JPH03227939A - 免疫能賦活化物質及びその製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 （産業上の利用分野） 本発明は、人の免疫能改善のために用いられる免疫能賦
活化物質及びその製造法に関する。

（従来の技術） 従来、ユーグレナから抽出したパラミロンは、そのまま
又はアルカリ処理、化学修飾、架橋結合及び／又はその
組み合わせにより宿主誘導の免疫能賦活作用を得ていた
。

（発明により解決すべき課題） 前記従来のパラミロン処理物は、水溶性の点で劣ってい
たり、賦活効果が薄いものであったり、化学修飾により
改善した物質で、動物実験で抗菌性を示しても、安全性
に欠けるなど問題点があった。

（課題を解決する為の手段） 然るに本発明は、天然物の酵素加水分解物又は酸分解物
でビタミン、ミネラル、アミノ酸、糖を含む栄養物で注
射剤としても有用であり、酵素分解においても、蛋白分
解酵素及び／又はβ−１゜３グルカナーゼを使用するの
で、合理的な調製物である。

即ち本発明の物は、ユーグレナの酵素処理物よりなるこ
とを特徴とした免疫能賦活化物質である。

また、ユーグレナの成分であるパラミロン抽出物を酵素
処理又は酸による加水分解処理したものである。次に、
ユーグレナ及びその成分の処理酵素として、蛋白分解酵
素及び／又はβ−１，３グルカナーゼを用いたものであ
る。更に、パラミロンの加水分解に酸として、塩酸、酢
酸、りん酸又は硫酸を使用したものである。

また本発明の方法は、ユーグレナからパラミロンを抽出
した後、このパラミロンを酵素処理又は酸による加水分
解することを特徴とした免疫能賦活化物質の製造法であ
る。また、パラミロン処理物の分子量を５，０００〜２
，０００，０００ダルトンとしたものである。

本発明に用いるユーグレナは、１６７５年アントンヴア
ン　レーペンフックにより初めて見出された生物で、和
名はミドリムシと呼ばれる。ユーグレナは、植物と動物
の両方の分類表に組み入れられて、植物学では（ミドリ
ムシ植物門）、動物学では原生動物門中（ミドリムシ目
）に分類されている。ユーグレナは葉緑体を持ち、光合
成を行うことで植物的であり、ビタミンＢ＋、Ｂ１０を
要求し、極めて柔軟な細胞膜複合体（ペリクル）を有し
て自在に細胞形態を変化し動き回ることから動物的とさ
れ興味ある単細胞真核生物である。

前記ユーグレナの細胞は」二記のペリクルで覆われてお
り、これはタンパク質を主成分としている。

ユーグレナ属には、２００種以上が知られているが、最
もよく研究に用いられているのはユーグレナ　グラシリ
スである。葉緑体は高等植物と同様に、Ｃ３型の光合成
を営むか、その光合成産物は、高等植物のように葉緑体
内には蓄積ぜす、シトシルに輸送されて、β−１，３グ
ルカン（パラミロン）として蓄積する。

このβ−１，３グルカンは、その他の植物体にも含まれ
、−例として椎茸にも含まれ、この子実体抽出物がザル
コーマ１８０に対し腫瘍増殖抑制効果のあることが知ら
れている（千原他、ネイチャー２２２巻、６８７頁、１
９６９年）。そして、椎茸の学名にちなんで、レンチナ
ンと命名された。これは分子量が９５〜１−０５万と大
きく、β−１，３結合を主体とするグルカンであり、水
に難溶であるが、アルカリに可溶である。

そして」二連の如く、パラミロンそのもの又はアルカリ
溶解物について、レンチナンと同様な効果があることが
報告されている（Ｌ、Ａ、ケサダ他、がん６７巻４５５
頁、１９７６年）。

本発明者は、このユーグレナ中のβ−１，３グルカンを
水溶性にして、しかも免疫賦活化能の高いものを求める
べく、長年の研究を行って来た。

有効成分を水溶性化して、経口的、又は注射剤として免
疫能が低下する担がん患者、又は加齢と共に特に細胞性
免疫が低下する高齢者に投Ｊｊシて免疫能を賦活化させ
ることを目的として本発明を完成した。すなわち、パラ
ミロンは、β−１，３グルカンを主成分とした重合体で
、水や熱水に不溶でゲル化しない。その溶解性を高める
ことは、生物的活性を期待するために重要である。そし
て、アルカリ性で溶解したり、又化学的修飾により溶解
性を増す努力をしたが、毒性が出たり、免疫能賦活化も
この分野で代表的なβ−１，３グルカン調製物であるレ
ンチナンと比肩できるものは現れていない。

又、水溶性化には、先つ加水分解酵素、すなわち、蛋白
分解酵素及び、又はβ−１，３グル力ン分解酵素を用い
て行った。

又、このβ−１，３グルカンの水溶性化には、ギ酸（佐
々木他、がん６７巻１９１頁、１９７６年）が用いられ
ているが、収量が悪く、工業的な利用には困難であるが
、本発明者は、塩酸、酢酸、りん酸、硫酸の単独又は組
み合わせにより高収量で分解することができた。

前記ユーグレナ　グラシリスをオダ培地により７日間培
養し、集菌後、洗滌して、凍結乾燥を行った。この菌体
を１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）に１０％（ｗ／
ｖ）　ａ度に分散させ、アルトロバクタルテウス由来の
酵素ラミナリペンタオハイドラーゼ、β−１，３グルカ
ナーゼ、又は蛋白分解酵素を適量添加、３７°Ｃにて２
４時間加水分解を行い分解後一部をとり、そのまま凍結
乾燥を行ったもの（Ｉ）、分解後３．００Ｏｒｐｍにて
１０分間遠心分離上澄液を凍結乾燥行ったもの（■）、
沈殿物を回収して、凍結乾燥を行ったもの（ＩＩ［）の
三分画を得た。猶、ユーグレナ培養の無処理、凍結乾燥
物（■）、シゾフイラン製剤（Ｖ）およびパラミロン調
製品（ＶＬ）パラミロン酵素処理水溶性化画分（■）及
びパラミロン酸加水分解処理水溶性化画分（■）を作り
、免疫能賦活効果を調べた。

免疫能賦活活性比較 ＣＤＦ系雄系中マウスい、各サンプルを生理的食塩水に
懸濁または溶解して、腹腔内に１日１回、５日間連続投
与し、初回投与してから３日後に抗原としてヒツジ赤血
球浮塀液（５ＲＢＣ）を投与、その４日後にＪＩ！ｌ！
臓の溶血抗体産生細胞数をカニンガム法に準じて算出し
た所、表−１、表−２の結果を得た。

表 表 以上の如く本発明の免疫賦活物質は、低分子が進みすぎ
ると、賦活作用が低下する。又、現在のところ、ユーグ
レナを酵素により加水分解、水溶性にしたものが５０ｍ
ｇ／ｋｇで最高の活性値（２８１，６）を示し、シゾフ
イラン製剤（１９８）と比べても優れていた。又、■の
水溶性画分は、相対的に低く、■（ユーグレナそのもの
）では、不溶性であるが高値を示した（表−１）。

又、実施例２．３に示した如く、精製パラミロンの酵素
分解物（■）及び酸加水分解物（■）は、低分子化され
水溶性化されたのにも拘らず、高い免疫能賦活化作用を
示しく表−２）、ユーグレナの酵素分解物と共に、本発
明の目標を達成するものであった。

実験］、酵素処理画分（■、■、■）の分子測定■、■
、■画分の分子量測定のため標準デキストラン（ファル
マシア製）を用い、液体クロマトグラフ装置によりゲル
濾過を行った。溶媒は０，３Ｍ水酸化ナトリウム水溶液
で、ゲルはＴＯＹＯＰＥＡＬ（観トーソー）（商標Ｊ（
Ｗ６５Ｆ）を用いた。ゲル量（半径１．５ｃｍ、高さ３
２ｃｍ）　、流速１ｍｌ／ｍｉｎであった。溶離パター
ン（図１）の結果をプロットしく図２）、■、■の分子
量は夫々５　、０００　＜、■は２．０００，０００で
あると推定された。

実験２．有効画分（■、■、■）の赤外線吸収スペクト
ル（図３．４．５） ０ ＫＢｒ法により画分■、■、■の赤外線吸収を調べた。

各両分の特徴的な吸収は以下の如くであり、８８４ｃｍ
’は、β−１，３グルカンによるものであった。

■８８４．１１０２．１１．４５ｃｍ　’■８８４．１
０８０．１４００ｃｍ” ■８８４．１１０２．１１４５．１３】０、］３３６５
ｃｍ−１実施例］） ユーグレナ　ダラシリスをオダ培地を用い、２７°Ｃ，
６０ｒｐｍで撹拌しながら７日間培養、集菌後、凍結乾
燥を行い、その５ｇを１．ＯｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７
，８）　５０　ｍｌに分散し、これに５ｍｇの豚トリプ
シンを加え、３７°Ｃで２０時間、無菌的に酵素処理を
行い、均一な分散液を得、分子篩より酵素活性を除去後
、凍結乾燥を行った。その後、カニンガム法により、免
疫賦活化能を検定し、肺細胞１００ケ当りの平均プラー
ク形成（数）にて対照と比較し、１ｍｇ／ｋｇ体重、１
０　ｍｇ／　ｋｇ体重及び５０■／　ｋｇ体重投与で、
対照を１００とした場合、夫々１５０．２　、２１０．
３　、２７９．５の力価を得た。

１ （実施例２） 実施例１と同じくして得られたユーグレナ標品１５ｇを
１０ｍＭりん酸緩衝液（ｐＨ７，０）に分散、５℃にて
、これに超音波発生装置（トミー精工、ＵＬ−２００）
により、超音波照射を１０分間、間欠的に実施し、均一
な液状物を得、次いで遠心分離により、粗パラミロン液
を得た後、６Ｍ尿素処理により精製を行い、凍結乾燥物
３ｇを得た。

斯くして得られたパラミロン標品を、１．０Ｍりん酸緩
衝液（ｐＨ７，０）に分散し、これにリゾクトニアソラ
ー（Ｒｈ＋ｚｏｐｃｔｏｎｉａ　５ｏｌａｎｉ　）由来
のβ］、３グルカナーゼを３ｍｇ加え、３７℃で２４時
間加水分解後、７５℃、１０分間加熱処理後、分子篩に
て、５０００以下を除去し、凍結乾燥に付し、以後の免
疫能賦活化試験に供した。

その結果、１　ｍｇ／　ｋｇ、　］、　Ｏｍｇ／　ｋｇ
及び５０ｍｇ／ｋｇ投与により、カニンガム法により試
験した結果、対照に比し、夫々１．５０．０　、２０１
．．１　、８５０．０の活性を得た。

（実施例３） ２ 実施例２と同様にして得られたパラミロン標品３ｇを４
Ｎ塩酸及び４Ｎ酢酸を含む水溶液５０ｍ１に膨潤させて
から懸濁し、８５℃で３０分間加熱した。分解液は、ア
ルコール濃度を代えて、溶離し、低分子分画（Ｉ、■）
と高分子分画（■、■）に分け、Ｉ、ＩＩの分子量は７
，０００〜５０，０００、■、■はｅｏ、ｏｏｏ〜１１
０，０００であった。Ｉ、ＩＩ分画の含分を実施例］と
同様に免疫能賦活化効果を試験した結果、１ｍｇ／ｋｇ
、１０ｍｇ／ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ投与で、夫々２Ｌ
０．０．３５０．０．４１５．０を得た。

（実施例４） 実施例１と同じく得たユーグレナ標品を５ｇ。

１．０ｍＭのりん酸緩衝液に分散し、これにアルトロバ
クター　ルテウス（Ａｒｔｈｒｏｂａｃｔｅｒ　Ｉｕｔ
ｅｕｓ）由来の蛋白分解酵素（Ｌ、０ＸｉＯ’単位／ｇ
）及びβ−１，３グルカンラミナリペンタオヒドラーゼ
（２，０Ｘ１０’単位／ｇ）、β−１，３グルカナーゼ
（Ｌ、５ｘ１．Ｏ”単位／ｇ）を含む酵素調製物（ザイ
モリエースー２０Ｔ、生化学工業）　　０．５ｍｇを加
え、撹拌しながら、無菌的に１６時間分解処理を行った
。

３ 加熱により酵素失活後、分子篩にて、５，０００以下を
除去した後、透析により精製し、濃縮、凍結乾燥を行っ
た。

実施例１と同様に、免疫能賦活化試験を行い、１　ｍｇ
／　ｋｇ、　１０　ｍｇ／　ｋｇ及び５０ｍｇ／ｋｇ投
与により、夫々Ｌ３０．１．２８０．５．４０３．１の
力価を得た。

利用形態及び投Ｌｉ量 ユーグレナ又はパラミロン酵素分解物粉末日量５０ｍｇ
／ｋｇの投与量で食品にそのまま添加、又は注射剤、タ
ブレット、エマルジョン、カプセル剤などの剤形で利用
することが効果的である。

（発明の効果） 即ち本発明は、ユーグレナ又はユーグレナから抽出した
パラミロン抽出物を酵素処理又は酸処理したので水溶性
であって、使用容易であると共に、人体に投与すると、
優れた免疫能賦活効果がある。

然してこの物質は、分子量が５，０００〜２，０００，
０００ダルトンの範囲内において有意性が大きい。

【図面の簡単な説明】

第１図は酵素処理画分（■、■、■）溶離パタ４ ンを示す図、第２図は酵素処理画分（■、■、■）のプ
ロットによる分子量の決定を示す図、第３図は酵素処理
画分（ｎ）の赤外吸収スペクトル図、第４図は酵素処理
画分（ＩＩＩ）の赤外吸収スペクトル図、第５図は無処
理パラミロン（ＩＶ）の赤外吸収スペクトル図である。 ５ 手続補正書 （自発） ２゜ ３゜ ４゜ 事件の表示 平成２年特許願第２０２３０号 発明の名称 免疫能賦活化物質及びその製造法 補正をする者 事件との関係　特許出願人 名称日研フード本社株式会社

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １　ユーグレナの酵素処理物よりなることを特徴とした
   免疫能賦活化物質 ２　ユーグレナの成分であるパラミロン抽出物を酵素処
   理又は酸による加水分解処理した請求項１記載の免疫能
   賦活化物質 ３　ユーグレナ及びその成分の処理酵素として、蛋白分
   解酵素及び／又はβ−１，３グルカナーゼを用いた請求
   項１記載の免疫能賦活化物質 ４　パラミロンの加水分解に酸として、塩酸、酢酸、り
   ん酸又は硫酸を使用した請求項１記載の免疫能賦活化物
   質 ５　ユーグレナからパラミロンを抽出した後、このパラ
   ミロンを酵素処理又は酸による加水分解することを特徴
   とした免疫能賦活化物質の製造法 ６　パラミロン処理物の分子量を５，０００〜２，００
   ０，０００ダルトンとした請求項５記載の免疫能賦活化
   物質の製造法