemischt, wodurch eine Reaktionslösung hergestellt wurde.
Als Substrat wurde hier das Folgende verwendet: Von Gerste stammendes 1,3-1,4-β-Glucan (erhältlich von Megazyme Inc.); Xyloglucan (erhältlich von Megazyme Inc.); Carboxymethylcellulose (erhältlich von Sigma-Aldrich Co., LLC); Hydroxyethylcellulose (erhältlich von Sigma-Aldrich Co., LLC); Xylan (erhältlich von Sigma-Aldrich Co., LLC); Laminarin (erhältlich von Sigma-Aldrich Co., LLC); von Baumwolle stammende Cellulose (erhältlich von Sigma-Aldrich Co., LLC); Phosphat-quellbare Cellulose (hergestellt aus Cellulose von den Erfindern der vorliegenden Erfindung); Paramylon (erhältlich von Euglena Co., Ltd.) und Alkali-aufgequollenes Paramylon.
Die Substratkonzentration in der Reaktionslösung wurde auf 0,1 % eingestellt für den Fall, dass das Substrat 1,3-1,4-β-Glucan, Xyloglucan, Carboxymethylcellulose, Hydroxyethylcellulose, Xylan oder Laminarin oder Cellulose war, und wurde auf 1 % eingestellt für den Fall, dass das Substrat Phosphat-quellbare Cellulose, Paramylon oder Alkali-aufgequollenes Paramylon war.
Auf diese Weise wurde mehr von Phosphat-quellbarer Cellulose, Paramylon und Alkali-aufgequollenem Paramylon, die wasserunlösliche Substrate sind, zum Reaktionssytem gegeben, verglichen mit den wasserlöslichen Substraten.
Die hergestellten Reaktionslösungen wurden bei 30°C eine Stunde inkubiert.
Nach der Methode von Lever, M. (Lever, M. (1972) A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates. Anal. Biochem. 47, 273-279) wurde 0,5N HCl-Lösung (200 µl), die 0,5% 4-Hydroxybenzhydrazid enthielt, zu der Reaktionslösung hinzugefügt und anschließend wurde die Lösung 5 Minuten mit kochendem Wasser behandelt. Die Lösung wurde auf natürlichem Wege gekühlt und anschließend wurde ein Wert bei 410 mit einem Spektrophotometer gemessen und es wurde ein Anstieg der Reduktionskraft, bezogen auf Glucose, berechnet, der als Wert für die Aktivität betrachtet wird.
Wenn Cellulose, Phosphat-quellbare Cellulose, Paramylon oder Alkali-aufgequollenes Paramylon als Substrat verwendet wird, wird die Reduktionskraft des Überstands gemessen, der durch Zentrifugation nach der Inkubation erhalten wird.
Die Ergebnisse der Messung sind in 6 gezeigt. In 6 wird eine Zersetzungsaktivität in Bezug auf Laminarin von 100 vorausgesetzt und die Mittelwerte der relativen Aktivität ± SE (n=3) sind gezeigt.
Gemäß 6 zeigte EgCel17A hohe Zersetzungsaktivität in Bezug auf Laminarin, Paramylon und Alkali-aufgequollenes Paramylon.
Darüber hinaus zeigte EgCel17A auch Zersetzungsaktivität in Bezug auf 1,3-1,4-β-Glucan, Hydroxyethylcellulose und Phosphat-quellbare Cellulose.
Andererseits zeigte EgCel17A keine Zersetzungsaktivität in Bezug auf Xyloglucan, Carboxymethylcellulose, Xylan und Cellulose.
Die Zersetzungsaktivität in Bezug auf Paramylon war etwas mehr als 20 % der Zersetzungsaktivität in Bezug auf Laminarin, und die Zersetzungsaktivität in Bezug auf Alkali-aufgequollenes Paramylon war etwas mehr als 80 % der Zersetzungsaktivität in Bezug auf Laminarin, was beweist, dass EgCel17A hohe Zersetzungsaktivität in Bezug auf Paramylon und Alkali-aufgequollenes Paramylon aufweist, die auf einem wesentlich höheren Niveau als die eines konventionellen Enzyms ist.
Das Höhe der Zersetzungsaktivität von EgCel17A war in absteigender Reihenfolge: Laminarin > Alkali-aufgequollenes Paramylon > Paramylon > 1,3-1,4-β-Glucan ≒ Phosphat-quellbare Cellulose > Hydroxyethylcellulose.
Aus diesem Ergebnis geht klar hervor, dass EgCel17A, welches eine endo-1,3-β-Glucanase ist, Laminarin, Paramylon und Alkali-aufgequollenes Paramylon abbaut, und andere Polysaccharide nur schlecht zersetzt.
Optimale Temperatur
Die Zersetzungsaktivität von EgCel17A in Bezug auf Laminarin wurde bei verschiedenen Temperaturen bestimmt, um die optimale Temperatur für EgCel17A zu untersuchen.
Die Reaktionslösung, die 0,1% Laminarin enthielt, und wie vorstehend in i) beschrieben, hergestellt wurde, wurde bei 30°C und 70°C 5 bis 120 Minuten inkubiert. Die Ergebnisse sind in 7 gezeigt.
Gemäß 7 wurde für den Fall, dass die Reaktion bei 70°C ablief, die maximale Zersetzungsaktivität beim Abbau von Laminarin 60 Minuten später gezeigt, die etwa 4-Mal die Zersetzungsaktivität bei der Reaktion bei 30°C war.
Darüber hinaus wurde die Reaktionslösung, die 0,1% Laminarin enthielt, und wie vorstehend in i) beschrieben, hergestellt wurde bei 30°C, 40°C, 50°C, 60°C und 70°C für 1, 2, 3, 4, 5, 6 und 20 Stunden bei jeder Temperatur inkubiert. Die Aktivitätswerte sind als Mittelwerte ± SE (n=3) angegeben. Die Ergebnisse sind in 8 gezeigt.
Aus 8 wird ersichtlich, dass, wenn eine Langzeit-Enzymreaktion für 5 Stunden oder länger durchgeführt wird, die Zersetzungsaktivität bei 40°C bis 50°C höher war als die Zersetzungsaktivität bei 70°C.
Optimaler pH-Wert
Die Laminarin-Zersetzungsaktivität von EgCel17A wurde bei verschiedenen pH-Werten bestimmt, so dass der optimale pH-Wert für EgCel17A untersucht wurde.
Die Reaktionslösung, die 0,1% Laminarin enthielt, und wie vorstehend in i) beschrieben, hergestellt wurde, wurde bei pH 3,5 bis 8,0 inkubiert. Um den pH-Wert einzustellen, wurde Natriumacetat (pH 3,5 bis 5,5, weiße Kreise) und Natriumphosphat (pH 5,5 bis 8,0, schwarze Kreise) verwendet. Die Ergebnisse sind in 9 gezeigt. Die Aktivitätswerte sind als Mittelwerte ± SE (n=3) angegeben.
Gemäß 9 wurde eine hohe Zersetzungsaktivität bei einem pH-Wert von 3,7 bis 7,0 beobachtet, wobei eine besonders hohe Zersetzungsaktivität bei einem pH-Wert von 4,0 bis 6,0 beobachtet wurde.
iv) Vergleich zwischen der Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A und derjenigen einer Trichoderma-Cellulase-Zubereitung.
Die Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma (Trichoderma reesei-Cellulase, Sigma-Aldrich Co., LLC), EgCel17A und Mischungen der Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma und EgCel17A wurden verwendet, um die Paramylon-Zersetzungsaktivitäten zu vergleichen.
Als Proben für die Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma wurden die gleichen Reaktionslösungen verwendet wie die Reaktionslösungen, die wie vorstehend beschrieben in i) hergestellt wurden, und die 1% Paramylon enthielten, mit der Ausnahme, dass sie 2 µg beziehungsweise 10 µg der Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma anstelle des Enzympräparats enthielten.
Weiterhin wurden als Proben für EgCel17A die gleichen Reaktionslösungen verwendet, wie die Reaktionslösungen, die wie vorstehend beschrieben in i) hergestellt wurden, und die 1% Paramylon enthielten, mit der Ausnahme, dass sie 0,4 µg, 2 µg und 4 µg, wie in Beispiel 2, hergestelltes EgCel17A anstelle des Enzympräparats enthielten.
Als Proben für die Mischungen der Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma und EgCel17A wurden die gleichen Reaktionslösungen verwendet, wie die Reaktionslösungen, die wie vorstehend beschrieben in i) hergestellt wurden, und die 1% Paramylon enthielten, mit der Ausnahme, dass sie das Folgende anstelle des Enzympräparats enthielten: 2 µg Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma und 0,4 µg des in Beispiel 2 hergestellten EgCel17A; 2 µg Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma und 2 µg des in Beispiel 2 hergestellten EgCel17A; 2 µg Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma und 4 µg des in Beispiel 2 hergestellten EgCel17A; 10 µg Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma und 0,4 µg des in Beispiel 2 hergestellten EgCel17A; 10 µg Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma und 2 µg des in Beispiel 2 hergestellten EgCel17A; 2 µg Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma und 4 µg des in Beispiel 2 hergestellten EgCel17A.
Jede Probe wurde bei pH 5,5 (Natriumacetatpuffer) bei einer Temperatur von 40°C für 18 Stunden inkubiert.
Die Ergebnisse sind in 10 gezeigt. Die Aktivitätswerte sind als Mittelwerte ± SE (n=3) angegeben.
Demzufolge zeigte die Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma schwache Paramylon-Zersetzungsaktivität, jedoch EgCel17A zeigte eine etwa 100fache Zersetzungsaktivität zu derjenigen der Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma bei gleicher Konzentration (2 µg). Darüber hinaus zeigte die Probe von 2 µg EgCel17A eine Zersetzungsaktivität auf dem gleichen Niveau wie 10 µg der Cellulase-Zubereitung aus Trichoderma.
iv) Vergleich zwischen der Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A und der von Bacillus subtilis-Glucanase
Die Glucanase von Bacillus subtilis (erhältlich von Megazyme Inc.) und EgCel17A wurden verwendet, um die Zersetzungsaktivitäten in Bezug auf Paramylon-zu vergleichen.
Als Proben für die Bacillus subtilis-Glucanase wurden die gleichen Reaktionslösungen verwendet wie die Reaktionslösungen, die wie vorstehend beschrieben in i) hergestellt wurden, und die 1% Paramylon enthielten, mit der Ausnahme, dass sie 2 µg beziehungsweise 10 µg der Bacillus subtilis-Glucanase anstelle des Enzympräparats enthielten.
Weiterhin wurden als Proben für EgCel17A die gleichen Reaktionslösungen verwendet wie die Reaktionslösungen, die wie vorstehend beschrieben in i) hergestellt wurden, und die 1% Paramylon enthielten, mit der Ausnahme dass sie 0,2 µg, 0,4 µg, 1 µg, 2 µg und 4 µg wie in Beispiel 2 hergestelltes EgCel17A anstelle des Enzympräparats enthielten.
Jede Probe wurde bei pH 5,5 (Natriumacetatpuffer) bei einer Temperatur von 40°C für 18 Stunden inkubiert.
Die Ergebnisse sind in 11 gezeigt. Die Aktivitätswerte sind als Mittelwerte ± SE (n=3) angegeben.
Demzufolge zersetzte die Glucanase aus Bacillus subtilis Paramylon schlecht und nur EgCel17A zeigte Paramylon-Zersetzungsaktivität.
Die Einflüsse von Rinderserumalbumin (BSA) auf die Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A.
Die Einflüsse von Rinderserumalbumin (BSA) auf die Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A wurden untersucht.
Proben wurden hergestellt, indem die gleichen Reaktionslösungen verwendet wurden, wie die Reaktionslösungen, die wie vorstehend beschrieben in i) erhalten wurden, und die 1% Paramylon enthielten, mit der Ausnahme, dass dazu 1,0 µg wie in Beispiel 2 hergestelltes EgCel17A anstelle des Enzympräparats hinzugefügt wurde, und dass weiterhin 0,2 µg, 5 µg beziehungsweise 10 µg BSA (Sigma-Aldrich Co., LLC) zur Reaktionslösung gegeben wurden. Diese Proben wurden bei pH 5,5 (Natriumacetatpuffer) bei einer Temperatur von 40°C für 18 Stunden inkubiert.
Die Ergebnisse sind in 12 gezeigt. Die Aktivitätswerte sind als Mittelwerte ± SE (n=3) angegeben.
Demzufolge zeigte die Probe, zu der 5 µg BSA hinzugefügt wurde, ein Paramylon-Zersetzungsaktivität, die um etwa 10 % verbessert war im Vergleich zu der Probe, der kein BSA zugesetzt wurde.
Von BSA ist bekannt, dass es eine stabilisierende und aktivierende Wirkung auf das Enzym hat und dessen Beitrag in Bezug auf die Verbesserung der Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A ist etwa 10 %, was verglichen mit dessen Beitrag auf andere Enzyme niedriger ist. Es ist daher klar, dass, wenn Paramylon durch EgCel17A zersetzt wird, so dass Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht hergestellt wird, die Notwendigkeit BSA zuzugeben geringer ist, als wenn andere zersetzende Enzyme verwendet werden.
vii) Die Einflüsse von Metall auf die Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A
Die Einflüsse von Metall auf die Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A wurden untersucht.
Metalle wurden zu den gleichen Reaktionslösungen gegeben, die wie vorstehend beschrieben in i) hergestellt wurden und die 1% Paramylon enthielten, mit der Ausnahme, dass 1,0 µg in Beispiel 2 hergestelltes EgCel17A anstelle des Enzympräparats zugegeben wurde.
In anderen Worten, die folgenden Proben wurden hergestellt: Probe ohne zugesetztes Metall; der Probe 10 mM NaCl zugesetzt; der Probe 50 mM NaCl zugesetzt; der Probe 100 mM NaCl zugesetzt; der Probe 1 mM MgCl₂ zugesetzt; der Probe 1 mM KCl zugesetzt; der Probe 1 mM CaCl₂ zugesetzt; der Probe 1 mM FeSO₄ zugesetzt; der Probe 1 mM MnCl₂ zugesetzt; der Probe 1 mM ZnSO₄ zugesetzt; der Probe 1 mM NiCl₂ zugesetzt; der Probe 1 mM CuSO₄ zugesetzt; und der Probe 1 mM CoCl₂ zugesetzt.
Diese Proben wurden bei pH 5,5 (Natriumacetatpuffer) bei einer Temperatur von 40°C für 18 Stunden inkubiert.
Die Ergebnisse sind in 13 gezeigt. Die Aktivitätswerte sind als Mittelwerte ± SE (n=3) angegeben.
Demzufolge zeigten die Probe mit 10 mM zugesetztem NaCl, die Probe mit 1 mM zugesetztem KCl und die Probe mit 1 mM zugesetztem ZnSO₄ verbesserte Paramylon-Zersetzungsaktivitäten um etwa 10 % verglichen mit der Probe, bei der kein Metall zugesetzt war.
Andererseits zeigte die Probe mit 1 mM zugesetztem CaCl₂, die Probe mit 1 mM zugesetztem FeSO₄, die Probe mit 1 mM zugesetztem MnCl₂, die Probe mit 1 mM zugesetztem NiCl₂, die Probe mit 1 mM zugesetztem CuSO₄ und die Probe mit 1 mM zugesetztem CoCl₂ reduzierte Paramylon-Zersetzungsaktivität verglichen mit der Probe, bei der kein Metall zugesetzt war.
Diese Ergebnisse haben bewiesen, dass Metallionen von Ca, Fe, Mn, Ni, Cu oder Co mit der Reaktionslösung vermischt werden, die Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A abnimmt. Es ist daher klar, dass wenn Paramylon durch EgCel17A zersetzt wird, so dass Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht hergestellt wird, eine Reaktionslösung oder Kulturmedium verwendet werden kann, bei denen die Konzentration an Metallionen reduziert ist, oder eine Reaktionslösung oder Kulturmedium, bei denen keine Metallionen beigemischt sind.
vii) Die Einflüsse einer Alkalibehandlung von Euglena, das Paramylon enthält, auf die Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A
In Bezug auf die Zersetzungsaktivität von EgCel17A auf Alkali-aufgequollenes Paramylon wurden die Einflüsse der Konzentration der Alkalilösung für die Vorbehandlung von Euglena untersucht.
In Wasser suspendiertes Euglena-Pulver wurde mit NaOH-Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen behandelt (nicht behandelt mit NaOH; behandelt mit 0,025 M NaOH; behandelt mit 0,05 M NaOH; behandelt mit 0,25M NaOH; behandelt mit 0,5 M NaOH; behandelt mit 1 M NaOH; behandelt mit 2 M NaOH; behandelt mit 3 M NaOH; behandelt mit 5 M NaOH) und neutralisiert mit Essigsäure, wodurch Alkali-behandeltes Euglena erhalten wurde.
Es wurden die gleichen Reaktionslösungen verwendet wie die Reaktionslösungen, die wie vorstehend in i) beschrieben hergestellt wurden mit der Ausnahme, dass 1 mg Alkali-behandeltes Euglena, in den entsprechenden Konzentrationen behandelt, anstelle von 1% Alkali-aufgequollenem Paramylon hinzugefügt wurde und weiterhin wurde 1 µg wie in Beispiel 2 hergestelltes EgCel17A als Enzympräparat hinzugefügt. Jede Probe wurde bei pH 5,5 (Natriumacetatpuffer) bei einer Temperatur von 40°C für 3 Stunden inkubiert.
Die Ergebnisse sind in 14 gezeigt. Die Aktivitätswerte sind als Mittelwerte ± SE (n=3) angegeben.
Demzufolge ist erkannt worden, dass die Behandlung mit 0,5 M oder mehr NaOH hohe Zersetzungsaktivität von EgCel17A ermöglicht. Insbesondere ist beobachtet worden, dass die Behandlung mit 2 M NaOH zu der höchsten Zersetzungsaktivität führte.
viii) Die Einflüsse von NaCl auf die Paramylon-Zersetzungsaktivität von EgCel17A
Die Einflüsse von Natriumchlorid auf die Zersetzungsreaktion von Alkali-aufgequollenem EgCel17A wurden untersucht.
Es wurden die gleichen Reaktionslösungen verwendet wie die Reaktionslösungen, die 1% Alkali-aufgequollenes Paramylon enthielten, und die wie vorstehend in i) beschrieben hergestellt wurden mit der Ausnahme, dass 1 µg EgCel17A anstelle des Enzympräparats und darüber hinaus, 0 M, 0,1 M, 0,5 M, 1,0 M, und 2,0 M NaCl hinzugefügt wurde.
Jede Probe wurde bei pH 5,5 (Natriumacetatpuffer) bei einer Temperatur von 40°C für 3 Stunden inkubiert.
Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt. Für den Fall, dass kein NaCl zugegeben wurde, wird die Zersetzungsaktivität als 100 angenommen, relative Aktivitätswerte sind als Mittelwerte ± SE (n=3) gezeigt.
In 15 wurde eine Verringerung der Zersetzungsaktivität von EgCel17A bei Anwesenheit von 0,5 M oder mehr NaCl beobachtet. Aus diesen Ergebnissen wird klar, dass, wenn Paramylon durch EgCel17A zersetzt wird, so dass Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht hergestellt wird, die Effizienz der Herstellung von Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht durch NaCl verringert wird. Für den Fall, dass eine Alkalibehandlung und Neutralisation als Vorbehandlung für die Zersetzung von Paramylon unter Verwendung von EgCel17A durchgeführt wurde, ist es notwendig, die Einflüsse der erzeugten Salze zu beachten. Es ist daher klar, dass für den Fall, dass eine Alkalibehandlung und Neutralisation als Vorbehandlung für die Zersetzung von Paramylon unter Verwendung von EgCel17A durchgeführt wurde, die NaCI-Konzentration reduziert werden kann, oder das NaCl entfernt werden kann, bevor EgCel17A zugesetzt wird.
(Testbeispiel 2: Transglycosylierungsaktivität von EgCel17A)
In dem vorliegenden Testbeispiel wurde die Transglycosylierungsaktivität von EgCel17A untersucht.
Zuerst wurden Laminarioligosaccharide (bezogen von Megazyme Inc.) mit einem Polymerisationsgrad von 4 bis 7 an einem Glucoserest an der Seite reduktiven Endes mit Sulphorhodamin markiert, gemäß dem Verfahren, vorgeschlagen von Fry et al. (Fry S. C. (2002) Novel ‚dot-blot‘ assays for glycosyltransferases and glycosylhydrolases: optimization for xyloglucan endotransglycosylase (XET) activity. Plant J. 11, 1141-1150.).
Die fluoreszenzmarkierten Laminarioligosaccharide wurden mithilfe von Papierchromatographie gereinigt (Lösungsmittel; Butanol:Essigsäure:Wasser = 1:1:1).
Unter Verwendung der fluoreszenzmarkierten Laminarioligosaccharide wurde die Transglycosylierungsaktivität von EgCel17A untersucht.
Es wurden die gleichen Reaktionslösungen verwendet wie die Reaktionslösungen, die wie vorstehend in i) des Testbeispiels beschrieben hergestellt wurden mit der Ausnahme, dass 0,1 % der fluoreszenzmarkierten Laminarioligosaccharide, oder eine Mischung von 0,1 % der fluoreszenzmarkierten Laminarioligosaccharide, und 0,1% Laminarin, was anstelle des Substrats verwendet wurde, und 0,2 µg in Beispiel 2 erhaltenes EgCel17A anstelle des Enzympräparats hinzugefügt wurden.
Die Proben wurden bei 40°C 0 Minuten (keine Inkubation), 15 Minuten, 30 Minuten beziehungsweise 60 Minuten inkubiert.
Die Ergebnisse sind in 16 gezeigt.
Wie in 16 dargestellt, wurden, nachdem die Zeit abgelaufen war, fluoreszenzmarkierte Produkte mit angesteigenden Molekulargewichten in den Reaktionslösungen beobachtet, die Laminarin sowie Laminarihexaose (Polymerisationsgrad: 6) beziehungsweise Laminariheptaose (Polymerisationsgrad: 7) enthielten.
Andererseits wurde bei dem Fall, wo kein Laminarin enthalten war, wie in 16 gezeigt, der Abbau von Laminarihexaose und Laminariheptaose beobachtet.
Aus diesen Ergebnissen geht klar hervor, dass EgCel17A nach dem Abbau von Laminarin als Polymer eine Übertragungsreaktion für den Transfer in fluoreszenzmarkierte Laminarihexaose und Laminariheptaose katalysiert.
(Testbeispiel 3: Verfahren zur Herstellung von Glucose aus Paramylon unter Verwendung von EgCel17A)
Alkali-aufgequollenes Paramylon und 100 mM Phosphatpuffer (pH 5,5) wurden zu EgCel17A (1 µg) gegeben, das in Beispiel 2 erhalten wurde, gefolgt von einer Inkubation bei 40°C für eine Stunde. Anschließend wurde das Reaktionsprodukt (1 µl) auf eine HPLC-Säule aufgetragen, die mit NaOH äquilibriert war, und daraufhin die Natriumacetatkonzentration (0 bis 100 mM) angehoben wurde, so dass das Reaktionsprodukt eluiert wurde.
Daraufhin wurden EgCel17A (1 µg) und MoCel3A (0,2 µg (hergestellt von den Erfindern der vorliegenden Erfindung) Takahashi, M., Konishi T., Takeda T. (2011) Biochemical characterization of Magnaporthe oryzae β-glucosidases for efficient β-glucan hydrolysis. Appl. Microbiol. Biotechnol., 91, 1073-1082), das eine von Magnaporthe oryzae abgeleitete β-Glucosidase ist, vermischt und Alkali-aufgequollenes Paramylon und 100 mM Phosphatpuffer (pH5,5) zugegeben. Die Mischung wurde bei 40°C für eine Stunde inkubiert und daraufhin wurde das Reaktionsprodukt mittels HPLC nachgewiesen.
Die Ergebnisse sind in 17 gezeigt.
Wie in 17 dargestellt, war für den Fall, wo Alkali-aufgequollenes Paramylon von EgCel17A alleine abgebaut wurde, das Signal von Glucose niedriger als die Signale derjenigen mit einem Polymerisationsgrad von 3 und 4, jedoch für den Fall, wo MoCel3A, eine von Magnaporthe oryzae abgeleitete β-Glucosidase, zu EgCel17A gegeben wurde und das Alkali-aufgequollene Paramylon dadurch abgebaut wurde, deutete das Signal von Glucose daraufhin, dass es das hauptsächlich hergestellte Produkt ist.
Die vorstehenden Beschreibungen machen deutlich, dass Vermischen von EgCel17A und MoCel3A eine effiziente Umwandlung von Paramylon in Glucose ermöglicht.
(Testbeispiel 4: Laminarioligosaccharidabbau und Übertragungsreaktion durch EgCel17A)
In dem vorliegenden Testbeispiel wurde die Zersetzungsaktivität von Laminarioligosaccharid und Übertragungsaktivität von EgCel17A untersucht.
Zuerst wurden die Laminarioligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad von 2 bis 7 (100 µg), EgCel17A (0,1µg) und einem Phosphatpuffer (Endkonzentration 100 mM, pH 5,5) vermischt und bei 40°C stehen gelassen. Nach 0 Stunden, 0,5 Stunden, 1 Stunde, 2 Stunden, 4 Stunden und 18 Stunden Reaktion wurden die Proben gesammelt und die Reaktionsprodukte mittels Dünnschichtchromatographie abgetrennt. Als Lösungsmittel wurde hier eine Lösung aus 1-Butanol:Essigsäure:Wasser = 2:1:1 verwendet. Nach der Entwicklung wurde es in Schwefelsäure/Ethanol (5:95)-Flüssigkeit getaucht, die 0,5 % Thymol enthielt, und anschließend für 5 Minuten bei 110°C behandelt.
Die Ergebnisse der Auftrennung der Reaktionsprodukte durch Dünnschichtchromatographie sind in 18 gezeigt.
Wie in 18 dargestellt, wurde die Laminaribiose (Polymerisgrad: 2) durch EgCel17A nicht abgebaut und die Laminarioligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad von 3 bis 7 durch EgCel17A abgebaut.
Gleichzeitig wurden im Hinblick auf die Laminarioligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad von 3 bis 7 und insbesondere diejenigen mit einem Polymerisationsgrad von 4 bis 7 nach 0,5 bis 4 Stunden Reaktion Laminarioligosaccharide mit einem höheren Polymerisationsgrad extrahiert und eine Übertragungsreaktion im Hinblick auf die Substrate der Laminarioligosaccharide mit einem Polymerisationsgrad von 3 bis 7, insbesondere diejenigen mit einem Polymerisationsgrad von 4 bis 7 wurden ausgelöst.
Als 18 Stunden der Reaktionszeit verstrichen waren, waren diese Substrate jedoch zu Glucose, Laminaribiose und Laminaritriose abgebaut.
(Beispiel 5: Herstellung des rekombinanten Proteins von EgCel81A und Bestimmung der Aktivität davon)
Plasmid-Aufbau
Ein Gen, erhalten durch Hinzufügen einer Sekretionssignalsequenz von EGL2 (AB032830), erhalten aus Pisum sativum, zu dem Egcel81A-Gen, und Hinzufügen einer Histidinmarkierung (His-tag) am 3‘Ende wurde in einen pCambia-Plasmidvektor transfiziert. Der so konstruierte Plasmidvektor wurde mittels Elektroporation in ein Agrobakterium transfiziert und anschließend wurde das transgene Agrobakterium auf einer YEB-Platte (Hefeextrakt 1 g/l, Pepton 5 g/l, Rinderextrakt 5 g/l, Saccharose 5 g/l, MgSO₂7H₂O 0,5 g/l), die Kanamycin enthielt, selektiert.
Gentransfer in den Reis-Kallus
Saatgut von Oryza sativa (Sasanishiki) wurden sterilisiert und ein C1-Medium (N6-1-Alanin 20 ml/l, N6-2-Alanin 50 ml/l, N6-3-Alanin 1 ml/l, N6-4-Alanin 10 ml/l, N6-Vitamin 1 ml/l, Saccharose 3,75 g/l, Casaminosäure 0,3 g/L, Prolin 2,878 g/l, 2,4-Ddichlorphenoxyessigsäure (100 mg/l) 20 ml/l, Gellan-Gummi 3 g/l, (pH 5,8)) damit angeimpft und bei 30°C für 5 Minuten an einem dunklen Ort kultiviert, wodurch Kallus-Bildung ausgelöst wurde. Die Reis-Kallusse wurden mit Agrobakterium vermischt und über ein K2-Medium (N6-1-Alanin 20 ml/l, N6-2-Alanin 50 ml/l, N6-3-Alanin 1 ml/l, N6-4-Alanin 10 ml/l, N6-Vitamin 1 ml/l, Saccharose 3,75 g, Glucose 10 g/l, Casaminosäure 0,3 g/l, 2,4-Dichlorphenoxyessigsäure (100mg/l) 20ml, Gellan-Gummi 3 g/l, (pH 5,2)) verteilt und an einem dunklen Ort für 3 Tage bei 25°C stehen gelassen. Nachdem die Agrobakterien von den Reis-Kallussen mit einem Reinigungspuffer entfernt wurden, wurde ein K2-Medium, das Carbenicillin (400 µg/ml) und Hygromycin (50 µg/ml) enthielt, mit den Reis-Kallussen angeimpft und bei 30°C für 10 Tage kultiviert. Daraufhin wurde ein K2-Medium, das Carbenicillin (300 µg/ml) und Hygromycin (50 µg/ml) enthielt, mit den Reiskallussen angeimpft und die Gen-transfizierten Körper selektiert.
Herstellung des Proteins
Acht einzelne Reis-Kallusse (10mg) wurden einem Zellaufschluss in einem Puffer (50 mM Natriumacetat (pH 7,0), 300 mM Natriumchlorid) unterworfen und daraufhin wurde der Überstand mittels Zentrifugation (5.000 UpM, 5 Min) gesammelt. Der Überstand wurde konzentriert und mittels Ultrafiltration entsalzt und daraufhin einem Western-Blot und einer Enzymaktivitätsmessung unterworfen.
iv) Western-Blot
Die in dem Überstand enthaltenen Proteine wurden über SDS-PAGE aufgetrennt und in PVDF-Membranen transkribiert. Der Western-Blot wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen den His-tag durchgeführt. Die Ergebnisse des Western-Blot-Experiments, das auf Basis der acht einzelnen Reis-Kallusse durchgeführt wurde, sind in 19 gezeigt. Die Nummern 1 bis 8 in 19 zeigen die acht einzelnen Reis-Kallusse an.
Enzymaktivität
Sieben Arten von Polysaccharidsubstraten (jeweils 0,1 % von 1,3-1,4-β Glucan, Xylan, Xyloglucan, Laminarin, Glucomannan, PSC (Phosphat-quellbare Cellulose) und Paramylon) und ein Puffer (100 mM Essigsäurepuffer (pH6,0)) wurden zu dem Überstand gegeben, der von dem Reis-Kallus Nr. 1 in 19 stammt, dessen Signal im Western-Blot nachgewiesen wurde, und bei 30°C für 18 Stunden stehen gelassen. Zu jeder Reaktionslösung wurde p-Hydroxybenzoesäurehydrazid zugegeben und die Reaktionslösung wurde für 5 Minuten gekocht. Anschließend wurde der Absorptionsgrad bei 410 nm gemessen, wobei angestiegene Reduktionskraft festgestellt wurde. Die Messergebnisse sind in 20 gezeigt.
vi) Ergebnis
Wie vorstehend beschrieben, wurden die Proteine aus acht einzelnen Reis-Kallussen hergestellt und ein Western-Blot-Experiment wurde unter Verwendung eines Antikörpers gegen den His-tag durchgeführt. Wie in 19 dargestellt, war das Ergebnis, dass fünf einzelne Reis-Kallusse (Nr. 1, 2, 4, 5 und 7) erhalten wurden, die EgCel81A produzierten.
Weiterhin wurde die Hydrolyseaktivität unter Verwendung des Reis-Kallus (Nr. 1) bestimmt. Wie in 20 dargestellt, war das Ergebnis, dass die Hydrolyseaktivität im Hinblick auf 1,3-1,4-β-Glucan und Laminarin deutlich erkennbar war. Da gewöhnlich β-1,3-Bindungen in diesen Polysacchariden vorhanden sind, wurde klargestellt, dass EgCel81A eine endo-1,3-β-Glucanase ist.

Claims

Eine Endo- 1,3- β-Glucanase, die aus einer Aminosäuresequenz (a) oder (b) hergestellt wurde, die nachfolgend gezeigt ist: (a) einer Aminosäuresequenz, die in SEQ ID Nummer 2 aufgeführt ist; und (b) einer Aminosäuresequenz, die durch Deletion, Substitution oder Hinzufügen von einer oder nicht mehr als 75 Aminosäuren in Bezug auf eine Aminosäuresequenz, die in den SEQ ID Nummer 2 aufgeführt ist, erhalten wurde, und die Hydrolyseaktivität vom Endo-Typ für die Hydrolysierung einer β-1,3-Bindung eines Alkali-aufgequollenen Paramylons aufweist, wobei das durch Hydrolyse des Alkali-aufgequollenen Paramylons erhaltene Hauptprodukt ein geradkettiges Oligosaccharid ist.
Ein Polynukleotid, das aus einer Basensequenz (a) oder (b) hergestellt wurde, die nachfolgend gezeigt ist: (a) einer Basensequenz, die in SEQ ID Nummer 1 aufgeführt ist; und (b) einer Basensequenz, die eine Identität von 70% oder mehr in Bezug auf eine Basensequenz, die in den SEQ ID Nummer 1, aufgeführt ist, erhalten wurde, und die Hydrolyseaktivität vom Endo-Typ für die Hydrolysierung einer β-1,3-Bindung eines Alkali-aufgequollenen Paramylons aufweist, wobei das durch Hydrolyse des Alkali-aufgequollenen Paramylons erhaltene Hauptprodukt ein geradkettiges Oligosaccharid ist.
Ein rekombinanter Vektor umfassend das Polynukleotid nach Anspruch 2.
Ein Transformant umfassend den rekombinanten Vektor nach Anspruch 3.
Ein Verfahren zur Herstellung einer Endo-1,3-β-Glucanase, wobei das Verfahren umfasst: Züchten des Transformanten nach Anspruch 4 in einem Kulturmedium; Erzeugen und Aufbewahren der Endo-1,3-β-Glucanase nach Anspruch 1 in dem Kulturprodukt; und Sammeln der Endo-1,3-β-Glucanase aus dem Kulturprodukt.
Eine Enzymzubereitung für die Reduzierung eines Molekulargewichts von Paramylon, wobei die Enzymzubereitung die Endo-1,3-β-Glucanase nach Anspruch 1 enthält.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Paramylons mit niedrigem Molekulargewicht, wobei das Verfahren umfasst: Endo-1,3-β-Glucanase nach Anspruch 1 auf Alkali-aufgequollenes Paramylon oder Alkali-behandelte Euglena einwirkt, um das Paramylon mit niedrigem Molekulargewicht, das das geradkettige Oligosaccharid mit einem Polymerisationsgrad von 2 oder mehr enthält, herzustellen.
Ein Verfahren zur Herstellung eines Paramylons mit niedrigem Molekulargewicht nach Anspruch 7, wobei die Endo-1,3-β-Glucanase auf Alkali-aufgequollenes Paramylon oder Alkali-behandelte Euglena in einer Lösung einwirkt, wobei eine Gruppe von Metallionen einschließlich Ca, Fe, Mn, Ni, Cu oder Co reduziert ist, oder der Losung nicht beigemischt sind, und Glucosidase zusammen mit der Endo-1,3-β-Glucanase auf Alkali-aufgequollenes Paramylon oder Alkali-behandelte Euglena einwirkt, so dass Glucose als ein Hauptprodukt des Paramylons mit niedrigem Molekulargewicht erzeugt wird.