KR102211649B1 - 자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 - Google Patents
자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 본 발명의 자두 추출물은 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 멜라노블라스트(melanoblast)의 분화 및 이동을 촉진시키고 항산화 활성을 나타내므로 백반증 또는 백모증 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.
멜라닌(melanin) 색소는 피부색을 결정하며 자외선을 흡수하여 피부를 보호하는 역할을 한다. 멜라닌 색소를 생성하는 멜라닌 세포(melanocyte)는 멜라노블라스트(melanoblast)에서 유래한다. 멜라노블라스트가 자극을 받아 멜라닌 세포로 분화되면, 티로시나아제가 활성화되어 세포 내 함유되어 있는 티로신을 DOPA(3,4-dihydroxy-L-phenyl-alanine)로 변화시키고, 이어서 DOPA는 도파옥시다제(dopaoxidase)라는 효소의 작용으로 도파퀴논(dopaquinone)이라는 물질로 변한 후 이후 일련의 화학반응을 거쳐 멜라닌으로 합성된다. 멜라닌 세포는 멜라닌을 만든 후 피부 상층부의 표피 조직까지 이동하여, 표피 조직에 존재하는 각질 형성 세포(keratinocyte)로 멜라닌을 전달한다. 세포 이동 과정에서 멜라닌 색소는 멜라노좀(melanosome)에 저장되어 운반되는데 생성 초기에는 색이 없다가 점차 상층부로 이동하면서 4-5 단계에 걸쳐 검은 색소로 채워져 마침내 완전한 색소를 띤 성숙한 멜라닌 과립이 된다.
백반증은 멜라닌 세포의 사멸이나 괴사로 인해 다양한 크기 및 형태의 백색반이 피부에 나타나는 후천성 탈색소 질환이다. 백반증 환자는 표피의 멜라닌 세포의 활성을 잃었지만, 모낭의 외부 모근초의 멜라노블라스트 세포는 영향을 받지 않는다. 전세계적으로 인구의 약 1%에서 나타나는 비교적 흔한 질환으로, 인종이나 지역에 따른 차이는 없다. 발생 연령은 10~30세에 가장 많고, 95%의 경우 40세 이전에 발병하고, 환자의 30%에서 가족력이 있다. 백반증의 임상 양상으로는 다양한 크기의 둥글거나 불규칙한 모양의 흰색 반점이 나타나고, 초기에는 탈색 정도가 뚜렷하지 않으나 시간이 경과하면서 뚜렷해지는 경우가 많으며, 정상피부와의 경계가 뚜렷하지 않을 수도 있으나 정상피부색 보다도 진하면서 뚜렷하게 나타날 수 있다. 드문 경우 가려움을 유발하기도 하며, 털이 있는 부위, 특히 머리카락, 눈썹부위에 흰반점이 나타나는 경우는 흰 털이 자라나는 경우도 있다. 백반증은 피부의 어디에나 발병할 수 있으나, 특히 손가락, 발가락, 무릎, 팔꿈치 등의 뼈가 돌출한 부위, 입주위, 코주위, 눈주위, 겨드랑이, 손목 안쪽 등에 자주 발생한다. 그리고 입술이나 성기 등 점막에도 올 수 있으며, 상처를 자주 받는 부위에 특히 잘 발생한다. 백반증의 분포는 좌우 대칭적이거나, 신경에 따른 분포를 보이기도 한다(Vitiligo Pathogenesis and Treatment, American Journal of Clinical Dermatology June 2001, Volume 2, Issue 3, pp.167-181).
백반증은 단순히 피부에 흰 반점이 나타나는 경우 외에 눈의 홍채와 망막의 색소이상을 동반할 수 있으며, 당뇨병, 악성 빈혈, 갑상선 기능 저하 또는 항진, 다운 증후군, 담즙성 간경변, 위암, 아디손병, 원형탈모증, 홍반성 낭창 등의 자가 면역질환과 병발할 수 있다. 백반증이 생기는 원인에 대해서 아직 정확히 밝혀진 바는 없으나, 자가면역설, 스트레스, 바이러스 가설, 신경체액설, 멜라닌 세포 자가 파괴설 등 여러 가지 설이 제시되고 있다. 그 외 고유세포 결손(inherent cellular defect), 유전요인, 세포사멸, 칼슘대사 이상 등의 다양한 인자들이 제시되고 있다.
자두는 장미과 벚나무속 자두아속에 속하며 원산지에 따라 동양계자두(Prunus salicina), 유럽계자두(Prunusdomestica) 및 북미 원산의 미국자두(Prunus americana)로 나뉜다. 자두에는 플라보노이드와 페놀산과 같은 페놀성 파이토케미칼(phytochemical)이 풍부하게 존재하고, 주로 네오클로로겐산(neochlorogenic acid)와 루틴(rutin)이 다량 함유되어 있으며, 붉은 색 자두 품종의 경우 안토시아닌(anthocyanin)이 소량 함유된 것으로 알려져 있다. 자두의 항산화능은 포도보다는 낮으나 사과에 비해서는 4배 이상 높으며, 과피가 과육보다 항산화물질이 많이 함유되어 있는 것으로 보고되었다.
본 발명자들은 자두 추출물의 신규한 용도를 개발하고자 예의 노력한 결과, 자두 추출물은 세포 독성이 없을 뿐만 아니라 멜라노블라스트(melanoblast)세포의 분화 및 이동을 촉진시켜 백반증 또는 백모증 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 자두(Prunus salicina) 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 자두(Prunus salicina) 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 자두(Prunus salicina) 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 자두(Prunus salicina) 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공한다.
또한, 본 발명은 자두(Prunus salicina) 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명의 자두 추출물은 세포 독성이 없을 뿐만 아니라, 멜라노블라스트(melanoblast) 세포의 분화 및 이동을 촉진시키므로 백반증 또는 백모증 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 자두(Prunus salicina)의 모습을 나타내는 도이다.
도 2는 자두 추출물이 처리된 멜라노블라스트(Melb-a)의 세포 생존율을 나타낸 결과이다 (Neg control(음성 대조군): DMSO 처리).
도 3은 자두 추출물이 처리된 멜라노블라스트(Melb-a)의 멜라닌 함량을 측정한 결과이다 (Neg control(음성 대조군): DMSO 처리).
도 4는 자두 추출물 처리 후, 막을 통과한 멜라노블라스트(Melb-a) 세포의 모습을 나타낸 도이다 (Neg control(음성 대조군): DMSO 처리).
도 5는 자두 추출물이 처리 후, 막을 통과한 멜라노블라스트(Melb-a) 세포의 수를 계수한 결과이다 (Neg control(음성 대조군): DMSO 처리).
도 2는 자두 추출물이 처리된 멜라노블라스트(Melb-a)의 세포 생존율을 나타낸 결과이다 (Neg control(음성 대조군): DMSO 처리).
도 3은 자두 추출물이 처리된 멜라노블라스트(Melb-a)의 멜라닌 함량을 측정한 결과이다 (Neg control(음성 대조군): DMSO 처리).
도 4는 자두 추출물 처리 후, 막을 통과한 멜라노블라스트(Melb-a) 세포의 모습을 나타낸 도이다 (Neg control(음성 대조군): DMSO 처리).
도 5는 자두 추출물이 처리 후, 막을 통과한 멜라노블라스트(Melb-a) 세포의 수를 계수한 결과이다 (Neg control(음성 대조군): DMSO 처리).
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 자두(Prunus salicina) 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 자두 추출물은 하기의 단계들을 포함하는 제조방법에 의해 제조될 수 있다:
1) 자두에 추출 용매를 가하여 추출하는 단계;
2) 단계 1)의 추출물을 여과하는 단계; 및
3) 단계 2)의 여과한 추출물을 감압 농축한 후 건조하는 단계.
상기 방법에 있어서, 단계 1)의 자두는 재배한 것 또는 시판되는 것 등 제한없이 사용할 수 있다.
상기 제조방법에서, 자두는 미국 캘리포니아산 건자두를 구입하여 사용할 수 있으며 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 단계 1)의 추출 용매는 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매일 수 있고, 구체적으로 상기 C1 내지 C2의 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다. 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면 메탄올로 추출하는 것이 가장 바람직하다.
상기 단계 1)의 추출 방법은 진탕추출, Soxhlet 추출 또는 환류추출일 수 있다. 이때, 추출 온도는 20 내지 60℃인 것이 바람직하며, 30 내지 50℃인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 또한, 상기 추출 용매는 추출에 사용되는 건자두의 중량 대비 2 내지 10배로 첨가하여 추출하는 것이 바람직하고, 4 내지 8배로 첨가하여 추출하는 것이 더 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
또한, 추출 시간은 10 내지 40시간인 것이 바람직하며, 20 내지 30시간이 더욱 바람직하나 이에 한정하지 않는다. 아울러, 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하며, 1 내지 3회인 것이 더욱 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 추출 온도, 추출 시간 또는 추출 횟수의 조건을 벗어난 범위에서는 추출이 충분히 이루어지지 않아 자두 추출물 내에 유효성분의 함량이 미미할 수 있다. 또는 더 이상 추출 수율이 증가하지 않아 추출 작업의 효율이 떨어질 수 있다.
상기 단계 3)의 감압 농축은 진공감압농축기 또는 진공회전증발기를 이용할 수 있다. 또한, 상기 건조는 감압건조, 진공건조, 비등건조, 분무건조 또는 동결건조일 수 있다.
상기 추출물은 멜라노블라스트의 멜라닌 세포로의 분화를 유도할 수 있다. 또한, 상기 추출물은 멜라노블라스트의 이동을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 미국 캘리포니아산 건자두를 구입한 후 메탄올로 추출하여 자두 추출물을 제조하였고, 상기 자두 추출물은 멜라노블라스트에서 세포 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라(도 2 참조) 멜라닌 함량 및 멜라노블라스트의 분화를 유도하며(도 3 참조), 멜라노블라스트의 이동을 촉진시킴(도4 내지 5참조)을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 자두 추출물은 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 조성물 전체 중량에 대하여 유효성분인 자두 추출물을 10 내지 95 중량%로 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 약학적 조성물은 상기 유효성분 이외에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종 이상 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 생물학적 제제에 통상적으로 사용되는 담체, 희석제, 부형제 또는 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체는 조성물을 생체 내에 전달하는데 적합한 것이면 모두 사용할 수 있다. 구체적으로, 상기 담체는 Merck Index, 13th ed., Merck & Co. Inc.에 기재된 화합물, 식염수, 멸균수, 링거액, 덱스트로스 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등과 같은 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
상기 조성물을 제제화하는 경우, 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 조성물은 경구용 제제 또는 비경구용 제제로 제형화될 수 있다. 경구용 제제로는 고형 제제 및 액상 제제가 포함될 수 있다. 상기 고형 제제는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 또는 트로키제일 수 있고, 이러한 고형 제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제를 첨가하여 조제할 수 있다. 상기 부형제는 전분, 탄산칼슘, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 또는 이의 혼합물일 수 있다. 또한, 상기 고형 제제는 윤활제를 포함할 수 있고, 그 예로는 마그네슘 스티레이트, 탈크등이 있다. 한편, 상기 액상 제제는 현탁제, 내용액제, 유제 또는 시럽제일 수 있다. 이때, 상기 액상 제제에는 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등과 같은 부형제가 포함될 수 있다.
상기 비경구용 제제는 주사제, 좌제, 호흡기 흡입용 분말, 스프레이용 에어로졸제, 파우더 및 크림 등을 포함할 수 있다. 상기 주사제는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁용제, 유제 등을 포함할 수 있다. 이때, 비수성용제 또는 현탁용제로서는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름이나, 에틸올레이트와 같이 주사가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여는 복강내, 직장내, 피하, 정맥, 근육내 또는 흉부내 주사 방식을 포함할 수 있다.
상기 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있다. 이는 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 환자의 민감도, 투여 시간, 투여 경로, 치료기간, 동시에 사용되는 약물 등에 따라 달라질 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명에 따른 약학 조성물에 포함되는 유효성분의 양은 0.0001 내지 1,000 ㎎/㎏, 구체적으로 0.001 내지 500 ㎎/㎏일 수 있다. 상기 투여는 하루에 1회 수회일 수 있다.
본 발명의 조성물은 단독 또는 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 병용 투여시, 투여는 순차적 또는 동시일 수 있다.
또한, 본 발명은 자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 화장료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 자두 추출물의 특징은 상기 서술한 바와 같다. 일례로, 상기 자두 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출될 수 있고, 구체적으로 상기 C1 내지 C2의 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.
상기 추출물은 멜라노블라스트의 멜라닌 세포로의 분화를 유도할 수 있다. 또한 상기 추출물은 멜라노블라스트의 이동을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 미국 캘리포니아산 건자두를 구입하고, 이를 메탄올로 추출하여 자두 추출물을 제조하였고, 상기 자두 추출물은 멜라노블라스트에서 세포 독성을 나타내지 않을 뿐만 아니라(도 2 참조) 멜라닌 함량 및 멜라노블라스트의 분화를 유도하며(도 3 참조), 멜라노블라스트의 이동을 촉진시킴(도4 내지 5참조)을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 자두 추출물은 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 화장료 조성물에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 상기 추출물에 추가로 동일 또는 유사한 기능을 나타내는 유효성분을 1종이상 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 화장료 조성물의 구체적인 제형으로서는 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.
또한, 상기 화장료 조성물은 본 발명의 혼합 추출물에 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(forming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다.
본 발명의 조성물에서 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.005 내지 90 중량% 함유되는 것이 바람직하지만, 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선 효과가 있고 독성이 나타나지 않는 범위에서 사용 용도에 따라서 상기 범위 이상 또는 이하로도 사용될 수 있다.
또한, 본 발명은 자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 피부 외용제를 제공한다.
본 발명에 따른 자두 추출물은 상기 서술한 바와 같다. 일례로, 상기 자두 추출물은 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출될 수 있고, 구체적으로 상기 C1 내지 C2의 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다.
상기 추출물은 멜라노블라스트의 멜라닌 세포로의 분화를 유도할 수 있다. 또한 상기 추출물은 멜라노블라스트의 이동을 촉진시킬 수 있다.
상기 추출물을 피부 외용제로 사용하는 경우, 추가로 지방 물질, 유기 용매, 용해제, 농축제 및 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(forming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제 및 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 또한, 상기 성분들은 피부 과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입될 수 있다.
또한, 본 발명은 자두 추출물을 유효성분으로 포함하는 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 건강기능식품을 제공한다.
본 발명에 따른 자두 추출물은 상기 서술한 바와 같다. 일례로, 상기 자두는 물, C1 내지 C2의 저급 알코올 또는 이들의 혼합 용매로 추출될 수 있고, 구체적으로 상기 C1 내지 C2의 저급 알코올은 메탄올 또는 에탄올일 수 있다. 상기 추출물은 멜라노블라스트의 멜라닌 세포로의 분화를 유도할 수 있다. 또한 상기 추출물은 멜라노블라스트의 이동을 촉진시킬 수 있다.
본 명세서의 "건강기능식품"이란 일상 식사에서 결핍되기 쉬운 영양소나 인체에 유용한 기능을 가진 원료나 성분을 사용하여 제조한 식품으로, 인체의 건강을 유지하는데 도움을 주는 식품을 의미하나 이에 한정되지 않으며 통상적인 의미의 건강식품을 모두 포함하는 의미로 사용한다.
건강기능식품의 형태 및 종류는 특별히 제한되지 않는다. 구체적으로, 상기 건강기능식품은 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상 및 환의 형태일 수 있다. 상기 건강기능식품은 추가성분으로서 여러 가지 향미제, 감미제 또는 천연 탄수화물을 포함할 수 있다. 상기 감미제는 천연 또는 합성 감미제일 수 있고, 천연 감미제의 예로는 타우마틴, 스테비아 추출물 등이 있다. 한편, 합성 감미제의 예로는 사카린, 아스파르탐 등이 있다. 또한, 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드, 디사카라이드, 폴리사카라이드, 올리고당 및 당알코올 등일 수 있다.
본 발명의 건강기능식품은 상기 서술한 추가성분 외에, 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙스탄 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올 등을 더 포함할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합으로 사용될 수 있다. 상기 첨가제의 비율은 본 발명의 조성물의 100 중량부당 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택될 수 있다.
본 발명의 자두 추출물은 식품에 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있다. 이때, 첨가되는 유효성분의 함량은 목적에 따라 결정될 수 있다. 일반적으로, 건강기능식품 중의 함량은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량부일 수 있다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없다면 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로도 사용될 수 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 자두 추출물의 제조
미국 캘리포니아산 건자두(Prunus salicina)를 구입하여 사용하였다. 건자두 샘플 대비 메탄올 5배를 가하여 40℃에서 24시간 동안 추출하였다. 상기 추출 과정을 2회 수행한 후, 여과지(Whatman filter paper No.1)를 이용해 추출물을 여과한 후 감압하여 농축물인 자두 메탄올 추출물을 얻었다.
<실시예 2> 멜라노블라스트 세포주 배양
멜라노블라스트(Melb-a)는 기능 유전체학 세포주 은행(Functional Genomics Cell Bank (영국), Welcome Trust)에서 분양받아 사용하였다. Melb-a는 완전 RPMI1640 배지 (RPMI 1640 배지(Invitrogen Corp (미국))에 1% 페니실린(penicillin)/스트렙토마이신(streptomycin), 1 ng/㎖ bFGF (Murine FGF(Fibroblast growth factor)-basic; PeproTech), 20 nM PDBu(Phorbol12,13-dibutyrate; Sigma Chemical Co, 미국), 및 5% 우태아 혈청(Fetal bovine serum; Invitrogen Corp, 미국)이 첨가)를 이용하여 37℃, 10% CO2 항온기에서 계대 배양하였다. 계대 배양은 배양된 세포에 트립신-EDTA(trypsin-EDTA; Invitrogen Corp (미국))를 처리하고 원심분리하여 침전시키고, 상등액을 제거한 뒤 완전(complete) RPMI 1640 배지를 첨가하여 세포를 현탁킨 후 1×104 세포수/접시의 농도로 10 cm 세포 배양 접시에 재분주하는 방식으로 수행하였다.
<실험예 1> 자두 추출물이 멜라노블라스트 세포 생존율에 미치는 영향 확인
6×104 개의 멜라노블라스트 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고, 37℃, 10% CO2 항온기에 24시간 전배양한 후, 배양액을 제거하고 DMSO에 녹인 실시예 1의 건자두(Prunus salicina) 추출물이 포함된 배양액을 10 및 50 ㎍/㎖ 농도로 각각 처리하였다. 음성 대조군으로 DMSO를 처리하였고, 양성 대조군으로 α-MSH(alpha-melanocyte stimulating hormone)를 처리하였다. 자두 추출물을 처리한 다음, 배지는 4일 동안 이틀마다 교환하였으며 배지를 교환할 때 다시 자두 추출물을 처리하였다. 자두 추출물을 처음 처리한 시점으로부터 4일 째에 배양된 세포에 MTT 시약(5 ㎎/㎖)을 처리한 후, 형성된 포르마잔(formazan)을 DMSO로 녹이고 ELISA 마이크로플레이트 리더기를 이용하여 540 nm의 파장의 흡광도를 측정하고, 무처리 대조군과 비교하였다.
그 결과, 자두 추출물은 10-50 ㎍/㎖의 농도로 처리시 멜라노블라스트 세포에서 독성을 나타내지 않음을 확인하였다 (도 2).
<실험예 2> 자두 추출물이 멜라노블라스트 분화에 미치는 영향 확인
멜라노블라스트는 타이로시나아제의 촉매 기능이 멈추어 있는 비색소 세포로, 자두 추출물이 멜라노블라스트의 분화를 유도하는지 확인하기 위하여, 멜라노블라스트의 멜라닌 함량을 측정하였다.
<멜라닌 함량 측정>
6×104 개의 멜라노블라스트 세포를 12-웰 플레이트에 접종하고, 37℃, 10% CO2 항온기에 24시간 전배양한 후, 배양액을 제거하고 DMSO에 녹인 실시예 1의 건자두(Prunus salicina) 추출물이 포함된 배양액을 10, 25, 50, 및 100 ㎍/㎖ 농도로 각각 처리하였다. 음성 대조군으로 DMSO를 처리하였고, 양성 대조군으로 α-MSH를 처리하였다. 자두 추출물을 처리한 다음, 배지는 4일 동안 이틀마다 교환하였으며 배지를 교환할 때 다시 자두 추출물을 처리하였다. 자두 추출물을 처음 처리한 시점으로부터 4일 째에 배양된 세포의 배양액을 제거하고 PBS 500㎕로 2번 세척한 후, 트립신-EDTA를 처리하여 세포를 수득하였다. 수득된 세포를 1.5 ㎖ 마이크로 튜브에 옮겨 담고 원심분리하여 세포를 침전시키고, 상등액을 제거한 뒤 10% DMSO가 들어있는 1N NaOH 용액 100 ㎕에 현탁시켜 이를 80℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 상기 용해된 세포 내의 멜라닌은 플레이트 리더기를 이용하여 405 nm의 파장의 흡광도를 측정하고 무처리 대조군과 비교하였다.
멜라노블라스트의 침전물을 육안으로 관찰한 결과, 음성 대조군은 흰색인 반면, 양성 대조군(α-MSH)과 자두 추출물을 처리한 실험군에서는 색 변화가 나타나 멜라닌 합성이 유도된 것으로 나타났다. 멜라닌 함량을 측정한 결과, 자두 추출물을 처리한 실험군은 멜라닌 함량이 증가한 것으로 나타났다(50 ppm 자두 추출물: 113%)(도 3). 상기 결과는 자두 추출물이 멜라닌 세포로 멜라노블라스트의 분화를 유도하였음을 보여준다.
<실험예 3> 자두 추출물이 멜라노블라스트 이동에 미치는 영향 확인
멜라노블라스트에서 분화된 멜라닌 세포(melanocyte)는 표피 조직으로 이동한 다음, 생성된 멜라닌을 각질 형성 세포(keratinocyte)로 전달하여 피부를 착색시킨다. 따라서, 자두 추출물이 멜라노블라스트 세포의 이동을 유도하는지 확인하기 위하여 하기 실험을 수행하였다.
구체적으로, 세포의 이동은 트랜스웰 세포 배양 챔버(Transwell cell culture chamber, ostar 3422)를 이용하여 측정하였다. 트랜스웰 세포 배양 챔버 내의 0.8 ㎛ 폴리비닐피롤리돈이 없는 폴리카보네이트(polyvinylpyrroliodone-free polycarbonate) 필터를 1% 젤라틴으로 코팅하였다. 코팅한 필터를 굳힌 후, 챔버의 아랫 부분에 실시예 1의 자두 추출물이 첨가된 무혈청 RPMI 배지 600 ㎕를 첨가하고, 챔버의 윗 부분에는 멜라노블라스트 세포(2.5×105 세포수/㎖)를 100 ㎕ 접종하고 24시간 동안 배양하였다. 배양이 완료되면, 필터를 오려내어 메탄올로 고정시키고 헤마톡실린(hematoxylin)과 에오신(eosin)으로 염색한 다음, 면봉을 이용하여 필터 위에 이동되지 않은 세포를 제거하였다. 필터의 아랫 부분으로 이동된 세포를 현미경으로 관찰하였으며, 필터를 4등분한 뒤 현미경으로 40배 확대하여 세포 수를 측정하고 평균값을 산출하였다. 실험은 각각의 조건에서 2번 반복 수행하였다.
그 결과, 자두 추출물을 10, 50 및 100 ppm 농도로 처리한 필터의 아래 면에서 멜라노블라스트 세포의 수가 무처리 대조군에 비해 각각 134%, 141%, 148% 증가한 것으로 나타나, 자두 추출물이 멜라노블라스트 세포의 이동을 촉진함을 확인하였다 (도 4 및 도 5).
Claims (8)
- 자두(Prunus salicina)의 메탄올 추출물만을 유효성분으로 포함하고, 상기 추출물은 멜라노블라스트의 멜라닌 세포로의 분화를 유도하며, 멜라노블라스트의 이동을 촉진시키는, 백반증 또는 백모증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
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- 자두(Prunus salicina)의 메탄올 추출물만을 유효성분으로 포함하고, 상기 추출물은 멜라노블라스트의 멜라닌 세포로의 분화를 유도하며, 멜라노블라스트의 이동을 촉진시키는, 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 화장료 조성물.
- 자두(Prunus salicina)의 메탄올 추출물만을 유효성분으로 포함하고, 상기 추출물은 멜라노블라스트의 멜라닌 세포로의 분화를 유도하며, 멜라노블라스트의 이동을 촉진시키는, 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 피부 외용제.
- 자두(Prunus salicina)의 메탄올 추출물만을 유효성분으로 포함하고, 상기 추출물은 멜라노블라스트의 멜라닌 세포로의 분화를 유도하며, 멜라노블라스트의 이동을 촉진시키는, 백반증 또는 백모증 예방 또는 개선용 건강기능식품.
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
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| Sang-Joo PARK 외. Screening of natural compounds which can induce melanoblast differentiation, proliferation and migration in melb-a cells. 2011년도 한국생물공학회 춘계학술발표대회 초록집. 2011년 4월 16일. page 270 |
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