KR102524917B1 - 택란 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물 및 이의 제조방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 MITF 억제제를 포함하는 피부미백용 조성물이 제공되며, 더욱 상세하게는 택란(lycopi herba)의 지상부 열수 추출물이 MITF 억제를 위한 유효성분으로 함유되어, 피부 내 멜라닌의 생성을 감소시킬 수 있는 피부 미백용 조성물이 제공된다. 본 발명에 따르면 MITF 억제를 위한 택란 지상부 열수 추출물의 유효 농도가 제공된다.

Description

택란 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 조성물 및 이의 제조방법 {COMPOSITION OF SKIN WHITENING CONTAINING EXTRACT OF LYCOPI HERBA AND METHOD OF MANUFACTURING THE SAME}
본 발명은 피부미백용 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 택란의 지상부를 열수 추출하여 MITF 억제제로 이용하고, 이를 유효성분으로 포함하여 피부 내 멜라닌 생성을 감소시킬 수 있는 피부미백용 조성물을 제공한다.
택란(Lycopi Herba)는 꿀풀과 식물로, 한국 및 아시아에 분포하며 한국에서는 전국에 야생하며 주로 연못이나 물가 등 습지 근처에서 군생한다. 연한 부분은 나물로 하고 성숙한 택란은 약용으로 이용된다. 택란에는 글루코시드 (glucoside), 타닌(tannin), 플라보노이드(flavonoide) 배당체, 페놀(phenol)류, 아미노산, 유기산, 사포닌(aponin), 글루코스(glucose), 갈락토오스(galactose), 리코포오스(lycopose), 라피노스(raffinose), 스타키오스(stachyose) 및 프룩토오스(fructose)가 함유되어 있다.
부인과 질환에 탁월한 효능을 보이는 택란은 주로 한방에서 이용되고 있다. 월경중에 통증이 있는 경통, 월경이 없거나 멈춘 경폐, 출산후에 남은 어혈로 인해 복통이 있는 산후어혈복통, 몸이 붓는 수종, 넘어지거나 부딪쳐서 다치고 손상당한 질박손상의 증상의 완화/치료에 이용되고 있다.
멜라닌은 흑갈색 또는 검은색을 띠는 색소로, 피부/털/눈 등에 존재하며 색을 띄게 해준다. 멜라닌을 만드는 세포를 멜라닌세포(melanocyte)라고 하며, 생성된 멜라닌은 멜라닌 세포 속의 멜라노솜(melanosome)이라는 세포소기관에서 생성/저장된다. 이러한 멜라닌의 양에 따라 피부의 색이 결정되는데, 멜라닌의 양이 많을수록 검은 피부의 색을 띠게 된다. 만약, 멜라닌이 적게 생성되거나 존재하지 않으면 백색증(Albino)와 같은 병에 걸리게 된다. 또한, 과도하게 생성된 멜라닌은 기미 (melasma), 주근깨 (freckle), 흑색종(melanoma) 등과 같은 질환을 유발하게 된다. 멜라닌의 주된 역할은 일정량 이상의 자외선을 흡수하여 유해한 자외선이 인체 내로 침투하는 것을 차단하여, 인체(피부)를 보호하는 것이다. 따라서 햇빛(자외선)에 의해 피부가 갈색으로 변하는 것은, 각질세포(keratinocyte) 밑에 존재하는 멜라닌세포에서 형성된 멜라닌이 피부를 보호하기위해 멜라닌색소를 형성하여 각질세포로 이동시켜 자외선이 피부 깊숙히 침투하는 것을 방지하기 때문이다. 멜라닌색소에는 크게 흑갈색 또는 검은색을 띠는 유멜라닌(eumelanin)과 노란색 또는 붉은색을 띠는 피어멜라닌(pheomelanin)이 존재한다.
기존 일반적인 알려진 미백 성분으로서, 코직산(Kojic acid), 알부틴(Arbutin) 등과 같은 티로시나제 효소활성을 억제하는 물질이 있다. 이들은 멜라닌 색소의 생성을 저해함으로써, 피부톤을 밝게 하여 피부 미백을 실현할 수 있을 뿐만 아니라, 자외선, 호르몬 또는 유전에 기인한 기미나 주근깨 등의 피부 과색소 침착증의 개선이 가능 하다. 그러나 피부 적용 시, 자극과 발적 등의 안전성의 문제로 사용량의 제한이 있다.
따라서, 천연물 유래로 생체에 안전하고 우수한 피부미백 활성을 갖는 조성물의 개발이 절실히 요구된다.
본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제는, 천연물 유래의 MITF 억제제를 제공하는 것에 있다.
본 발명은 MITF 억제제로 택란 추출물을 이용하고, 이를 유효성분으로 함유하여 피부 내 멜라닌 생성을 감소시킬 수 있는 피부미백용 조성물을 제공함에 목적이 있다.
본 발명은 또한, MITF의 발현을 유의적으로 억제시킬 수 있는 택란 추출물의 부위, 추출 방법, 이용 농도를 제공함에 목적이 있다.
또한, 본 발명은 택란(lycopi herba) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 건강기능식품, 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 피부 색소 침착 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물을 제공함에 목적이 있다.
상술한 과제를 해결하기 위해, 본 발명의 피부미백용 화장료 조성물은 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 포함하고, 상기 택란 지상부의 열수 추출물은 MITF의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 상기 택란(lycopi herba) 지상부는 택란의 줄기를 포함하는 것이 바람직하다. 본 발명의 택란의 지상부에는 택란의 뿌리인'지순'이 포함되지 않는다.
본 발명의 택란은 개쉽싸리(Lycopus coreanus Leveil) 또는 흑쉽싸리(Lycopus uniflorus Michaux.)인 것이 바람직하다.
본 발명의 상기 열수 추출물은 택란의 지상부를 80 내지 120℃에서 1 내지 5시간 동안 열수 추출한 것일 수 있으며, 상기 조성물은 택란 지상부의 열수 추출물을 12.5 μg/ml 내지 50μg/ml 또는 25 내지 50μg/ml의 농도로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이의 제형인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 포함하고, 상기 택란 지상부의 열수 추출물은 MITF 의 발현을 억제하는, 피부미백용 건강기능식품, 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 피부 색소 침착 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명은 또한, 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 포함하고, 상기 택란 지상부의 열수 추출물은 MITF 의 발현을 억제하는, 피부 미백용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 a) 택란(lycopi herba)에서 지상부를 분리하는 단계, b) 상기 분리된 택란의 지상부에 증류수를 첨가하고, 80 내지 120℃에서 1 내지 5시간 동안 가열하는 단계, 및 c) 상기 b) 단계에 따른 가열물에서 택란 잔여물을 필터링한 후 감압농축하여 택란 지상부의 열수 추출물을 제조하는 단계를 포함할 수 있다. 여기서, 상기 택란 지상부의 열수 추출물은 MITF의 발현을 억제할 수 있다.
본 발명의 피부미백용 화장료 조성물은 택란 지상부의 열수 추출물을 MITF 저해제로 함유하여 피부 내 멜라닌 생성을 감소시킬 수 있는 장점이 있다.
본 발명의 피부미백용 화장료 조성물은 천연 추출물을 이용하여 부작용이 높지 않은 이점이 있다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 피부미백용 건강기능식품, 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물 및 피부 색소 침착 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물이 제공될 수 있다.
도 1은 흑색종(B16F1) 세포에 α-멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH) 및 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 택란 지상부의 열수 추출물, 에탄올 추출물을 처리한 후 MTT assay를 통해 측정한 세포독성 실험결과이다. 도 1을 참조하면, 에탄올 추출의 경우 50μg/mL부터 세포독성이 발생하는 것을 알 수 있으나, 열수 추출의 경우 50μg/mL에서도 세포독성이 확인되지 않는다.
도 2는 흑색종 세포에 택란 지상부의 열수 추출물, 에탄올 추출물 및/또는 α-멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)를 각각 처리하고, 분광광도계를 이용하여 흡광도를 측정하여 멜라닌의 함량을 확인한 이미지이다. 도 2를 참조하면, 택란 지상부 추출물 농도가 12.5 내지 50μg/mL일 때, 멜라닌 함량의 평균 값이 열수 추출물에서 더 낮다는 것을 알 수 있다. 특히, 택란 지상부 추출물 농도가 50μg/mL인 경우, 열수 추출을 이용하였을 때 멜라닌 함량이 유의적으로 적다는 것을 알 수 있다.
도 3은 흑색종 세포에 택란 지상부의 열수 추출물, 에탄올 추출물 및/또는 α-멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)를 각각 처리한 후, 각 세포에서의 티로시나아제 활성을 확인한 그래프이다. 도 3에서 티로시네이스(tyrosinase) 활성은 낮을수록 미백에 효과가 좋다고 볼 수 있다. 도 3의 그래프를 참조하면, 열수 추출의 경우 에탄올 추출의 경우보다 티로시나아제의 활성을 유의적으로 억제시킬 수 있음을 알 수 있다. 이러한 효과는 특히, 택란 지상부 열수 추출물의 농도가 50μg/mL일 때 유의적이다.
도 4는 멜라닌 생성 과정의 주요 효소인 티로시네이스(tyrosinase), TRP-1, TRP-2의 발현을 확인한 결과이다. 흑색종(B16F1) 세포에 12.5, 25, 50μg/mL의 농도로 택란 지상부의 열수 추출물을 처리한 결과 α-MSH에 의해 증가된 티로시네이스(tyrosinase)와 TRP-1, TRP-2의 발현 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있다. 이와 같은 결과는 특히, 50 μg/mL의 농도에서 유의적임을 알 수 있다.
도 5는 TRP-1, TRP-2의 발현을 유도하는 전사인자인 MITF의 발현을 확인한 결과이다. 흑색종(B16F1) 세포에 12.5, 25, 50 μg/mL의 농도로 택란 지상부의 열수 추출물을 처리한 결과 α-MSH에 의해 증가된 MITF 단백질 수준이 감소하는 것을 확인할 수 있다.
도 6은 흑색종(B16F1) 세포에 택란 지상부의 열수 추출물, α-멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH)를 각각 처리한 후, MAPK 단백질(p38, p-p38, JNK, p-JNK, ERK, p-ERK)의 발현 억제 효과를 확인한 결과이다. 기존 미백 관련 기전 연구에서 ERK의 인산화가 증가되면 MITF가 저해되고 티로시네이스의 발현을 하향 조절하는 것으로 잘 알려져 있는데, 택란 지상부의 열수 추출물과 코직산을 처리하였을 때, ERK의 인산화를 활성화하는 것을 확인할 수 있다. 이는 택란 지상부의 열수 추출물이 티로시네이스(tyrosinase)의 발현을 억제할 수 있다는 것을 의미한다. 특히, 택란 지상부의 열수 추출물의 경우, 단순 농도 증가와는 별개로, 50 μg/mL의 농도에서 유의적으로 ERK의 인산화가 촉진된다는 것을 알 수 있다.
도 7은 본 발명의 일 실시예에 따라 흑색종(B16F1) 세포에서 p-CREB 발현 및 cAMP 농도에 대한 택란 지상부의 열수 추출물의 효과를 확인한 결과이다. 도 7의 (A) 내지 (C)를 참조하면, α-MSH에 의해 증가된 cAMP 및 p-CREB의 농도가 택란 지상부의 열수 추출물의 처리에 따라 감소됨을 확인할 수 있다.
도 8은 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 택란 뿌리 추출물의 처리 시 B16F1 세포 내 멜라닌 함량의 변화를 확인한 그래프이다. 도 8에서, R-Water는 택란(Lycopus lucidus) 뿌리의 물 추출물, R-Ethanol는 택란(Lycopus lucidus) 뿌리의 에탄올 추출물, KA는 코직산(1mM)을 의미한다(###p<0.001 대조군과 비교; ***p<0.001, α-MSH 자극군과 비교).
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 제조된 택란 뿌리 추출물의 처리 시 B16F1 세포의 세포 생존율을 확인한 결과이다. 도 9에서, R-Water는 택란(Lycopus lucidus) 뿌리의 물 추출물, R-Ethanol는 택란(Lycopus lucidus) 뿌리의 에탄올 추출물, KA는 코직산(1mM)을 의미한다. 도 9에서의 결과는 3개의 독립적인 실험에서의 평균 ± SD로 표시되었다(대조군과 비교하여 #p<0.05, ###p<0.001).
이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명한다. 본 발명의 이점 및 특징, 그리고 그것들을 달성하는 후술되어 있는 실시 예들을 참조하면 명확해질 것이다. 그러나 본 발명은 이하에서 게시되는 실시 예들에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있으며, 단지 본 실시예들은 본 발명의 게시가 완전하도록 하고, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이며, 본 발명은 청구항의 범주에 의해 정의될 뿐이다. 명세서 전체에 걸쳐 동일 참조 부호는 동일 구성 요소를 지칭한다.
다른 정의가 없다면, 본 명세서에서 사용되는 모든 용어(기술 및 과학적 용어를 포함)는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 공통적으로 이해될 수 있는 의미로 사용될 수 있을 것이다. 또 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 용어들은 명백하게 특별히 정의되어 있지 않는 한 이상적으로 또는 과도하게 해석되지 않는다. 본 명세서에서 사용된 용어는 실시예들을 설명하기 위한 것이며 본 발명을 제한하고자 하는 것은 아니다. 본 명세서에서, 단수형은 문구에서 특별히 언급하지 않는 한 복수형도 포함한다.
본 명세서에서, 택란(lycopi herba) 추출물은 택란의 다양한 기관 또는 부분(예: 잎, 꽃, 뿌리, 줄기, 가지, 껍질 및 종자 등)으로부터 추출하여 얻은 것을 의미한다. 본 발명에서는 택란(lycopi herba)의 지상부 추출물을 이용한다. 택란의 뿌리는 "지순"이라고도 하며, 산후복통 등에 효과가 좋다고 알려져 있으나, 택란의 지순과 지상부는 함유된 성분이 달라, 서로 다른 효능을 갖는다.
본 명세서에서 "지상부"란 지표면 위에 있는 식물체의 부분을 의미하며, 줄기, 잎, 눈 및 꽃 부분이 포함될 수 있다. 본 발명에서 택란(lycopi herba)의 지상부는 택란의 줄기를 포함한다.
본 발명에 따른 택란(lycopi herba) 지상부 추출물은 글루코시드 (glucoside), 타닌(tannin), 플라보노이드(flavonoide) 배당체, 페놀(phenol)류, 아미노산, 유기산, 사포닌(aponin), 글루코스(glucose), 갈락토오스(galactose), 리코포오스(lycopose), 라피노스(raffinose), 스타키오스(stachyose) 및 프룩토오스(fructose)를 함유할 수 있다.
본 발명의 추출물은 상술한 추출 용매에 의한 추출물뿐만 아니라, 통상적인 정제 과정을 거친 추출물도 포함한다. 예컨대, 이산화탄소에 의한 감압, 고온에 의한 초임계추출법에 의한 추출, 초음파를 이용한 추출법에 의한 추출, 일정한 분자량 컷-오프 값을 갖는 한외 여과막을 이용한 분리, 다양한 크로마토그래피 (크기, 전하, 소수성 또는 친화성에 따른 분리를 위해 제작된 것)에 의한 분리 등, 추가적으로 실시된 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 활성 분획도 본 발명의 추출물에 포함되는 것이다. 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 따르면, 본 발명의 추출물은 열수추출방법에 따라 추출된 것이다.
본 발명의 일 실시예에 따르면, 택란(lycopi herba) 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 화장료 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명의 택란(lycopi herba) 추출물은 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉, 통상적인 온도와 압력의 조건 하에서, 통상적인 용매를 사용하여 제조될 수 있으며, 바람직하게는 정제수(또는 물), 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올, 글리세린, 에틸아세테이트, 아세톤, 부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 디클로로메탄, 클로로포름, 에틸에테르, 부틸렌글라이콜 및 헥산으로 이루어진 군으로부터 선택된 적어도 하나의 용매를 사용하여 추출되며, 가장 바람직하게는 증류수를 사용하여 열수 추출된다.
본 발명의 일 실시예에 따르면 피부미백용 화장료 조성물은 상기 택란(lycopi herba) 지상부 추출물을 12.5 ~ 50μg/mL의 농도로 포함할 수 있다. 상기 추출물의 농도가 12.5μg/mL 미만인 경우에는 미백 효과가 극히 미약하며, 50μg/mL초과인 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하며, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있고, 경제적이지 못하다. 본 발명의 가장 바람직한 일 실시예에 따르면, 본 발명의 화장료 조성물은 택란의 지상부 추출물을 50μg/mL의 농도로 포함한다.
본 발명의 다른 실시예에 따르면, 본 발명의 피부미백용 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 또는 스프레이의 제형일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 건강기능식품이 제공될 수 있다.
택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부미백용 건강기능식품은 유효성분인 상기 택란 추출물의 혼합물을 함유하는 것 외에 통상의 식품 조성물과 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다.
상기 건강기능식품의 제제 형태는 정제, 캅셀, 분말, 과립, 액상, 환 등이 될 수 있다. 예를 들어, 정제 또는 캡슐제의 형태로의 제제화를 위해, 유효성분은 에탄올, 글리세롤, 물 등과 같은 경구, 무독성의 약제학적으로 허용 가능한 불활성 담체와 결합될 수 있다. 또한, 원하거나 필요한 경우, 적합한 결합제, 윤활제, 붕해제 및 발색제 또한 혼합물로 포함될 수 있다. 적합한 결합제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 젤라틴, 글루코스 또는 베타-락토오스와 같은 천연 당, 옥수수 감미제, 아카시아, 트래커캔스 또는 소듐올레이트와 같은 천연 및 합성 검, 소듐 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 벤조에이트, 소듐 아세테이트, 소듐 클로라이드 등을 포함한다. 붕해제는 이에 제한되는 것은 아니나, 녹말, 메틸 셀룰로스, 아가, 벤토니트, 잔탄 검 등을 포함한다. 액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1 성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명에서 상기 피부 색소 침착 질환은 기미 (melasma), 주근깨 (freckle), 흑색종(melanoma)으로 이루어진 군에서 선택된 적어도 어느 하나를 포함할 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물의 추출물은 담체, 희석제 및 부형제 중 하나 이상을 더 포함하여 과립제, 레모네이드제, 산제, 시럽제, 액제, 엑스제, 엘릭서제, 유동엑스제, 유제, 현탁제, 전제, 침제, 정제, 주정제, 캡슐제, 틴크제, 환제, 경피흡수제, 로션제, 리니멘트제, 에어로솔제, 연고제, 첩부제, 파스타제, 카타플라스마제, 크림제, 유제, 페이스트제제, 비수용성용제, 동결건조 제제, 좌제 및 주사제로 이루어진 군에서 선택된 하나를 제형으로 할 수 있다.
또한, 상기 본 발명에 더 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 제제화 시에 일반적으로 사용되는 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내 용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 또한 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propyleneglycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 상기 상술한 제형 내 유효성분으로서의 본 발명에 따른 추출물의 함량은 사용 형태 및 목적, 환자 상태, 증상의 종류 및 경중 등에 의하여 적절하게 조절할 수 있다.
본 발명의 추출물 함유 조성물의 투여 용량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여형태, 건강상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있으며, 의사 또는 약사의 판단에 따라 일정 시간간격으로 1일 1회 내지 수회로 분할 투여할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 실시예에 따르면 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 색소 침착 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물이 제공될 수 있다.
본 발명에서 사용되는 용어 "의약외품"은 사람이나 동물의 질병을 진단, 치료, 개선, 경감, 처치 또는 예방할 목적으로 사용되는 물품들 중 의약품보다 작용이 경미한 물품들을 의미하는 것이다. 예를 들어 약사법에 따르면 의약외품이란 의약품의 용도로 사용되는 물품을 제외한 것으로, 사람ㆍ동물의 질병 치료나 예방에 쓰이는 제품, 인체에 대한 작용이 경미하거나 직접 작용하지 않는 제품 등이 포함된다.
본 발명의 의약외품 조성물은 피부 색소 침착 개선을 목적으로 사용되는 것으로, 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 영양화장수, 마사지크림, 영양크림, 팩, 마스크팩, 마스크시트, 젤 또는 피부 점착타입 화장료의 제형을 갖는 화장료 조성물일 수 있으며, 또한, 로션, 연고, 겔, 크림, 패취 또는 분무제와 같은 경피투여형 제형일 수 있다.
또한, 각 제형에 있어서 의약외품 조성물은 다른 성분들을 기타 의약외품의 제형 또는 사용목적 등에 따라 임의로 선정하여 배합할 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적(억제 또는 완화)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 예를 들어, 점증제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 및 담체 등을 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
1-1. 택란 지상부 추출물의 제조
본 실험에 사용된 택란(Lycopus uniflorus Michaux.)은 구입하여 이용하였다. 택란은 물(열수 추출)과 100%에탄올로 추출하여 2종의 추출물을 제조하였다. 택란 지상부의 물(열수) 추출물의 제조 방법은 시료(분리된 택란 지상부) 50g 당 증류수 1L를 넣고 전기약탕기 (대웅약탕기, 대웅바이오가전, 한국)를 이용하여 2시간 동안 끓인 후, 필터페이퍼 (advantec, No.41)를 이용하여 필터링하였으며, 감압농축한 다음 동결 건조하였다.
택란 지상부의 100% 에탄올 추출물의 제조방법은 시료 50g 당 용매 1L를 넣은 후 1시간 동안 초음파처리(sonicate)한 다음 상온에서 보관(overnight)하여 1차 추출하였고, 다음날 1차 추출용매를 제거한 후 다시 용매 IL를 추가하여 같은 방법으로 2차 추출하였다. 다음날 1, 2차 추출물을 모아 필터링 후 감압농축한 다음 동결건조하여 시료로 사용하였다.
1-2. 택란 뿌리 추출물의 제조
택란의 지상부를 제외한 택란의 뿌리 부분을 열수추출물과 에탄올로 추출하여 시료를 제조하여 멜라닌 억제 효능 평가를 수행하였다. 택란뿌리 추출방법은 지상부 추출 방법과 같다.
1-3. 추출 수율
실시예 1-1에 따라 제조된 물(열수)추출물, 100% 에탄올 추출물의 수율은 하기와 같이 나타났다. 열수 추출물 및 에탄올 추출물의 수율은 각각 16.38%, 2.95%로, 열수로 추출하였을 때의 수율이 에탄올로 추출했을 때의 수율보다 5배 이상 높았다.
1-4. 세포 배양
마우스 흑색종 세포주(Mouse melanoma cell line)인 흑색종(B16F1) 세포를 이용하여 실험을 진행하였으며, 10% fetal bovin serum (FBS)과 1% penicillin streptomycin을 포함한 DMEM 배지를 이용하여, 5% CO2, 37℃를 유지하면서 인큐베이터에서 배양하였다.
1-5. 통계처리
이하 본 연구에서 시행된 실험은 총 3회 이상 반복되었고 데이터의 통계적인 유의성 검정은 GraphPad Prism 5.0 프로그램을 이용하여 Student t-test 및 ANOVA방법으로 검증하였다. 결과 값은 mean ± standard deviation (SD)로 나타내었고, p value는 0.05 미만인 경우를 통계적인 유의성이 있다고 판단하였다.
세포 독성 평가
택란 지상부 추출물의 세포독성평가는 MTT assay 방법으로 확인하였다. B16F1 세포를 1X104 밀도로 24 well plate에 시딩(seeding)한 후 다음날, 택란 지상부 추출물 (실시예 1-1에 따라 제조된 열수 추출물, 100%에탄올 추출물)과 양성대조군 코직산(kojic acid, 1 mM) 및 α-멜라닌세포 자극 호르몬(α-MSH, 200 nM)을 처리하고, 72시간 동안 37℃에서 배양하였다. 72시간 후에, MTT 시약이 포함된 배지로 교체한 후 37℃에서 1시간 동안 더 배양하였다. MTT 시약이 함유된 배지를 제거하고, 다이메틸설폭시화물(DMSO) 400μL를 넣어 보라색으로 생성된 포르마잔 (formazan)을 용해시켰다. 용해물질을 96 well plate로 150 μL씩 옮긴 후, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. α-MSH를 처리하지 않은 대조군의 생존율을 100%로 하여 시료 처지군의 세포 생존율을 계산하였다. 그 결과는 도 1과 같다.
도 1에서는 택란 지상부를 증류수(열수), 100% 에탄올로 추출하여 2종의 시료(실시예 1-1)를 확보하여 세포 독성을 확인하였다. 택란 지상부의 열수 추출물 및 100% 에탄올 추출물을 12.5, 25, 50 μg/mL의 농도로 처리를 하고 72시간 후 MTT assay를 수행하였다. 그 결과, 열수 추출물은 50 μg/mL이하의 농도에서 독성이 나타나지 않았고 에탄올 추출물은 25 ug/mL 이하의 농도에서 세포독성이 나타나지 않았다. 즉, 본 실시예에 따르면, 택란 지상부의 열수 추출물은 12.5 내지 50 μg/mL의 농도에서 독성이 나타나지 않는 반면, 택란 지상부의 에탄올 추출물의 경우 50 μg/mL 이상의 농도에서는 독성이 나타남을 알 수 있다.
멜라닌(Melanin) 합성 저해능 측정
본 발명에 따라 제조된 택란 추출물의 처리에 따른 멜라닌 함량을 측정하기 위해, B16F1 세포를 8X104 밀도로 60 mm 디시(dish)에 시딩(seeding) 후 농도별 택란 지상부의 열수 추출물과 100% 에탄올 추출물 (12.5, 25, 50 μg/mL)과 양성대조군인 코직산 (kojic acid, 1 mM)과 α-MSH (200 nM)을 처리하고, 72시간 동안 37℃에서 멜라닌 생성을 유도하였다. 72시간 후에 세포를 회수한 후, 10% 다이메틸설폭시화물(DMSO)이 함유된 1M 수산화나트륨(NaOH)을 넣고 80℃에서 1시간 동안 넣어 멜라닌을 녹인 후 흡광도 405 nm에서 멜라닌의 함량은 측정하였다. 그 결과는 도 2와 같다.
도 2를 참조하면, 같은 농도로 시료를 처리하여 세포 내 멜라닌 생성양을 측정한 결과, α-MSH로 멜라닌 합성을 유도하였을 때 세포내 멜라닌 생성양은 172.67%로 증가하였다. 택란 지상부의 열수추출물 (12.5, 25, 50 μg/mL)을 처리하였을 때의 세포내 멜라닌 생성양은 각각 160.46%, 153.77%, 127.90%로 멜라닌 생성을 억제하였다. 또한, 100% 에탄올 추출물 (12.5, 25, 50 μg/mL)을 처리하였을 때, 세포내 멜라닌 생성양은 각각 170.05%, 147.09%, 135.46%로 억제되었다. 결과를 종합하였을 때, 택란 지상부의 열수 추출물은 전반적으로 에탄올추출물 보다 멜라닌 생성 억제 효능이 우수하다는 것을 알 수 있다.
Tyrosinase 저해 활성 측정
본 실시예에서는 택란 지상부 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과가 멜라닌 생성 과정의 주요 효소인 티로시네이스(Tyrosinase) 활성 억제에 의한 것인지 확인하기 위하여, 세포내 티로시네이스(Tyrosinase) 활성 억제실험을 수행하였다. B16F1 세포를 8X104 밀도로 60 mm 디시(dish)에 넣고, 농도별 택란 지상부의 열수 추출물과 에탄올추출물 (12.5, 25, 50 μg/mL)과 양성대조군인 코직산 (kojic acid, 1 mM)과 α-MSH (200 nM)을 처리하고, 72시간 동안 37℃에서 배양하였다. 72시간 배양 후 phosphate buffered saline (PBS)로 세척한 다음, 세포를 모은 후 lysis buffer (PRO-PREP, iNtRON, Korea)를 이용하여 단백질을 추출하여 정량한 후, 96well plate에 같은 양의 단백질을 넣고 L-dopa (2 mg/mL)를 첨가하였다. 37℃에서 1시간 반응시킨 후 450nm에서 흡광도를 측정하였다. 티로시네이스(Tyrosinase)의 활성도는 α-MSH를 처리하지 않은 대조군의 흡광도에 대한 백분율로 계산하였다. 본 실험에 다른 결과는 도 3 및 하기 표 1과 같다.
택란 열수 추출물 및 100% 에탄올(주정) 추출물의 멜라닌합성 억제활성 및 티로시나제 억제 활성 비교
추출방법 농도(ug/mL) Intracellular melanin (Inhibition %) 티로시네이스 활성도(Tyrosinase activity(Inhibition %))
- Control 100% 100%
- α-MSH (200 ng/mL) 172.67% 297.08%
열수추출 12.5 160.46% (16.80%) 242.33% (27.78%)
25 153.77% (26.00%) 229.44% (34.32%)
50 127.90% (61.60%) 172.50% (63.21%)
에탄올추출 12.5 170.05% (3.60%) 273.96% (11.73%)
25 147.09% (35.2%) 248.66% (24.56%)
50 135.46% (51.20%) 207.29% (45.56%)
도 3 및 표 1의 내용을 참조하면, 택란 지상부의 열수 및 에탄올 추출물 모두 티로시네이스(Tyrosinase) 활성을 억제하였다. 택란 지상부의 열수 추출물을 50 μg/mL 농도를 처리하였을 때 양성대조군인 코직산 (1 mM, 142 μg/mL) 보다 우수한 티로시네이스(Tyrosinase) 활성 억제 효과가 나타나, 가장 유의한 추출방법에 따른 처리 농도임을 알 수 있다.
5-1. 단백질 발현 분석 (western blot)
택란 지상부의 열수(물) 추출물의 멜라닌 합성 억제 기전 확인을 위해 멜라닌 생성 과정의 주요 효소인 tyrosinase, TRP-1, TRP-2 및 이들의 발현을 유도하는 전사인자인 MITF(microphthalmia-associated transcription factor)의 발현을 관찰하였다. B16F1 세포를 8X104 밀도로 60 mm dish에 넣고, 농도별 택란 지상부의 열수추출물 (12.5, 25, 50 μg/mL), 양성대조군인 코직산 (kojic acid, 1 mM)과 α-MSH (200 nM)을 처리하고, 72시간 동안 37℃에서 배양하였다. 72시간 후에, 세포는 PBS로 세척한 후 lysis buffer를 이용하여 단백질을 추출하였다. 추출한 단백질은 Bradford assay 방법으로 정량하였으며, 정량한 단백질은 10% SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)로 분리한 후 polyvinylidene difluoride (PVDF) 멤브레인으로 옮겼다. 멤브레인은 Tris-buffered saline-Tween 20 solutions (TBS-T)으로 녹인 5% skim milk로 1시간 동안 블락킹(blocking)하였으며, TBS-T로 세척 후 1차 항체로 4℃에서 overnight 시켰다. 다음날, TBS-T로 세척한 후 2차 항체 (anti-mouse 및 anti-rabbit IgG)로 상온에서 1시간 반응시켰다. 단백질 밴드는 HRP substrate 및 ImageQuant LAS 500 (GE Healthcare Life Science, USA)을 통해 확인하였다. 해당 결과는 도 4 및 도 5에 나타나있다.
도 4 및 도 5를 참조하면 B16F1 세포에 12.5, 25, 50 μg/mL의 농도로 택란 지상부의 열수 추출물을 처리한 결과 α-MSH에 의해 증가된 tyrosinase와 MITF 단백질 수준이 감소함을 알 수 있다.
또한, 본 실시예에서는 상기 단백질 발현 분석 방법을 이용하여, 티로시네이스(tyrosinase) 저해 기전을 확인하기 위하여 MAPK (p38, p-p38, JNK, p-JNK, ERK, p-ERK)를 측정하였다 (도 6 참조). 기존 미백 관련 기전 연구에서 ERK의 인산화가 증가되면 MITF가 저해되고 티로시네이스(tyrosinase) 발현을 하향 조절하는 것으로 잘 알려져 있는데, 기존 연구 결과와 마찬가지로 택란 지상부의 열수추출물과 코직산을 처리하였을 때, ERK의 인산화를 활성화하였다. 또한, 택란 지상부의 열수추출물 또는 코직산을 처리하였을 때 α-MSH 처리로 인하여 활성화된 p-p38과 p-JNK가 저해되었다. 따라서, 택란 지상부의 열수추출물의 미백효과를 나타내는 메커니즘은 MAPK 경로의 조절을 통하여 tyrosinase 발현을 억제함으로써 멜라닌 생성을 감소시키는 것임을 알 수 있다.
즉, 본 발명에 따라 제조된 택란의 지상부 추출물은 MITF 저해제로 이용될 수 있음을 알 수 있고, 이 중에서도 택란의 지상부를 열수 추출하였을 때, 50μg/mL 농도에서 가장 유의적인 효과를 나타낸다.
5-2. 세포 내 cAMP 농도 측정 (ELISA assay)
흑색종 세포의 cAMP 생성량을 측정하기 위해서, B16F1 세포를 30 X 104 밀도로 60 mm 디시(dish)에 넣고, 24시간 배양 후 농도별 택란 지상부의 열수추출물을 24시간 전처리 후 α-MSH (200 nM)를 처리하고 20분 동안 배양하였다. 이 후 배지를 제거하고 세포를 phosphate buffer saline (PBS)로 세척해 준 다음 lysis 버퍼로 세포를 떼어내어 냉동실에서 25분간 얼린 후 녹인 세포 용해물은 13,000 rpm에서 10분 동안 원심분리기를 이용하여 상층액을 분리하였다. 이후, 이를 이용하여 cAMP 농도는 cAMP ELISA kit (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA)를 사용하여 정량화하였다. 본 실험에 따른 결과는 도 7과 같다.
cAMP의 과도한 발현에 의해 tyrosinase 유전자발현이 유도되어 멜라닌 생성이 증가한다. B16F1 세포에 택란 지상부의 열수 추출물을 24시간 전처리한 후 α-MSH (200 nM)를 20분 처리한 후에 세포를 회수하여 cAMP 생성량을 확인하였다. α-MSH를 처리하였을 때의 cAMP의 농도는 204.79 pmol로 무처리군의 cAMP 농도가 4.61 pmol인 것에 비해 40배 이상 증가하였다(도 7 참조). 택란 지상부의 열수추출물을 12.5, 25, 50 μg/mL의 농도로 처리하였을 때의 cAMP의 농도는 각각 181.21 pmol, 153.94 pmol, 119.93 pmol로 감소하였다. 양성대조군인 코직산(kojic acid)을 처리하였을 때의 cAMP의 농도는 81.15 pmol이었다. 이를 통하여 택란 지상부의 열수 추출물 처리시 cAMP 생성이 유의적으로 억제됨을 알 수 있다.
택란 뿌리 추출물의 미백효과 분석
본 발명의 실시예 1-2에 따라 제조된 택란뿌리 추출물과 -MSH(200nM)를 동시 처리하고 72시간 후 멜라닌 함량의 변화를 측정하였다. -MSH를 처리하였을 때 멜라닌 생성량은 무처리군 대비 약 170% 정도 증가하였으며, 택란뿌리 열수추출물을 12.5-50ug/mL로 처리하였을 때 멜라닌 생성 변화량은 유의적인 차이가 나타나지 않았다(도 8 참조). 택란뿌리 에탄올추출물을 12.5-50ug/mL의 농도로 처리하고 -MSH를 200nM로 처리하였을 때는 멜라닌 생성량이 농도의존적으로 감소하는 것을 확인하였다 (도 8 참조). 그러나, 이는 독성으로 인한 세포 생존율의 감소로 멜라닌 생성량이 감소된 것으로 확인되었다 (도 9 참조). 따라서, 택란뿌리 열수추출물은 멜라닌 합성 억제가 나타나지 않았으며, 택란뿌리 에탄올추출물은 독성이 확인되었다. 이상의 결과를 종합할 때, 택란 지상부의 열수 추출물은 멜라닌 합성 억제 효능이 우수한 반면 뿌리 추출물은 멜라닌 합성 억제 효능이 미미한 것을 알 수 있다.
특히, 본 발명에 따라 택란의 지상부 추출물을 제조 시 물 추출을 이용하였을 경우 에탄올 추출물보다 미백효과가 좋았으나, 택란의 뿌리 추출물의 경우는 물추출물에서 전혀 효과가 발생하지 않았으며, 에탄올 추출물에서의 멜라닌 생성 감소 효과는 세포 생존 저하에 따른 것이므로, 이와 같은 도출은 단순히 추출 농도에 의존되는 효과가 아님을 알 수 있다.
이상 본 발명의 실시예들을 설명하였지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

Claims (12)

  1. 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 12.5 ~ 50μg/mL의 농도로 포함하고, 상기 택란은 흑쉽싸리(Lycopus uniflorus Michaux.)인, 피부미백용 화장료 조성물.
  2. 제1 항에 있어서,
    상기 택란(lycopi herba) 지상부는 택란의 줄기를 포함하는 것인, 피부미백용 화장료 조성물.
  3. 삭제
  4. 제1 항에 있어서,
    상기 열수 추출물은 택란의 지상부를 80 내지 120℃에서 1 내지 5시간 동안 열수 추출한 것인, 피부미백용 화장료 조성물.
  5. 삭제
  6. 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 12.5 ~ 50μg/mL의 농도로 포함하고, 상기 택란은 흑쉽싸리(Lycopus uniflorus Michaux.)인, 피부미백용 건강기능식품.
  7. 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 12.5 ~ 50μg/mL의 농도로 포함하고, 상기 택란은 흑쉽싸리(Lycopus uniflorus Michaux.)인, 피부 색소 침착 질환 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 택란(lycopi herba) 지상부의 열수 추출물을 12.5 ~ 50μg/mL의 농도로 포함하고, 상기 택란은 흑쉽싸리(Lycopus uniflorus Michaux.)인, 피부 색소 침착 질환 예방 또는 개선용 의약외품 조성물.
  9. 피부 미백용 조성물의 제조방법에 있어서,
    a) 택란(lycopi herba)에서 지상부를 분리하는 단계;
    b) 상기 분리된 택란의 지상부에 증류수를 첨가하고, 80 내지 120℃에서 1 내지 5시간 동안 가열하는 단계; 및
    c) 상기 b) 단계에 따른 가열물에서 택란 잔여물을 필터링한 후 감압농축하여 택란 지상부의 열수 추출물을 전체 조성물에 대해 12.5 ~ 50μg/mL의 농도로 포함하도록 제조하는 단계를 포함하고,
    상기 택란은 흑쉽싸리(Lycopus uniflorus Michaux.)인, 피부미백용 조성물의 제조방법.
  10. 제9 항에 있어서,
    상기 택란(lycopi herba) 지상부는 택란의 줄기를 포함하는 것인, 피부미백용 조성물의 제조방법.
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