CN108047345A - 富集纯化龙葵多糖的方法及利用该方法得到的龙葵多糖 - Google Patents

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杨鑫骥
张洁
孙李丹
计燕萍
朱琦峰
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Abstract

本发明提供了一种富集纯化龙葵多糖的方法及利用该方法得到的龙葵多糖，涉及龙葵多糖的提取纯化领域，该富集纯化龙葵多糖的方法包括采用大孔树脂对龙葵粗多糖进行吸附处理和对吸附龙葵粗多糖后的大孔树脂进行解吸处理的步骤，利用该方法能够缓解利用现有技术的纯化工艺得到的龙葵多糖纯度低的问题，达到提高龙葵多糖的纯度的目的。

Description

富集纯化龙葵多糖的方法及利用该方法得到的龙葵多糖
技术领域
本发明涉及龙葵多糖的提取纯化技术领域，尤其是涉及一种富集纯化龙葵多糖的方法及利用该方法得到的龙葵多糖。
背景技术
龙葵为茄科茄属草本植物龙葵Solanum nigrum L.的干燥全草，有毒，性寒味苦微甘，具有清热解毒、活血化瘀、利水消肿等功效。龙葵的主要成分有生物碱、多糖、皂苷等，现代研究报道龙葵多糖具有抗肿瘤、免疫调节、保护肝脏等作用，但是一般多糖的纯化比较困难，而且纯化方法较复杂，而且利用目前的制备方法得到的龙葵多糖的纯度较低，一般在40％左右。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种富集纯化龙葵多糖的方法，以缓解利用现有技术的纯化工艺得到的龙葵多糖纯度低的问题。
本发明的第二目的在于提供一种利用上述方法得到的龙葵多糖，该龙葵多糖具有纯度较高的优点。
为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：
一种富集纯化龙葵多糖的方法，包括采用大孔树脂对龙葵粗多糖进行吸附处理和对吸附龙葵粗多糖后的大孔树脂进行解吸处理的步骤。
进一步的，将龙葵粗多糖配置成上样液，然后用装柱后的大孔树脂对所述上样液进行吸附处理，吸附处理完成后采用洗脱的方法对所述大孔树脂进行解吸处理，对洗脱后得到的洗脱液进行干燥处理得到纯化后的龙葵多糖。
进一步的，所述上样液的配置方法包括以下步骤：将龙葵粗多糖溶于水中得到所述上样液；
优选地，在超条件下将龙葵粗多糖溶于水中得到所述上样液；
优选地，所述上样液的浓度为0.5～15mg/ml，优选为2.5～ 10mg/ml。
进一步的，采用湿法装柱得到装柱后的大孔树脂；
优选地，湿法装柱的过程包括：大孔树脂经清洗和浸泡发生膨胀后进行装柱，然后对装柱后的大孔树脂进行洗脱处理至无杂质，得到装柱后的大孔树脂；
优选地，所述清洗包括用蒸馏水对大孔树脂浸洗2～4次；
优选地，所述浸泡包括用乙醇溶液进行浸泡；
优选地，所述乙醇溶液的体积浓度为90％～97％，浸泡时间为 22～26h；
优选地，对装柱后的大孔树脂进行洗脱处理的过程包括：先用乙醇进行第一次洗脱处理至洗脱液中无有机物杂质后再用酸溶液进行第二次洗脱处理，之后用蒸馏水冲洗至中性；然后再用碱溶液进行第三次洗脱处理，之后用蒸馏水冲洗至中性；
优选地，所述酸溶液包括盐酸溶液；
优选地，所述盐酸溶液的质量浓度3％～7％；
优选地，所述碱溶液包括NaOH溶液；
优选地，所述NaOH溶液的质量浓度为3％～7％。
进一步的，所述吸附处理包括使龙葵粗多糖的上样液流经装柱后的大孔树脂的步骤；
优选地，先调节上样液至中性再使上样液流经装柱后的大孔树脂；
优选地，上样液的上样量≤10倍柱体积，优选为3～10倍柱体积，上样液的上柱流速为≤0.5ml/min，优选为0.1～0.5ml/min；
优选地，吸附处理过程中的温度为25～35℃。
进一步的，所述解吸处理包括用洗脱剂对吸附龙葵粗多糖后的大孔树脂进行洗脱的步骤；
优选地，所述洗脱剂包括水、乙醇或NaCl溶液，优选为NaCl 溶液；
优选地，所述NaCl溶液的浓度为0.3～3mol/L，优选为0.5～ 2mol/L；；
优选地，所述洗脱剂的用量为1～4倍柱体积，流速为3～ 5ml/min。
进一步的，先对洗脱液进行浓缩再进行干燥处理；
优选地，所述浓缩的方法包括蒸发浓缩；
优选地，所述干燥的方法包括浸膏真空干燥或冷冻干燥。
进一步的，所述龙葵粗多糖的制备方法包括以下步骤：以龙葵为原料，用热水提取法、微波提取法、超声提取法或闪式提取法提取得到；
优选地，所述原料包括龙葵全草、龙葵饮片、龙葵根、龙葵茎、龙葵叶或龙葵果实中的任一种或至少两种的组合；
优选地，所述龙葵粗多糖的制备方法包括以下步骤：将龙葵原料粉碎和脱脂后加水进行闪式提取得到提取液，提取液经分离浓缩和干燥后得到所述龙葵粗多糖；
优选地，粉碎前包括干燥的步骤；
优选地，所述干燥温度为40～60℃；
优选地，龙葵原料粉碎后的目数为30～50目；
优选地，优选地，所述脱脂包括用有机溶剂进行回流处理；
优选地，所述有机溶剂包括石油醚、乙醚、丙酮、氯仿、甲醇、乙酸乙酯或异丙醇；
优选地，用石油醚在48～52℃条件下进行回流处理2h；
优选地，石油醚的重量为龙葵原料重量的3～5倍；
优选地，龙葵粗多糖的制备方法包括2～4次脱脂处理；
优选地，加水进行闪式提取时的加水量为脱脂后龙葵粉料重量的 28～32倍；
优选地，闪式提取的电压为75～85V，提取时间为1～3min；
优选地，龙葵粗多糖的制备方法包括2～4次闪式提取的过程；
优选地，所述分离浓缩和干燥的过程包括：提取液经过滤、浓缩和离心处理后取上清液，向上清液中加乙醇静置沉淀，沉淀物经洗涤和干燥后得到所述龙葵粗多糖；
优选地，向上清液中加乙醇至乙醇的含量为75wt％～85wt％，优选为79wt％～81wt％；
优选地，所述静置沉淀的温度为3～8℃，优选为4～5℃；
优选地，所述沉淀物依次用乙醇和乙醚进行洗涤；
优选地，所述干燥温度为55～65℃。
进一步的，所述大孔树脂的型号包括DM301、S-8、NKA-9、 HPD-500、AB-8、CAD-40、HPD722、HPD-450、D101、X-5、HPD100、HPD300、ADS-8、D4020、D3520、D4006、DA201、H103、D141或XDA-5中的任一种或至少两种的组合；
优选地，所述大孔树脂的型号包括S-8、HPD-450或D3520，优选为S-8。
一种根据上述富集纯化龙葵多糖的方法制备得到的龙葵多糖。
与已有技术相比，本发明具有如下有益效果：
大孔树脂是新型有机高聚物吸附剂，具有大孔结构但不含交换基团，通过物理吸附作用选择性吸附有机物质。因此，利用大孔树脂可以有效提高对龙葵多糖的纯化。
本发明中，通过利用大孔树脂对龙葵粗多糖进行纯化处理，得到的龙葵多糖含量明显提高，纯度可由目前的45.75％提高至91.00％，富集纯度提高了将近2倍。同时，本发明提供的方法具有工艺简单，成本低，易操作，效率高和经济环保的优点。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明S-8型、D3520型和HPD-450型大孔树脂的静态吸附动力学曲线图；
图2为本发明S-8型大孔树脂在不同上样液浓度下的静态吸附率曲线图；
图3为本发明S-8型大孔树脂在不同液固比下的静态吸附率曲线图；
图4本发明S-8型大孔树脂在上样液不同pH值下的静态吸附率曲线图；
图5本发明S-8型大孔树脂在不同吸附温度下的静态吸附率曲线图；
图6本发明S-8型大孔树脂在上样液不同种类的洗脱剂下的静态解吸率曲线图；
图7本发明S-8型大孔树脂在不同上样流速下的动态吸附率曲线图；
图8本发明S-8型大孔树脂在不同上样液加入量下吸附后的多糖含量变化曲线图；
图9本发明S-8型大孔树脂在不同洗脱流速下的动态解吸率曲线图；
图10本发明S-8型大孔树脂在不同洗脱剂用量下的动态解吸率曲线图。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
本发明的一个方面提供了一种富集纯化龙葵多糖的方法，包括采用大孔树脂对龙葵粗多糖进行吸附处理和对吸附龙葵粗多糖后的大孔树脂进行解吸处理的步骤。
大孔树脂是新型有机高聚物吸附剂，具有大孔结构但不含交换基团，通过物理吸附作用选择性吸附有机物质。因此，利用大孔树脂可以有效提高对龙葵多糖的纯化。
本发明中，通过利用大孔树脂对龙葵粗多糖进行纯化处理，得到的龙葵多糖含量明显提高，纯度可由目前的45.75％提高至91.00％，富集纯度提高了将近2倍。同时，本发明提供的方法具有工艺简单，成本低，易操作，效率高和经济环保的优点。
作为本发明优选的实施方式，将龙葵粗多糖配置成上样液，然后用装柱后的大孔树脂对所述上样液进行吸附处理，吸附处理完成后采用洗脱的方法对所述大孔树脂进行解吸处理，对洗脱后得到的洗脱液进行干燥处理得到纯化后的龙葵多糖。
作为本发明优选的实施方式，所述上样液的配置方法包括以下步骤：将龙葵粗多糖溶于水中得到所述上样液；可选地，在超条件下将龙葵粗多糖溶于水中得到所述上样液；可选地，所述上样液的浓度为 0.5～15mg/ml，优选为2.5～10mg/ml。通过优化上样液的溶解调节，可以使龙葵粗多糖可充分地溶解于水中，便于后续的吸附过程。
在上述优选实施方式中，上样液的浓度典型但非限制性的例如可以为0.5mg/ml、1mg/ml、2mg/ml、3mg/ml、4mg/ml、5mg/ml、7mg/ml、 9mg/ml、10mg/ml、13mg/ml或15mg/ml。
作为本发明优选的实施方式，采用湿法装柱得到装柱后的大孔树脂；可选地，湿法装柱的过程包括：大孔树脂经清洗和浸泡发生膨胀后进行装柱，然后对装柱后的大孔树脂进行洗脱处理至无杂质，得到装柱后的大孔树脂。清洗以去除大孔树脂中的杂质，避免向龙葵多糖中引入杂质，降低纯度。浸泡使大孔树脂充分膨胀，避免吸附过程中变形，影响操作。
作为本发明优选的实施方式，所述清洗包括用蒸馏水对大孔树脂浸洗2～4次；可选地，所述浸泡包括用乙醇溶液进行浸泡；优选地，所述乙醇溶液的体积浓度为90％～97％，优选为95％，浸泡时间为 22～26h，优选为24h。用蒸馏水反复清洗以进一步提高大孔树脂的洁净度。
作为本发明优选的实施方式，对装柱后的大孔树脂进行洗脱处理的过程包括：先用乙醇进行第一次洗脱处理至洗脱液中无有机物杂质后再用酸溶液进行第二次洗脱处理，之后用蒸馏水冲洗至中性；然后再用碱溶液进行第三次洗脱处理，之后用蒸馏水冲洗至中性；可选地，所述酸溶液包括盐酸溶液；优选地，所述盐酸溶液的质量浓度3％～ 7％，优选为5％；可选地，所述碱溶液包括NaOH溶液；优选地，所述NaOH溶液的质量浓度为3％～7％，优选为5％。通过优化装柱后的大孔树脂的洗脱工艺，可以进一步提高大孔树脂的洁净度，从而提高大孔树脂的吸附能力，提高得到的龙葵多糖的纯度。
作为本发明优选的实施方式，所述吸附处理包括使龙葵粗多糖的上样液流经装柱后的大孔树脂的步骤；可选地，先调节上样液至中性再使上样液流经装柱后的大孔树脂；可选地，上样液的上样量≤10 倍柱体积，优选为3～10倍柱体积，上样液的上柱流速为≤0.5ml/min，优选为0.1～0.5ml/min；可选地，吸附处理过程中的温度为 25～35℃，优选为30℃。通过优化吸附处理过程中的工艺参数，可以使大孔树脂充分富集吸附上样液中的龙葵多糖，进而提高大孔树脂的吸附量，提高处理效率。
作为本发明优选的实施方式，所述解吸处理包括用洗脱剂对吸附龙葵粗多糖后的大孔树脂进行洗脱的步骤；可选地，所述洗脱剂包括水、乙醇或NaCl溶液，优选为NaCl溶液；优选地，所述NaCl溶液的浓度为0.3～3mol/L，优选为0.5～2mol/L；优选地，所述洗脱剂的用量为1～4倍柱体积，流速为3～5ml/min，优选为4ml/min。通过优化优化解吸处理工艺，可以提高大孔树脂的解吸量，提高龙葵多糖的提取率。
作为本发明优选的实施方式，先对洗脱液进行浓缩再进行干燥处理；可选地，所述浓缩的方法包括蒸发浓缩；可选地，所述干燥的方法包括浸膏真空干燥或冷冻干燥。通过蒸发浓缩提高生产效率。
作为本发明优选的实施方式，所述龙葵粗多糖的制备方法包括以下步骤：以龙葵为原料，用热水提取法、微波提取法、超声提取法或闪式提取法提取得到；优选地，所述原料包括龙葵全草、龙葵饮片、龙葵根、龙葵茎、龙葵叶或龙葵果实中的任一种或至少两种的组合；优选地，所述龙葵粗多糖的制备方法包括以下步骤：将龙葵原料粉碎和脱脂后加水进行闪式提取得到提取液，提取液经分离浓缩和干燥后得到所述龙葵粗多糖；优选地，粉碎前包括干燥的步骤；优选地，所述干燥温度为40～60℃；优选地，龙葵原料粉碎后的目数为30～50 目；优选地，所述脱脂包括用有机溶剂进行回流处理；优选地，所述有机溶剂包括石油醚、乙醚、丙酮、氯仿、甲醇、乙酸乙酯或异丙醇；优选地，用石油醚在48～52℃条件下进行回流处理2h；优选地，石油醚的重量为龙葵原料重量的3～5倍；优选地，龙葵粗多糖的制备方法包括2～4次脱脂处理；优选地，加水进行闪式提取时的加水量为脱脂后龙葵粉料重量的28～32倍；优选地，闪式提取的电压为75～ 85V，优选为80V，提取时间为1～3min，优选为2min；优选地，龙葵粗多糖的制备方法包括2～4次闪式提取的过程。
利用上述优选的实施方式，可以以龙葵全草、龙葵饮片、龙葵根、龙葵茎、龙葵叶或龙葵果实为原料制备龙葵粗多糖，进而提高了龙葵的利用率。通过优化龙葵粗多糖提取过程中的各项工艺参数，可以进一步提高龙葵粗多糖中的含糖量。
作为本发明优选的实施方式，所述分离浓缩和干燥的过程包括：提取液经过滤、浓缩和离心处理后取上清液，向上清液中加乙醇静置沉淀，沉淀物经洗涤和干燥后得到所述龙葵粗多糖；优选地，向上清液中加乙醇至乙醇的含量为75wt％～85wt％，优选为79wt％～81wt％，进一步优选为80wt％；优选地，所述静置沉淀的温度为3～ 8℃，优选为4～5℃；优选地，所述沉淀物依次用乙醇和乙醚进行洗涤；优选地，所述干燥温度为55～65℃。通过优化分离浓缩和干燥过程中的各项工艺参数，可以进一步提高龙葵粗多糖中的含糖量。
作为本发明优选的实施方式，所述大孔树脂的型号包括DM301、 S-8、NKA-9、HPD-500、AB-8、CAD-40、HPD722、HPD-450、D101、 X-5、HPD100、HPD300、ADS-8、D4020、D3520、D4006、DA201、 H103、D141或XDA-5中的任一种或至少两种的组合；优选地，所述大孔树脂的型号包括S-8、HPD-450或D3520，优选为S-8。
在运用大孔树脂分离纯化龙葵多糖时，大孔树脂的极性和所含官能团对化合物吸附能力有很大的影响。因此对于中药活性成分的纯化，选择恰当的树脂型号非常重要。
本研究通过静态吸附实验和解吸附实验，通过对上述型号的大孔树脂对龙葵多糖进行静态和动态的吸附及解吸附试验，获得一条龙葵多糖提取纯化工艺路线。
本发明优选实施方式为龙葵多糖的结构测定和构效关系研究提供了原料，对龙葵多糖的利用和新药开发有重要意义。
本发明的另一个方面提供了一种根据上述富集纯化龙葵多糖的方法制备得到的龙葵多糖。
下面将结合实施例和对比例对本发明做进一步详细的说明。
实施例1
本实施例是一种富集纯化龙葵多糖的方法，包括以下步骤：
步骤a)龙葵粗多糖的提取：称取龙葵饮片，50℃干燥，粉碎过 40目筛，加入龙葵原料重量4倍量的石油醚，50℃回流脱脂2h；共进行2次回流脱脂后弃液留渣，药渣晾干，置于闪式提取器中并加入药渣重量30倍的水进行闪式提取中，提取电压为80V，提取2min；进行2次闪式提取后合并提取液，滤过，减压浓缩至1/2的药材量，离心处理取上清液，在上清液中加入乙醇至含醇量为80％，4℃冷藏静置沉淀过夜，减压抽滤后对沉淀物依次用无水乙醇和乙醚洗涤各洗涤1次，60℃真空干燥，得龙葵粗多糖；
步骤b)大孔树脂装柱及处理：将大孔树脂置于烧杯中，用蒸馏水浸洗2次，去除细小和破碎的树脂粉末，然后采取95％浓度的乙醇浸泡24h，待其充分膨胀后，湿法装柱；之后用乙醇洗脱至洗出液与等体积水混合不产生白色浑浊且在200-400nm范围扫描紫外光谱，无明显吸收峰后，再用5％HCl溶液洗脱，蒸馏水冲洗至中性，再用 5％NaOH溶液洗脱，蒸馏水冲洗至中性，备用；
步骤c)配置龙葵粗多糖上样液：称取龙葵粗多糖，加水在超声条件下溶解，配制成浓度为5mg/ml的龙葵粗多糖上样液，备用；
步骤d)利用S-8型大孔树脂对龙葵多糖进行吸附纯化处理：将龙葵粗多糖上样液用稀盐酸或NaOH调节pH至7.0，上样量为10倍柱体积，上柱流速0.5ml/min，在30℃温度下进行吸附纯化处理；
步骤e)解吸处理：上样完成后，采用0.5mol/L的NaCl作为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂的用量为5倍柱体积，洗脱流速为4ml/min；
步骤f)干燥处理：收集步骤e)中流出的洗脱液，将洗脱液旋转蒸发浓缩后浸膏真空干燥至恒重，即得目标产物龙葵多糖。
实施例2
本实施例是一种富集纯化龙葵多糖的方法，包括以下步骤：
步骤a)龙葵粗多糖的提取：称取龙葵饮片，50℃干燥，粉碎过 40目筛，加入龙葵原料重量4倍量的石油醚，50℃回流脱脂2h；共进行2次回流脱脂后弃液留渣，药渣晾干，置于闪式提取器中并加入药渣重量30倍的水进行闪式提取中，提取电压为80V，提取2min；进行2次闪式提取后合并提取液，滤过，减压浓缩至1/2的药材量，离心处理取上清液，在上清液中加入乙醇至含醇量为80％，4℃冷藏静置沉淀过夜，减压抽滤后对沉淀物依次用无水乙醇和乙醚洗涤各洗涤1次，60℃真空干燥，得龙葵粗多糖；
步骤b)大孔树脂装柱及处理：将大孔树脂置于烧杯中，用蒸馏水浸洗2次，去除细小和破碎的树脂粉末，然后采取95％浓度的乙醇浸泡24h，待其充分膨胀后，湿法装柱；之后用乙醇洗脱至洗出液与等体积水混合不产生白色浑浊且在200-400nm范围扫描紫外光谱，无明显吸收峰后，再用5％HCl溶液洗脱，蒸馏水冲洗至中性，再用 5％NaOH溶液洗脱，蒸馏水冲洗至中性，备用；
步骤c)配置龙葵粗多糖上样液：称取龙葵粗多糖，加水在超声条件下溶解，配制成浓度为5mg/ml的龙葵粗多糖上样液，备用；
步骤d)利用S-8型大孔树脂对龙葵多糖进行吸附纯化处理：将龙葵粗多糖上样液用稀盐酸或NaOH调节pH至7.0，上样量为7倍柱体积，上柱流速0.4ml/min，在28℃温度下进行吸附纯化处理；
步骤e)解吸处理：上样完成后，采用0.6mol/L的NaCl作为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂的用量为4倍柱体积，洗脱流速为5ml/min；
步骤f)干燥处理：收集步骤e)中流出的洗脱液，将洗脱液旋转蒸发浓缩后浸膏真空干燥至恒重，即得目标产物龙葵多糖。
实施例3
本实施例是一种富集纯化龙葵多糖的方法，包括以下步骤：
步骤a)龙葵粗多糖的提取：称取龙葵饮片，50℃干燥，粉碎过 40目筛，加入龙葵原料重量4倍量的石油醚，50℃回流脱脂2h；共进行2次回流脱脂后弃液留渣，药渣晾干，置于闪式提取器中并加入药渣重量30倍的水进行闪式提取中，提取电压为80V，提取2min；进行2次闪式提取后合并提取液，滤过，减压浓缩至1/2的药材量，离心处理取上清液，在上清液中加入乙醇至含醇量为80％，4℃冷藏静置沉淀过夜，减压抽滤后对沉淀物依次用无水乙醇和乙醚洗涤各洗涤1次，60℃真空干燥，得龙葵粗多糖；
步骤b)大孔树脂装柱及处理：将大孔树脂置于烧杯中，用蒸馏水浸洗2次，去除细小和破碎的树脂粉末，然后采取95％浓度的乙醇浸泡24h，待其充分膨胀后，湿法装柱；之后用乙醇洗脱至洗出液与等体积水混合不产生白色浑浊且在200-400nm范围扫描紫外光谱，无明显吸收峰后，再用5％HCl溶液洗脱，蒸馏水冲洗至中性，再用 5％NaOH溶液洗脱，蒸馏水冲洗至中性，备用；
步骤c)配置龙葵粗多糖上样液：称取龙葵粗多糖，加水在超声条件下溶解，配制成浓度为5mg/ml的龙葵粗多糖上样液，备用；
步骤d)利用S-8型大孔树脂对龙葵多糖进行吸附纯化处理：将龙葵粗多糖上样液用稀盐酸或NaOH调节pH至7.0，上样量为5倍柱体积，上柱流速0.6ml/min，在32℃温度下进行吸附纯化处理；
步骤e)解吸处理：上样完成后，采用0.4mol/L的NaCl作为洗脱剂进行洗脱，洗脱剂的用量为6倍柱体积，洗脱流速为3ml/min；
步骤f)干燥处理：收集步骤e)中流出的洗脱液，将洗脱液旋转蒸发浓缩后浸膏真空干燥至恒重，即得目标产物龙葵多糖。
实施例4-22分别提供了一种富集纯化龙葵多糖的方法，其与实施例1的不同之处在于，实施例4-22中的大孔树脂的型号分别为： DM301、NKA-9、HPD-500、AB-8、CAD-40、HPD722、HPD-450、D101、X-5、HPD100、HPD300、ADS-8、D4020、D3520、D4006、 DA201、H103、D141和XDA-5，其余工艺条件和步骤均与实施例1 相同。
说明：实施例1-22中所用的龙葵饮片购自浙江嘉信医药有限公司，经鉴定符合中国药典(批号20150720)；大孔树脂为沧州宝恩化工有限公司生产的产品；苯酚、氢氧化钠、盐酸、硫酸、乙醚、无水乙醇等常规试剂，均为国产分析纯；称量所用称为北京赛多利斯生产的BS224S型电子分析天平；闪式提取器为河南金鼐科技生产的 JHBE-50T型闪式提取器；旋转蒸发仪为德国IKA公司生产的 RV10-V型旋转蒸发仪。
下面将结合静态吸附与解吸附试验和动态吸附与解吸附试验对本发明做进一步详细地说明。
在进行试验前先建立用于测量龙葵多糖含量的标准曲线，建立的方法如下：
步骤a)标准品溶液的配制：精密称取105℃干燥至恒重的无水葡萄糖标准品适量，加水溶解，置于500ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，得浓度为0.1mg/ml的葡萄糖对照品溶液；
步骤b)标准曲线的制备：精密量取葡萄糖对照品溶液0.1ml、0.2ml、0.3ml、0.4ml、0.5ml、0.6ml、0.7ml、0.8ml、0.9ml和1.0 ml，分别置于10ml容量瓶，各加水至2.0ml，加入6％苯酚溶液1.0ml 摇匀，加浓硫酸5.0ml摇匀，置于沸水浴加热15min，冷却至室温，用水作空白对照，用紫外分光光度计在490nm处测定吸光度，以葡萄糖质量浓度C为横坐标，吸光度A为纵坐标，绘制回归曲线，计算得回归方程为A＝17.42C+0.019(R2＝0.993)。结果表明葡萄糖浓度在0.005～0.05mg/ml范围内线性关系良好。
其中，无水葡萄糖标准品购自中国医药上海化学试剂公司；紫外分光光度计为济南海能公司生产的I3型紫外可见分光光度计。
实验一：静态吸附与解吸附试验
静态吸附与解吸附试验的过程如下：分别将实施例1-22中的龙葵粗多糖上样液置于锥形瓶中，分别加入各实施例中对应的大孔树脂，然后置于25℃的恒温水浴振荡器中，120r/min振荡吸附24h后，抽滤取上清液测定吸光度，根据回归方程计算多糖含量，并按照下式计算吸附率与解吸率，结果列于表1。
Q(mg/g)＝(C0－C1)×V1/m
E(％)＝(C0－C1)/C0×100％
Z(mg/g)＝C2×V2/m
D(％)＝Z×100％/Q
上式中：Q表示吸附量，即1g大孔树脂吸附多糖的质量(mg)； E表示吸附率，即树脂吸附样品的百分率(％)；Z表示解吸量，即 1g大孔吸附树脂解吸的多糖质量(mg)；D表示解吸率，即树脂解吸样品的百分率(％)；C0表示吸附前多糖溶液质量浓度(mg/ml)；C1表示吸附后多糖溶液质量浓度(mg/ml)；V1表示加入的多糖溶液体积(ml)；m表示大孔树脂质量(g)；C2表示解吸后洗脱液中多糖质量浓度(mg/ml)；V2表示加入的洗脱液体积(ml)。
其中，恒温水浴振荡器购自上海博迅公司的SHZ-B型水浴恒温振荡器。
实验二：动态吸附与解吸附试验
分别收集实施例1-22步骤d)中经吸附纯化处理后流出的流出液，测定多糖含量，计算吸附率；再进行解吸处理，收集步骤e)中的洗脱液，测定多糖含量和洗脱液体积，计算解吸附率；将洗脱液旋转蒸发至浸膏，冷冻干燥至恒重，称定干燥物质量；计算纯化后多糖的含量，按下式计算经过纯化后龙葵多糖的富集倍数；平行试验重复 3次，最后取平均值，结果列于表1。
X1(％)＝(V1×C0)×100％/m1
X2(％)＝(V2×C2)×100％/m2
Y(％)＝X2×100％/X1
上式中：X1表示纯化前粗多糖纯度(％)；X2表示纯化后精多糖纯度(％)；C0表示纯化前多糖溶液质量浓度(mg/ml)；V1表示上样液体积(ml)；C2表示纯化后洗脱液中多糖质量浓度(mg/ml)；V2表示洗脱液体积(ml)。m1表示粗多糖质量(g)；m2表示精多糖质量 (g)。
表1实施例1-22的静态和动态吸附与解吸附试验结果
从表中的数据可以看出，利用S-8型大孔树脂富集纯化的吸附率和解吸率最高，其次是D3520和HPD-450，因此，本发明中可以优选采用S-8型大孔树脂、D3520型大孔树脂或HPD-450型大孔树脂对龙葵多糖进行富集纯化处理。
实验三：S-8型、D3520型和HPD-450型大孔树脂的静态吸附动力学曲线
分别用实施例2、实施例10和实施例17中的龙葵粗多糖上样液置于锥形瓶中，分别加入各实施例中对应的大孔树脂，即S-8型、 D3520型和HPD-450型大孔树脂，然后再置于恒温水浴振荡器中， 120r/min振荡吸附一定时间，该振荡吸附时间分为0h、0.5h、1h、1.5h、2h、2.5h、3h、3.5h、4h、4.5h和5h，每种型号大孔树脂均分别进行以上时间的振荡吸附，吸附完成后抽滤取上清液测定吸光度，根据回归方程计算多糖含量，并按照实验一中的公式计算吸附率。其中，图 1示出了S-8型、D3520型和HPD-450型大孔树脂随吸附时间的变化关系。从图1可以看出，随着吸附时间的延长，静态吸附率逐渐提高，当吸附时间超过2h后静态吸附率的提高速度逐渐平缓。
实验四：S-8型大孔树脂在不同上样液浓度、不同液固比、上样液不同pH值和不同吸附温度下的静态吸附率以及在不同种类的洗脱剂下的解吸率
采用试验一中的静态测试方法分别测试S-8型大孔树脂在不同上样液浓度、不同液固比(上样液体积与S-8型大孔树脂的质量之比)、上样液不同pH值和不同吸附温度下的静态吸附率，其中，除需要测试的变量不同外，其他与实验一中的条件相同，结果如图2-5所示；采用试验一中的静态测试方法测试S-8型大孔树脂在不同种类的洗脱剂下的解吸率，其中，除需要测试的变量不同外，其他与实验一中的条件相同，结果如图6所示。
从图2中可以看出，随着上样液质量浓度的增加，S-8型大孔树脂对多糖的静态吸附率逐渐升高，当上样液质量浓度为5mg/ml时， S-8型大孔树脂对多糖的静态吸附率达到最高值，随后随着上样液质量浓度的增加呈下降趋势。
从图3中可以看出，液固比在(10～40)：1的范围内变化时，随着液固比的增加，S-8型大孔树脂对多糖的静态吸附率逐渐降低，证明液固比的最佳配比不能不能超过10：1。
从图4中可以看出，上样液pH值在4～9之间变化时，S-8型大孔树脂对多糖的静态吸附率有一定的波动，但是变化不是很明显，当 pH值为7时，静态吸附率有最高值。
从图5中可以看出，当静态吸附温度在25～45℃之间变化时，静态吸附率在30℃处有最高值，因此，超过30℃，静态吸附率逐渐降低。
从图6中可以看出，分别采用水、不同浓度的乙醇和不同浓度的 NaCl溶液对S-8型大孔树脂进行解吸时，NaCl溶液的解吸效果整体上要高于乙醇和水，乙醇的解吸效果要好于水。当NaCl溶液的浓度为0.5mol/L时解吸效果最优。
实验五：S-8型大孔树脂在不同上样流速下的动态吸附率，在不同上样液加入量下吸附后的多糖含量，以及在不同洗脱流速和不同洗脱剂用量下的动态解吸率
分别收集实施例1-22步骤d)中经吸附纯化处理后流出的流出液，测定多糖含量，计算吸附率；再进行解吸处理，收集步骤e)中的洗脱液，测定多糖含量和洗脱液体积，计算解吸附率；
采用试验二中的动态测试方法分别测试S-8型大孔树脂在不同上样流速下的动态吸附率，其他参数条件与实施例2中的相同，结果如图7所示；采用试验二中的动态测试方法收集在不同上样液加入量的情况下经吸附纯化处理后流出的流出液，测定多糖含量(即吸附后的流出液中的多糖质量浓度)，其他参数条件与实施例2中的相同，结果如图8所示；采用试验二中的动态测试方法在不同洗脱流速和不同洗脱剂用量下的动态解吸率，其他参数条件与实施例2中的相同，结果如图9和图10所示。
从图7中可以看出，上样流速在0.5～4ml/min的范围内变化时，随着，随着上样流速的提高，S-8型大孔树脂在不同上样流速下的动态吸附率逐渐降低。
从图8中可以看出，随着上样液加入量的增加，经吸附处理后的流出液中的多糖含量逐渐上升。当上样液体积较低时，流出液多糖浓度较低，并随着上样液体积的增大而缓慢增加。当上样液大于10BV 时，流出液中多糖浓度开始迅速增加，此时S-8树脂对多糖的吸附量趋近于饱和。因此最大上样液体积为10BV。
从图9中可以看出，当洗脱流速在0.5～4ml/min的范围内变化时，当洗脱流速在3ml/min以内变化时，解吸率变化不大，但是当洗脱流速为4ml/min时，解吸率出现较大幅度的提升。
从图10中可以看出，当洗脱剂用量超过4倍的柱体积达到5倍的柱体积时，解吸率逐渐接近于0，从图10可以看出，洗脱剂的最佳用量为1～4倍的柱体积。当洗脱剂用量为2BV时，多糖解吸率达到最大值，但是当洗脱剂用量继续增加至3BV和4BV时，还是有多糖会被洗脱出来，只有当洗脱剂用量大于4BV后，多糖才会被彻底的洗脱干净。
尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种富集纯化龙葵多糖的方法，其特征在于，包括采用大孔树脂对龙葵粗多糖进行吸附处理和对吸附龙葵粗多糖后的大孔树脂进行解吸处理的步骤。
2.根据权利要求1所述的富集纯化龙葵多糖的方法，其特征在于，将龙葵粗多糖配置成上样液，然后用装柱后的大孔树脂对所述上样液进行吸附处理，吸附处理完成后采用洗脱的方法对所述大孔树脂进行解吸处理，对洗脱后得到的洗脱液进行干燥处理得到纯化后的龙葵多糖。
3.根据权利要求2所述的富集纯化龙葵多糖的方法，其特征在于，所述上样液的配置方法包括以下步骤：将龙葵粗多糖溶于水中得到所述上样液；
优选地，在超条件下将龙葵粗多糖溶于水中得到所述上样液；
优选地，所述上样液的浓度为0.5～15mg/ml，优选为2.5～10mg/ml。
4.根据权利要求2所述的富集纯化龙葵多糖的方法，其特征在于，采用湿法装柱得到装柱后的大孔树脂；
优选地，湿法装柱的过程包括：大孔树脂经清洗和浸泡发生膨胀后进行装柱，然后对装柱后的大孔树脂进行洗脱处理至无杂质，得到装柱后的大孔树脂；
优选地，所述清洗包括用蒸馏水对大孔树脂浸洗2～4次；
优选地，所述浸泡包括用乙醇溶液进行浸泡；
优选地，所述乙醇溶液的体积浓度为90％～97％，浸泡时间为22～26h；
优选地，对装柱后的大孔树脂进行洗脱处理的过程包括：先用乙醇进行第一次洗脱处理至洗脱液中无有机物杂质后再用酸溶液进行第二次洗脱处理，之后用蒸馏水冲洗至中性；然后再用碱溶液进行第三次洗脱处理，之后用蒸馏水冲洗至中性；
优选地，所述酸溶液包括盐酸溶液；
优选地，所述盐酸溶液的质量浓度3％～7％；
优选地，所述碱溶液包括NaOH溶液；
优选地，所述NaOH溶液的质量浓度为3％～7％。
5.根据权利要求1-4任一项所述的富集纯化龙葵多糖的方法，其特征在于，所述吸附处理包括使龙葵粗多糖的上样液流经装柱后的大孔树脂的步骤；
优选地，先调节上样液至中性再使上样液流经装柱后的大孔树脂；
优选地，上样液的上样量≤10倍柱体积，优选为3～10倍柱体积，上样液的上柱流速为≤0.5ml/min，优选为0.1～0.5ml/min；
优选地，吸附处理过程中的温度为25～35℃。
6.根据权利要求1-4任一项所述的富集纯化龙葵多糖的方法，其特征在于，所述解吸处理包括用洗脱剂对吸附龙葵粗多糖后的大孔树脂进行洗脱的步骤；
优选地，所述洗脱剂包括水、乙醇或NaCl溶液，优选为NaCl溶液；
优选地，所述NaCl溶液的浓度为0.3～3mol/L，优选为0.5～2mol/L；
优选地，所述洗脱剂的用量为1～4倍柱体积，流速为3～5ml/min。
7.根据权利要求2-4任一项所述的富集纯化龙葵多糖的方法，其特征在于，先对洗脱液进行浓缩再进行干燥处理；
优选地，所述浓缩的方法包括蒸发浓缩；
优选地，所述干燥的方法包括浸膏真空干燥或冷冻干燥。
8.根据权利要求1-4任一项所述的富集纯化龙葵多糖的方法，其特征在于，所述龙葵粗多糖的制备方法包括以下步骤：以龙葵为原料，用热水提取法、微波提取法、超声提取法或闪式提取法提取得到；
优选地，所述原料包括龙葵全草、龙葵饮片、龙葵根、龙葵茎、龙葵叶或龙葵果实中的任一种或至少两种的组合；
优选地，所述龙葵粗多糖的制备方法包括以下步骤：将龙葵原料粉碎和脱脂后加水进行闪式提取得到提取液，提取液经分离浓缩和干燥后得到所述龙葵粗多糖；
优选地，粉碎前包括干燥的步骤；
优选地，所述干燥温度为40～60℃；
优选地，龙葵原料粉碎后的目数为30～50目；
优选地，所述脱脂包括用有机溶剂进行回流处理；
优选地，所述有机溶剂包括石油醚、乙醚、丙酮、氯仿、甲醇、乙酸乙酯或异丙醇；
优选地，用石油醚在48～52℃条件下进行回流处理2h；
优选地，石油醚的重量为龙葵原料重量的3～5倍；
优选地，龙葵粗多糖的制备方法包括2～4次脱脂处理；
优选地，加水进行闪式提取时的加水量为脱脂后龙葵粉料重量的28～32倍；
优选地，闪式提取的电压为75～85V，提取时间为1～3min；
优选地，龙葵粗多糖的制备方法包括2～4次闪式提取的过程；
优选地，所述分离浓缩和干燥的过程包括：提取液经过滤、浓缩和离心处理后取上清液，向上清液中加乙醇静置沉淀，沉淀物经洗涤和干燥后得到所述龙葵粗多糖；
优选地，向上清液中加乙醇至乙醇的含量为75wt％～85wt％，优选为79wt％～81wt％；
优选地，所述静置沉淀的温度为3～8℃，优选为4～5℃；
优选地，所述沉淀物依次用乙醇和乙醚进行洗涤；
优选地，所述干燥温度为55～65℃。
9.根据权利要求1-4任一项所述的富集纯化龙葵多糖的方法，其特征在于，所述大孔树脂的型号包括DM301、S-8、NKA-9、HPD-500、AB-8、CAD-40、HPD722、HPD-450、D101、X-5、HPD100、HPD300、ADS-8、D4020、D3520、D4006、DA201、H103、D141或XDA-5中的任一种或至少两种的组合；
优选地，所述大孔树脂的型号包括S-8、HPD-450或D3520，优选为S-8。
10.一种根据权利要求1-9任一项所述的富集纯化龙葵多糖的方法制备得到的龙葵多糖。
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