CN115778890B - 洋甘菊胞外囊泡在制备化妆品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了洋甘菊胞外囊泡在化妆品中的应用。洋甘菊胞外囊泡可用于制备美白或者促进皮肤修复、创伤愈合的化妆品；还可以作为化妆品功能性物质的载体。通过细胞实验发现，洋甘菊胞外囊泡能够抑制B16F10细胞增殖，且能够促进L929细胞创伤愈合。洋甘菊胞外囊泡包载大黄素与大黄素相比，具有更好的酪氨酸酶抑制和抗氧化能力。因此，洋甘菊胞外囊泡用作化妆品生物材料能够改善如大黄素等功能性成分的生物利用度。将洋甘菊胞外囊泡用来包载大黄素等功能性化妆品成分，能够改善其难溶于水和生物利用度低的问题，提高大黄素等活性成分在功能性化妆品中的应用效果，且制备方法简单，成本低。

Description

洋甘菊胞外囊泡在制备化妆品中的应用

技术领域

本发明属于化妆品技术领域，具体涉及洋甘菊胞外囊泡在化妆品中的应用。

背景技术

随着人们对化妆品的健康性和安全性要求越来越高,绿色天然的消费理念日益深入人心。由于植物活性成分不仅不良反应小,而且功效温和,植物源化妆品愈来愈受到消费者的青睐。一些活性物质面临着较差的水溶性和生物利用度低等问题，严重限制了其在功能性化妆品中的应用。因此，在植物材料中寻找一种用于递送活性物质的载体十分重要。

近年来，关于植物来源的胞外囊泡的研究受到广泛关注。胞外囊泡是细胞主动释放的纳米级膜囊泡。基于胞外囊泡的脂质双分子层结构，其能够实现对亲水性和疏水性物质的装载，在机体内部表现出良好的生物稳定性和生物相容性。一般认为，植物来源的胞外囊泡对病原菌具有抵抗防御作用，或者作为载体对于分泌蛋白的促分泌及运输作用，或将siRNA运输至真菌细胞中，沉默靶向转录本，发挥杀灭真菌细胞的作用。研究显示，植物的胞外囊泡(EVs)是可能是植物免疫应答的一个重要成员。细然而，将植物来源的胞外囊泡应用在化妆品上的研究极少。

洋甘菊含有多糖、挥发油、黄酮等化学成分，具有抗菌、抗氧化、抗炎等多种生物活性。沈珺莲等人的研究发现洋甘菊精油可以促进皮肤成纤维细胞增殖和迁移，具有促进皮肤创伤愈合的作用。洋甘菊可以抑制酪氨酸酶、具有抗氧化活性，是一种具有美白等功效潜力的化妆品植物。

大黄素具有抗肿瘤、抗炎、镇痛、保护器官等多种药理作用。

胡桂洲等人的研究发现大黄素具有抑制酪氨酸酶的作用，具有美白功效。但是由于大黄素几乎不溶于水，生物利用度低，极大地限制了它在美白化妆品中的应用。目前较常用的解决方法是制备大黄素纳米结构脂质体，尚未见到使用植物胞外囊泡递送大黄素的相关报道。

因此，需要对现有技术加以改进，解决这类功能性物质在化妆品中应用问题，尤其是提高脂溶性和难溶于水的物质的利用度。

发明内容

本发明针对现有技术中的不足，旨在提供一种洋甘菊胞外囊泡的应用。

本发明还提供一种洋甘菊胞外囊泡包载大黄素，并将其用于化妆品。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种洋甘菊胞外囊泡在制备化妆品中的应用。

进一步，所述的化妆品为美白或者促进皮肤修复、创伤愈合的化妆品。优选的，所述的化妆品具有抑制黑色素生成、抑制酪氨酸酶活性、促进皮肤成纤维细胞增殖或者促进皮肤创伤愈合。

洋甘菊胞外囊泡还作为功能性物质的载体应用于化妆品。

洋甘菊胞外囊泡可以包载水溶性、溶性或者油性的化妆品功能性物质。

上述洋甘菊胞外囊泡的制备方法，包括如下步骤：

(1)洋甘菊清洗浸泡后，经破碎、挤压后收集汁液；

(2)获得的洋甘菊汁液经过由低到高的差速离心去除植物纤维、细胞碎片沉淀，取上清液；

(3)获得的上清液经超高速离心，取沉淀，得到洋甘菊胞外囊泡沉淀。

优选的，步骤(1)中，洋甘菊清洗后置于无菌水中浸泡12-30h；优选方式为在无菌水中浸泡24h。

优选的，步骤(1)中，洋甘菊经破碎、挤压后过150-300目滤布或滤网收集汁液；优选方式为过200目滤布或滤网。

步骤(2)中，所述差速离心的过程为：1000g-1200g，1-3次，每次5-15min；3000-3500g，1-3次，每次5-15min；10000-12000g，1-3次，每次20-40min；20000g，1-3次，每次20-40min。本发明的一个优选方式中，所述差速离心的过程为：1000g，10min×2；3000g，10min×2；10000g，30min×2；20000g，30min×2。

步骤(3)中，所述超高速离心为100000-150000g离心0.5-3小时。本发明的一个优选方式中，120000g离心2小时。

所获得的洋甘菊胞外囊泡能够抑制B16F10细胞增殖，并且能够促进L929细胞创伤愈合，因此可以实现抑制黑色素和美白效果，以及促进皮肤成纤维细胞增殖和迁移，可以实现皮肤修复功能和加快创伤愈合。

上述洋甘菊胞外囊泡还作为功能性物质的载体应用于化妆品。

洋甘菊胞外囊泡可以用于包载水溶性、溶性或者油性的化妆品功能性物质。

所述洋甘菊胞外囊泡可包载大黄素、光甘草定或α-熊果苷。

一种洋甘菊胞外囊泡包载大黄素，以洋甘菊胞外囊泡为载体，包载大黄素。

一种洋甘菊胞外囊泡包载大黄素的制备方法为：将洋甘菊胞外囊泡与大黄素的混合溶液超声分散后，去除未包载的大黄素，经过超高速离心，取沉淀。

优选的，洋甘菊胞外囊泡与大黄素的质量比为0.5-10：1，更优选为1：1。

上述洋甘菊胞外囊泡包载大黄素(GCEVs-E)可制备功能性化妆品。所述的化妆品为美白或抗氧化的化妆品。

上述的洋甘菊胞外囊泡包载大黄素可用于制备面膜，面膜中还含有羧甲基纤维素钠、甘油、丁二醇、透明质酸钠和α-熊果苷。

一种面膜，含羧甲基纤维素钠、甘油、丁二醇、透明质酸钠、α-熊果苷制成生物面膜。

与大黄素制得的面膜相比，由GCEVs-E制得的面膜具有更好的酪氨酸酶抑制和抗氧化能力。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

从洋甘菊中分离得到洋甘菊胞外囊泡，能够抑制B16F10细胞增殖，并且能够促进L929细胞增殖和迁移，促进创伤愈合，因此可以实现抑制黑色素和美白效果，以及促进皮肤成纤维细胞增殖和皮肤修复。

洋甘菊胞外囊泡用作化妆品生物材料能够改善如大黄素等功能性成分的生物利用度。将洋甘菊胞外囊泡用来包载大黄素等功能性化妆品成分，能够改善其难溶于水和生物利用度低的问题，提高大黄素等活性成分在功能性化妆品中的应用效果，且制备方法简单，成本低。相较于脂质体等合成物质，来源于洋甘菊的胞外囊泡易于获得、制备方法简单且可以增强效果。

附图说明

图1是实施例1中洋甘菊胞外囊泡的制备工艺流程图。

图2是实施例1所获得的洋甘菊外囊泡形态及粒度分布和表面电位分析：(A)原子力显微镜下的洋甘菊胞外囊泡；(B)通过马尔文粒度仪测得洋甘菊外囊泡的粒度分布和表面电位。

图3是实施例2中洋甘菊外囊泡对B1610细胞的抑制作用。

图4是实施例3中洋甘菊胞外囊泡促进L929细胞迁移作用。

图5是实施例4中洋甘菊胞外囊泡对大黄素的包封率。

图6是实施例中GCEVs-E制成面膜后的抑制酪氨酸酶活性考察。

图7是实施例中GCEVs-E制成面膜后的抗氧化性考察。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例的附图对本发明实施例的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于所描述的本发明的实施例，本领域普通技术人员在无需创造性劳动的前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1洋甘菊胞外囊泡的分离和纯化

按照如图1所示的方法，用水清洗洋干燥的甘菊，清洗后置于无菌水中浸泡24h；经过榨汁机破碎、挤压后获得洋甘菊汁液，过200目滤布。

取过滤后的洋甘菊汁液，通过差速离心制得洋甘菊胞外囊泡，工艺过程为：1000g，10min×2；3000g，10min×2；10000g，30min×2；20000g，30min×2离心去除植物纤维、细胞碎片等；滤液经CP70-ME超速离心机离心120000g，2h得到洋甘菊胞外囊泡(GCEVs)。

洋甘菊胞外囊泡的形态和尺寸通过原子力显微镜和马尔文粒度仪进行评估，其电镜图的形态和及粒度分布和表面电位分析如图2所示。

结果显示，洋甘菊胞外囊泡呈现出球状结构，保持较好的完整性；洋甘菊胞外囊泡的粒径分布于548.2±10.2nm左右，具有良好的分散性；洋甘菊胞外囊泡带有负电荷。

新鲜的洋甘菊可以清洗后直接破碎挤压取洋甘菊汁液，其余处理同上。

实施例2洋甘菊胞外囊泡对B16F10细胞的抑制作用

采用MTT法测定GCEVs的细胞毒性：首先将MTT溶于PBS中，使得MTT浓度为5mg/mL。将B16F10细胞接种于96孔培养板(10000个/孔)，培养过夜。将GCEVs稀释至5、10、20、40、60、80、100、160、200μg/mL，96孔中加入GCEVs与细胞共孵育48h，在每孔中加20μL的MTT溶液，在37℃再孵育4h，移去培养基，每孔加入150μL的DMSO，溶解内化的紫色甲臜晶体。酶标仪测量A570。细胞活力按不同浓度GCEVs吸光度与对照实验吸光度的百分比计算。

结果如图3所示，随着GCEVs浓度的上升，B16F10细胞的活力不断下降，这意味着GCEVs具有抑制B16F10细胞增殖的能力，具有美白效果。

实施例3洋甘菊胞外囊泡促进L929细胞迁移作用

将L929细胞以100000个/孔接种于6孔培养板，37℃培养24h。每孔加入1mL完全培养基和1mL的GCEVs(50、100μg/mL)，细胞刮刀创造划痕，细胞培养箱中培养，分别于0、6h、24h观察创口愈合。

结果如图4所示，GCEVs浓度越高，促进划痕愈合效果越好，说明GCEVs具有良好的促进创伤愈合能力。

实施例4洋甘菊胞外囊泡包载大黄素

一、洋甘菊胞外囊泡包载大黄素的制备

不同质量比的洋甘菊胞外囊泡-大黄素混合溶液经超声10min×2，室温静置孵育1h恢复胞外囊泡的结构，未包载的大黄素通过30kDa分子量的超滤离心管去除，洋甘菊胞外囊泡-大黄素混合溶液经120000g，2h获得沉淀，溶解于PBS中，大黄素的包载量通过HPLC法测定，安捷伦C18柱(250mm×4.6mm，5μm)，流动相为甲醇-0.1％磷酸水溶液(90：10)，检测波长为254nm，流速为0.3mL/min，柱温为25℃，进样量20μL。

结果如图5所示，显示在1：1的比例下洋甘菊胞外囊泡能够实现对大黄素的较好的包封，包封率在72％左右。

二、GCEVs-E抑制酪氨酸酶活性考察

配制100U/mL的酪氨酸酶溶液，备用。精确称取5.33mg L-多巴粉末放于10mL离心管中,加入9mL PBS，涡旋2min，使L-多巴充分溶于PBS，即得3mmol/L的L-多巴溶液。

精确量取3、5、10、20、30μL的1mg/mL大黄素母液，加入PBS补足到1mL，即得3、5、10、20、30μg/mL的大黄素溶液。精确量取6、10、20、40、60μL的GCEVs-E母液(浓度为500μg/mL)，加入PBS补足到1mL，即得3、5、10、20、30μg/mL的GCEVs-E溶液。根据表1按A组、B组、C组和D组加样至96孔板中，其中样品液为不同浓度的大黄素、GCEVs-E(GCEVs-E的浓度以所包载的大黄含量计)；稀释维生素C至同样浓度梯度，作为阳性对照

表1酪氨酸酶活性测定试剂添加

加样后，96孔板置于37℃水浴10min，然后在每个孔中依次加入50μL的L-多巴溶液，37℃水浴继续反应30min，使用酶标仪于490nm处测量各孔的吸光度。酪氨酸酶的活性按下列公式计算：

酪氨酸酶活性(％)＝[(ODA-ODD)/(ODB-ODC)]×100％

结果如图6所示，GCEVs-E实验组具有更低的酪氨酸酶活性，说明GCEVs-E具有更好的抑制酪氨酸酶活性的能力。

三、GCEVs-E的抗氧化活性考察

称取7.89mg DPPH粉末，用10mL无水乙醇溶解，即得2×10-4mol/L DPPH母液，1mLDPPH母液用19mL无水乙醇稀释，即得10-5mol/L DPPH反应液，遮光。

精确量取3、5、10、20、30μL的1mg/mL大黄素母液，加入PBS补足到1mL，即得3、5、10、20、30μg/mL的大黄素溶液。精确量取6、10、20、40、60μL的GCEVs-E母液(浓度为500μg/mL)，加入PBS补足到1mL，即得3、5、10、20、30μg/mL的GCEVs-E溶液。根据文献[13]的方案并加以修改，根据表2按A组、B组、C组加样至96孔板中，其中样品液为不同浓度的大黄素、GCEVs-E(GCEVs-E的浓度以所包载的大黄含量计)；稀释维生素C至同样浓度梯度，作为阳性对照：

表2DPPH清除实验试剂添加

加完样，避光放置30min后，用酶标仪测量各孔的A517。DPPH的清除率按下列公式计算：

DPPH清除率(％)＝[1-(ODA-ODC)/ODB]×100％

结果如图7所示，GCEVs-E组具有更高的DPPH清除率，说明GCEVs-E具有更好的抗氧化活性。

实施例5

取洋甘菊胞外囊泡包载大黄素0.1g，加入5g羧甲基纤维素钠、20g甘油、2g丁二醇、1透明质酸钠和0.5gα-熊果苷，加入100mL无菌水，混匀后制成面膜，涂抹可实现美白和抗氧化效果。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种洋甘菊胞外囊泡在制备化妆品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的化妆品为美白或者促进皮肤修复、创伤愈合的化妆品。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述洋甘菊胞外囊泡为化妆品功能性物质的载体。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述洋甘菊胞外囊泡包载大黄素、光甘草定或α-熊果苷。

5.一种包载大黄素的洋甘菊胞外囊泡，其特征在于，以洋甘菊胞外囊泡为载体，包载大黄素。

6.根据权利要求5所述的包载大黄素的洋甘菊胞外囊泡，其特征在于，制备方法为：将洋甘菊胞外囊泡与大黄素的混合溶液超声分散后，去除未包载的大黄素，100000-150000g离心0.5-3小时取沉淀。

7.根据权利要求6所述的所述包载大黄素的洋甘菊胞外囊泡，其特征在于，洋甘菊胞外囊泡与大黄素的质量比为0.5-10：1。

8.权利要求5-7任一项所述包载大黄素的洋甘菊胞外囊泡在制备化妆品方面的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的化妆品为美白或抗氧化的化妆品。

10.一种面膜，其特征在于，含有权利要求5-7任一项所述的包载大黄素的洋甘菊胞外囊泡、羧甲基纤维素钠、甘油、丁二醇、透明质酸钠和α-熊果苷。