CN112321670A - 阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种阿魏菇Pleurotus ferulae lenzi中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法与应用，本发明的抗肿瘤蛋白提取物是将阿魏菇Pleurotus ferulae lenzi子实体烘干并研磨成粉后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换而获得。该蛋白提取物命名为XD1，是分子量约为17.5kDa的单体蛋白；对人非小细胞肺腺癌细胞株A549的生长具有明显的抑制作用。本发明的阿魏菇Pleurotus ferulae lenzi抗肿瘤蛋白提取物为天然活性产物，对人类无毒副作用且对环境无污染；制备流程简单，易得，成本较低，适于工业化生产。

Description

阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法。
背景技术
近年来，肿瘤作为最难治愈的疾病之一，已经严重影响到人类健康和生活质量，其发病率呈逐年上升的趋势。应用于临床治疗的方法经历了长久的探索，传统的手术切除法、放射化疗法、化学药物疗法等具有局限性、选择性差、易复发、易转移等缺点，难以彻底清除肿瘤细胞，因此，开发研制预防肿瘤的药物迫在眉睫。与人工合成的化学药物相比，天然抗肿瘤药物具有毒性低和安全性高的优势，大型食药用真菌因其独特的药理活性，成为抗肿瘤药物的重要来源。发挥抗肿瘤作用的物质主要包含多糖、蛋白质等大分子以及小分子物质，其中最重要的生物大分子蛋白质在医药和食品领域的应用上也具有广阔的前景。
阿魏菇(Pleurotusferulaelenzi)又被称作阿魏侧耳、阿魏蘑，在分类学上隶属于担子菌亚门、层菌纲、伞菌目、侧耳科、侧耳属，是新疆特色的食用菌，由于腐生或寄生在药用植物阿魏根茎部而有阿魏菇的名称。阿魏菇中富有钾、钙、硒、铁、镁、锗和铬等元素，且蛋白质含量约占干菇的20％，含有18种氨基酸，具备人体必需的8种氨基酸。阿魏菇同时具有较高的药用价值，可以防癌、抗癌并且能够养护肠胃、治疗肠道寄生虫等，故其也是新疆重要的中药材，具有良好的开发利用前景。
阿魏菇作为新疆的一种特有真菌，因其地理位置偏僻和人工栽培技术尚未完全成熟，受到的关注较少，因此对于阿魏菇的研究有待加深。近年来，对于阿魏菇生物活性成分的研究主要集中在多糖和粗提物方面，诸如多糖的分离纯化、结构分析及其抗氧化作用和免疫调节活性以及粗提物的抗肿瘤活性等。
1、杜彤等从阿魏菇中提取的多糖对于老龄鼠和果蝇的抗衰老有一定的效果；能够降低急性肝损伤小鼠血清中天冬氨酸转氨酶AST和丙氨酸转氨酶ALT含量，增强肝组织GSH和SOD活力，降低肝组织MDA水平，显著改善肝组织结构，减少肝细胞坏死。巩平等发现阿魏菇多糖能够联合顺铂通过诱导宫颈癌细胞凋亡，并且促进荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能，提高免疫活性。陈庆庆等的研究中表明阿魏菇多糖对羟自由基、超氧阴离子自由基、DPPH自由基、ABTS自由基有较强的清除效果。
2、王为兰证实阿魏菇子实体醇提取物对B16F10细胞、MCF-7细胞、Eca109细胞、HeLa细胞的生长有一定的抑制作用。张月明等从细胞凋亡角度探讨不同剂量水提物和醇提物对体外培养的四种肿瘤细胞人肝癌细胞株(QCY-7703,Q3)、人胃癌细胞株(MGC-803)、人宫颈癌细胞株(Hela)、小鼠肺腺瘤细胞株(SPC-A-1)生长抑制的作用，发现通过调节P53基因和FAS基因的转录和表达发挥抗肿瘤作用。Jo,Kyung-Jin等发现阿魏菇水提物可以降低喂食高脂饮食小鼠的脂质吸收，从而起到抗肥胖和抗糖尿病的作用。总的来说，目前对阿魏菇生物活性物质的研究大多集中在多糖，而蛋白方面较少，郑杰[20]等提取了阿魏菇中的多酚氧化酶(PPO)，并对其理化性质做了简要测定，以及从杨爱霞阿魏菇中分离得到的大小为17.5KD左右凝集素蛋白，能显著促进小鼠淋巴细胞的增殖，增强其免疫活性，尚未见从阿魏菇中提取抗肿瘤蛋白的相关报道。
发明内容
本发明目的在于提供一种阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物及其制备方法，抑制人非小细胞肺腺癌细胞株A549的生长，弥补化学合成药物毒副作用高和安全性低的不足。
本发明所述阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物，来源于阿魏菇，是子实体烘干研磨成粉后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换而获得的分子量为17.5kDa的单体蛋白。
所述阿魏菇Pleurotusferulaelenzi中抗肿瘤蛋白提取物是按照如下方法制备的：
1)将阿魏菇子实体50～70℃烘干并研磨成粉，溶解于蒸馏水溶液中，18～23℃浸提8～16小时，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液；
2)向上清液中加入(NH4)2SO4至饱和度为80％，2～6℃放置8～16小时，8000～12000rpm离心15～25min，收集沉淀，即得阿魏菇蛋白粗提物；
3)将阿魏菇蛋白粗提物用蒸馏水溶解，然后在2～6℃、5～10倍重量的蒸馏水中透析24～72小时，每间隔4小时更换一次蒸馏水，透析后10000～14000rpm离心15～25min收集上清液并进行冷冻干燥，即得阿魏菇蛋白粗粉；
4)将阿魏菇蛋白粗粉溶解于10～50mM、pH6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于HiTrapQHP强阴离子交换柱，用含1mol/LNaCl的10～50mM、pH6.0～8.0Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰；
5)将洗脱峰组分冷冻干燥后溶于10～50mM、pH6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于DEAE-52弱阴离子交换柱，用含0.03mol/LNaCl的10～50mM、pH6.0～8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集该浓度下的洗脱峰，获得阿魏菇抗肿瘤蛋白提取物。
进一步的，步骤1)中阿魏菇子实体粉末与蒸馏水的料液比为1:10。
本发明采用SDS-PAGE进行纯度检测，证明阿魏菇Pleurotusferulaelenzi中抗肿瘤蛋白提取物是分子量为17.5kDa的单体蛋白。
本发明中阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物对人非小细胞肺腺癌细胞株A549的生长具有明显的抑制作用(可用于相应药物的制作中)，AnnexinV-FITC/PI双染色证明该蛋白提取物能够诱导肿瘤细胞凋亡。
本发明的优点和有益效果：
(1)本发明中阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物为天然提取物，具有良好的安全性；(2)本发明中阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物为单一蛋白，为获得该蛋白的氨基酸序列及其编码基因提供了基础；(3)本发明中阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物具有良好的抗肿瘤效果；(4)本发明中阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物制备简单，成本低，适于大规模生产。
附图说明
图1本发明Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物的强离子交换层析图。
图2本发明Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物的弱离子交换层析图。
图3本发明Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物的SDS-PAGE图。
图4本发明Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物对A549细胞生长的抑制作用。
图5本发明Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用；A.未加抗肿瘤蛋白提取物的A549细胞；B.100μg/mL抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞；C.150μg/mL抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞；D.200μg/mL抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞。
图6本发明Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物诱导肿瘤细胞线粒体膜电位下降的作用；A.未加抗肿瘤蛋白提取物的A549细胞；B.100μg/mL抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞；C.150μg/mL抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞；D.200μg/mL抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞；E.50μmol/L线粒体解偶联剂cccp处理的A549细胞。
具体实施方式
下面结合附图及具体实施例对本发明作进一步的说明。
以下所述实施例中所用的材料、试剂等，任何人均能从商业渠道采购。所述的阿魏菇Pleurotusferulaelenzi可从新疆省清河县当地市场获得。
实施例1、
阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物的制备与检测。
(1)将阿魏菇子实体55℃烘干并研磨成粉，浸泡于粉末质量10倍的蒸馏水中，22℃浸提12小时，4000rpm离心20min，收集上清液；
(2)向上清液中加入硫酸铵至饱和度为80％，4℃放置12小时，10000rpm离心20min，收集沉淀，即得阿魏菇蛋白粗提物；
(3)蒸馏水溶解阿魏菇蛋白粗提物，然后在2℃、5倍重量的蒸馏水中透析72小时，每间隔4小时更换一次蒸馏水，透析后14000rpm离心15min收集上清液并进行冷冻干燥，即得阿魏菇蛋白粗粉；
(4)将阿魏菇蛋白粗粉溶解于50mM、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中，上样于HiTrapQHP强阴离子交换柱，用含1mol/LNaCl的50mM、pH7.8Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰，并将其命名为Qx，洗脱图如附图1所示；
(5)将洗脱峰组分冷冻干燥后溶于10mM、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中上样于DEAE-52弱阴离子交换柱，用含0.03mol/LNaCl的10mM、pH7.8Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱峰，获得阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物，并将其命名为XD1，洗脱图如附图2所示；
(6)采用SDS-PAGE进行纯度检测，证明阿魏菇Pleurotusferulaelenzi中抗肿瘤蛋白提取物XD1是分子量为17.5kDa的单体蛋白，电泳图如附图3所示。
实施例2、
阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物的制备与检测。
(1)将阿魏菇子实体50℃烘干并研磨成粉，浸泡于粉末质量10倍的蒸馏水中，23℃浸提8小时，8000rpm离心10min，收集上清液；
(2)向上清液中加入硫酸铵至饱和度为80％，2℃放置16小时，12000rpm离心15min，收集沉淀，即得阿魏菇蛋白粗提物；
(3)蒸馏水溶解阿魏菇蛋白粗提物，然后在6℃、10倍重量的蒸馏水中透析24小时，每间隔4小时更换一次蒸馏水，透析后12000rpm离心20min收集上清液并进行冷冻干燥，即得阿魏菇蛋白粗粉；
(4)将阿魏菇蛋白粗粉溶解于50mM、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中，上样于HiTrapQHP强阴离子交换柱，用含1mol/LNaCl的50mM、pH7.8Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰，并将其命名为Qx，洗脱图如附图1所示；
(5)将脱峰组分冷冻干燥后溶于10mM、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中上样于DEAE-52弱阴离子交换柱，用含0.03mol/LNaCl的10mM、pH7.8Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱峰，获得阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物，并将其命名为XD1，洗脱图如附图2所示；
(6)采用SDS-PAGE进行纯度检测，证明阿魏菇Pleurotusferulaelenzi中抗肿瘤蛋白提取物XD1是分子量为17.5kDa的单体蛋白，电泳图如附图3所示。
实施例3、
阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物的制备与检测。
(1)将阿魏菇子实体70℃烘干并研磨成粉，浸泡于粉末质量10倍的蒸馏水中，18℃浸提16小时，5000rpm离心15min，收集上清液；
(2)向上清液中加入硫酸铵至饱和度为80％，6℃放置8小时，8000rpm离心25min，收集沉淀，即得阿魏菇蛋白粗提物；
(3)蒸馏水溶解阿魏菇蛋白粗提物，然后在4℃、8倍重量的蒸馏水中透析48小时，每间隔4小时更换一次蒸馏水，透析后10000rpm离心25min收集上清液并进行冷冻干燥，即得阿魏菇蛋白粗粉；
(4)将阿魏菇蛋白粗粉溶解于50mM、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中，上样于HiTrapQHP强阴离子交换柱，用含1mol/LNaCl的50mM、pH7.8Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰，并将其命名为Qx，洗脱图如附图1所示；
(5)将脱峰组分冷冻干燥后溶于10mM、pH7.8的Tris-HCl缓冲液中上样于DEAE-52弱阴离子交换柱，用含0.03mol/LNaCl的10mM、pH7.8Tris-HCl缓冲液洗脱，收集洗脱峰，获得阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物，并将其命名为XD1，洗脱图如附图2所示；
(6)采用SDS-PAGE进行纯度检测，证明阿魏菇Pleurotusferulaelenzi中抗肿瘤蛋白提取物XD1是分子量为17.5kDa的单体蛋白，电泳图如附图3所示。
实施例4
本发明抗肿瘤蛋白提取物对A549细胞的抗增殖作用
(1)将A549细胞按105个/ml的浓度接种100μL于96孔板中，37℃培养24小时；
(2)每孔加入10μL用培养基依次梯度稀释的浓度为50μg/mL、100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL的实施例1-3制备的抗肿瘤蛋白提取物，每个浓度3个平行，并设空白对照，37℃培养48h。
(3)每孔加入25μL预冷的50％TCA溶液，4℃放置1h；
(4)蒸馏水洗涤5次，室温干燥后每孔加入100μLSRB染液(SRB4g/L，1％乙酸)染色30min；
(5)弃去染色液，用1％乙酸溶液洗涤5次除去浮色,室温干燥后每孔加150μL10mM的Tris-HCl(pH7.4)溶液溶解染料，用酶联免疫检测仪测定490nm处吸光值。
该蛋白提取物对A549细胞的抗增殖作用如附图4所示，处理A549细胞48小时后对A549细胞抗增殖作用的IC50值约为190.55μg/mL。
实施例5
本发明抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞凋亡的诱导作用
(1)将A549细胞按105个/ml的浓度接种2mL于6孔板中，37℃培养24小时后加入相同体积的抗肿瘤蛋白提取物溶液，使之终浓度为100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL，空白对照加入等体积的PBS；
(2)孵育12小时后，用不含EDTA的胰酶消化液消化细胞，消化时间不宜过长，终止消化后将细胞悬液加至相应的离心管，2500rpm离心3min，弃培养基；
(2)用3mL预冷的PBS洗涤两次；2500rpm离心3min，弃上清，重复2次；
(3)用预冷的BindingBuffer轻轻悬浮细胞至5×105～1×106个/mL；
(4)取0.5mL细胞悬液至流式细胞管内，加入5μLAnnexinV-FITC混匀后，避光，室温温育15min；
(5)加入5μLPI；
(6)过200目细胞筛后上流式细胞仪检测。
研究表明在细胞凋亡早期，细胞膜磷脂酰丝氨酸PS外翻可与FITC标记的AnnexinV结合；在细胞凋亡晚期或发生坏死，细胞膜失去选择透过性，PI可透过细胞膜与DNA结合。根据两个染料的着色状态结合流式细胞仪可定量检测A549细胞凋亡状况。图5是A549细胞用AnnexinV-FITC/PI染色经流式细胞仪检测的结果，其象限图中的右象限代表AnnexinV-FITC染色的细胞，即凋亡细胞。未处理组如图5-A所示凋亡的A549细胞比率为6.30％，图5-B、5-C、5-D分别表示100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL阿魏菇Pleurotus ferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞，凋亡细胞的比率分别为17.23％、24.60％、33.90％。从图中可以看出随着阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物浓度的增加，凋亡细胞的比率逐渐增加，表明本发明的阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞凋亡具有诱导作用。
实施例6
本发明抗肿瘤蛋白提取物诱导肿瘤细胞线粒体膜电位下降的作用
(1)将A549细胞按105个/ml的浓度接种2mL于6孔板中，37℃培养24小时后加入相同体积的抗肿瘤蛋白提取物溶液，使之终浓度为100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL，空白对照加入等体积的PBS；
(2)孵育12小时后，用胰酶消化细胞，取2×105个细胞，重悬于0.5mL细胞培养液中，阳性对照提前用10μM的CCCP处理20min，加入0.5mLJC-1染色工作液，颠倒数次混匀，37℃孵育30分钟；
(3)在孵育期间，用蒸馏水稀释5×JC-1染色缓冲液至1×JC-1染色缓冲液，并放置于冰浴；
(4)37℃孵育结束后，500g4℃低温离心5分钟，收集细胞沉淀缓慢吸出上清；
(5)用1×JC-1染色缓冲液洗涤2次：加入1mL1×JC-1染色缓冲液重悬细胞，500g4℃低温离心5分钟，沉淀细胞，弃上清；再加入1mL1×JC-1染色缓冲液重复上述步骤；
(6)用适量1×JC-1染色缓冲液将沉淀细胞重新悬浮后，将细胞悬液过200目筛，流式细胞管内加入0.5mL细胞悬液内上机检测。
正常生理状态下，线粒体通透性转换孔MPTP规律性开放保证线粒体内外膜间离子浓度的平衡；在受到多种刺激后，线粒体外膜通透性增加，MPTP持续非特异性开放，导致线粒体膜电位去极化。在线粒体膜电位较高时，JC-1以聚合物存在于线粒体的基质中，可以发出红色荧光；在线粒体膜电位下降或丧失时，JC-1以单体形式存在与胞浆内，可以产生绿色荧光。通过荧光颜色的转变并结合流式细胞技术来检测线粒体膜电位的变化情况。图6是A549细胞用JC-1染色经流式细胞仪检测的结果，其象限图中的Q2代表发出红色荧光细胞，即膜电位较高。未处理组如图6-A所示线粒体膜电位下降的A549细胞比率为5.02％，图6-B、6-C、6-D分别表示100μg/mL、150μg/mL、200μg/mL阿魏菇Pleurotusferulae lenzi抗肿瘤蛋白提取物处理的A549细胞，线粒体膜电位下降细胞的比率分别为12.4％、18.0％、39.90％；图6-E表示阳性对照50μmol/L线粒体解偶联剂cccp处理的A549细胞，线粒体膜电位下降细胞的比率为55.4％从图中可以看出随着阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物浓度的增加，A549细胞线粒体膜电位去极化逐渐增加，表明本发明的阿魏菇Pleurotusferulaelenzi抗肿瘤蛋白提取物对肿瘤细胞线粒体膜电位下降具有诱导作用。

Claims (9)

1.阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物，其特征在于所述的抗肿瘤蛋白提取物来源于阿魏菇，是子实体烘干研磨成粉后，经浸提、盐析、透析、冻干、离子交换而获得的分子量为17.5kDa的单体蛋白。
2.权利要求1所述的阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
1)将阿魏菇子实体50～70℃烘干去除水分后研磨成粉末，溶解于蒸馏水溶液中，18～23℃浸提8～16小时，4000～8000rpm离心10～20min，收集上清液；
2)向上清液中加入(NH4)2SO4至饱和度为80％，2～6℃放置8～16小时，8000～12000rpm离心15～25min，收集沉淀，即得阿魏菇蛋白粗提物；
3)将阿魏菇蛋白粗提物用蒸馏水溶解，然后在2～6℃、5～10倍重量的蒸馏水中透析24～72小时，每间隔4小时更换一次蒸馏水，透析后10000～14000rpm离心15～25min收集上清液并进行冷冻干燥，即得阿魏菇蛋白粗粉；
4)将阿魏菇蛋白粗粉溶解于10～50mM、pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于HiTrap Q HP强阴离子交换柱，用含1mol/LNaCl的10～50mM、pH 6.0～8.0Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰；
5)将洗脱峰组分冷冻干燥后溶于10～50mM、pH 6.0～8.0的Tris-HCl缓冲液中，上样于DEAE-52弱阴离子交换柱，用含0.03mol/LNaCl的10～50mM、pH 6.0～8.0Tris-HCl缓冲液洗脱，收集该浓度下的洗脱峰，获得阿魏菇抗肿瘤蛋白提取物。
3.根据权利要求2所述的阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于，步骤1)中阿魏菇子实体粉末与蒸馏水的料液比为1:10。
4.根据权利要求2或3所述的阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于，步骤1)中的优选条件是，烘干温度55℃，22℃浸提12小时，4000rpm离心20min。
5.根据权利要求2或3所述的阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于，步骤2)中的优选条件是，加入硫酸铵至饱和度为80％，4℃放置12小时，10000rpm离心20min。
6.根据权利要求2或3所述的阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于，步骤3)中的优选条件是，在2℃、5倍重量的蒸馏水中透析72小时，透析后14000rpm离心15min。
7.根据权利要求2或3所述的阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于，步骤4)中的优选条件是，将阿魏菇蛋白粗粉溶解于50mM、pH 7.8的Tris-HCl缓冲液中，上样于HiTrap Q HP强阴离子交换柱，用含1mol/LNaCl的50mM、pH7.8 Tris-HCl缓冲液线性洗脱，收集洗脱峰。
8.根据权利要求2或3所述的阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的制备方法，其特征在于，步骤5)中的优选条件是，将洗脱峰组分冷冻干燥后溶于10mM、pH 7.8的Tris-HCl缓冲液中上样于DEAE-52弱阴离子交换柱，用含0.03mol/LNaCl，的10mM、pH 7.8Tris-HCl缓冲液洗脱。
9.权利要求1所述阿魏菇中抗肿瘤蛋白提取物的应用，其特征在于：用于对人非小细胞肺腺癌细胞株A549的生长抑制药物的制作，Annexin V FITC/PI双染色证明该蛋白提取物能够诱导肿瘤细胞凋亡。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103275198A (zh) * 2013-06-13 2013-09-04 石河子大学 一种阿魏菇凝集素分离纯化的方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘阳等: "阿魏菇凝集素对小鼠腹腔巨噬细胞免疫活性的影响", 《中国食品学报》 *
杨爱霞: "阿魏菇凝集素分离纯化及性质研究", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 工程科技Ⅰ辑》 *
杨爱霞等: "阿魏菇凝集素分离纯化及理化性质的研究", 《食品与生物技术学报》 *

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