CN101348812A - 一种地衣多糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种采用从地衣中提取的多糖及多糖制备的方法。经动物体内药理试验证明多糖WPT－1、WPT－2均具有明显的免疫促进活性、抗肿瘤活性、辐射防护活性、升高白细胞活性及DNA损伤修复活性。

Description

一种地衣多糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中草药提取多糖，更具体地说是从地衣中提取多糖和它的应用，具体包括地衣多糖HWPT-1、HWPT-2的提取方法及WPT-1、WPT-2在免疫调节、抗肿瘤、辐射防护、升高白细胞和DNA损伤修复方面的作用。

背景技术

地衣是一类特殊的生物有机体，是由真菌和藻类联合形成的共生复合体，由于这种特殊的生存状态，使得地衣有很多独特的药用价值，如抗炎、抗溃疡、祛风湿、强心、降压等等。近30年来，地衣中多糖类成分的研究逐渐引起人们的注意。由于多糖类化合物是一种免疫调节剂，作为癌症的辅助治疗药物，具有不良反应小，安全性高等优点，因此，多糖类物质是目前地衣研究领域的一个热点。迄今为止，已经有100多种地衣中的多糖成分被发现和研究。

石花是常见的地衣类植物，生于岩石上，上表面呈灰白色，背面黑色，有清热解毒及外伤止血之功效。本研究所用石花采于四川冕宁县泸宁区，经中国科学院微生物研究所地衣-真菌学家魏江春教授鉴定为梅衣科梅衣属的染色梅衣，学名为Parmelia tinctorium。本发明从地衣石花中提取获得两种均一体多糖。药理试验表明两种均一体多糖均具有明显的免疫调节活性、抗肿瘤活性、辐射防护活性、升高白细胞活性和DNA损伤修复活性。

发明内容

本发明的目的是提供一种地衣多糖。

本发明的另一目的是提供一种地衣多糖提取分离方法。

本发明的再一目的是提供该多糖的医学用途。

本发明是这样实施的：

取干地衣全草粉碎品，加95％的乙醇，回流提取2-4次，每次提取时间为10-16h，滤去母液，残渣阴干。脱脂后的干品用沸水提取3-5次，每次提取时间为5-8h，将每次提取的提取液过滤，所得的水提液合并，减压浓缩至小体积，对流水透析3-4天，继续将溶液浓缩至小体积，酶法结合三氯乙酸-正丁醇法除蛋白，加入1％-3％的木瓜蛋白酶，50℃-70℃水浴酶解2h-4h，再加入多糖溶液1-2倍体积的三氯乙酸-正丁醇液(v/v＝1∶5-1∶10)，振摇10-30min，静置1.0-3.0h。取下清液，用1mol/LNaOH溶液中和至中性，加入1％活性炭煮沸5-10min，脱色，再用蒸馏水透析3-4天，袋内溶液浓缩至1/3-1/5体积，加入3-4倍于糖溶液体积的95％乙醇于溶液中，于4℃沉淀过夜。离心收集沉淀，在40℃的低温真空干燥箱中脱水得粗多糖WPT。

取水提粗多糖WPT，加入0.1mol/LNaCl溶解，离心除去不溶物，上清液通过纤维素柱层析分离，先用0.1mol/LNaCl溶液洗脱，自动收集仪收集流分(硫酸-苯酚法检测多糖组分)，收集糖反应阳性部分减压浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-1，再用2mol/LNaCl溶液梯度洗脱，收集该组分多糖溶液，经浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-2；获得的两个组分分别经Sephadex G-150、Sephadex G-200柱层析分离，洗脱得到的糖组分经减压、浓缩、干燥得到均一体多糖HWPT-1和HWPT-2。

药理试验：

一.非特异性免疫功能影响试验-小鼠碳粒廓清试验

材料与方法

1.实验材料

1.1动物：纯种ICR小鼠，体重22-24g，雌雄兼用。

1.2药物：WPT-1、WPT-2分别用生理盐水配置，给药剂量为20mg/kg，环磷酰胺给药剂量为50mg/kg。

2.实验方法：

2.1分组与给药：

(1)对照组：1，4，7d给生理盐水，按体重0.1ml/10g，腹腔注射。

(2)地衣多糖(WPT-1、WPT-2)：剂量20mg/kg，第1，4，7d按体重0.1ml/10g腹腔注射。

(3)环磷酰胺组：按体重0.1ml/10g给药，腹腔注射2次。

(4)地衣多糖(D)+环磷酰胺(Cy)：地衣多糖WPT-1、WPT-2，剂量20mg/kg，第1，4，7d按体重0.1ml/10g腹腔注射；环磷酰胺，剂量50mg/kg，按体重0.1ml/10g，腹腔注射2次。

2.2观察指标：取体重22-24g小鼠，分组给药。末次给药30min后，尾静脉注射印度墨汁0.1ml/10g，注射后不同时间(1min和10min)，用20μl吸管分别从眼眶静脉取血20μl，溶于2ml、0.1％Na₂CO₃溶液中摇匀，于波长680nm下比色，测定光密度(OD)，计算吞噬指数K。

K＝logOD₁-logOD₂/t₂-t₁

实验结果：

地衣多糖WPT-1对RES吞噬功能的影响

注：t值和P值均是与环磷酰胺组相比；***为P＜0.001

地衣多糖WPT-2对RES吞噬功能的影响

注：t值和P值均是与环磷酰胺组相比；**为P＜0.01

经统计学处理，地衣多糖WPT-1、WPT-2对由化疗药环磷酰胺造成的免疫功能低下的小鼠，对其网状内皮系统吞噬功能具有明显的激活、增强作用。

二.抗肿瘤试验

材料与方法

1材料

动物选择：放射所自繁殖IRM-2纯系小鼠，雌雄兼用。

瘤种：放射所动物室从IRM-2纯系小鼠自发淋巴瘤(病理结论)传代培养。

药物配置：WPT-1、WPT-2各设三个剂量组20mg/kg，40mg/kg，60mg/kg，溶剂为蒸馏水。

2方法

接种：选择肿瘤生长旺盛且无溃破，健康情况良好的IRM-2小鼠，脱臼处死，固定于手术板上，用碘酒，新洁而灭消毒动物皮肤，无菌条件下在超净台内剥肿瘤，切开肿瘤成直径2mm左右的小块，在动物左侧腹股沟处皮下接种。

分组给药：接种后次日将动物随机分组(8只一组，雌雄各半)，设对照组及高、中、低四个组，每天给药一次，腹腔注射，每次0.5ml，对照组给予蒸馏水0.5ml，连续给药10天。

疗效评价：停药后24h后处死动物，称体重，解剖剥离瘤块，称瘤重。

肿瘤抑制率：C-T/C×100％

式中T为给药组平均瘤重，C为对照组平均瘤重。

实验结果：

地衣多糖WPT-1抑制淋巴瘤实验

注：t值和P值均是与对照组相比；*为P＜0.05；**为P＜0.01

地衣多糖WPT-2抑制淋巴瘤实验

注：t值和P值均是与对照组相比；*为P＜0.05

经统计学处理，地衣多糖WPT-1在高、中、低3个剂量时对小鼠自发恶性淋巴瘤均有一定的抑制作用，高剂量组抑瘤效果最好；WPT-2在高、中2个剂量时对小鼠自发恶性淋巴瘤有一定的抑制作用，中剂量组抑瘤效果较好。

三.抗放射、升高白细胞试验

1.实验材料

1.1动物：纯种C57小鼠，体重22-24g。

1.2实验方法：

1.2.1分组与给药：动物随机分为四组(8只一组，雌雄各半)：空白对照组、阳性对照药组(茜草双脂)、药物(WPT-1、WPT-2)20mg/kg、50mg/kg、80mg/kg五个剂量组。照射前第3、2、1日连续3次给药，腹腔注射，0.5ml/只；对照组给予生理盐水，腹腔注射，0.5ml/只。

1.2.2致伤条件：¹³⁷Csγ射线一次全身照射，照射剂量率为1.9932×10²C·kg^-1·min^-1，小鼠吸收剂量为6.5Gy。

观察指标：(1)白细胞数：照射后第7天将小鼠颈部脱椎处死，眼眶取血，白细胞稀释液稀释，电子显微镜下记数细胞数。

(2)股髓有核细胞数(bone marrow nucleated cells，BMNC)：照射后7天将小鼠颈部脱椎处死，取一侧股骨，白细胞稀释液冲洗骨髓，电子显微镜下记细胞数。

(3)脾指数：取出脾脏，称重，计算脾指数。

(4)脾结节(Colong forming unit of spleen，CFU-s)：将脾脏放入Bouin氏液内，24h后，肉眼记数突出脾脏表面结节数。

实验结果：

地衣多糖WPT-1对辐射损伤小鼠升高白细胞及造血功能保护实验

注：t值和P值均是与对照组相比；*为P＜0.05；**为P＜0.01；***为P＜0.001

地衣多糖WPT-2对辐射损伤小鼠升高白细胞及造血功能保护实验

注：t值和P值均是与对照组相比；*为P＜0.05；**为P＜0.01；***为P＜0.001

经统计学处理，地衣多糖WPT-1、WPT-2在高、中2个剂量时WBC、BMNC、CFU-S、脾指数各项指标，与对照组相比差异显著。

四.单细胞凝胶电泳实验(SCGE)检测辐射损伤小鼠DNA修复试验：

1.实验材料

1.1动物：纯种C57小鼠，体重22-24g。

1.2实验方法：

1.2.1分组与给药：动物随机分为五组(8只一组，雌雄各半)：空白对照组、阳性对照药组(茜草双脂)、药物(WPT-1、WPT-2)20mg/kg、50mg/kg、80mg/kg五个剂量组。照射前第3、2、1日连续3次给药，腹腔注射，0.5ml/只；对照组给予生理盐水，腹腔注射，0.5ml/只。

1.2.2致伤条件：¹³⁷Csγ射线一次全身照射，照射剂量率为1.9932×10²C·kg^-1·min^-1，小鼠吸收剂量为6.5Gy。

观察指标：(1)采小鼠外周血约0.2ml，肝素抗凝。所取外周血与小鼠对应编号后，做单细胞凝胶电泳(SCGE)实验检测小鼠淋巴细胞照射后的DNA双链断裂，CASP软件分析彗星图像，观察彗星尾部DNA％(TDNA％)、尾长(TL)、尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)等指标。

1.2.3淋巴细胞分离

预先在0.5ml离心管中加入4℃预冷的0.2ml淋巴细胞分离液，所取外周血沿离心管内壁轻轻加在淋巴细胞分离液面上，3500rpm离心2min，离心后吸取中间层淋巴细胞，置于2ml离心管中，加PBS至2ml，1500r/min离心6min，弃上清。如此重复洗涤2次，再将淋巴细胞悬于PBS，调整细胞密度为2×10⁴/ml，置4℃冰箱备用。

1.2.4碱性单细胞凝胶电泳实验

(1)铺胶：取100μl正常熔点琼脂糖凝胶均匀铺于自制微电泳槽内，置4℃冰箱固化，25μl淋巴细胞悬液与75μl低熔点琼脂糖凝胶混匀后均匀铺于第1层凝胶上面，置于4℃冰箱固化；(2)裂解和电泳：胶板置于新鲜配制的碱性裂解液，4℃冰箱中裂解1.5h；用双蒸水漂洗去掉多余的盐分，于4℃电泳液中静置20min，然后在20V，200mA电泳条件下电泳20min；③染色和观察：溴化乙锭(EB)染色，双蒸水漂洗，荧光显微镜下观察彗星，用Nikon相机随机摄取彗星图像，每只动物拍摄40个彗星图像。

1.2.5彗星图像分析

彗星图像采用波兰弗罗茨瓦夫(University of Wroclaw)大学提供的CASP系统自动分析，分析结果用SPSS13.0统计软件直接读取。选取尾部DNA百分含量(TDNA％)、尾长(TL)、尾矩(TM)和Olive尾矩(OTM)作为分析指标。

实验结果：

地衣多糖WPT-1对辐射损伤小鼠淋巴细胞DNA修复实验

注：t值和P值均是与对照组相比；***为P＜0.001

地衣多糖WPT-2对辐射损伤小鼠淋巴细胞DNA修复实验

注：t值和P值均是与对照组相比：***为P＜0.001

经统计学处理，阳性对照组、地衣多糖WPT-1、WPT-2高、中、低剂量组受照小鼠淋巴细胞DNA双链断裂的彗星各项指标TDNA％、TL、TM和OTM逐渐减小，给药组DNA损伤修复增加，残余损伤逐渐减少，呈显著的剂量效应关系，80mg/kg剂量组对DNA损伤的修复作用最好。

具体实施方式

实施例：

干地衣全草粉碎品，加95％的乙醇，回流提取2次，每次提取时间为12h，滤去母液，残渣阴干。脱脂后的干品(2公斤)用沸水提取，每次加水20升，提取时间为6h，以苯酚硫酸法检测提取液糖含量，直至糖反应不明显，共计提取3次。将每次提取过滤所得的水提母液合并，减压浓缩至小体积，使用半透膜对流水透析3天，继续将溶液浓缩至小体积，加入1％的木瓜蛋白酶，50℃水浴酶解3h，再加入与多糖溶液同体积的三氯乙酸-正丁醇液(v/v＝1∶10)，振摇10min，静置1.0h。取下清液，用1mol/LNaOH溶液中和至中性，加入1％活性炭煮沸5min，脱色，再用蒸馏水透析3天，袋内溶液浓缩至适当体积(1/3-1/5)，加入95％的乙醇3倍于糖溶液的体积于4℃沉淀过夜。离心收集沉淀，经无水乙醇，丙酮，无水乙醚依次洗涤三次后在40℃的低温真空干燥箱中脱水得到50g棕灰色的固体(WPT，产率2.5％)。

取4g水提粗多糖WPT，加入适量0.1mol/L NaCl溶解，离心除去不溶物，上清液通过DEAE-纤维素柱层析分离，先用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集仪收集流分，硫酸-苯酚法检测，收集糖组分。减压浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-1，再用2mol/LNaCl溶液梯度洗脱，收集该组分多糖溶液，经浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-2。获得的组分分别经Sephadex G-150柱层析得到洗脱主要糖组分，组分WPT-1经减压、浓缩、干燥得到多糖HWPT-1(250mg)，组分WPT-2经减压、浓缩、干燥得到多糖HWPT-2(150mg)。

药理试验：

取上述WPT-1、WPT-2分别按照试验中提及的药理试验方法进行小鼠碳粒廓清试验、抗肿瘤试验、抗放射、升高白细胞试验及单细胞凝胶电泳实验。结果表明，地衣多糖WPT-1、WPT-2具有良好的免疫调节活性、抗肿瘤活性、辐射防护活性、升高白细胞活性和DNA损伤修复活性。

Claims (6)

1.一种地衣多糖的制备方法，其特征是包括以下步骤：

A.干地衣全草粉碎物95％的药用乙醇回流提取2-4次后，滤去母液，残渣阴干；

B.上述脱脂后的干品沸水提取3-5次，提取液过滤，合并提取液减压浓缩至小体积，用对流水透析3-4天，继续将溶液浓缩到小体积，酶法结合三氯乙酸-正丁醇法除蛋白，静置分层取下清液，用1mol/L NaOH溶液中和至中性，加入1％活性炭煮沸脱色，再用蒸馏水透析3-4天，袋内溶液浓缩至1/3-1/5体积，加入3-4倍于糖溶液体积的95％乙醇，在冰箱中(4℃)放置过夜，离心收集沉淀，在40℃的低温真空干燥箱中脱水的粗多糖WPT；

C.加入0.1mol/L NaCl溶解粗多糖，离心除去不溶物，上清液通过纤维素柱层析分离，先用0.1mol/L NaCl溶液洗脱，自动收集仪收集流分(硫酸-苯酚法检测多糖组分)，收集糖反应阳性部分减压浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-1，再用2mol/LNaCl溶液梯度洗脱，收集该组分多糖溶液，经浓缩、透析、冷冻干燥得次级多糖组分WPT-2；获得的组分分别经Sephadex G-150、Sephadex G-200柱层析得到洗脱主要糖组分，组分WPT-1经减压、浓缩、干燥得到多糖HWPT-1，组分WPT-2经减压、浓缩、干燥得到多糖HWPT-2。

2.权利要求1所述的地衣多糖提取物，其特征是步骤B中除蛋白工艺为加入1％-3％的木瓜蛋白酶，50℃-70℃水浴酶解2h-4h，再加入多糖溶液1-2倍体积的三氯乙酸-正丁醇液(v/v＝1∶5-1∶10)，振摇10-30min，静置1.0-3.0h。

3.权利要求1所述的地衣多糖的用途，其特征在于作为免疫调节药物的应用。

4.权利要求1所述的地衣多糖的用途，其特征在于作为抗肿瘤药物的应用。

5.权利要求1所述的地衣多糖的用途，其特征在于作为辐射防护药物及升白药物的应用。

6.权利要求1所述的地衣多糖的用途，其特征在于作为DNA损伤防护剂的应用。