CN101167755A - 具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物的制备方法及用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物的制备方法及用途。步骤是：①以少棘蜈蚣为原料母体，清洗，干燥；②研磨干燥后的原料母体得蜈蚣细粉；③将蜈蚣细粉经水提、过滤得残渣再重复水提，离心后取上清；④减压浓缩上清，经醇提后得沉淀；⑤将沉淀经硫酸铵分段盐析后收集60％饱和度的沉淀物；⑥将沉淀物经DEAE－50纤维素离子交换层析柱、洗脱、脱盐后浓缩；⑦将所得浓缩液经Sephadex G－200柱纯化，得蜈蚣多糖蛋白复合物纯品。制备方法易行，操作简便，原料来源广泛，且应用在制备抗肿瘤药物中能有效杀伤肿瘤细胞和提高机体免疫力，疗效显著。该多糖蛋白复合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
Description
技术领域
本发明属于天然高分子领域，也属于生化制药领域，涉及一种天然抗肿瘤新药，更具体涉及一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物的制备方法，同时还涉及一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
背景技术
1.肿瘤已成为威胁人类健康的头号杀手
肿瘤是严重威胁人类生命的常见病和多发病之一，其发病率逐年增高。据世界卫生组织调查表明，全世界每年新发现癌症患者近1000万人。每年因癌症死亡的人数近700万人。最近统计资料表明，我国每年新发现癌症患者约2000万人，近150万人死于癌症。癌症的死亡人数占总死亡数的1/5。因此防癌、治癌已成为一项迫在眉睫的艰苦任务。
2.当前治疗肿瘤的方法与相关药品很多，但都存在一定的局限性
治疗肿瘤的传统方法有手术切除、放疗和化疗。但对于许多病人，在被确诊为肿瘤时，就已经失去了手术切除的机会；而放疗则存在局限性和对正常组织的损伤性；化疗普遍存在细胞毒性作用，特别对肝、肾、骨髓和消化系统的毒副作用非常严重，因此，大大制约了它们在临床上的应用。新兴的介入治疗对原发灶有一定的作用，但难以对付不断散发的转移灶；基因治疗给肿瘤患者带来曙光，但其载体构建、载体与弹头的交联及其在机体分布、代谢过程中的变化等诸多问题还在探讨之中。
3.多糖蛋白复合物的抗肿瘤活性
多糖蛋白复合物(Polysaccharide-protein Complex)广泛存在于动植物体内，其生理功能除了粘附和支持作用外，在细胞识别、信号传导、调控机体免疫功能以及控制细胞的迁移、增殖、分化、代谢等方面都有十分重要的作用。近年来，从植物、动物中提取的多糖蛋白复合物类药物的抗肿瘤活性引起了人们的广泛关注，通过对其作用机理的研究发现多糖蛋白复合物的抗肿瘤作用主要在于其能增强机体的体液免疫和细胞免疫功能，有的能直接杀伤肿瘤细胞(F.Liu et al.，.Immunomodulation and Anti-Cancer Activity of Polysaccharide-Protein Complexes，Current Medicinal Chemistry，2000，7(7)，715-729)。已有研究表明一些新型结构的多糖蛋白复合物在增强机体免疫和控制肿瘤细胞增殖方面具有显著作用：①从宁夏枸杞中(Lycium barbarum)提取得到的多糖蛋白复合物(LBP)具有具有增强机体免疫功能、抗癌抑瘤的作用及抗氧化抗衰老等作用(Lu Gan et al.，Immunomodulation and antitumor activity by a polysaccharide-protein complexfrom Lycium barbarum.2004；4(4)：563-9.)，且经研究发现其抗肿瘤作用机理是抑制原癌基因c-myc的表达(赵荣国.冬虫夏草的药理研究进展[J].新疆中医药，1992，(4)：46-49)；②从担子菌纲云芝菌丝体中提取得到的分子量在50～200 KD左右的云芝多糖蛋白复合物(Polysaccharide-protein complexes of Coriolusversicolor，PSK)作为一种具有增强免疫作用的生物调节剂，在日本已被广泛用于临床。实验表明，PSK不仅可以通过增强肿瘤抗原的免疫原性而促使机体对肿瘤细胞的识别和杀灭，而且体外、体内给药均可显著增强小鼠脾淋巴细胞的转化和功能，并促进其分泌IL-2和IFN-γ等免疫活性因子，且能增强荷瘤小鼠和正常小鼠脾淋巴细胞产生抗体的能力(Jian Cui et al.，polysaccharide-protein complexof Coriolus versicolor：physiological activity，uses，and production.2003；21(2)：109-22.)。③从螺旋藻中提取得到的多糖蛋白复合物(spirulina platensispolysaccharide-protein complex，SPP)可提高不同病期白血病患者NK细胞活性，但不影响正常人NK细胞活性。另外，体外研究表明，SPP能抑制B37乳癌细胞和K562白血病细胞；体内研究表明，SPP能抑制H22肝癌细胞、ECA肿瘤细胞以及S180癌细胞，同时发现SPP能增加脾和胸腺的重量，提高活化的NK细胞的活性和数量以及激活荷瘤小鼠脾淋巴细胞产生IL-2，对化疗导致的白细胞下降也有治疗作用(曲显俊，等.螺旋藻多糖抗癌作用的实验研究[J].中国海洋药物，2000，19(3)：10-14)。④从海洋软体动物和传统中药土鳖虫中提取的多糖蛋白复合物均具有显著的抗肿瘤活性(顾谦群等.扇贝糖蛋白的化学组成与抗肿瘤活性的研究[J].中国海洋药物，1998(3)：23-26；韩雅莉，谢昆.土鳖虫糖蛋白的提取及抗肿瘤活性初步研究.汕头大学学报(自然科学版)，2006(11)，21(4)：46-50)。⑤此外，海绵体多糖蛋白复合物，4-硒硫酸酯多糖蛋白复合物(SE-CARRA)，人参多糖蛋白复合物(Ginseng polysaccharide-proteincomplex，GP)也有抗肿瘤活性。戴氏虫草多糖蛋白复合物(Cordyceps taiipolysaccharide-protein complex，CDP)能引起T、NK以及单核-巨嗜细胞的活化、增殖，同时对小鼠T淋巴细胞分泌IL-2和TNFβ具有促进作用。鲍鱼多糖(Abalone polysaccharide-protein complex，AP)对裸鼠移植人鼻咽癌细胞具有明显的抑制作用，能明显抑制人鼻咽癌的生长，诱导肿瘤细胞凋亡和坏死。
4.祖国医学中蜈蚣的研究进展和研究空白
蜈蚣是我国传统中药材之一。祖国医学中，蜈蚣入药历史悠久，主要用于息风镇痉，攻毒散结，通络止痛。近年来，对蜈蚣及其提取物抗肿瘤作用的研究日趋深入。曲爱兵等研究发现蜈蚣提取物对胃癌细胞、肝癌细胞有一定的抑制作用(曲爱兵，等.蜈蚣组织提取物抗肿瘤活性的初步研究.实用肿瘤学杂志，2003(7)：29-30)。许鸣镝，柳雪枚等在文献中提及蜈蚣总碱性蛋白对人口腔上皮细胞鳞癌(KB细胞)和人结肠癌细胞(HCT细胞)有明显的抑制作用，且活性稳定(许鸣镝，等.蜈蚣碱性蛋白SSmp-d的分离纯化及其部分理化性质鉴定.Chinese Biochemical Journal，1997，1113(15)：586-591)。曾红等将蜈蚣脱脂处理后，经柱层析分离出总蛋白成分，用MTT法发现其对人NCI-H23肺癌细胞、UO-31肾癌细胞、KM-12结肠癌细胞、BEL-7402肝癌细胞和SK-OV-3卵巢癌细胞的生长有抑制作用(曾红，张国刚，程巨龙，等.蜈蚣中抗癌活性成分的提取.Hunan Journal ofTraditional Chinese Medicine，2004，120(15)：57-58)。焦波等研究发现蜈蚣的水提取物具有显著的抗肿瘤活性(焦波，等.蜈蚣提取物对小鼠精原细胞的作用.山东医科大学学报.1999，37(4)：358)。但是，迄今为止，经检索没有一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物的制备方法及其用途被公开或使用。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物的制备方法，方法易行，操作简便，原料来源广泛，能有效地杀伤肿瘤细胞和提高机体免疫力，疗效显著，成本低，对人体基本无毒副作用。
本发明的另一个目的是在于提供了一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物在制备治疗或预防肺癌、肝癌、口腔表皮癌、结肠癌和乳腺癌的药物中的应用。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
本发明从少棘蜈蚣全虫中获得一种高效抗肿瘤活性组分—蜈蚣多糖蛋白复合物(Scolopendra Polysaccharide-Protein Complex)，简称SPPC。蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)为单一组分的多糖蛋白复合物，相对分子质量为128,000D，其多糖含量91.8％，主要为Gal、Fru、Ara、Rha，蛋白含量8.2％，主要为Asp、Glu、Gly、Pro；多糖部分和蛋白部分是通过O-糖肽键连接的。同时该多糖蛋白复合物具有良好的水溶性、热稳定性以及对pH值和离子强度的不敏感性，并且在800μg/ml没有表现出明显的溶血和凝集活性。
一种具有抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物的制备方法，它包括下列步骤：
①以少棘蜈蚣作为原料母体，清洗3～5次，烘干2～4小时，烘干温度控制在60～80℃；
②研磨第1步骤中干燥后的原料母体并过50～200目筛得蜈蚣细粉；
③将第2步骤中的蜈蚣细粉用5倍体积蒸馏水抽提1～3小时，温度控制在80～90℃，纱布过滤(得一份提取液)，取残渣再用4倍体积蒸馏水重复提取三次(得三份提取液)，合并以上四份提取液，2500r/min离心20～30分钟，获取上清；
④将第3步骤中的上清减压至0.1MPa后浓缩，温度控制在50～70℃，加入5倍体积95％乙醇，于4℃静置过夜，倾去上清，取沉淀，2500r/min离心10分钟，收集沉淀；
⑤将第4步骤中的沉淀用500ml蒸馏水溶解，计量40％饱和度所需要的固体硫酸铵量，于4℃加入，搅拌4h、10000r/min离心20分钟后，收集上清并计量体积，重复此步骤的操作(1次)，收集60％饱和度的沉淀物；
⑥将第5步骤中的沉淀物用30ml蒸馏水溶解后，上DEAE-50离子交换层析柱(2.6×40cm)纯化，以蒸馏水平衡，用0.05～0.25mol/LNaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用透析袋在双蒸水中透析48小时脱盐，再用聚乙二醇20000浓缩；
⑦将第6步骤中的浓缩液上Sephadex G-200层析柱(2.6×60cm)纯化，用0.02mol/L pH为7.2的Tris-HCl溶液洗脱后，经真空冷冻干燥，预冻温度控制在-45～-15℃，加热温度控制在20～40℃，干燥8～12小时后得蜈蚣多糖蛋白复合物纯品。
以上所述的SPPC：①明显提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和胸腺指数，恢复荷瘤动物低下的迟发性变态反应(DTH)，通过影响T细胞数量、增强NK细胞毒性和IL-2的活性，达到调节机体免疫功能的作用；②具有对人A549肺癌细胞、口腔表皮癌KB细胞、KM-12结肠癌细胞、BEL-7402肝癌细胞和MCF-7乳腺癌细胞生长的抑制作用；③与环磷酰胺联合使用可显著提高抑瘤作用，并对大鼠血小板减少和骨髓有核细胞数量减少具有保护作用，具有一定的减毒增效作用。
一种具有天然抗肿瘤活性的蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)，以少棘蜈蚣全虫为原料母体水浴抽提，将提取液浓缩后，经醇提，硫酸铵盐析，DEAE-50纤维素离子交换层析，Sephadex G-200柱层析后获得多糖蛋白复合体。一种从少棘蜈蚣(Scolopendra Subspinipes Mutilans L.Koch)中提取、分离、纯化得到的蜈蚣多糖蛋白复合物(Scolopendra Polysaccharide-Protein Complex)，简称SPPC。所述的sPSPC的分子量为128,000道尔顿。所述的蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)，①多糖与蛋白质的含量分别为91.8％和8.2％；②糖组成特点：主要由半乳糖、果糖、阿拉伯糖、鼠李糖和甘露糖组成。③氨基酸组成特点：主要由天冬氨酸、谷氨酸、甘氨酸和脯氨酸组成。④连接键：多糖部分和蛋白部分是通过O-糖肽键连接的。⑤溶解性：溶于水。⑥热稳定性：稳定。⑦pH值和离子强度的敏感性：不敏感。⑧溶血和凝集活性：在800μg/ml没有明显的溶血和凝集活性。
本发明的优点：
1.本发明采用的蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)是以少棘蜈蚣作为原料母体经提取、分离和纯化得到的，原料来源广泛且质量优良。
2.蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的提取、分离、纯化工艺简单易行，技术成熟。
3.蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)具有良好的水溶性、热稳定性以及对pH值和离子强度的不敏感性，无明显的溶血和凝集活性。
4.蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)可通过增强巨噬细胞吞噬能力、影响T细胞数量、增强NK细胞毒性和IL-2的活性等作用提高机体的免疫功能。
5.蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)可直接有效地杀伤肿瘤细胞，产生抑瘤效应。
6.蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)与环磷酰胺等化疗药物联合应用具有减毒增效作用。
7.本发明采用常规给药剂型，技术成熟，生产工艺简单易行。
8.本发明采用常规给药方式，给药方便，无痛苦，没有后遗症。
附图说明
图1表示蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的Sephadex G-100凝胶层析洗脱曲线。图中横坐标表示洗脱液的洗脱体积，纵坐标表示于490nm处的吸光度。
图2表示蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的考马斯亮蓝R-250染色(B)和过碘酸-Schiff染色(C)。
图3表示蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的红外光谱图。图中横坐标表示红外光的扫描波数，纵坐标表示透过率。
图4表示蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的紫外光谱图。图中横坐标表示紫外光的扫描波长，纵坐标表示于吸光度。
图5表示蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)经β-消除反应后的紫外光谱图。
具体实施方式
现结合以下具体实例对本发明的技术方案作进一步说明，但本发明的内容不完全限于此。
实施例1：蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的制备
①取新鲜的蜈蚣成虫100g，清洗3次，60℃烘干2小时；
②研磨第1步骤中干燥后的原料母体并过50目筛得蜈蚣细粉；
③将第2步骤中的蜈蚣细粉用500ml蒸馏水于80℃抽提1小时，纱布过滤(得一份提取液)，取残渣再用400ml蒸馏水重复提取三次(得三份提取液)，合并以上四份提取液，2500r/min离心20分钟，获取上清；
④将第3步骤中的上清在50℃下减压浓缩，加入5倍体积95％乙醇，于4℃静置过夜，倾去上清，取沉淀，2500r/min离心10分钟，收集沉淀；
⑤将第4步骤中的沉淀用500ml蒸馏水溶解，计量40％饱和度所需要的固体硫酸铵量，于4℃缓慢加入，搅拌4h、10000r/min离心20分钟后，收集上清并计量体积，重复此步骤操作，收集60％饱和度的沉淀物；
⑥将第5步骤中的沉淀物用30ml蒸馏水溶解，上DEAE-50离子交换层析柱(2.6×40cm)纯化，以蒸馏水平衡，用500ml 0.05mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用透析袋在双蒸水中透析48小时脱盐，再用聚乙二醇20000浓缩；
⑦将第6步骤中的浓缩液上Sephadex G-200层析柱(2.6×60cm)纯化，用200ml 0.02mol/L pH为7.2的Tris-HCl溶液洗脱后，经真空冷冻干燥，预冻温度控制在-45℃，加热温度控制在20℃，干燥8小时后得蜈蚣多糖蛋白复合物纯品0.315g。
实施例2：蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的制备
①取新鲜的蜈蚣成虫100g，清洗4次，70℃烘干3小时；
②研磨第1步骤中干燥后的原料母体并过100目筛得蜈蚣细粉；
③将第2步骤中的蜈蚣细粉用500ml蒸馏水于85℃抽提2小时，纱布过滤(得一份提取液)，取残渣再用400ml蒸馏水重复提取三次(得三份提取液)，合并以上四份提取液，2500r/min离心25分钟，获取上清；
④将第3步骤中的上清在60℃下减压浓缩，加入5倍体积95％乙醇，于4℃静置过夜，倾去上清，取沉淀，2500r/min离心10分钟，收集沉淀；
⑤将第4步骤中的沉淀用500ml蒸馏水溶解，计量40％饱和度所需要的固体硫酸铵量，于4℃缓慢加入，搅拌4h、10000r/min离心20分钟后，收集上清并计量体积，重复此步骤操作，收集60％饱和度的沉淀物；
⑥将第5步骤中的沉淀物用30ml蒸馏水溶解，上DEAE-50离子交换层析柱(2.6×40cm)纯化，以蒸馏水平衡，用500ml 0.10mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用透析袋在双蒸水中透析48小时脱盐，再用聚乙二醇20000浓缩；
⑦将第6步骤中的浓缩液上Sephadex G-200层析柱(2.6×60cm)纯化，用200ml 0.02mol/L pH为7.2的Tris-HCl溶液洗脱后，经真空冷冻干燥，预冻温度控制在-30℃，加热温度控制在30℃，干燥10小时后得蜈蚣多糖蛋白复合物纯品0.300g。
实施例3：蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的制备
①取新鲜的蜈蚣成虫100g，清洗5次，70℃烘干4小时；
②研磨第1步骤中干燥后的原料母体并过200目筛得蜈蚣细粉；
③将第2步骤中的蜈蚣细粉用500ml蒸馏水于90℃抽提3小时，纱布过滤(得一份提取液)，取残渣再用400ml蒸馏水重复提取三次(得三份提取液)，合并以上四份提取液，2500r/min离心30分钟，获取上清；
④将第3步骤中的上清在70℃下减压浓缩，加入5倍体积95％乙醇，于4℃静置过夜，倾去上清，取沉淀，2500r/min离心10分钟，收集沉淀；
⑤将第4步骤中的沉淀用500ml蒸馏水溶解，计量40％饱和度所需要的固体硫酸铵量，于4℃缓慢加入，搅拌4h、10000r/min离心20分钟后，收集上清并计量体积，重复此步骤操作，收集60％饱和度的沉淀物；
⑥将第5步骤中的沉淀物用30ml蒸馏水溶解，上DEAE-50离子交换层析柱(2.6×40cm)纯化，以蒸馏水平衡，用0.25mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用透析袋在双蒸水中透析48小时脱盐，再用聚乙二醇20000浓缩；
⑦将第6步骤中的浓缩液上Sephadex G-200层析柱(2.6×60cm)纯化，用200ml 0.02mol/L pH为7.2的Tris-HCl溶液洗脱后，经真空冷冻干燥，预冻温度控制在-15℃，加热温度控制在40℃，干燥12小时后得蜈蚣多糖蛋白复合物纯品0.295g。
实施例4：
1、蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)中多糖、蛋白质含量组成以及纯度、分子量测定(1)测定方法
①纯度鉴定及分子量测定：将蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)纯品溶解后进行Sephadex G-100凝胶过滤层析，层析柱(2.6×60cm)，用0.02mol/L pH为7.2的Tris-HCl溶液洗脱，洗脱速度为1ml/min，分步收集器收集，6ml/管，并通过苯酚-硫酸反应于490nm检测洗脱峰，得其凝胶层析洗脱曲线；另外，采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离胶pH为8.9，分离胶浓度为12％，浓缩胶pH为8.9，浓缩胶浓度为12％，电极缓冲液为Tris-甘氨酸电泳缓冲液，样品溶解于上样缓冲液后，在100℃中煮3-5min，上样浓度为2mg/ml，上样量为20μl，恒压90-180V，染色液为甲醇：染色液储备液(1∶4)，染色2h，使用水∶乙醇∶醋酸(17∶1∶2)的脱色液脱色，脱色5-10h，之后分别经过考马斯亮蓝R-250试剂和过碘酸-Schiff试剂(PAS)染色后，通过凝胶成像分析系统观测结果；SPPC的分子量测定采用激光光散射法(LLS)。
②多糖含量测定：采用苯酚-硫酸法，以葡萄糖作为参比。具体为，准确称取蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)10mg，加适量双蒸水溶解，转移至100ml容量瓶中定容；吸取该溶液1.0ml、2.0ml分别加双蒸水至20ml，得两份样品待测液(浓度分别为5μg/ml、10μg/ml)；取上述两种浓度待测液各2.0ml，双管平行，分别加入50g/L水饱和酚溶液0.5ml，混匀后迅速加入浓硫酸5ml，充分混合，室温静置5min，置于沸水浴中15min，冷却至室温，UV-1601紫外分光光度计于490nm处比色；读取吸光度，对照以葡萄糖为参比制得的标准曲线，求得相应多糖浓度值，计算多糖含量。
③单糖组成分析：将蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)多糖部分充分水解后，采用高效液相色谱(HPLC)法分析。具体为，准确称取sPSPC 20mg，加入2M H2SO4 6ml，充分溶解后移入刻度试管，密封，于100℃水浴中水解10h；水解液以固体碳酸钡中和，4000rpm离心，留取上清；上清液冷冻干燥浓缩至0.5ml，收集浓缩液；将浓缩液进行高效液相色谱分析，分析柱Zorbax Carbohydrate Analysis Column，流动相为乙腈∶水＝78/22(v/v)，流速为1.5ml/min，进样量20ml，柱温30℃，采用示差折光检测器检测，对照单糖标准品的保留时间确定单糖的种类，根据各组分的峰面积比值计算摩尔比。
④蛋白含量测定：采用Folin-酚试剂法，以牛血清白蛋白为标准制作标准曲线，牛血清白蛋白用凯氏定氮法测定其蛋白含量。
⑤氨基酸组成分析：仪器为日立-835型氨基酸自动分析仪。将蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)蛋白部分充分酸解后，用氨基酸自动分析仪进行分析。具体为，准确称取SPPC 20mg，加入含有20mg苯酚的6M H2SO4 4ml，充分溶解后移入安瓿瓶，密封，于110℃水解24h；水解液在真空浓缩器充分浓缩干燥后，重新溶解在2ml的柠檬酸盐缓冲液，过0.45μm的尼龙微孔滤膜，收集滤液；将滤液注入氨基酸自动分析仪进行氨基酸组成分析。
⑥红外光谱分析：仪器为FT-IR型傅立叶变换-红外光谱仪(美国尼高力)。具体为，准确称取蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)10mg，加入200mg干燥的KBr晶体，在红外灯照射下于研钵中轻轻研磨至极细，用压片机压片，红外光谱在400～4000cm-1扫描，测定透光率曲线。
⑦核磁共振谱(NMR)分析：用重水(D2O)作溶剂，进行核磁共振谱分析。
⑧β-消除反应及紫外光谱分析：仪器为UV-3000。具体为，将蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)配成5mg/mL的溶液，再将SPPC溶液用0.2mol/L NaOH于60℃处理30min，对照样品按同样方法配制，配好后立即放入4℃冰箱，分别用UV-3000在200～400nm之间进行扫描。
(2)测定结果：
①蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的Sephadex G-100凝胶层析洗脱曲线如图1，只在60ml附近出现一个洗脱峰；并且，SPPC经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，进一步用考马斯亮蓝R-250试剂和过碘酸-Schiff试剂染色，在凝胶成像分析系统中只显示单一条带，且纯度≥95％，见图2。以上结果表明，SPPC为单一组分的多糖蛋白复合物。另外，用激光散射法(LLS)测定SPPC的分子量为128,000D。
②苯酚-硫酸法测得蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)多糖部分含量为91.8％；多糖部分水解液高效液相色谱(HPLC)的分析结果表明，水解液出峰的保留时间分别与Gal、Fru、Ara、Rha和Man准确地对应，说明SPPC中含有这五种单糖，具体如表1所示。
表1.sPSPC的单糖组成及含量
| Monosaccharide | Content(％) |
| 半乳糖(Gal)果糖(Fru)阿拉伯糖(Ara)鼠李糖(Rha)甘露糖(Man) | 61.919.55.54.92.4 |
③Folin-酚试剂法测得蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)蛋白部分含量为8.2％；蛋白部分酸解后经过氨基酸自动分析仪分析结果表明，SPPC蛋白部分氨基酸组成种类丰富，其中Asp、Glu、Gly、Pro含量较高，具体如表2所示。
表2.SPPC的氨基酸组成及含量
| Amino Acid | Content(％) |
| 天冬氨酸(Asp)苏氨酸(Thr)丝氨酸(Ser)谷氨酸(Glu)脯氨酸(Pro)甘氨酸(Gly)丙氨酸(Ala)半胱氨酸(Cys)缬氨酸(Val)甲硫氨酸(Met)异亮氨酸(Ile)亮氨酸(Leu)酪氨酸(Tyr)苯丙氨酸(Phe)组氨酸(His)赖氨酸(Lys)精氨酸(Arg) | 11.25.94.910.39.19.38.38.00.60.45.61.16.66.01.43.47.9 |
④蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的红外光谱分析结果见见图3，红外光谱在400～4000cm-1扫描，sPSPC显示具有多糖蛋白复合物一般特征吸收。在3420cm-1附近有强吸收，示有O-H键的伸缩振动(γ-OH)；在2930cm-1附近有中强吸收，示有C-H键的伸缩振动(γC-H)；在1640cm-1附近有强吸收，示有酰胺键的C＝O键伸缩及N-H键的变角振动；在1154cm-1、1082cm-1和1024cm-1处还有3个强吸收峰，提示组成的单糖可能为吡喃环结构；在851cm-1有吸收峰，在890cm-1附近无吸收峰，示SPPC的多糖部分以α-糖苷键连接。
⑤在蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的1H NMR谱中，可见到半乳糖端质子信号为δ5.360，甘露糖端基质子信号为δ5.185；在糖的1H NMR谱中，端基质子信号在δ5.0以下的一般为β-构型，在δ5.0以上的一般为α-构型，推断半乳糖和甘乳糖残基为α-吡喃型，与红外光谱的分析一致；半乳糖端基质子信号强度远大于甘露糖端基质子信号，与其含量大小有关，葡萄糖端基质子信号未能检测出可能因为含量太低，与其它的氢的信号堆积在一起，难以归属。
⑥β-消除反应及紫外光谱分析结果得图4和图5，在200～400nm之间进行扫描，蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)在260nm处无吸收，在280nm左右有一肩形峰，这是多糖蛋白复合体的特征吸收峰；糖肽键的2种类型，N-型糖肽键和O-型糖肽键，前者对碱稳定，后者极易被碱打开；在糖肽连接处，若为丝氨酸即转变成α-氨基丙烯酸，若为苏氨酸，则转变为α-氨基丁烯酸，这两种不饱和氨基酸，均在230～240nm处有特征吸收峰；SPPC经碱处理后，在240nm处产生明显的特征吸收峰，说明SPPC中多糖部分和蛋白部分是通过O-糖肽键连接。
综上所述，蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)为单一组分的多糖蛋白复合物，相对分子质量为128,000D，其多糖含量91.8％，主要为Gal、Fru、Ara、Rha，蛋白含量8.2％，主要为Asp、Glu、Gly、Pro；且多糖部分和蛋白部分是通过O-糖肽键连接的。
2、SPPC理化性质测定
(1)测定方法
①蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)对温度的稳定性：取sPSPC分别置于-20℃～121℃的温度范围内设计的10个不同温度(-20℃、4℃、15℃、25℃、37℃、50℃、70℃、90℃、100℃和121℃)处理30min，10000r/min离心10min，用MTT法检测其对小鼠脾淋巴细胞转化的影响，以未经诱导的SPPC作对照。
②蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)对pH值的稳定性：将SPPC在不同pH值(pH2.2、pH3.0、pH4.0、pH5.0、pH6.0、pH7.0和pH8.0)的0.02mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中放置48h(4℃)后，用MTT法检测其对小鼠脾淋巴细胞转化的影响，以双蒸水处理组作对照。
③蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)对离子强度的稳定性：将SPPC分别在pH 6.0，0.2、0.02和0.002mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液，以及pH8.0，0.2、0.02和0.002mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液中放置48h(4℃)后，用MTT法检测其对小鼠脾淋巴细胞转化的影响。
④蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)的溶血和凝集活性检测：以1ml pH7.5，50mmol/LTris-HCl(含0.15mol/L NaCl)分别溶解SPPC 800μg、400μg、200μg、100μg和50μg，分别和等体积小鼠红细胞悬液(缓冲液同前，终浓度1％(V/V))混匀，37℃振荡1h，离心取上清液，测其546nm的OD值，即红细胞释放的血红素量；阳性对照为小鼠红细胞悬液与等体积蜂毒肽melittin的pH7.5、50mmol/LTris-HCl(含0.15mol/L NaCl)溶液混和；阴性对照(不溶血)为小鼠红细胞悬液与等体积上述缓冲液混和。同时鉴定凝集活性，阴性对照同上，阳性对照为不加样品，改加植物血球凝集素，肉眼观察红细胞有无凝集现象。
(2)测定结果
①在10个不同温度条件处理下，蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)均表现出明显的免疫调节功能，即使121℃、1.5×105Pa的高温高压处理30min，仍有免疫调节活性，可见SPPC具有对热稳定的特性。
②蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)溶解在7种不同pH值溶液中48h后，仍具有免疫调节活性，说明SPPC对酸和弱碱的耐受性较强。
③蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)在不同离子强度的pH6.0和pH8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液处理下，均产生了免疫调节活性，说明离子强度对SPPC的活性影响不大。
④通过溶血实验，可见蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)在800μg/ml以下，与阴性对照相似，没有表现出溶血活性，而作为阳性对照的蜂毒肽在1400μg/ml，溶血活性已达100％(完全溶血)；凝集实验也未发现SPPC在800μg/ml以下对小白鼠的红细胞有凝集作用，而阳性对照红细胞凝集现象非常明显。
为了公开本发明的实质，以下从免疫调节、抑瘤作用、减毒增效等三个方面对蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)进行药效学研究，现将具体实验方法及实验结果详细说明如下，但本发明的内容完全不限于此。
(一)实验材料
1、药品：少棘蜈蚣(Scolopendra Subspinipes Mutilans L.Koch)成体由湖北当阳市养殖场提供，体重3g左右，由中国科学院武汉植物研究所江明喜研究员鉴定。呋喃氟脲嘧啶(FT207)由济南制药厂生产，批号：031003；环磷酰胺由江西恒瑞医药股份有限公司生产，批号：21156-21160；复方阿胶浆由山东阿胶股份有限公司生产，批号：040672。
2、动物：昆明种小鼠、BALB/c小鼠、SD种大鼠，雌雄兼用，由武汉大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(鄂)2003-0004。
3、癌细胞株和靶细胞：S180瘤株、艾氏腹水癌细胞，A549肺癌细胞、口腔表皮癌KB细胞、KM-12结肠癌细胞、BEL-7402肝癌细胞和MCF-7乳腺癌细胞株由中国医科院药物所引进、传代；NK敏感细胞Yac-1株和IL-2依赖株CTLL细胞引自武汉大学典型生物保藏中心。
4、试剂：MTT(Sigma)；IL-2由中国军事医学科学院提供，效价400IU/Amp；CD4(L3T4抗体)和CD8(Lyt-2抗体)试剂盒，由北京医科大学免疫教研室提供；
5、仪器：450型酶标仪由美国BioRad生产；ZT-N型多头细胞收集器由浙江东浦医疗器械厂生产；EG 2101型液体闪烁计数器，国产；荧光显微镜(Olimpus)。
(二)实验方法与结果
1.免疫试验
(1)ConA/LPS刺激荷瘤小鼠脾淋巴细胞体外增殖实验
分别制备NS组和50mg.kg-1、100mg.kg-1、200mg.kg-1s SPPC给药组的荷瘤小鼠脾淋巴细胞。颈椎脱臼处死以上各实验组荷瘤小鼠(每组5只)，75％乙醇浸泡1-2分钟，在无菌操作台内迅速取出脾脏，置于盛有5-10ml冷Hanks液的平皿内，平皿内预先放置一块略大于平皿的孔径为400目的尼龙筛网。用无菌针芯轻捻脾组织，使单个脾细胞滤过筛网进入平皿内。吸取冷Hanks冲洗筛网，将细胞悬液吸入离心管。4℃离心(1500r/min，5min)，弃上清，加入适量的Tris-NH4Cl(0.16mol.L-1，pH7.2)以溶解红细胞，吹打均匀，静置1-2分钟。再次离心并用冷Hanks液悬浮并离心洗涤细胞2次，弃上清，用完全RPMI-1640培养基悬浮细胞，作细胞计数，调细胞浓度至1×107.mL-1。取96孔平底细胞培养板，每组每孔加入1×106个荷瘤小鼠脾淋巴细胞及终浓度为2.5μg.ml-1的ConA或5μg.ml-1的LPS共孵育，各组处理均作6个平行孔。在5％O2、37℃水蒸气饱和的二氧化碳培养箱内培养68小时，培养结束后用MTT法检测细胞增殖。
表1.SPPC对荷瘤小鼠脾淋巴细胞体外增殖的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 淋巴细胞增殖(A570) |
| 正常对照组荷瘤对照组SPPC低剂量组SPPC中剂量组SPPC高剂量组 | --51020 | 0.43±0.0112.50±0.17△△18.94±2.22**22.81±1.93**26.93±2.26** |
与正常对照组比较，△△P＜0.01；与荷瘤对照组比较，**P＜0.01
由表1结果可见，荷瘤对照组的脾淋巴细胞体外增殖明显低于正常对照组，表明荷瘤组小鼠的脾淋巴细胞功能低下，而SPPC大、中、小三个剂量组的淋巴细胞增殖均明显高于荷瘤对照组，说明SPPC可明显刺激荷瘤小鼠的脾淋巴细胞体外增殖。
(2)对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响
取体重20～24g健康小鼠，参照文献《新药(西药)临床前研究指导原则汇编》方法进行实验，计算巨噬细胞吞噬百分率和吞噬指数，结果见表2。
由表2结果可见，荷瘤对照组的腹腔巨噬细胞吞噬率与吞噬指数均明显低于正常对照组，表明荷瘤组小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能低下，而SPPC大、中、小三个剂量组的上述指标均明显高于荷瘤对照组，说明SPPC可明显提高荷瘤小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能
表2.SPPC对荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 吞噬率(％) | 吞噬指数 |
| 正常对照组荷瘤对照组SPPC低剂量组 | --5 | 43.50±5.4234.27±3.38△△48.11±4.99** | 0.70±0.120.18±0.06△△0.68±0.19** |
| SPPC中剂量组SPPC高剂量组 | 1020 | 57.22±6.38**40.40±4.17** | 0.80±0.10**0.55±0.09** |
与正常对照组比较，△△P＜0.01；与荷瘤对照组比较，**P＜0.01
吞噬百分率＝[吞噬CRBC的吞噬细胞数/200个巨噬细胞数(吞与未吞)]×100％吞噬指数＝被吞噬的CRBC数/200个巨噬细胞
(3)对荷瘤小鼠迟发性变态反应的影响
表3结果显示，荷瘤对照组的DTH值明显低于正常对照组，与未致敏的荷瘤空白组基本相同；而SPPC三个剂量组的DTH值则明显高于荷瘤对照组，与正常对照组比较无显著性差异；表明SPPC可提高荷瘤小鼠的DTH反应，使其受损的免疫功能恢复正常。
表3.SPPC对荷瘤小鼠DTH反应的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | DTH(mg) |
| 正常对照组荷瘤对照组SPPC低剂量组SPPC中剂量组SPPC高剂量组 | --51020 | 2.60±0.591.33±1.00△△3.45±1.28*3.66±1.33**3.90±1.60** |
与正常对照组比较，△△P＜0.01；与荷瘤对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
(4)对荷瘤小鼠免疫器官重量的影响
取18～22g昆明种小鼠，无菌抽取传代7天的S180肉瘤细胞混悬液，用生理盐水稀释(约相当于1×107个瘤细胞/ml)，将小鼠右腋皮肤碘酒消毒后，皮下注入瘤细胞稀释悬液0.2ml/只；24小时后随机分为：模型对照组、FT207阳性对照组(0.15g/kg)和SPPC大、中、小(20、10、5mg/kg)三个剂量组，除模型对照组灌胃生理盐水外，其余各组动物每日灌胃给药一次，连续9天(灌胃体积均为0.25ml/10g)，于末次给药后2日，脱颈椎处死小鼠，取胸腺、脾脏，称重，计算胸腺指数与脾指数，结果见表4：化疗药FT207可使荷瘤小鼠的胸腺和脾指数明显降低，而SPPC则可明显提高荷瘤小鼠的胸腺和脾指数。
表4.SPPC对荷瘤小鼠免疫器官重量的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 胸腺指数(mg/10g) | 脾指数(mg/10g) |
| 荷瘤对照组FT207组SPPC低剂量组SPPC中剂量组SPPC高剂量组 | -0.1551020 | 26.6±6.315.6±5.528.8±7.9##31.6±6.2##35.6±13.0## | 80.6±11.962.3±13.576.5±15.775.9±13.291.8±19.7# |
与FT207组比较，#P＜0.05，##P＜0.01
(5)对荷瘤小鼠IL-2活性的影响
结果见表5。SPPC可使荷瘤小鼠的IL-2水平明显升高，对调节荷瘤小鼠机体免疫功能，抑制肿瘤有积极的作用。
表5.SPPC对荷瘤小鼠IL-2水平的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 体重变化(g) | IL-2活性(U/ml) |
| 空白对照组荷瘤对照组FT207组SPPC低剂量组SPPC中剂量组SPPC高剂量组 | --0.1551020 | -1.7-0.8-3.5-1.9-1.6-1.6 | 24.29±4.7015.55±3.95△38.38±4.9840.43±5.82**48.21±5.37**52.47±6.98** |
与空白对照组比较，△P＜0.05；与荷瘤对照组比较，**P＜0.01
(6)对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
结果见表6。荷瘤对照组的NK细胞活性明显低于正常对照组，而SPPC大、中、小三个剂量组的上述指标均明显高于荷瘤对照组，NK细胞活性的增强，表明对抑制肿瘤生长发挥了积极作用。
表6.SPPC对荷瘤小鼠NK细胞活性的影响
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 动物数(只) | NK细胞活性(％) | |
| 开始 | 结束 | |||
| 空白对照组荷瘤对照组FT207组SPPC低剂量组SPPC中剂量组sPSPC高剂量组 | --0.1551020 | 101010101010 | 101010999 | 24.58±4.8515.66±4.39△32.68±10.5546.75±11.28**52.69±9.88**64.79±10.78** |
与空白对照组比较，△P＜0.05；与荷瘤对照组比较，**P＜0.01
(7)对荷瘤小鼠T细胞亚群的影响
在T淋巴细胞静活化期，其细胞膜表面出现的抗原性不同的糖蛋白分子，其作用也不同。存在于小鼠成熟的杀伤(TC)/抑制(TS)T细胞表面的Lyt-2抗原，称为CD8分子，它能增强抗原识别受体(TCR)对外来抗原和自身MHCI类抗原的结合，以增强识别；存在于小鼠成熟的杀伤/抑制T细胞表面的L3T4分子称为CD4分子，它能增强抗原识别受体(TCR)对外来抗原和自身MHC II类抗原的结合。检测T细胞亚群中的CD4、CD8表面分子的表达与比例关系，有助于了解药物的抗肿瘤活性与免疫功能之间的关系，因此，我们进行了SPPC对纯系荷瘤小鼠(S180)的T细胞亚群影响的试验，结果见表7～10。
表7结果显示，各荷瘤组小鼠CD4亚群和CD8亚群与正常组比较均有显著性差异，说明接种肿瘤后，对动物的辅助性T细胞是有影响的。SPPC各给药组对CD4的变化影响不大，而SPPC各剂量组与荷瘤对照组比较，CD8有显著性差异，说明SPPC对荷瘤动物的细胞毒性T细胞CD8亚群有明显影响；由于荷瘤小鼠体内受到瘤细胞的侵蚀，其正常的T细胞亚群比例因受到多方面因素的影响而失去平衡，而给药后CD4/CD8恢复较明显，SPPC大、中、小剂量组与荷瘤对照组比较均有显著性差异。
表7.SPPC对T细胞亚群CD4、CD8、CD4/CD8的影响(n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | CD4 | CD8 | CD4/CD8 |
| 空白对照组荷瘤对照组FT207组SPPC低剂量组SPPC中剂量组SPPC高剂量组 | --0.1551020 | 28.50±4.6019.77±5.23##18.36±2.3316.55±3.6119.21±5.8416.62±5.84 | 23.23±4.888.60±3.04##12.58±2.99*16.20±5.94**29.06±7.23**23.08±8.77** | 1.29±0.402.55±0.88##1.58±0.38*0.99±0.26**0.65±0.30**0.85±0.57** |
与空白对照组比较，##P＜0.01；与荷瘤对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
上述试验结果显示，SPPC具有较好的机体免疫调节作用；通过增强荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能、调节机体免疫功能、影响T细胞亚群的活性、提高NK细胞活性及诱导IL-2活性的增强，对抑制肿瘤生长发挥了积极的作用。
2.抑瘤试验
(1)对多种癌细胞系的体外抑制作用
用SPPC 50、100、200mg.kg-1处理小鼠，制备含药血清；用0.25％胰酶消化、传代细胞。用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液调整细胞浓度至2×104.ml-1，96孔培养板每孔加入100μl，37℃，5％CO2孵育24h，弃培养液，加入10％过滤除菌的含药血清，37℃，5％CO2共孵育18h，采用MTT法检测细胞增殖。
表8.SPPC对不同癌细胞株细胞生长的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 抑制率(％) | ||||
| A549 | KB | KM-12 | BEL-7402 | MCF-7 | ||
| 空白对照组SPPC组 | -51020 | 1.3±0.221.1±2.9**50.6±2.5**70.0±2.1** | 0.9±0.110.4±1.6**23.1±1.7**41.9±2.8** | 1.4±0.310.8±1.2**38.9±2.5**70.2±1.4** | 1.2±0.510.9±1.2*35..3±2.4**56.2±1.8** | 0.8±0.123.1±1.7**36.9±2.3**50.33±1.8** |
与空白对照组比较，**P＜0.01
结果，与空白对照组比较，SPPC大、中、小三个剂量组对人A549肺癌细胞、口腔表皮癌KB细胞、KM-12结肠癌细胞、BEL-7402肝癌细胞和MCF-7乳腺癌细胞的生长均有明显的抑制作用，且存在一定的量效关系(表8)。
(2)对S180肉瘤株的抑制作用
取肿瘤细胞(荷瘤小鼠腹腔S180肉瘤细胞2×106接种于雄性健康BALB/c裸鼠腋下，随机分组。于接种后第2天开始灌胃给药，1次/天，剂量分别为5mg.kg-1、10mg.kg-1、20mg.kg-1 SPPC，对照给予相应体积的生理盐水，连续灌胃10天，于试验结束时，摘眼球取血，摘瘤、称瘤重。
结果见表9。与荷瘤对照组比较，SPPC大、中剂量组对S180瘤体生长均有明显的抑制作用，抑瘤率分别为56.6％和49.6％；结果表明，SPPC对小鼠S180瘤体生长有明显的抑制作用，且存在一定的量效关系。
表9.SPPC对S180荷瘤小鼠瘤体生长的影响
与生理盐水组比较，* P＜0.05，** P＜0.01
(3)对艾氏腹水癌小鼠生存期的影响
表10结果表明：SPPC大、中剂量组均延长艾氏腹水癌小鼠存活期，与荷瘤组比较有显著性差异；SPPC小剂量组的作用不明显。三次试验结果均表明SPPC具有延长荷瘤小鼠生存期的作用。
表10SPPC对艾氏腹水癌小鼠生存期的影响
与生理盐水组比较，*P＜0.05，** P＜0.01
3.减毒增效试验
(1)减毒试验
检验结果见表11～13。表11结果表明，大鼠注射环磷酰胺后，可使骨髓有核细胞数下降48.9％，而SPPC大、中剂量给药组可明显改善环磷酰胺引起的大鼠骨髓有核细胞数降低。说明大、中剂量的SPPC对骨髓有核细胞具有保护作用，对化疗药造成的骨髓造血功能抑制具有一定的减毒效果。
表11SPPC对环磷酰胺大鼠骨髓有核细胞数的影响(n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 骨髓有核细胞数(×109/L) |
| 正常对照组环磷酰胺对照组SPPC组 | --51020 | 6.97±2.303.56±1.24△5.88±2.557.80±2.59*7.64±2.79* |
与正常对照组比较，△P＜0.05；与模型对照组比较，*P＜0.05
表12结果表明，大鼠注射环磷酰胺后使白细胞和血小板数显著下降；SPPC大、中、小剂量组的血小板数降低幅度均显著减小，其检测值明显高于模型对照组。提示SPPC大、中、小剂量对环磷酰胺造成的血小板减少均有较好的对抗作用，可以在一定程度上减轻化疗药的毒副作用。
表12环磷酰胺大鼠试验后血液学指标检测值(
n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | WBC(×109/L) | Hb(g/L) | RBC(×1012/L) | PLC(×109/L) |
| 正常对照组模型对照组SPPC组 | --51020 | 10.39±5.314.13±2.02△△4.98±2.614.43±1.374.11±2.42 | 134.60±5.10121.20±8.12118.50±6.34126.20±6.48122.80±7.27 | 8.40±3.337.00±0.727.33±0.557.10±0.517.12±0.78 | 617.20±47.53289.60±52.14△△537.80±104.19589.00±96.72608.60±123.39 |
与正常对照组比，△△P＜0.01；与模型对照组比，**P＜0.01
(2)增效试验
结果见表13。单独用药组：环磷酰胺(25mg/kg)、SPPC(5mg/kg)的抑瘤率分别为37.4％和46.6％，而联合用药组(环磷酰胺25mg/kg+SPPC 5mg/kg)的抑瘤率则为77.9％，与单独用药组比较，抑瘤率均有所提高；从上述试验结果可以看出：SPPC与小剂量的化疗药合用，不仅可减轻化疗药的毒副作用，同时还可提高抑瘤率，显示了联合用药的优势。
表13SPPC与环磷酰胺合用对S180瘤株生长的影响(
n＝10)
| 组别 | 剂量(mg/kg) | 瘤体重(g) | 抑瘤率(％) |
| 生理盐水组环磷酰胺组SPPC组SPPC+环磷酰胺组 | -251010+25 | 1.31±0.210.82±0.44**0.83±0.49**0.29±0.21** | 37.436.677.9 |
与生理盐水组比较，**P＜0.01
(三)结论
上述各项实验结果表明，从节肢动物蜈蚣全虫中提取的蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)不仅具有调节机体免疫功能和抑制肿瘤生长的作用，而且与化疗药合用时还可以减轻其毒副作用和增强其抑瘤效果。
1.蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)可明显提高荷瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能和胸腺指数，恢复荷瘤小鼠低下的DTH反应，通过影响T细胞数量、增强NK细胞毒性和IL-2的活性，起到调节机体免疫功能的作用。
2.蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)可剂量依赖性的抑制S180肉瘤株，三个剂量组的抑瘤率分别为56.6％、49.6％、35.7％，对艾氏腹水癌小鼠的生存期有延长作用；同时与低于治疗剂量的环磷酰胺合用时，可产生抑瘤的协同作用，提高抑瘤率。
3.蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)对环磷酰胺造成的大鼠血小板减少和骨髓有核细胞数量减少具有保护作用，提示其与化疗药联合应用，具有减毒作用。
综上所述，通过药效学试验研究结果表明：蜈蚣多糖蛋白复合物(SPPC)不仅具有调节机体免疫功能和抑制肿瘤生长的作用，而且与化疗药合用时还可以减轻其毒副作用和增强其抑瘤效果。
Claims (7)
1.一种蜈蚣多糖蛋白复合物的制备方法，它包括下列步骤：
A.以少棘蜈蚣作为原料母体，清洗3～5次，烘干2～4小时，烘干温度控制在60～80℃；
B.研磨第A步骤中干燥后的原料母体并过50～200目筛得蜈蚣粉；
C.将第B步骤中的蜈蚣粉用5倍体积蒸馏水抽提1～3小时，温度控制在80～90℃，纱布过滤得一份提取液，取残渣再用4倍体积蒸馏水重复提取三次得三份提取液，合并四份提取液，2500r/min离心20～30分钟，获取上清；
D.将第C步骤中的上清减压浓缩，温度控制在50～70℃，加入5倍体积95％乙醇，于4℃静置过夜，倾去上清，取沉淀，2500r/min离心10分钟，收集沉淀；
E.将第D步骤中的沉淀用500ml蒸馏水溶解，计量40％饱和度所需要的固体硫酸铵量，于4℃加入，搅拌4h、10000r/min离心20分钟后，收集上清并计量体积，重复此步骤的操作，收集60％饱和度的沉淀物；
F.将第E步骤中的沉淀物用30ml蒸馏水溶解后，上DEAE-50离子交换层析柱纯化，以蒸馏水平衡，用0.05～0.25mol/L NaCl溶液洗脱，收集洗脱液，用透析袋在双蒸水中透析48小时脱盐，再用聚乙二醇20000浓缩；
G.将第F步骤中的浓缩液上Sephadex G-200层析柱纯化，用0.02mol/L pH为7.2的Tris-HCl溶液洗脱后，经真空冷冻干燥，预冻温度控制在-45～-15℃，加热温度控制在20～40℃，干燥8～12小时后得蜈蚣多糖蛋白复合物。
2.一种蜈蚣多糖蛋白复合物在制备治疗或预防肿瘤的药物中的应用。
3.一种蜈蚣多糖蛋白复合物在制备治疗或预防肝癌的药物中的应用。
4.一种蜈蚣多糖蛋白复合物在制备治疗或预防肺癌的药物中的应用。
5.一种蜈蚣多糖蛋白复合物在制备治疗或预防口腔表皮癌的药物中的应用。
6.一种蜈蚣多糖蛋白复合物在制备治疗或预防结肠癌的药物中的应用。
7.一种蜈蚣多糖蛋白复合物在制备治疗或预防乳腺癌的药物中的应用。
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