JP6929836B2 - 植物搾汁物由来の細胞外小胞体を含む皮膚改善および脱毛防止用組成物 - Google Patents
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Description
[実施例1]
ドラゴンフルーツ、ドラゴンフルーツの葉、ブルーベリー、アボカド、アスパラガス、マンゴー、ササゲ(cowpea)、トウガラシ、ザクロおよびウコンを蒸留水で洗浄した後、撹拌速度が40rpmの低速スクリューで搾汁して得られた液状の植物汁を篩にかけて浮遊物を除去した。この後、25℃で10分間培養し、2,000gで30分間遠心分離して上澄液を分離した後、ポリビニリデンジフルオライド材質の0.45μmの気孔を含む濾過膜で濾過し、この後、同一材質の0.22μmの気孔を含む濾過膜で濾過して濾液を得た。
前記実施例1で得られた濾液内に含まれた細胞外小胞体の含有量および分布を確認するために、ブラッドフォード蛋白質アッセイ(Bradford protein assay)を用いて、ドラゴンフルーツ、ドラゴンフルーツの葉、ブルーベリー、アボカド、アスパラガス、マンゴーおよびトウガラシから得られた濾液内に含まれた蛋白質の含有量を測定して、その結果を図1にグラフで示した。また、NTA(Nanoparticle tracking analysis)により、ダイズ、ニンニクおよびショウガから得られた濾液に含まれた細胞外小胞体のサイズ別の分布と粒子数を測定して、その結果を下記表1および図2に示し、透過電子顕微鏡(TEM)を用いて、ダイズから得られた濾液内に含まれた細胞外小胞体の写真を撮影して図3に示した。
線維芽細胞2×104細胞/mlを24ウェルに接種し、24時間後にササゲ(cowpea)から得られた細胞外小胞体をPKH26レッド蛍光細胞リンカーキット(Sigma)で標識した後、前記線維芽細胞に処理した。6時間培養後、1μmのDAPIをPBSで希釈して、5分間暗い空間下で培養し、PBSで洗浄した後、蛍光顕微鏡で撮影して、その結果を図4に示した。
毛乳頭細胞(Dermal papilla cell、DPC)2×104細胞/mlを24ウェルプレート(SPL、Korea)に同一に分注した。24時間の安定化時間後、実施例1で得られた細胞外小胞体を含む濾液を細胞に48時間処理した。MTS試薬(Promega、USA)と細胞の基本培地(FBS free、1%p/s)を1:5の比率で希釈して、各ウェルあたり500μlずつ分注し、1時間30分反応後、490nmの波長における吸光度を測定し、細胞生存率の変化を評価して、その結果を図5にグラフで示した。ただし、陽性対照群には10%ウシ胎児血清(FBS)を処理し、陰性対照群には何ら処理をしなかった。
毛乳頭細胞(DPC)5×105細胞/mlを60mmのディッシュ(SPL、Korea)に同一に分注し、実施例1で得られた細胞外小胞体を含むダイズ由来の濾液を細胞に48時間処理した。この後、RNA分離キット(Quiagen、USA)を用いて細胞からRNAを分離した後、cDNA合成キット(Intronbio、Korea)を用いて分離されたRNA1μgに対するプライマーを合成した。プライマーは10pmol/μlの濃度で使用し、2Xサイバーグリーンマスターミックス(Takara、Japan)を添加して、LEF−1(Lymphoid enhancer−binding factor−1)、ベルシカン(Versican)、Gli−1およびPtc−1(the patched protein−1)遺伝子の発現程度を検出して、その結果を図6にグラフで示した。ただし、対照群には何ら処理をしなかった。
皮膚角質形成細胞(HaCat)2×104細胞/mlを24ウェルプレート(SPL、Korea)に同一に分注した。24時間の安定化時間後、実施例1で得られた細胞外小胞体を含むアスパラガス由来の濾液を0.5μg、1μgおよび5μgの量で細胞に48時間処理した。MTS試薬(Promega、USA)と細胞の基本培地(FBS free、1%p/s)を1:5の比率で希釈して、各ウェルあたり500μlずつ分注し、1時間30分反応後、490nmの波長における吸光度を測定し、細胞生存率を評価して、その結果を図7にグラフで示し、細胞数を測定して、対照群対比の細胞数の変化を図8にグラフで示した。ただし、対照群には何ら処理をしなかった。
ヒト皮膚線維芽細胞(human diploid fibroblast、HDF)5×104細胞/ウェルの濃度で培養皿に付着させた後、実施例1で得られた細胞外小胞体を含むアスパラガス由来の濾液を5μgおよび10μgの量で処理した。48時間培養後、各細胞でイントロンプレミックス(intron premix)を用いてcDNAを合成し、これを用いてリアルタイムPCRを行った。それぞれの処理群の細胞で皮膚老化防止および再生関連遺伝子であるケラチン細胞成長因子(Keratinocyte growth factor)、プロコラーゲン(procollagen)および線維芽細胞成長因子(basic fibroblast growth factor)の発現程度を確認して、その結果を図9〜図11にグラフで示した。
黒色腫細胞(B16F10)5×104細胞/mlを6ウェルプレート(SPL、Korea)に同一に分注した。24時間の安定化時間後、実施例1で得られた細胞外小胞体を含むアスパラガス由来の濾液(0.5μg、1μg、5μg)とメラニン誘導a−MSH0.5μgを細胞に処理した。72時間培養後に上澄液を除去し、冷PBS2mlで1回洗浄した後、1N NaOHをウェルあたり550μlずつ添加して細胞を溶かした後、ピペットで1.5mlに細胞収獲(harvest)し、100℃で30分間沸かした後、13,000rpmで遠心分離し、上澄液を新しいチューブに移した。上澄液100μlを96ウェルプレートに移した後、A450nmで対照群対比のメラニン含有量の変化を測定して、その結果を図12にグラフで示した。ただし、陽性対照群にはa−MSHのみを0.5μgで処理し、陰性対照群には何ら処理をしなかった。
ササゲを撹拌速度が40rpmの低速スクリューで搾汁した後、300gで10分、1,200gで20分、10,000gで30分間遠心分離して大きい粒子を除去した後、上澄液のみを取って、超遠心分離機器を用いて100,000gで1時間10分間遠心分離して、最終的に沈んだペレットを回収して、ササゲからエキソソームを抽出した。
Claims (9)
- 植物搾汁物由来の細胞外小胞体(extracellular vesicles)を有効成分として含み、
前記細胞外小胞体の平均直径は、100〜200nmであり、
前記植物は、ドラゴンフルーツ、ドラゴンフルーツの葉、ブルーベリー、アボカド、アスパラガス、マンゴー、ササゲ、トウガラシ、ザクロおよびウコンから構成された群より選択される1種以上である、脱毛予防または治療用薬学的組成物。 - 前記細胞外小胞体は、5〜10μg/mlの濃度で含まれる、請求項1に記載の脱毛予防または治療用薬学的組成物。
- 植物搾汁物由来の細胞外小胞体(extracellular vesicles)を有効成分として含む、請求項1又は2に記載の脱毛予防または治療用薬学的組成物の製造方法であって、
スクリューを用いて植物を搾汁して植物搾汁物を得るステップと、
前記植物搾汁物を静置培養するステップと、
培養された植物搾汁物を遠心分離して上澄液を回収するステップと、
前記上澄液を平均気孔サイズが0.1〜1.0μmの気孔を含む濾過膜で濾過して濾液を回収するステップとを含み、
前記スクリューは、撹拌速度が20〜100rpmであり、
前記濾液は、前記細胞外小胞体を含み、
前記細胞外小胞体の平均直径は、100〜200nmであり、
前記植物は、ドラゴンフルーツ、ドラゴンフルーツの葉、ブルーベリー、アボカド、アスパラガス、マンゴー、ササゲ、トウガラシ、ザクロおよびウコンから構成された群より選択される1種以上である、脱毛予防または治療用薬学的組成物の製造方法。 - 前記植物を搾汁するに先立ち、植物を洗浄して不純物を除去するステップをさらに含む、請求項3に記載の脱毛予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
- 前記静置培養は、20〜30℃で12〜48時間行われる、請求項3又は4に記載の脱毛予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
- 前記遠心分離は、100〜20,000gで10〜120分間1回以上行われる、請求項3〜5の何れか1項に記載の脱毛予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
- 前記遠心分離は、100〜500gで10〜30分間1次的に行い、1,000〜2,000gで10〜30分間2次的に行った後、5,000〜20,000gで30分〜1時間3次的に行われる、請求項3〜6の何れか1項に記載の脱毛予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
- 前記濾過は、平均気孔サイズが0.2〜0.5μmの気孔を含む濾過膜を用いて1回以上行われる、請求項3〜7の何れか1項に記載の脱毛予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
- 前記濾過は、平均気孔サイズが0.4〜0.5μmの気孔を含む濾過膜を用いて行われる1次的濾過と、平均気孔サイズが0.2〜0.3μmの気孔を含む濾過膜を用いて行われる2次的濾過を含む、請求項3〜8の何れか1項に記載の脱毛予防または治療用薬学的組成物の製造方法。
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