CN102558128B - 含银杏原花青素提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种银杏原花青素提取物，该提取物中原花青素含量为88.7～98.5%，总黄酮含量不超过10%，黄酮醇苷含量不超过5%。本发明还提供制备上述提取物的制备方法，其包括下列内容：采用乙醇水溶液提取、β-葡萄糖苷酶水解、大孔树脂吸附分离、聚酰胺树脂吸附分离等步骤得到的提取物。本发明提供的银杏原花青素提取物可作为用于预防或治疗心脑血管疾病、眼科疾病、抗氧化活性、美容抗衰老为目的的保健食品、药品或化妆品。

Description

含银杏原花青素提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及天然产物的提取方法和提取物，具体涉及从银杏中提取原花青素的方法以及利用该方法获得的银杏原花青素提取物及其应用。 

背景技术

原花青素因其高抗氧化活性而名满全球，各国的研究人员均非常重视原花青素的开发。目前通过已报道的文献所得，研究人员已经从多种植物中提取分离得到了含量较高的原花青素，如葡萄籽、可可、玫瑰花、松树皮、莲房、越橘果实及其叶子、茶籽壳、沙枣果肉、地榆根等。原花青素是一种由若干个儿茶素类化合物聚合而成，具有黄烷-3-醇结构的植物多酚类化合物，组成原花青素的单体化合物有5对，分别是儿茶素和表儿茶素（所组成的原花青素叫做Procyanidin），阿夫儿茶素和表阿夫儿茶素（所组成的原花青素叫做Propelargonidin），没食子儿茶素和表没食子儿茶素（所组成的原花青素叫做Prodelphinidin），非瑟酮醇和表非瑟酮醇（所组成的原花青素叫做Profisetinidin），洋槐儿茶素和表洋槐儿茶（所组成的原花青素叫做Prorobinetinidin）。不同植物中的原花青素，其单体组成及比例都是不同的。大部分植物原花青素以儿茶素和表儿茶素组成为主，研究最多的葡萄籽原花青素中，这两种单体组成的原花青素占到了9成以上。其组成原花青素的5对单体结构如下： 

组成原花青素的5对单体结构

经研究证实，原花青素具有广泛的药理学活性，包括抗氧化和自由基清除、抗菌和抗病毒、抗肿瘤、抗炎、抗辐射等。原花青素具有较好的心脑血管保护作用，包括脑组织保护、心脏保护、抗动脉硬化、抗血小板聚集、调节血脂等。此外，原花青素还具有眼保护、胃保护、肝脏保护、肾脏保护、抗糖尿病等作用，而这些保护作用的机制与原花青素的抗氧化活性密切相关。原花青素因具有上述活性，使其可用于眼科疾病、肝脏疾病、心脑血管疾病、糖尿病、皮肤病等的治疗，癌症的辅助治疗及美容的功效。

银杏被誉为植物界的“活化石”，银杏叶及其提取物中也存在着含量丰富的原花青素，在提取物中，原花青素的含量可达7%。德国的F. Qa'dan团队通过对银杏叶原花青素组成的研究发现，银杏原花青素的组成与葡萄籽原花青素的组成区别极大：银杏原花青素由没食子儿茶素和表没食子儿茶素组成的Prodelphinidin，比例高达85%；而由儿茶素和表儿茶素组成的Procyanidin，比例仅15%。没食子儿茶素和表没食子儿茶素的结构与儿茶素和表儿茶素的区别是在B环5’位上多出一个羟基，因此这两类化合物在本身性质和生物活性上也存在着一定的区别。从结构看，Prodelphinidin的活性应该比Procyanidin更好。

但目前还未有较好的技术来提取分离银杏原花青素，原因是银杏叶提取物主要有效成分——黄酮类成分，其不但含量高，达44%以上，为原花青素的5倍，而且其结构、极性与原花青素非常相似，使得分离起来具有相当的难度。尤其是银杏黄酮醇苷，其与活性最高的二聚体、三聚体原花青素的结构、分子量、极性均非常相似。因此，找到一种银杏原花青素的分离纯化技术，尤其是分离高活性的低聚体，对于银杏产业的进一步发展意义重大。

发明内容

本发明的目的是提供了从银杏叶中提取富含原花青素的高纯度银杏原花青素提取物的制备方法，该方法可以有效的将银杏原花青素和银杏黄酮分离开来，以获得高纯度的银杏原花青素提取物产品。 

为实现上述发明目的，本发明以银杏叶为原料，经粉碎后，采用溶剂提取—β-葡萄糖苷酶水解—大孔树脂分离—聚酰胺树脂分离的方法，具体制备方法包括如下步骤：

1）银杏叶粉碎后用乙醇水溶液回流提取，获得提取液，并回收提取液中的乙醇至提取液无醇味；

2）提取液中加入β-葡萄糖苷酶，在该含酶水溶液中水解水解黄酮醇苷，获得水解溶液；

3）水解溶液用大孔树脂吸附分离，用20～40%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，获得乙醇洗脱液；

4）洗脱液用聚酰胺树脂进行第二次吸附分离，用水或低浓度丙酮水溶液洗脱并弃去洗脱液，再用高浓度丙酮水溶液进行洗脱，获得丙酮洗脱液；

5）丙酮洗脱液干燥后即得银杏原花青素提取物产品。

根据本发明的制备方法，其中，在乙醇溶剂提取步骤中，银杏叶粉碎至粒径0.1-1cm，用3-12倍量的50～90%乙醇混合水溶液回流提取0.5h~1.5h；将提取残渣用3-12倍量50～90%乙醇水溶液再次回流提取0.5h~1.5h，过滤，收集提取液，以此方法回流提取次数为2-3次；合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为0.5～2L，用蒸馏水稀释至3-7L，使部分沉淀溶解，过滤后，收集滤液。

根据本发明的制备方法，其中，在β-葡萄糖苷酶水解步骤中，向上述滤液中加入β-葡萄糖苷酶得到含酶的水溶液，酶的加入量为5～50mg，使得含酶的水溶液中含有β-葡萄糖苷酶的浓度为1～10μg/ml，在40～50℃水浴中酶水解4～8小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液。采用的β-葡萄糖苷酶的酶活力为40U/mg，购置于南京都莱生物技术有限公司。

根据本发明的制备方法，还包括，加入20mg的β-葡萄糖苷酶，使得含酶的水溶液中含有浓度为4μg/ml，在45℃水浴中水解6小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液。

根据本发明的制备方法，其中，在大孔树脂分离步骤中，大孔树脂可以选用AB-8、HPD-750、HPD-200A、HPD-100C。优选为HPD200A。

根据本发明的制备方法，还包括树脂分离步骤中梯度洗脱处理使用20-35%的乙醇水溶液，优选为25%的乙醇水溶液。

根据本发明的制备方法，其中，在聚酰胺树脂分离步骤中，先用浓度5～30%的丙酮水溶液洗脱，弃去该丙酮洗脱溶液，再用浓度70～90%的丙酮水溶液洗脱，获得丙酮洗脱液。

本发明还提供了根据本发明的制备方法制备的高纯度银杏原花青素提取物产品，其中所述高纯度银杏原花青素提取物产品中，含有88%重量以上的银杏原花青素，小于10%重量的银杏总黄酮，小于5%重量的银杏黄酮醇苷。

本发明还提供了根据本发明的制备方法制备的银杏原花青素提取物产品，其中所述银杏原花青素提取物产品中，银杏原花青素含量为88.7%～98.5%，总黄酮含量为1.5%～8.7%，黄酮醇苷含量为0.6%～3.3%。

在本发明中，采用USP29版的原花青素测定方法——盐酸正丁醇法，来测定银杏原花青素提取物中原花青素的含量。具体步骤如下：

1）试剂A：正丁醇与盐酸混合溶剂（体积比95：5）；

2）试剂B：2g硫酸铁铵用100ml水和盐酸的混合溶液溶解（其中盐酸体积为17.5ml）；

3）称取约125mg提取物，用甲醇溶解并定容至100ml。精确量取1.0ml，再用甲醇定容至20ml，得样本溶液；

4）取1.0ml样本溶液，加入6.0ml试剂A和0.25ml试剂B，混匀，沸水浴加热40min后，用冰水浴迅速冷却至室温；用试剂A定容至10ml，546nm处测定溶液的吸光度值，甲醇为随行空白对照，葡萄籽原花青素为对照。

由于原花青素具有很强的抗氧化活性，其可以增加机体各组织器官的抗氧化能力，对心肌缺血再灌注的大鼠心肌细胞、心脏功能；脑缺血再灌注小鼠的脑神经细胞、脑功能；青光眼大鼠视网膜细胞及其功能均具有较好的保护作用，起到了预防、保健和治疗的作用。此外，银杏原花青素还具有很好的美容抗衰老的功效。

本发明还提供了根据本发明的方法制备的银杏原花青素提取物在用于预防或治疗心脑血管疾病药物或食品中的应用。

本发明还提供了根据本发明的方法制备的银杏原花青素提取物在用于预防或治疗眼科疾病药物或食品中的应用。

本发明还提供了根据本发明的方法制备的银杏原花青素提取物用于美容抗衰老食品中的应用。

本发明还提供了根据本发明的方法制备的银杏原花青素提取物用于美容抗衰老化妆品中的应用。

本发明还提供了一种用于抗衰老、抗氧化活性、预防心脑血管疾病、预防眼科疾病和美容的药物或保健品或化妆品，可以制备银杏原花青素提取物片剂、胶囊剂和软膏剂，其含有银杏原花青素提取物，该银杏原花青素提取物中含有：银杏原花青素含量88%以上，银杏总黄酮含量小于10%，银杏黄酮醇苷含量小于5%。

本发明提出的银杏原花青素提取物，其制备方法，先用β-葡萄糖苷酶对提取液中的黄酮醇苷进行降解，使极性、分子量、结构与低聚原花青素较为相似的黄酮醇苷降解为苷元和糖类成分，再利用大孔树脂分离、聚酰胺树脂梯度洗脱分离的方法，有效的将原花青素成分和黄酮类成分分离开来，最终获得高纯度的银杏原花青素产品。该方法操作简单、对仪器设备的要求低、成本较低、适合工业化生产。

 具体实施方案：

下面的实施例，用于进一步说明和描述本发明，但并不意味着本发明仅限于此。实施例中取值为本发明所述范围的任一具体数值，均为可实施。  

以下实施例中所用的银杏原花青素、黄酮醇苷、总黄酮的含量测定方法：

原花青素含量：根据USP29版，用盐酸正丁醇法测定原花青素的含量；

黄酮醇苷含量：根据ChP2010版方法测定黄酮醇苷的含量；

总黄酮含量：根据ChP2000版银杏叶提取物中总黄酮的含量测定方法测定总黄酮的含量。

实施例1： 银杏原花青素提取物的制备

以银杏叶为原料，经粉碎后，采用溶剂提取—β-葡萄糖苷酶水解—大孔树脂分离—聚酰胺树脂分离的方法，具体制备方法包括如下步骤：

1）银杏叶粉碎至粒径0.1-1cm，用3-12倍量的50～90%乙醇水溶液回流提取0.5h~ 1.5h，过滤，收集提取液；将提取残渣用3-12倍量的50～90%乙醇水溶液再次回流提取0.5h~1.5h，过滤，收集提取液（以此方法回流提取次数为2-3次）；合并提取液，用旋转蒸发仪减压浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为0.5～2L，加入蒸馏水稀释至3-7倍量体积，过滤，收集滤液（即提取液）；

2）上述提取液中加入5-50mg的β-葡萄糖苷酶，控制含酶水溶液中β-葡萄糖苷酶的浓度为1～10μg/ml，水解黄酮醇苷，其水解条件：在40～50℃水浴中水解4～8小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液；

3）酶水解溶液用大孔树脂吸附分离，大孔树脂可以选用AB-8、HPD-750、HPD-200A、HPD-100C，梯度洗脱处理使用20～40%的乙醇水溶液，优选使用25%的乙醇水溶液，获得乙醇洗脱液；

4）上述乙醇洗脱液用聚酰胺树脂进行第二次吸附分离，先用水或浓度5～30%的丙酮水溶液洗脱，优选使用20%的丙酮水溶液，弃去该洗脱溶液；再用浓度70～90%的丙酮水溶液洗脱，优选使用80%的丙酮水溶液，收集该丙酮洗脱液。

5）上述丙酮洗脱液经旋转蒸发仪减压浓缩干燥后，得到银杏原花青素提取物产品。

制备的银杏原花青素提取物，原花青素的含量为88.7～98.5%，总黄酮含量小于10%，黄酮醇苷含量小于5%。

实施例2： 银杏原花青素提取物的制备

以银杏叶为原料，经粉碎后，采用溶剂提取—β-葡萄糖苷酶水解—大孔树脂分离—聚酰胺树脂分离的方法，具体制备方法包括如下步骤：

1）银杏叶粉碎至粒径0.1-1cm，加入10倍体积70%的乙醇水溶液，回流提取1h，过滤，收集提取液；将提取残渣用10倍体积70%的乙醇水溶液再次回流提取1h，过滤，收集提取液；合并上述两次提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为投料量的1倍量体积，加入蒸馏水稀释至5倍量体积，过滤；

2）上述稀释后的提取液中加入20mg左右的β-葡萄糖苷酶，控制含酶水溶液中β-葡萄糖苷酶的浓度为4μg/ml，水解黄酮醇苷，其水解条件：在45℃水浴中水解6小时，过滤，收集滤液（即得酶水解溶液）；

3）将上述滤液（酶水解溶液）用HPD200A大孔树脂进行吸附，再用25%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收至无醇味；

4）将上述洗脱液用聚酰胺树脂吸附，用水洗脱，弃去该洗脱溶液；再用80%的丙酮水溶液洗脱，收集80%丙酮洗脱液；

5）上述80%丙酮洗脱液经浓缩、干燥后，得到银杏原花青素提取物产品。

制备的银杏原花青素提取物，含98.5%重量的银杏原花青素，1.5%重量的总黄酮，0.6%重量的黄酮醇苷。

实施例3：大孔树脂吸附分离中大孔树脂筛选研究

1）取2kg银杏叶，粉碎至粒径小于1cm，加入20L 70%的乙醇水溶液，回流提取1h，过滤，收集提取液；将上述提取残渣用20L 70%的乙醇水溶液再次回流提取1h，过滤，收集提取液；合并上述两次提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为2L，加入蒸馏水稀释至10L，过滤，收集滤液；

2）将上述滤液用表1中的大孔树脂吸附分离原花青素，再用30%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收至无醇味；

3）将上述洗脱液上样于30～60目聚酰胺树脂进行第二次吸附分离，再用80%的丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；

4）回收上述洗脱部位，并测定其原花青素和总黄酮的含量。具体结果见表1，其中以HPD-200A纯化效果最佳。

表1 大孔树脂吸附分离用不同大孔树脂比较

树脂名称	80%丙酮部位重量	原花青素含量	原花青素重量	总黄酮含量
					AB-8	7.99 g	45.34%	3.623 g	49.67%
HPD-750	6.96 g	52.13%	3.628 g	40.31%
					HPD-100C	7.01 g	52.59%	3.687 g	40.59%
HPD-200A	6.96 g	57.56%	4.006 g	38.16%

实施例4 大孔树脂吸附分离中洗脱用乙醇水溶液筛选研究

1）取2kg银杏叶，粉碎至粒径小于1cm，加入20L 70%的乙醇水溶液，回流提取1h，过滤，收集提取液；将上述提取残渣用20L 70%的乙醇水溶液再次回流提取1h，过滤，收集提取液；合并上述两次提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为2L，加入蒸馏水稀释至10L，过滤，收集滤液；

2）上述稀释后的提取液中加入20mg的β-葡萄糖苷酶，控制含酶水溶液中β-葡萄糖苷酶的浓度4μg/ml，水解黄酮醇苷，其水解条件：在45℃水浴中水解6小时，过滤，收集滤液；

3）将上述滤液用HPD-200A大孔树脂吸附分离原花青素，再分别用20%、25%、30%、35%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收至无醇味；

4）将上述洗脱液上样于30～60目聚酰胺树脂，水洗后用20%丙酮溶液洗脱，弃去该洗脱溶液；再用80%的丙酮水溶液洗脱，收集80%丙酮洗脱液；

5）回收上述洗脱部位，并测定原花青素、黄酮醇苷和总黄酮的含量。具体结果见表2，其中大孔树脂20%洗脱部位经后续纯化得到的原花青素含量最高，但得率最低；25%洗脱部位经后续纯化得到的原花青素含量、黄酮醇苷含量及总黄酮含量均与20%乙醇部位差不多，但得率明显增加；而30%及35%乙醇部位虽然得率进一步增加，但原花青素含量明显降低，黄酮醇苷和总黄酮含量明显增加；因此，25%为最佳乙醇洗脱浓度。

表2 大孔树脂吸附分离洗脱用乙醇水溶液浓度比较

大孔树脂洗脱部位	得率	原花青素含量	黄酮醇苷含量	总黄酮含量
					20%乙醇	0.102%	98.60%	0.57%	1.33%
25%乙醇	0.158%	98.17%	0.61%	1.57%
					30%乙醇	0.212%	93.25%	2.58%	5.25%
35%乙醇	0.251%	89.03%	4.33%	9.37%

实施例5 β-葡萄糖苷酶水解浓度的筛选研究

1）取1kg银杏叶，粉碎至粒径小于1cm，加入10L 70%的乙醇水溶液，回流提取1h，过滤，收集提取液；将上述提取残渣用10L 70%的乙醇水溶液再次回流提取1h，过滤，收集提取液；合并上述两次提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为1L，加入蒸馏水稀释至5L，过滤，收集滤液；

2）加入5～50mg的β-葡萄糖苷酶（终浓度为1～10μg/ml），在45℃水浴中水解6小时，过滤，收集滤液；

3）将上述滤液用HPD200A大孔树脂吸附分离原花青素，再用25%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收至无醇味；

4）将上述洗脱液上样于30～60目聚酰胺树脂，用20%的丙酮水溶液洗脱，弃去该丙酮洗脱液，再用80%的丙酮水溶液洗脱，收集洗脱液；

5）回收上述洗脱部位，并测定其原花青素、总黄酮及黄酮醇苷的含量。具体结果见表3。随着β-葡萄糖苷酶终浓度的增加，原花青素含量逐渐增加，黄酮醇苷和总黄酮含量逐渐下降，到4μg/ml时达峰值，之后进入平台期。

表3  β-葡萄糖苷酶水解浓度比较

实施例6 聚酰胺树脂吸附分离工艺筛选

1）将1kg银杏叶粉碎至粒径小于1cm，加入10L 70%的乙醇水溶液，回流提取1h，过滤，收集提取液；将上述提取残渣用10L 70%的乙醇水溶液再次回流提取1h，过滤，收集提取液；合并上述两次提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为1L，加入蒸馏水稀释至5L，过滤，收集滤液；

2）加入20mg的β-葡萄糖苷酶（终浓度为4μg/ml），在45℃水浴中水解6小时，过滤，收集滤液；

3）将上述滤液用HPD200A大孔树脂进行吸附，再用25%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收至无醇味；

4）将上述洗脱液用聚酰胺树脂吸附，水洗后用不同梯度的丙酮溶液洗脱，再用80%的丙酮水溶液洗脱，收集80%丙酮洗脱液；

5）回收80%丙酮部位，并测定原花青素、总黄酮及黄酮醇苷的含量。具体结果见表4。以20%丙酮洗脱后再用80%丙酮洗脱效果最佳。

表4 聚酰胺树脂吸附分离预洗脱用丙酮水溶液浓度比较

梯度丙酮浓度	总得率	原花青素含量	黄酮醇苷含量	总黄酮含量
					5%	0.257%	88.7%	3.29%	8.7%
10%	0.213%	93.2%	1.81%	4.7%
					15%	0.176%	95.3%	1.58%	3.1%
20%	0.155%	98.3%	0.62%	1.6%
					25%	0.139%	98.4%	0.57%	1.5%
30%	0.128%	98.4%	0.54%	1.5%

实施例7  不同大孔树脂对终产品原花青素含量的影响

1）将1kg银杏叶粉碎至粒径小于1cm，加入10L 70%的乙醇水溶液，回流提取1h，过滤，收集提取液；将上述提取残渣用10L 70%的乙醇水溶液再次回流提取1h，过滤，收集提取液；合并上述两次提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为1L，加入蒸馏水稀释至5L，过滤，收集滤液；

2）加入20mg的β-葡萄糖苷酶（终浓度为4μg/ml），在45℃水浴中水解6小时，过滤，收集滤液；

3）将上述滤液用表5中的大孔树脂进行吸附，再用25%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收至无醇味；

4）将上述洗脱液用聚酰胺树脂吸附，水洗后用不同梯度的丙酮溶液洗脱，再用80%的丙酮水溶液洗脱，收集80%丙酮洗脱液；

5）回收80%丙酮部位，并测定原花青素、总黄酮及黄酮醇苷的含量。具体结果见表5。各树脂通过上述工艺均能得到含量为90%以上的原花青素提取物；其中，以HPD200A所得的终产品原花青素含量最高，相应的总黄酮含量和黄酮醇苷含量最低。

表5 不同大孔树脂对终产品原花青素含量的影响

树脂名称	原花青素含量	黄酮醇苷含量	总黄酮含量
				AB-8	93.73%	2.58%	5.74%
HPD-750	92.58%	2.97%	6.90%
				HPD-100C	95.39%	1.76%	4.15%
HPD-200A	98.27%	0.69%	1.62%

实施例8  最佳工艺的稳定性研究

研究对象：3个不同产地的银杏叶，每个产地银杏叶分别重复3次

工艺路线：

1）1kg银杏叶粉碎至粒径小于1cm，加入10L 70%的乙醇水溶液，回流提取1h，过滤，收集提取液；将上述提取残渣用10L 70%的乙醇水溶液再次回流提取1h，过滤，收集提取液；合并上述两次提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为1L，加入蒸馏水稀释至5L，过滤，收集滤液；

2）加入20mg的β-葡萄糖苷酶（终浓度为4μg/ml），在45℃水浴中水解5小时，过滤，收集滤液；

3）将上述滤液用HPD200A大孔树脂进行吸附，再用25%的乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，回收至无醇味；

4）将上述洗脱液用聚酰胺树脂吸附，水洗后用20%丙酮溶液洗脱，再用80%的丙酮水溶液洗脱，收集80%丙酮洗脱液；

回收80%丙酮部位，并测定原花青素、总黄酮及黄酮醇苷的含量。具体结果见表6。所有9个批次的各项指标均非常稳定，平均总得率0.162%，RSD=3.97%；平均原花青素含量98.1%，RSD=0.34%；平均黄酮醇苷含量0.63%；RSD=3.49%；总黄酮含量1.58%，RSD=4.53%。

表6不同产地银杏叶最佳工艺的稳定性

银杏叶批次	总得率	原花青素含量	黄酮醇苷含量	总黄酮含量
					产地1批次1	0.155%	98.2%	0.61%	1.53%
产地1批次2	0.162%	98.2%	0.60%	1.65%
					产地1批次3	0.156%	97.5%	0.63%	1.61%
产地2批次1	0.172%	98.3%	0.63%	1.56%
					产地2批次2	0.170%	98.1%	0.65%	1.62%
产地2批次3	0.164%	98.5%	0.61%	1.58%
					产地3批次1	0.154%	97.7%	0.64%	1.64%
产地3批次2	0.163%	98.4%	0.60%	1.42%
					产地3批次3	0.166%	97.8%	0.66%	1.62%

实施例9 本发明银杏原花青素提取物在体外对各种类型细胞氧化损伤的保护作用

培养大鼠原代主动脉血管内皮细胞、心肌细胞、视网膜细胞及脑神经细胞，将生长状态良好的细胞种植入96孔板中，待细胞密度达8成后，弃去培养基，换用含200umol/L H₂O₂培养基100ml，及100ml含药培养基。阴性对照加入200ml普通培养基，以葡萄籽原花青素作为阳性对照组（原花青素含量95.28%）。培养24h后，MTT法测定细胞存活率，并计算半数有效量（ED50）。

表明，本发明银杏原花青素提取物在体外对各种类型细胞的氧化损伤均具有较好的保护作用，其ED₅₀值均明显小于葡萄籽原花青素。银杏原花青素提取物对视网膜细胞的保护作用最佳，结果见表7。

表7  本发明银杏原花青素提取物在体外对各种类型细胞氧化损伤的保护作用

细胞类型	银杏原花青素ED50（mg/L）	葡萄籽原花青素ED50（mg/L）
			内皮细胞	4.8	6.7
心肌细胞	4.3	6.9
			视网膜细胞	3.6	5.8
神经细胞	5.2	8.4

实施例10 本发明银杏原花青素提取物对心肌缺血再灌注大鼠的影响

雄性SD大鼠随机分为6组，模型组、假手术组、银杏原花青素高（原花青素含量98.2%，100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg）及葡萄籽原花青素对照组（原花青素含量95.28%，50mg/kg）。实验前3天进行灌胃给药，模型组和假手术组给予相同体积的蒸馏水。

大鼠称重后，按1g/kg腹腔注射20%乌拉坦麻醉，仰卧位固定，四肢皮下插入针形电极，以监测标准肢体Ⅱ导联心电图。颈部正中切口，分离气管并插管，连接微型人工呼吸器，沿胸骨左缘第3、4肋间打开胸腔，小心撕开心包膜，暴露心脏，以左心耳肺动脉圆锥交界处的左冠状静脉为标志，用小圆针及5号无损伤缝合线于冠状动脉前降支距左心耳下缘2 mm处穿线备用，线中央放一长约0.6cm、直径0.1 cm硬质小塑料管，结扎时小塑料管正好压在左冠状动脉前降支上，以阻断和恢复血流，结扎后以心电图S-T段明显抬高为结扎成功的标准（假手术组不结扎）。结扎30min后拔除小塑料管再灌注60min。再灌注结束后对大鼠进行腹主动脉取血，离心后取血清，测定血清中SOD、LDH、CK的活性及MDA的含量。具体结果见表8。

本发明银杏原花青素对大鼠心肌缺血再灌注有较好的保护作用，可以提高氧自由基清除剂SOD 的活性、增强心肌抗氧化能力、抑制心肌脂质过氧化，从而预防心肌损伤。在相同的剂量下，本发明银杏原花青素的效果明显优于葡萄籽原花青素（P<0.05）。

表8  高含量银杏原花青素对心肌缺血再灌注大鼠的影响

与假手术组比：##：P<0.01；

与模型组比：*：P<0.05；**：P<0.01；

中剂量组与对照组比：$：P<0.05。

试验说明银杏原花青素提取物对心肌缺血再灌注有较好的保护作用，可用于治疗心绞痛。

实施例11 本发明银杏原花青素提取物对脑缺血再灌注小鼠的影响

雄性ICR小鼠随机分为6组，模型组、假手术组、银杏原花青素高（原花青素含量98.2%，120mg/kg）、中（60mg/kg）、低（30mg/kg）及葡萄籽原花青素对照组（原花青素含量95.28%，60mg/kg）。实验前3天进行灌胃给药，模型组和假手术组给予相同体积的蒸馏水。

小鼠称重后，按400 mg/kg腹腔注射4%水合氯醛麻醉，颈部皮肤去毛消毒，正中切口，分离左侧颈总动脉和颈外动脉。结扎颈外动脉，在颈总动脉上剪开一小口，将一头端用烧至成球形的直径为0.11mm的鱼线沿颈总动脉，经颈内动脉向颅内插至大脑中动脉分叉处，插入深度约12～13 mm，结扎颈内动脉和颈总动脉，固定鱼线，缝合皮肤。缺血2小时后轻轻拉出鱼线至颈内外动脉分叉处，实现再灌注。假手术组仅分离颈总动脉和颈外动脉，不插鱼线。小鼠苏醒后出现手术对侧肢体运动障碍即为模型制备成功。神经功能缺陷评分参照Longa的5分制评分标准进行神经功能缺陷评分。0分为正常，无神经损伤症状；l分为不能完全伸展对侧前爪；2分为提尾后向外侧转圈；3分为行走时向对侧倾倒；4分为不能自发行走或意识丧失。手术后24小时将小鼠断头处死，取脑，计算脑梗死面积百分比，及测定脑组织匀浆中的SOD活性及MDA含量。具体结果见表9。

本发明银杏原花青素对小鼠脑缺血再灌注有较好的保护作用，可以提高氧自由基清除剂SOD 的活性、增强脑组织细胞的抗氧化能力、减少脂质过氧化物对脑细胞的损伤，减少了脑梗死范围。在相同的剂量下，本发明银杏原花青素的效果明显优于葡萄籽原花青素（P<0.05）。

表9  本发明银杏原花青素对脑缺血再灌注小鼠的影响

与假手术组比：##：P<0.01；

与模型组比：*：P<0.05；**：P<0.01；

中剂量组与对照组比：$：P<0.05。

试验说明银杏原花青素提取物，可以增强脑组织细胞的抗氧化能力、减少脂质过氧化物对脑细胞的损伤，可用于治疗脑梗死。

实施例12 本发明银杏原花青素提取物对青光眼大鼠的影响

雄性SD大鼠随机分为6组，模型组、假手术组、银杏原花青素高（原花青素含量98.2%，100mg/kg）、中（50mg/kg）、低（25mg/kg）及葡萄籽原花青素对照组（原花青素含量95.28%，50mg/kg）。实验前3天进行灌胃给药，模型组和假手术组给予相同体积的蒸馏水。

大鼠称重后，按1g/kg腹腔注射20%乌拉坦麻醉，将连接生理盐水瓶输液管的5号头皮针刺入大鼠左眼前房，测定此时的眼压。眼底镜观察可见视网膜缺血苍白、水肿，眼头皮针底血流阻断，半小时后球结膜水肿苍白，眼球变得浑浊，即造模成功。右眼作为对照眼，不造模。

造模后各组动物按组别继续给药，造模后7天处死动物，处死前测定各眼的眼压。处死后迅速取眼，剥离视网膜，对视网膜匀浆后，测定匀浆液的SOD活性及MDA含量。具体结果见表10。

本发明银杏原花青素对大鼠青光眼有较好的保护作用，可以明显降低眼压，提高氧自由基清除剂SOD 的活性、增强视网膜细胞的抗氧化能力、减少脂质过氧化物对视网膜细胞的损伤。在相同的剂量下，本发明银杏原花青素的效果明显优于葡萄籽原花青素（P<0.05）。

表10  高含量银杏原花青素对青光眼大鼠的影响

与假手术组比：##：P<0.01；

与模型组比：*：P<0.05；**：P<0.01；

中剂量组与对照组比：$：P<0.05。

试验说明银杏原花青素提取物对青光眼有较好的保护作用，可以明显降低眼压，是治疗青光眼的备选药物。

实施例13 本发明银杏原花青素提取物对光老化小鼠的影响

雌性ICR小鼠随机分为6组，模型组、正常组、银杏原花青素高（原花青素含量98.2%，120mg/kg）、中（60mg/kg）、低（30mg/kg）及葡萄籽原花青素对照组（原花青素含量95.28%，60mg/kg），模型组和假手术组给予相同体积的蒸馏水。除正常组外，其余各组均剃去背部的毛，每日用UVA灯管照射，共持续8周，造成小鼠光老化模型。8周后，处死动物，取下背部脱毛处的全层皮肤，测定SOD活性及HYP含量。具体结果见表11。

本发明银杏原花青素提取物能抑制光照造成的皮肤老化过程，抑制由于光老化损伤导致的皮肤中SOD活性及HYP含量的降低，恢复皮肤活力和弹性，其效果比葡萄籽原花青素更好，因此本发明银杏原花青素提取物可用于具有美容抗衰老功效的保健品和化妆品中。

表11  高含量银杏原花青素对光老化小鼠的影响

与假手术组比：##：P<0.01；

与模型组比：*：P<0.05；**：P<0.01；

中剂量组与对照组比：$：P<0.05。

试验说明银杏原花青素提取物有很好的抗氧化作用。

实施例14 银杏原花青素片剂

取干燥并粉碎的本发明银杏原花青素提取物（原花青素含量98.2%），振动过筛60目，得干粉，加入15～20%的微晶纤维素，混合均匀后，加入0.5%～1.0%的硬脂酸镁作为润滑剂，直接压片，制成银杏原花青素片剂。该银杏原花青素片剂中含银杏原花青素提取物200mg/片。

实施例15 银杏原花青素胶囊剂

取干燥并粉碎的本发明银杏原花青素提取物（原花青素含量98.2%），振动过筛60目，得干粉，加入15～20%的麦芽糊精，混匀、制粒，灌装胶囊，制成银杏原花青素胶囊剂。该银杏原花青素胶囊剂中含银杏原花青素提取物200mg/粒。

实施例16 银杏原花青素软膏剂

取干燥并粉碎的银杏原花青素提取物（原花青素含量98.2%），振动过筛60目，备用。将硬脂酸甘油酯，硬脂酸，白凡士林及液状石蜡加热熔化为油相。将甘油和蒸馏水加热，加入十二烷基硫酸钠及羟苯乙酯溶解为水相。将水相缓缓倒入油相中，混合均匀，冷却后，加入银杏原花青素提取物，搅拌均匀，制成银杏原花青素软膏剂。该银杏原花青素软膏剂中含银杏原花青素提取物500mg/g软膏剂。

Claims (9)

1.一种银杏原花青素提取物的制备方法，所述银杏原花青素提取物含有：银杏原花青素含量达到88%以上，银杏总黄酮含量小于10%，银杏黄酮醇苷含量小于5%，其步骤如下：1）银杏叶粉碎后用乙醇水溶液回流提取，获得提取液，并回收提取液中的乙醇至提取液无醇味；2）提取液中加入β-葡萄糖苷酶，在该含酶水溶液中水解，获得酶水解溶液；3）水解溶液用大孔树脂吸附分离，用20～40%的乙醇水溶液进行梯度洗脱，获得乙醇洗脱液；4）洗脱液用聚酰胺树脂进行第二次吸附分离，用水或5～30%丙酮水溶液洗脱并弃去洗脱液，再用70～90%的丙酮水溶液进行洗脱，获得丙酮洗脱液；5）丙酮洗脱液干燥后即得银杏原花青素提取物产品。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤1）所述的银杏叶粉碎至粒径0.1-1cm，每公斤银杏叶加入3-12倍量50～90%乙醇水混合溶液回流提取0.5h~1.5h，过滤，收集提取液；将提取残渣用3-12倍量50～90%乙醇水溶液再次回流提取0.5h~1.5h，过滤，收集提取液；合并提取液，用减压干燥装置浓缩提取液至无醇味，剩余溶液体积约为0.5～2L，加入蒸馏水稀释至3～7L，过滤，收集滤液。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤2），提取液中加入β-葡萄糖苷酶，得到含有浓度1～10μg/ml β-葡萄糖苷酶的含酶水溶液，在40～50℃水浴中水解4～8小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征是步骤2），提取液中加入β-葡萄糖苷酶，得到含有浓度4μg/ml β-葡萄糖苷酶的含酶水溶液，在40～50℃水浴中水解4～8小时，过滤，收集滤液，获得酶水解溶液。

5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤3）中分离用大孔树脂可以选用AB-8、HPD-750、HPD-200A、HPD-100C。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征是步骤3）中分离用大孔树脂为HPD-200A。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤3）中用20-35%的乙醇水溶液进行梯度洗脱。

8.根据权利要求1或7所述的制备方法，其特征是步骤3）中用25%的乙醇水溶液进行梯度洗脱。

9.根据权利要求1所述的制备方法，其特征是步骤4）中先用20%的丙酮水溶液洗脱，弃去丙酮洗脱溶液，再用浓度80%的丙酮水溶液洗脱，获得丙酮洗脱液。