CN117205136B

CN117205136B - 植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物、组合物及方法和应用

Info

Publication number: CN117205136B
Application number: CN202311488866.7A
Authority: CN
Inventors: 高琦; 侯佳丽; 魏薇; 张旭辉
Original assignee: Beijing Yaojing Gene Technology Co ltd
Current assignee: Beijing Yaojing Gene Technology Co ltd
Priority date: 2023-11-09
Filing date: 2023-11-09
Publication date: 2024-02-06
Anticipated expiration: 2043-11-09
Also published as: CN117205136A

Abstract

本发明涉及一种植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物、组合物及方法和应用，采用纳米囊泡光耀技术（NanoGlOW技术）。用于护肤的植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物为植物类囊泡通过负载技术内部包裹有外源美容活性小分子的复合物，植物类囊泡用于作为载体递送外源美容活性小分子渗透进完整皮肤。本发明的纳米植物类囊泡负载胜肽的工程化负载技术结合了化学活化和物理促包裹的多个关键技术，具有操作简单、适用于大规模生产的特点。植物类囊泡作为载体，内部包裹有美容活性小分子，能帮助美容活性小分子进行更好的跨完整皮肤的递送。

Description

植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物、组合物及方法和应用

技术领域

本发明属于护肤品或药品技术领域，涉及一种植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物、组合物及方法和应用。

背景技术

传统化妆品功能性原料多为化学合成或植物提取，而近十年来，化妆品功能性原料向着生物美容与基因美容方向迅猛发展。生物活性胜肽（又称美容肽）由一定序列的多个氨基酸组成。天然存在于皮肤细胞中的活性肽具有细胞通讯功能,如蛋白质调节、细胞增殖、细胞迁移、氨基化、血管生成和黑色素生成等，为化妆品原料和成品提供了新的思路。美容肽在各种化妆品中的应用已越来越普遍，其功能除了常见的抗衰老、舒敏、修复等外，在美白、丰胸、减肥及生发等方面也飞速发展。

皮肤是人体最大的器官。人们一直认为，由于皮肤屏障的存在，分子量大于500Da的分子不能较好地透过皮肤屏障而发挥良好的美容功效。美容肽是近五年来复合增速最高的皮肤有益剂，达26.52%。美容肽功能丰富多样，但单个氨基酸的平均分子量为110Da，所以四肽及以上的胜肽几乎无法透过皮肤屏障，这将会影响美容肽功效作用的发挥。而且肽类物质作为自然界常见的生物活性物质，容易受到环境刺激（如热、光、湿度等）和人体皮肤中的各种蛋白酶的影响而发生降解和失活。这些因素都将导致胜肽在皮肤中的生物利用率较低，这也是常规美容肽类作为化妆品原料急需解决的难点问题。

在化妆品领域，应用较广的递送系统包括环糊精包合物技术和多种微粒递送系统：微囊和微球、脂质体和新型脂质体、纳米乳和亚微乳、脂质纳米粒等，这些方法生成的载体多为人工化学合成技术，存在一定的致敏性风险。近些年迅速发展的天然细胞外囊泡也能作为递送系统，比较常用的是哺乳动物细胞外囊泡。哺乳动物细胞外囊泡一般含有常见生物标志物，如CD63，CD9，Calnexin等，而且哺乳动物细胞外囊泡由于脂蛋白含量高，普通的室温静孵方式负载脂溶性分子就能达到较高的阳性率。但哺乳动物类囊泡（包括人源类囊泡）用于皮肤时，可能存在伦理问题。值得注意的是人源产品在我国化妆品安全技术规范（2015年版）中明确规定为化妆品禁用组分。

植物类囊泡虽然也是一种选择，但存在如下问题：第一、植物纳米超微囊泡不含有哺乳动物细胞外囊泡的常见生物标志物，如CD63，CD9，Calnexin等，目前难以从母细胞水平的基因工程化修饰进行外源美容活性分子的负载；第二、植物的纳米类囊泡的脂蛋白和脂质含量比哺乳动物细胞外囊泡少，且植物类囊泡的膜层结构比哺乳动物的外囊泡更加厚，因而即使是采用体外物理和化学的方式进行负载，植物纳米类囊泡的溶解性、化学修饰的活性、透膜层的装载能力都与哺乳动物细胞外囊泡有所不同，有许多需要重新摸索和尝试的地方：比如哺乳动物细胞外囊泡由于脂蛋白含量高，普通的室温静孵方式负载脂溶性分子就能达到较高的阳性率，而植物类囊泡的脂蛋白含量少且囊膜更厚，室温静孵无法实现脂溶性分子的负载，阳性率极低。而目前体外的植物类囊泡负载方法的报道很少，远远不及哺乳动物外囊泡负载技术研究得广泛。

目前，常规细胞外囊泡负载药物用于皮肤时，通常用于病理性皮肤组织的治疗，皮肤表层屏障功能已破坏的场景（CN115161256A），透皮难度相对较低。而健康皮肤中，因皮肤表层屏障功能，导致类囊泡在健康皮肤上具有更高的透皮难度。

因此，有必要研发一种能负载美容原料跨过健康完整的皮肤屏障的递送技术。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物、植物类囊泡负载美容活性小分子的方法，及它们的应用。

本发明的纳米植物类囊泡负载胜肽的工程化负载技术结合了化学活化和物理促包裹的多个关键技术，具有阳性率高、操作简单稳定、适用于大规模生产的特点。同时本发明制备的纳米植物类囊泡负载胜肽的复合物能透过健康的完整皮肤，能够适用于更广泛的健康人群。目前工程化纳米植物类囊泡负载美容原料跨过健康完整的皮肤屏障的递送技术还未见报道。

本发明通过物理和化学手段，以乙酰基六肽-3\8、九肽-1、蓝铜胜肽、棕榈酰四肽-7为代表，将胜肽包裹在纳米植物类囊泡内部，纳米植物类囊泡包括但不限于高山火绒草类囊泡、天山雪莲类囊泡、滨海刺芹类囊泡、海茴香类囊泡、人参类囊泡和生姜类囊泡等。利用纳米植物类囊泡的囊膜结构协助胜肽更多地透过皮肤屏障，从而增加胜肽的皮肤生物利用率。

解决方案

为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

第一方面，本发明提供一种用于护肤的植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物，为通过负载技术使植物类囊泡内部包裹有外源美容活性小分子的复合物，植物类囊泡用于作为载体递送外源美容活性小分子渗透进完整皮肤。

外源美容活性小分子是指从植物组织中提取的原生植物类囊泡中不含有或仅有微量的、具有美容活性的化妆品原料小分子成分，可以通过负载技术使外源美容活性小分子进入植物类囊泡内。

进一步地，植物类囊泡选自高山火绒草类囊泡、天山雪莲类囊泡、滨海刺芹类囊泡、海茴香类囊泡、人参类囊泡和生姜类囊泡中的一种或几种。

可选地，植物类囊泡来源其对应植物的愈伤组织培养时的培养液。

进一步地，所述外源美容活性小分子包括胜肽、胶原蛋白、玻色因、依克多因、麦角硫因中的一种或几种，可选地所述胜肽选自乙酰基六肽-3\8、九肽-1、蓝铜胜肽、棕榈酰四肽-7中的一种或几种。

进一步地，负载有外源美容活性小分子的植物类囊泡的直径为50~150nm。

第二方面，提供一种用于护肤的组合物，包含若干植物类囊泡，至少30%的植物类囊泡内包裹有外源美容活性小分子。

进一步地，至少32%、至少34%、至少40%、至少45%或至少49%的植物类囊泡中负载有美容活性小分子。

进一步地，植物类囊泡的含量为1×10⁷~1×10¹³个/mL，可选地为1×10⁸~1×10¹³个/mL，可选地为1×10⁹~1×10¹²个/mL。

进一步地，采用如下方法制得：将含有植物类囊泡、外源美容活性小分子和溶剂的混合液，先后进行化学活化、变温超声孵育，使植物类囊泡负载外源美容活性小分子。

第三方面，提供一种植物类囊泡负载美容活性小分子的方法，包括：将含有植物类囊泡、外源美容活性小分子和溶剂的混合液，先后进行化学活化、超声孵育、变温旋转孵育，获得植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物。

进一步地，混合液中的溶剂为水、PBS、DMSO中的一种或几种。

进一步地，混合液中，植物类囊泡的含量为1×10⁷~1×10¹³个/mL，可选地为1×10⁸~1×10¹³个/mL，可选地为1×10⁹~1×10¹²个/mL；

和/或，混合液中，美容活性小分子的浓度为0.0000001~10g/mL，可选地为0.00001~5g/mL。

进一步地，化学活化中，采用活化剂溶液活化，活化剂选自聚乙烯亚胺、PEG400、PEG2000、NHS/EDC（NHS为N-羟基丁二酰亚胺，EDC为1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺）、DCC/DMAP（DCC为二环己基碳二亚胺，DMAP为N,N-二甲基-4-氨基吡啶）和聚山梨酯80中的一种或几种；

进一步地，化学活化中采用的活化剂的工作浓度为0.1~10%m/v，可选地为1%m/v；可选地，化学活化中，采用的溶剂选自水、PBS、DMSO中的一种或几种。

进一步地，超声孵育的方法为：功率50~300W；频率40~100Hz；占空比20%~100%；时间0.5~5min；可选地功率为120W，可选地频率为50Hz，可选地占空比为50%，可选地时间为3min；

进一步地，变温旋转孵育的方法为：4~42℃变温,即一定时间内线性升高温度；转速50~200rpm；时间20~120min；可选地变温温度10~37℃，可选地转速为80~150rpm；可选地时间为30~60min；可选地，变温策略为线性变温（例如，变温范围为4~42℃时，在20~120min内从4℃线性升温至42℃）。

进一步地，还包括孵育后去除游离美容活性小分子原料，可选地，去除方法包括离心和洗涤，可选地离心方法为：将孵育后的混合液加入到30~300kDa的超滤管中进行离心，弃去流穿中游离原料；可选地洗涤方法为：用PBS洗涤，可选地，至少洗涤2次、3次、4次或5次，每次弃去流穿。

进一步地，外源美容活性小分子包括胜肽、胶原蛋白、玻色因、依克多因、麦角硫因中的一种或几种；可选地，胜肽选自乙酰基六肽-3\8、九肽-1、蓝铜胜肽、棕榈酰四肽-7中的一种或几种。

第四方面，提供一种第一方面所述的用于护肤的植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物、或第二方面所述的组合物、或第三方面所述的方法制得的植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物在制备护肤产品中的应用。

本发明用纳米植物类囊泡作为美容原料递送载体具有比人源细胞外囊泡更多的优点：第一、纳米植物类囊泡的膜囊结构比人源细胞外囊泡更加厚实，理化稳定性更高，对负载在其内的原料的保护作用更强。第二、植物愈伤组织培养时的培养液常被作为废液丢弃，变成生产垃圾，而本发明采用的纳米植物类囊泡提取自这种废弃液，不仅实现了环境友好的废液再利用，而且大幅降低了获得纳米植物类囊泡的生产成本，其成本远低于哺乳动物细胞培养的细胞外囊泡。第三，植物原料在化妆品中的使用历史悠久，植物原料与蛋白原料的复配有可能达到增效的效果。本发明的纳米植物类囊泡载体来自于安全高效的植物愈伤组织原料，如高山火绒草、天山雪莲、滨海刺芹、海茴香、人参和生姜等，使用纳米植物类囊泡载体有增强所负载胜肽功效的可能性。因此，植物类囊泡是很有价值的化妆品原料的功效性递送载体。

有益效果

1）与传统的合成脂质体相比，本发明用天然的纳米植物类囊泡为胜肽的递送载体，安全性更高。另外使用了Franz渗透模型对负载后的样本进行透皮效率的对比，结果显示与游离肽相比，本发明的纳米植物类囊泡的样本能更多地透过皮肤。同时皮肤切片结果也显示，植物类囊泡载体帮助更多的胜肽进入皮肤的真皮层，增加了胜肽的皮肤生物利用率。

2）本发明建立了一种植物类囊泡对胜肽化妆品原料的递送方法。在美容护肤应用上，将美容原料负载到植物类囊泡内部有以下显著优势：第一、利用植物类囊泡本身的膜囊结构可以帮助大分子的化妆品原料透过完整的皮肤表层屏障，到达更深的真皮层或皮下组织；第二、植物类囊泡的膜囊结构可以保护稳定性较差的原料，实现原料的缓释，延长作用时间，从而使原料发挥出应有的美容功效；第三、植物类囊泡内部本身有一些活性物质有效成分，负载美容原料后，功效上有与美容原料的功效进行双重互补或叠加增益的可能性。因此，植物类囊泡负载美容原料有可能发展成为经正常完整皮肤递送美容原料的皮肤深层靶向性兼功效增强双作用载体。而目前植物类囊泡负载美容原料递送技术在美肤领域的应用尚属于空白。值得注意的是，这种递送方法适用于植物类囊泡递送胜肽、胶原蛋白外，也有递送玻色因、依克多因、麦角硫因等多种美容活性小分子物质的潜力。

附图说明

一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

图1：本发明的纳米流式仪检测实施例1的阳性率（左）和颗粒数（右）。

图2：本发明的产品实施例1透射电镜图。

图3：本发明的产品实施例2透射电镜图。

图4：本发明的产品实施例3透射电镜图。

图5：本发明的产品实施例4透射电镜图。

图6：本发明的产品实施例1和产品对比例1的Franz扩散池模型透皮实验结果。

图7：本发明的产品实施例2和产品对比例2的Franz扩散池模型透皮实验结果。

图8：本发明的产品实施例1和对比例1的皮肤切片图：HE染色（上）和荧光成像（下）。

图9：本发明的产品对比例5透射电镜图。

图10：本发明的产品对比例6透射电镜图。

具体实施方式

为更好地说明本发明，现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施案例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。除非特殊说明，以下所用到的各种试剂均为商品化试剂，其中所用的化学试剂不低于分析纯。

以下实施例中，本发明采用化学活化、超声、变温旋转孵育工艺合成了纳米植物类囊泡负载胜肽的护肤原料复合物。

美容肽的常见分类包括神经递质抑制肽、载体肽、信号肽、酶抑制剂肽、结构蛋白肽等。乙酰基六胜肽-3\8（Acetylhexapeptide-3\8，别称Argireline），又被称为类肉毒杆菌素，是胜肽里应用最广泛的产品之一，属于神经递质抑制肽。作用机理是通过竞争结合的方式阻碍神经递质（如乙酰胆碱）或提高乙酰胆碱酯酶在神经肌肉连接处的过量释放，及神经元的胞外分泌等，从而局部阻断信号传导到肌肉引起肌肉过度收缩，舒缓肌肉减少动态细纹（表情纹）等，特别适合早期的抗初老（除皱）产品以及其他年龄段快速除皱产品开发。

蓝铜胜肽(Copper peptide或Cu-GHK)是最常见的载体肽，它参与铜或锰转运到皮肤细胞，是伤口愈合和酶促过程所必需的成分，促进正常胶原蛋白合成，并提供抗炎和抗氧化反应。在化妆品应用中，蓝铜胜肽主要用于抗衰老，抗皱，晒后修复，皮肤更新，皮肤保湿，刺激头发生长的产品。蓝铜胜肽诱导的胶原蛋白合成明显优于维生素C、维甲酸或褪黑素。使用一个月后在接受Cu-GHK治疗的患者中，70%的患者胶原蛋白增加，而维生素C组为50%，视黄酸组为40%。

九肽-1属于酶抑制剂肽，这类胜肽能抑制在皮肤色素沉着中起关键作用的酪氨酸酶的活性，从而阻断黑色素向角质层传递，达到美白祛斑效果。

棕榈酰四肽-7是信号肽的代表。将棕榈酰四肽-7在暴露于UVB照射后试验中作为治疗组，可以通过减少细胞环境中IL-6的分泌而起到抗炎作用。与对照组相比，能增强细胞外基质结构，减少纤维沉积，减少受试者面部皱纹。

本发明的一种提高胜肽类化妆品原料皮肤生物利用度的纳米植物类囊泡载体技术，包括：

第一步：纳米植物类囊泡和胜肽的准备。纳米植物类囊泡来自于植物愈伤组织培养液，这种培养液通常属于工业生产废液，我们利用这种常规废弃的培养液，通过超速离心，分子筛层析技术分离得到50~300nm的纳米级植物类囊泡作为载体。第二步，用水、PBS或DMSO等溶剂配制胜肽母液和植物类囊泡反应液。

第三步：先后利用化学活化、超声、变温旋转孵育工艺处理后，实现胜肽在植物类囊泡中的高效负载。

制备工艺的实施例可以为：

表1制备工艺的实施例

。

表1中，“+”代表采用相应的技术，“-”代表未采用相应的技术，例如，实施例5中，加入了活化剂，超声孵育，未进行变温旋转孵育或恒温孵育。

其中，表1中，化学活化采用的活化剂为聚乙烯亚胺（PEI）、PEG400、PEG2000、NHS/EDC、DCC/DMAP和聚山梨酯80中的一种或多种；采用水或PBS或DMSO作为溶剂配制活化剂。活化剂的加入量为0.1~10%m/v（在混合液中的终浓度）。

其中，表1中，超声条件一般为：功率50~300W；频率40~100Hz；占空比20%~100%；时间0.5~5min。

其中，表1中，变温旋转孵育的条件一般为：4~42℃变温；转速50~200rpm；时间20~120min，即一定时间（20~120min）内线性升高温度（4~42℃）。

上述方法实施例1~7中，属于前期的工艺研究，尝试了多种参数，其中，较优的条件为：

方法实施例1~7和对比例1中，胜肽母液的浓度为0.1mg/mL（溶剂为水，也可以采用DMSO），植物类囊泡反应液中植物类囊泡的含量为2×10¹¹个/mL（溶剂为水，也可以为PBS）。

方法实施例1、2、5、6中，活化剂为NHS/EDC，浓度为1%m/v，溶剂为PBS。

方法实施例1、3、5、7中，超声条件为：功率为120W，频率为50Hz；占空比为50%；时间为3min。

方法实施例1、4、6、7中，变温旋转孵育的条件一般为：4~42℃变温；转速80rpm；时间60min，即一定时间内（60min）从4℃线性升高温度至42℃。

以高山火绒草类囊泡反应液和乙酰基六肽-3\8母液为例，方法实施例1~7按照表1的技术路线按上述较优的条件进行相应地处理，相应地，

方法实施例1较优的制备方法为：将高山火绒草类囊泡反应液和乙酰基六肽-3\8母液混合，加入活化剂NHS/EDC（活化剂终浓度为1%m/v，溶剂为PBS），活化时间为20min；然后进行超声处理，超声条件为：功率为120W，频率为50Hz；占空比为50%；时间为3min；再进行变温孵育，变温旋转孵育的条件一般为：4~42℃变温；转速80rpm；时间60min。

方法实施例2~7的制备方法相对方法实施例1较优的制备方法根据表1省略相应的步骤。

按照方法实施例1~7的较优方法孵育完后，加入到100kDa的超滤管中进行离心，弃去流穿中游离原料，连续洗涤3次，每次弃流穿，收集负载胜肽后的样品；重悬截物，即为植物类囊泡负载胜肽的复合样本。

采用纳米流式仪测定纳米植物类囊泡负载胜肽后的样品的粒径、回收率、阳性率（表2）。

表2纳米流式仪测定高山火绒草植物类囊泡负载FITC标记的乙酰基六肽-3\8后的样品的粒径、回收率、阳性率

。

表2中，FITC标记乙酰基六肽-3\8被纳米植物类囊泡负载后，以此纳米流式仪器的荧光通道检测携带有荧光信号的纳米囊泡（未成功的游离多肽已在超滤洗涤中被洗去），回收率是指超滤洗涤完成后的颗粒数比上未洗涤之前的原液中的颗粒数（洗涤过程中可能会使部分纳米囊泡破碎而造成颗粒数损失，因此要知道洗涤后的回收率）。阳性率是指负载有目标胜肽的类囊泡数量（通过检测携带有荧光信号的纳米囊泡）/原有类囊泡数量。

表2中，回收率和阳性率是范围值，是因为采用表1中不同的参数进行了尝试，实施例1在采用较优的制备方法时，回收率、阳性率分别为72%、49%。

由表2可知，从粒径上看，与方法对比例1相比，方法实施例1~7的平均粒径有增大趋势，尤其是结合了两种或两种以上工艺的方法实施例1、5、6、7，平均粒径比方法对比例1增加了3~10nm，可能是胜肽的进入导致了平均粒径的增加。回收率各组之间差别无明显规律。从阳性率上进行分析，采用了活化剂、超声、变温旋转孵育一种、两种或三种关键工艺的方法实施例1~7与比常规室温孵育的方法对比例1的阳性率提高了2.3~32.6倍。方法实施例2、3、4的阳性率的结果显示活化剂、超声、变温旋转孵育对胜肽负载作用的影响力从大到小。采用了两种工艺的方法实施例5、6、7比仅使用一种工艺的方法实施例2、3、4具有更好的阳性率。结合了三种工艺技术的方法实施例1纳米流式仪检测结果显示颗粒数达1.63×10¹¹particle/mL，其中阳性颗粒数为8.01×10¹⁰particle/mL，阳性率最高可达49.0%（图1）。说明这三种工艺均是形成纳米植物类囊泡负载胜肽递送体系的关键技术，其负载功效可以叠加。透射电镜图显示了负载胜肽的植物类囊泡载体形态完整，说明本发明中的合成技术路线没有对样品形成损坏。（图2-图5）。

将不同植物来源的植物类囊泡分别与不同的胜肽进行负载组合，组合方式如表3，按照实施例1较优的方法进行产品实施例1~4的制备，产品对比例1~4用水稀释至与产品实施例1~4的胜肽含量相同。

表3不同产品实施例中的纳米植物外囊泡种类和胜肽种类

。

产品实施例1~4的产品的透射电镜图分别如图2~4所示，说明负载胜肽的植物类囊泡载体形态完整，没有对样品形成破坏。产品实施例1~4的阳性率分别为49%、45%、41%、43%，产品对比例5的负载阳性率为46%，产品对比例6的负载阳性率为44%。

测试例1

透皮效率和透皮深度检测：用Cy5荧光标记胜肽，通过Franz透皮扩散池对产品实施例1~4和产品对比例1~4的透皮效率进行检测，皮肤切片看产品实施例1~4和产品对比例1~4皮肤渗透深度。透皮扩散池的池口直径为20mm，下层扩散池体积为20mL。用0.9％生理盐水作为扩散池下层接收液，透皮率以三次平行实验计算。具体操作为取6~8周龄的Balb/c小鼠，用动物专用剃毛器尽可能地剃去小鼠背部毛发，选取皮肤状态柔软完整的小鼠安乐死后取其背部皮肤，用圆头镊子去除皮下脂肪，无菌生理盐水清洗杂毛和多余血丝，制备完毕后作为渗透模型，安装至扩散池进行负载样本的透皮效率检测。分别在0h,2h,4h,8h,18h,24h,42h,48h采集下层液进行荧光信号检测。结果显示随着时间的延长，产品实施例1~4在下层可以检测到荧光信号的增长，而产品对比例1~4的荧光信号增长不明显（见图6，图7）。说明产品实施例1~4的植物类囊泡负载胜肽原料有良好的皮肤渗透性，能够透过皮肤，植物类囊泡对胜肽类美容原料起到了保护和缓释的作用。而产品对比例1~4的游离胜肽不能透过皮肤，或者是稳定性差，在检测时间内发生了分解而无法发挥较好的功效（表4）。

表4产品实施例1~4和产品对比例1~4的透皮效率检测

。

表5皮肤切片对产品实施例1~4和产品对比例1~4的透皮深度进行检测

。

同时，另一组试验采集24h时小鼠皮肤的样品做切片，红色的荧光信号代表了所示踪的Cy5标记的胜肽的皮肤渗透深度。可以看到经过纳米植物类囊泡负载的胜肽可以通过皮肤的表皮层到达皮肤的真皮层和皮下组织。而游离的胜肽在24h时基本还停留在皮肤的表皮层，除了少量通过毛孔到达浅表真皮层的胜肽之外，大多数的游离胜肽无法到达皮肤真皮层深处发挥作用（见表5，图8）。

测试例2

将产品实施例1的高山火绒草类囊泡负载Cy5标记的乙酰基六肽-3\8与产品对比例5的脂质体囊泡负载的Cy5标记的乙酰基六肽-3\8的原料进行透皮效率的对比。

首先需经过气动挤压系统合成脂质体，其包括：（1）使用32.65mg磷脂，12.28mg胆固醇和0.79mgPEG2000混合于15mL氯仿超声形成乳白色液体；（2）将乙醇、氯仿（200mg/mL，3mL）加入混合液中搅拌30min,并通过旋转蒸发用纯水剥离形成的脂膜；1mL纯水逐滴加入上述液体，高速搅拌15000rpm，25min,初步获得脂质体；（3）进一步将脂质体经过400nm,200nm的气动挤压系统，形成均一的纳米脂质体。进一步地，用与产品实施例1相同的方法制备产品对比例5，获得以脂质体负载乙酰基六肽-3\8的产品对比原料5（见图9）。

使用测试例1中的Franz透皮模型检测产品实施例1和产品对比例5的透皮效率。即，在48h收集两组扩散池下层液，进行FL荧光信号检测。结果如表6显示，产品实施例1下层检测到的荧光信号显著高于产品对比例5的荧光信号，且荧光值约是产品对比例5的3倍（见表6）。说明产品实施例1经植物类囊泡负载胜肽原料有良好的皮肤渗透性，且效果优于脂质体负载胜肽原料。

表6产品实施例1与产品对比例5的48h透皮结果比较

。

测试例3

另外，用与产品实施例1相同的方法制备产品对比例6，获得以牛奶外囊泡为代表的哺乳动物细胞外囊泡负载乙酰基六肽-3\8原料（图10）。实施细胞吸收实验，对比产品实施例1的高山火绒草类囊泡负载乙酰基六肽-3\8代表的植物类负载囊泡和产品对比例6的牛奶外囊泡负载乙酰基六肽-3\8代表的动物来源的负载囊泡,进行不同种类的囊泡负载结构的细胞吸收效率检测研究。

细胞吸收效率检测实验方案如下：HaCaT细胞以1×10⁴cells/孔的密度接种于24孔板中，培养24h以贴壁后，分别加入1mg/mL的LeoExo@FITC-AH-8和milkExo@FITC-AH-8，在孵育1h，2h，4h后弃去药物，PBS清洗5次，以去除孔内未吸收的纳米囊泡。将各孔细胞吸收纳米囊泡情况进行荧光成像，每孔选取3个视野拍摄图像。用Image J进行荧光强度分析，结果见表7。

表7中结果显示，4h内，产品实施例1代表的植物类囊泡负载胜肽组能够更多更快地被细胞吸收，显示出更高的荧光值，与产品对比例6代表的动物类囊泡负载组相比显示出显著性差异。这显示出植物类囊泡负载胜肽的优势，将更容易进入细胞更快发挥作用。

表7产品实施例1和产品对比例6细胞吸收检测荧光值

。

综上，本发明采用化学活化、超声、变温旋转孵育工艺处理后，实现了胜肽的高效负载，与产品对比例1~4的游离胜肽进行对比，表明植物类囊泡负载技术可以增强胜肽类美容原料的透皮性能，这归因于植物类囊泡作为纳米材料本身的优势。与产品对比例6的哺乳动物细胞外囊泡负载原料相比，植物类囊泡负载技术可以更好地促进胜肽类美容原料的细胞吸收性能。

上述说明示出并描述了本发明的优选实施案例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施案例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种用于护肤的植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物，其特征在于，其为植物类囊泡通过负载技术内部包裹有外源美容活性小分子的复合物，植物类囊泡用于作为载体递送外源美容活性小分子渗透进完整皮肤；

植物类囊泡选自高山火绒草类囊泡、天山雪莲类囊泡、滨海刺芹类囊泡、海茴香类囊泡、人参类囊泡和生姜类囊泡中的一种或几种；

所述外源美容活性小分子包括胜肽、玻色因、依克多因、麦角硫因中的一种或几种；

负载有外源美容活性小分子的植物类囊泡的直径为50~150nm；

复合物采用如下方法制得：将含有植物类囊泡、外源美容活性小分子和溶剂的混合液，先后进行化学活化、超声孵育、变温旋转孵育，使植物类囊泡负载外源美容活性小分子；其中，

化学活化中，采用活化剂溶液活化，活化剂选自聚乙烯亚胺、PEG400、PEG2000、NHS/EDC、DCC/DMAP和聚山梨酯80中的一种或几种；化学活化中采用的活化剂的工作浓度为0.1~10%m/v；化学活化中采用的溶剂选自水、PBS、DMSO中的一种或几种；

超声孵育的方法为：功率50~300W；频率40~100Hz；占空比20%~100%；时间0.5~5min；

变温旋转孵育的方法为：4~42℃变温；转速50~200rpm；时间20~120min；变温策略为线性变温。

2.根据权利要求1所述的复合物，其特征在于，所述外源美容活性小分子包括胜肽，胜肽选自乙酰基六肽-3\8、九肽-1、蓝铜胜肽、棕榈酰四肽-7中的一种或几种。

3.一种用于护肤的组合物，其特征在于，包含若干植物类囊泡，至少30%的植物类囊泡内包裹有外源美容活性小分子；

负载有外源美容活性小分子的植物类囊泡的直径为50~150nm；

采用如下方法制得：将含有植物类囊泡、外源美容活性小分子和溶剂的混合液，先后进行化学活化、超声孵育、变温旋转孵育，使植物类囊泡负载外源美容活性小分子；其中，

4.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，至少32%的植物类囊泡中负载有美容活性小分子。

5.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，至少34%的植物类囊泡中负载有美容活性小分子。

6.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，至少40%的植物类囊泡中负载有美容活性小分子。

7.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，至少45%的植物类囊泡中负载有美容活性小分子。

8.根据权利要求3所述的组合物，其特征在于，至少49%的植物类囊泡中负载有美容活性小分子。

9.根据权利要求3至8任一所述的组合物，其特征在于，植物类囊泡的含量为1×10⁷~1×10¹³个/mL。

10.根据权利要求3至8任一所述的组合物，其特征在于，植物类囊泡的含量1×10⁸~1×10¹³个/mL。

11.根据权利要求3至8任一所述的组合物，其特征在于，所述外源美容活性小分子包括胜肽，胜肽选自乙酰基六肽-3\8、九肽-1、蓝铜胜肽、棕榈酰四肽-7中的一种或几种。

12.一种植物类囊泡负载美容活性小分子的方法，其特征在于，包括：将含有植物类囊泡、外源美容活性小分子和溶剂的混合液，先后进行化学活化、超声孵育、变温旋转孵育，使植物类囊泡负载外源美容活性小分子得到复合物；

其中，

变温旋转孵育的方法为：4~42℃变温；转速50~200rpm；时间20~120min；变温策略为线性变温；

负载有外源美容活性小分子的植物类囊泡的直径为50~150nm；

外源美容活性小分子包括胜肽、玻色因、依克多因、麦角硫因中的一种或几种。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，混合液中的溶剂为水、PBS、DMSO中的一种或几种。

14.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，混合液中，植物类囊泡的含量为1×10⁷~1×10¹³个/mL。

15.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，混合液中，植物类囊泡的含量为1×10⁸~1×10¹³个/mL。

16.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，混合液中，美容活性小分子的浓度为0.0000001~10g/mL。

17.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，混合液中，美容活性小分子的浓度为0.00001~5g/mL。

18.根据权利要求12至17任一所述的方法，其特征在于，还包括孵育后去除游离美容活性小分子原料。

19.根据权利要求12至17任一所述的方法，其特征在于，所述外源美容活性小分子包括胜肽，胜肽选自乙酰基六肽-3\8、九肽-1、蓝铜胜肽、棕榈酰四肽-7中的一种或几种。

20.一种权利要求1或2所述的用于护肤的植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物、或权利要求3至11任一所述的组合物、或权利要求12至19任一所述的方法制得的植物类囊泡负载美容活性小分子的复合物在制备护肤产品中的应用。