CN105111323B

CN105111323B - 一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法

Info

Publication number: CN105111323B
Application number: CN201510534404.3A
Authority: CN
Inventors: 黄越燕; 朱琦峰
Original assignee: Jiaxing University
Current assignee: Jiaxing University
Priority date: 2015-08-27
Filing date: 2015-08-27
Publication date: 2017-09-29
Anticipated expiration: 2035-08-27
Also published as: CN105111323A

Abstract

本发明公开了一种新的、相对安全、得率高、纯度高、具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化工艺路线，其步骤如下：龙葵粉末粉碎过筛，依次采用石油醚、乙醇脱脂，再用闪式提取，经浓缩醇沉后，以三氯乙酸脱蛋白，活性炭脱色，二次醇沉，最后干燥制得龙葵精制多糖，得率为2.554%。该产物对H22肝癌细胞的体外生长具有抑制作用，1.4‑1.8 mg/mL浓度时细胞抑制率35.80‑85.4%，对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长具有抑制作用，抑制率为37.73%‑42.60%。

Description

一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法

技术领域

本发明属药物提取纯化技术领域，特别是一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法。

背景技术

龙葵(Solanum nigrumL.)属茄科植物，其性寒味苦，微甘，有小毒，归肺、肾二经。龙葵作为传统中草药在我国各地均有分布，具有清热解毒、消肿散结、消炎利尿的功效。龙葵多糖对肉瘤S180、胃癌MFC、宫颈癌U14等均有明显的生长抑制作用，能够增加免疫器官脾脏和胸腺重量，并且能够显著延长荷瘤小鼠的生命周期，且无毒副作用或毒副作用明显低于传统的化疗药物。但对龙葵多糖的研究，大多集中于粗提取物，对其精制品的分离纯化工艺的研究未见报道。

在传统的方法中，多采用水为溶剂提取获得龙葵粗多糖；但以水为溶剂提取获得的龙葵粗多糖仍含有蛋白质、色素等杂质，这些成分的存在会影响药物的质量及安全。常用的脱蛋白方法采用Sevag法时，效率不高，操作需反复多次，成本消耗大、毒性氯仿易残留，多糖易损失；采用盐酸法时，效果虽好，但强酸性会使部分多糖降解，降低多糖活性；三氟三氯乙烷法因溶剂沸点低易挥发不宜大量使用，采用酶法脱蛋白时会受到酶的专一性所限制。

基于以上问题，寻找一种工艺简单、成本低、操作方便、得率高、纯度高的龙葵多糖纯化工艺方法，对于批量生产具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖用于开发抗肿瘤药物尤为重要。

发明内容

为了解决现有技术中的上述问题，本发明针对具有抗肿瘤活性的龙葵多糖为目标，提供一条简单合理、操作方便、成本低、得率高、纯度高的提取纯化工艺路线。本发明采用石油醚及乙醇进行脱脂，闪式提取，三氯乙酸脱蛋白，活性炭脱色，二次醇沉等方法制备龙葵精制多糖。

本发明的一个目的在于提供具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法。

一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)龙葵粗多糖样品的制备：

龙葵饮片40-60℃干燥6-8h后，粉碎过40目筛，制得龙葵粉末；将龙葵粉末加入4-5重量倍石油醚，于50-55℃水浴条件下，加热回流脱脂2次，每次2h，过滤去液留渣；将药渣加入2倍重量的80％乙醇，于80℃水浴条件下加热回流2次，每次1h，过滤去液留渣，药渣晾干，制成已脱脂的龙葵粉末；将上述已脱脂的龙葵粉末置于闪式提取仪的容器中，加蒸馏水30重量倍，以80V电压闪式提取2次，每次2min；合并提取液，纱布过滤，以3000r/min离心15min，取上清液减压浓缩至50％药材体积，在搅拌下加入乙醇调节含醇量至80％，2-6℃静置冷藏12-24h，减压抽滤，沉淀用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3次后，60℃真空干燥，得龙葵粗多糖；

(2)龙葵精制多糖的纯化：

将步骤(1)所得的龙葵粗多糖用蒸馏水溶解配成质量浓度为1％的溶液，用3％-5％三氯乙酸溶液缓缓调节pH至2.5-3.0，振荡处理20min，2-6℃静置2-4h，以3000r/min离心10min去除胶状蛋白沉淀；在上清液中加入活性炭，以稀HCl调节pH至5，40℃保温脱色20min，静置1h后，以4000rpm/min离心20min除去沉淀；将上清液加入4倍量的95％乙醇沉淀，2-6℃静置冷藏12-24h，以4000rpm/min离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3次后，60℃真空干燥得龙葵精制多糖。

进一步地，步骤(2)中用三氯乙酸溶液调节pH至2.5。

步骤(2)中活性炭的加入量为待处理液量的0.7％。

本发明所述龙葵饮片是指市售的经过自然或人工干燥的中药龙葵。

本发明将龙葵饮片经过预处理、脱脂、提取、脱蛋白、脱色和醇沉的步骤，得到的龙葵精制多糖。

本发明的另一个目的在于提供利用本发明的方法提取的龙葵精制多糖组分在制备抗肿瘤药物试剂中的应用。

龙葵精制多糖的抗肿瘤活性作用：采用MTT法检测利用本发明方法制得的龙葵精制多糖对肝癌细胞H22体外生长表现出明显的抑制作用，在浓度1.4-1.8mg/mL时细胞增殖抑制率为35.80-85.4％，对H22荷瘤小鼠的肿瘤体内生长也表现出明显抑制作用，给药剂量在30-60mg/kg时肿瘤生长抑制率为37.73％-42.60％，而对荷瘤小鼠的胸腺、脾脏等免疫器官并无不良影响。

有益技术效果

与现有技术相比，本发明具有以下优点及效果：

(1)本发明设计了一条工艺简单、操作方便、成本低、得率高、纯度高的龙葵精制多糖的提取纯化工艺路线，与Sevag法、酶法脱蛋白比较，该工艺路线蛋白脱除率和多糖保留率均较高。

(2)本发明在快速高效进行闪式提取龙葵粗多糖的基础上，采用三氯乙酸脱去多糖水提液中的蛋白质等杂质，采用活性炭脱除色素等杂质，使有效成分的含量提高，有利于后期产品质量控制。

(3)本发明通过体外MTT细胞增殖实验和小鼠移植瘤模型动物体内实验，对所获得的龙葵精制多糖进行了抗肿瘤活性的测定，证实经该提取纯化工艺得到的龙葵精制多糖具有较强的抗肿瘤活性。

附图说明

图1是龙葵精制多糖对H22荷瘤小鼠体内肿瘤生长的抑制实体图。

具体实施方式

实施例1龙葵精制多糖的制备

(1)龙葵粗多糖的提取：

预处理：称取100g龙葵饮片(购自浙江嘉信医药有限公司)60℃下6-8h烘干，粉碎机粉碎过40目筛。

脱脂：将上述步骤的龙葵粉末加入料液比1:4的石油醚(400ml)，于50℃水浴条件下加热回流提取2h，共提取2次，过滤弃液留渣。在留下的渣中加入2倍量的80％乙醇(200ml)，于80℃水浴条件下加热回流1h，共2次，双层纱布过滤，去液留渣，药渣平铺于通风处晾干。

多糖提取：将通风处晾干的药渣置于闪式提取器(JHBE-50T型闪式提取器，公司名称：河南金鼐科技发展有限公司)内，加水30倍量，以提取电压80V进行闪式提取2min，共2次，4层纱布过滤，滤液于3000r/min离心10min，得到的水提液，减压浓缩至小体积(至50ml)，离心取上清液。在搅拌下，向上清液中加入95％乙醇至含醇量为80％，4℃冷藏静置12h，虹吸上清液弃去，于3000r/min离心15min，将沉淀抽滤，分别依次用无水乙醇(100ml左右)、乙醚(100ml左右)洗涤2次，60℃真空干燥至恒重，即得龙葵粗多糖12.63g，得率为12.63％。

(2)龙葵精制多糖的纯化：

脱蛋白：龙葵粗多糖12.63g用蒸馏水溶解配成质量浓度为1％的样品液，缓缓加入5％三氯乙酸调节pH至2.5，振荡处理20min，4℃静置4h后，以3000r/min离心10min，去除胶状蛋白沉淀。

脱色：将上清液加入待处理液量的0.7％用量的活性炭，以稀HCl(1mol/L)调节pH至5，在40℃条件下保温脱色20min，静置1h后以4000rpm/min离心20min，除去活性炭沉淀，留上清液。

醇沉：将上清液，加入4倍量的95％乙醇沉淀，2-6℃静置冷藏24h，以4000rpm/min离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3次后，60℃真空干燥得龙葵精制多糖。经测定蛋白质脱除率为90.93％，多糖保留率为90.83％，精制多糖质量为2.554g，得率为2.554％。

实施例2龙葵精制多糖的制备

(1)龙葵粗多糖的提取：

称取100g龙葵饮片60℃6-8h烘干，粉碎机粉碎过40目筛，加入料液比1:4的石油醚，50℃水浴加热回流提取2h，共提取2次，过滤弃液留渣，加入2倍量的80％乙醇，于80℃水浴条件下加热回流1h，共2次，双层纱布过滤，去液留渣，药渣平铺于通风处晾干。然后将药渣置于闪式提取器内，加水30倍量，以提取电压80V进行闪式提取2min，共2次，4层纱布过滤，滤液于3000r/min离心10min，得到的水提液，减压浓缩至小体积(至100ml)，离心取上清液。在搅拌下加入95％乙醇至含醇量为80％，4℃冷藏静置12h，虹吸上清液弃去，于3000r/min离心15min，将沉淀抽滤，分别依次用无水乙醇、乙醚洗涤2次，60℃真空干燥至恒重，即得龙葵粗多糖11.90g。

(2)龙葵精制多糖的纯化

龙葵粗多糖用蒸馏水溶解配成质量浓度为1％的样品液，缓缓加入5％三氯乙酸调节pH至2.5，振荡处理20min，4℃静置4h，以3000r/min离心10min，去除胶状蛋白沉淀。将上清液加入待处理液量的0.7％用量的活性炭，以稀HCl调节pH至5，在40℃条件下保温脱色20min，静置1h后以4000rpm/min离心20min，除去活性炭沉淀。将上清液，加入4倍量的95％乙醇沉淀，2-6℃静置冷藏24h，以4000rpm/min离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3次后，60℃真空干燥得龙葵精制多糖。经测定蛋白质脱除率为88.98％，多糖保留率为88.28％，精制多糖得率为2.400％。

实施例3龙葵精制多糖的抗肿瘤作用

(1)龙葵精制多糖的体外抗肿瘤作用

将从实施例1中制备得到的龙葵精制多糖配制成10mg/mL的储备液，0.22μm无菌滤膜过滤除菌后置于4℃冷藏备用。临用前用无菌注射用水稀释成0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/ml系列浓度。

取腹腔内传代7天的肝癌H22小鼠，颈脱臼处死小鼠，无菌操作抽取腹水，置于离心管，1000r/min离心5min，小心吸取沉淀中的上层细胞，加PBS吹打洗涤2次，1000r/min离心5min。用含10％小牛血清的RPMI1640的完全培养液吹打，稀释调整肿瘤细胞浓度至1×10^5/ml。

将稀释后的瘤液接种于96孔培养板，每组设6复孔，每孔加细胞悬液100μl(1×10⁴个细胞)。实验设置阳性组、阴性组、空白组、给药组，分别加入100μl5-Fu溶液(5mg/ml)、细胞培养液、空白培养液、龙葵精制多糖(0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8、2.0mg/ml)，各孔内液体总量均为200μl。置于37℃、5％CO₂条件下培养24h及48h。

培养时间到后，在避光条件下每孔加入5mg/mL的MTT磷酸盐缓冲液20μl，吹打均匀，继续培养4h。终止培养，用枪头轻轻吸弃150μl培养孔内的培养液，每孔加入150μl二甲基亚砜，经震荡混匀10min，使形成的蓝紫色甲臜颗粒充分溶解。

用酶标仪于490nm波长处，测定各孔的吸光度A值，计算细胞抑制率。细胞抑制率％＝(阴性组A值－实验组A值)/阴性组A值×100％

重复三次实验，结果显示：在体外培养条件下，龙葵精制多糖能明显抑制H22细胞的增殖，且作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增加。药物在较低浓度即有抑制作用，作用最佳浓度为1.4-1.8mg/mL，抑制率35.80-85.4％。龙葵精制多糖对H22细胞的增殖抑制情况见表1。

表1龙葵精制多糖对H22细胞的抑制率

(2)龙葵精制多糖的体内抗肿瘤作用

药液的配制：分别称取一定量龙葵精制多糖，加蒸馏水40mL溶解，超声振荡20min，转移至50mL容量瓶定容，得2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL龙葵精制多糖溶液。

取传代接种后7-9天之H22肝癌荷瘤小鼠，于无菌条件下从腹腔抽出瘤液，用灭菌生理盐水(1:4)稀释，调整瘤细胞数至1.37×10⁷/mL，每只小鼠右腋皮下接种0.2mL。随后将小鼠随机分为5组，每组10只。

于接种次日给药，低、中、高剂量药物组分别给予2、4、8mg/ml浓度的龙葵精制多糖溶液，阳性对照组给予环磷酰胺2mg/ml，阴性对照组给予生理盐水，给药量均为0.2ml/只，每日给药1次，连续8-10天。常规饲养，饮水食物不限，每日观察小鼠的自主活动、大便和毛色及瘤体大小等情况。

停药次日断椎处死，称小鼠体重，解剖剥离皮下瘤体，观察瘤体形态及出血坏死情况，称瘤重，同时剖取胸腺和脾脏，称其重量，按下式计算抑瘤率及免疫器官指数。抑瘤率(％)＝(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重)/对照组平均瘤重×100％。脾脏(胸腺)指数＝脾脏(胸腺)重量(mg)/体重(g)。

表2龙葵精制多糖对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用

注：vs阴性对照组，**P＜0.01

表3龙葵精制多糖对H22荷瘤小鼠的免疫器官的作用

注：vs阳性对照组，*P＜0.05，**P＜0.01

结果显示：

龙葵多糖对H22荷瘤小鼠的生长有明显的抑制作用，且存在剂量效应关系，见图1。实验组在给药剂量30、60、120mg/kg时，平均抑瘤率分别为37.73％、38.24％、42.60％，见表2。龙葵多糖能提高H22荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，相比于阳性环磷酰胺组明显降低脾脏指数和胸腺指数，龙葵多糖对小鼠的毒副作用小，更加安全，见表3。

Claims

1.一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)龙葵粗多糖样品的制备：

(2)龙葵精制多糖的纯化：

2.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤(2)中用三氯乙酸溶液调节pH至2.5。

3.根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤(2)中活性炭的加入量为待处理液量的0.7％。